ISO 12228-2:2014
(Main)Determination of individual and total sterols contents — Gas chromatographic method — Part 2: Olive oils and olive pomace oils
Determination of individual and total sterols contents — Gas chromatographic method — Part 2: Olive oils and olive pomace oils
ISO 12228-2:2014 specifies a procedure for the gas chromatographic determination of the contents and composition of sterols and triterpene dialcohols in olive and olive pomace oils. For the determination of the contents and composition of sterols in all other animal and vegetable fats and oils, ISO 12228‑1 is to be used.
Détermination de la teneur en stérols individuels et totaux — Méthode par chromatographie en phase gazeuse — Partie 2: Huile d'olive et huile de grignons d'olive
L'ISO 12228-2:2014 spécifie un mode opératoire de détermination de la teneur et de la composition des stérols et des dialcools triterpéniques contenus dans l'huile d'olive et l'huile de grignons d'olive par chromatographie en phase gazeuse. Pour déterminer la teneur et la composition des stérols dans tout autre corps gras d'origine animale ou végétale, l'ISO 12228-1 doit être utilisée.
General Information
Relations
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Standards Content (Sample)
МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 12228-2
Первое издание
2014-10-01
Определение содержания и состава
стеринов. Метод газовой
хроматографии.
Часть 2.
Оливковое масло и жмыховое
оливковое масло
Determination of individual and total sterols contents — Gas
chromatographic method —
Part 2. Olive oils and olive pomace oils
Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава ISO
Ссылочный номер
ISO 12228-2:2014(R)
©
ISO 2014
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ISO 12228-2:2014(R)
ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ
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предварительного письменного согласия ISO по соответствующему адресу, указанному ниже, или комитета-члена ISO в стране
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Опубликовано в Швейцарии
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ISO 12228-2:2014(R)
Содержание Страница
Предисловие . iv
1 Область применения . 1
2 Нормативные ссылки . 1
3 Термины и определения . 1
4 Принцип . 2
5 Реактивы . 2
6 Аппаратура. 3
7 Проба . 4
7.1 Отбор проб . 4
7.2 Приготовление пробы для испытания . 4
8 Методика . 4
8.1 Проба для анализа . 4
8.2 Получение неомыляемого вещества . 5
8.3 Разделение фракций стеринов и двухатомных тритерпеновых спиртов
(эритродиола, уваола) тонкослойной хроматографией (TLC) . 5
8.4 Приготовление триметилсилиловых эфиров . 6
8.5 Газохроматографический анализ . 6
9 Выражение результатов . 8
9.1 Количественная оценка . 8
9.2 Определение общего содержания стеринов . 8
9.3 Состав стеринов . 8
9.4 Состав двухатомных тритерпеновых спиртов . 9
10 Прецизионность . 9
10.1 Межлабораторное испытание . 9
10.2 Предел повторяемости, r . 9
10.3 Предел воспроизводимости, R . 9
11 Протокол испытаний . 9
Приложение A (информативное) Рисунки . 10
Приложение B (информативное) Межлабораторное испытание . 13
Библиография . 16
© ISO 2014 – Все права сохраняются iii
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ISO 12228-2:2014(R)
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) всемирная федерация национальных органов
по стандартизации (комитеты-члены ISO). Работа по подготовке международных стандартов обычно
ведется через технические комитеты ISO. Каждый комитет-член ISO, проявляющий интерес к
тематике, по которой учрежден технический комитет, имеет право быть представленным в этом
комитете. Международные организации, государственные и негосударственные, имеющие связи с ISO,
также принимают участие в работе. ISO тесно сотрудничает с Международной электротехнической
комиссией (IEC) по всем вопросам стандартизации в области электротехники.
Процедуры, используемые для разработки данного документа, и процедуры, предусмотренные для его
дальнейшего ведения, описаны в Части 1 Директив ISO/IEC. В частности, следует отметить различные
критерии утверждения, требуемые для различных типов документов ISO. Проект данного документа
был разработан в соответствии с редакционными правилами в Части 2 Директив ISO/IEC
(см. www.iso.org/directives).
Необходимо обратить внимание на возможность того, что ряд элементов данного документа могут
быть предметом патентных прав. Международная организация ISO не должна нести ответственность
за идентификацию таких прав, частично или полностью. Сведения о патентных правах,
идентифицированных при разработке документа, будут указаны во Введении и/или в перечне
полученных ISO объявлений о патентном праве (см. www.iso.org/patents).
Любое торговое название, использованное в данном документе, является информацией,
предоставляемой для удобства пользователей, а не свидетельством в пользу того или иного товара
или той или иной компании.
Для пояснения значений конкретных терминов и выражений ISO, относящихся к оценке соответствия, а
также информация о соблюдении Международной организацией ISO принципов ВТО по техническим
барьерам в торговле (TВT), см. следующий унифицированный локатор ресурса (URL): Foreword —
Supplementary information.
Технический комитет, несущий ответственность за данный документ, ISO/TC 34, Пищевые продукты,
Подкомитет SC 11, Животные и растительные жиры и масла.
Настоящее первое издание ISO 12228-2 отменяет и заменяет ISO 12228:1999, которое подверглось
техническому пересмотру.
ISO 12228 состоит из следующих частей под общим названием Определение содержания и состава
стеринов. Метод газовой хроматографии:
— Часть 1. Животные и растительные жиры и масла
— Часть 2. Оливковое масло и жмыховое оливковое масло
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МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ISO 12228-2:2014(R)
Определение содержания и состава стеринов.
Метод газовой хроматографии.
Часть 2.
Оливковое масло и жмыховое оливковое масло
1 Область применения
Настоящая часть ISO 12228 устанавливает методику газохроматографического определения
содержания и состава стеринов и двухатомных тритерпеновых спиртов в оливковом масле и
жмыховом оливковом масле. Для определения содержания и состава стеринов во всех других
животных и растительных жирах и маслах должна использоваться методика, указанная в ISO 12228-1.
ПРИМЕЧАНИЕ Эта часть ISO 12228 технически идентична стандарту Международного Совета по оливкам
COI/T.20/Doc. №.30 (ноябрь 2011).
2 Нормативные ссылки
Следующие ссылочные нормативные документы, частично или полностью, являются обязательными
при применении данного документа. Для датированных ссылок применяется только цитированное
издание документа. Для недатированных ссылок необходимо использовать самое последнее издание
нормативного ссылочного документа (включая любые изменения).
ISO 661, Жиры и масла животные и растительные. Приготовление пробы для испытания
3 Термины и определения
Применительно к настоящему документу используются следующие термины и определения.
3.1
состав стеринов
composition of sterols
состав отдельных стеринов в пробе, начиная с холестерина и заканчивая ∆7-авенастерином
(см. Таблицу 1) в условиях, установленных в настоящей части ISO 12228
ПРИМЕЧАНИЕ 1 к статье: Состав выражают в процентах от площадей всех пиков, нормализованных к 100 %.
3.2
общее содержание стеринов
total sterol content
массовая доля суммы всех отдельных стеринов, определенных в соответствии с методом,
установленным в настоящей части ISO 12228, начиная с холестерина и заканчивая ∆7-авенастерином
(см. Таблицу 1), деленная на массу пробы для анализа
ПРИМЕЧАНИЕ 1 к статье: Содержание выражают в миллиграммах на килограмм.
3.3
состав двухатомных тритерпеновых спиртов
composition of triterpene dialcohols
состав эритродиола и уваола в пробе в условиях, установленных в настоящей части ISO 12228
ПРИМЕЧАНИЕ 1 к статье: Состав выражают в процентах от площадей всех пиков, начиная с холестерина и
заканчивая уваолом (см. Таблицу 1) в условиях, установленных в настоящей части ISO 12228, нормализованных
100 %.
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ISO 12228-2:2014(R)
4 Принцип
Омыляют пробу для анализа при кипячении с обратным холодильником в этанольном растворе
гидроксида калия. Эстрагируют неомыляемое вещество диэтиловым эфиром. Разделяют фракции
стеринов и двухатомных тритерпеновых спиртов из неомыляемого вещества с помощью тонкослойной
хроматографии на пластинках с щелочным силикагелем. Определяют качественный и количественный
состав фракций стеринов и двухатомных тритерпеновых спиртов с помощью газовой хроматографии
триметилсилиловых эфиров, используя холестанол в качестве внутреннего стандарта.
5 Реактивы
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Необходимо принимать во внимание инструкции, которые
устанавливают правила обращения с опасными веществами. Необходимо соблюдать
технические, организационные и персональные меры безопасности.
Используют только реактивы признанной аналитической чистоты, если не оговорено иначе, и воду,
[1]
соответствующую классу чистоты 3 согласно ISO 3696 .
5.1 Гидроксид калия, минимальная массовая доля w = 85 г/100 г.
5.2 Гидроксид калия, этанольный раствор, концентрация, c, приблизительно 2 моль/л.
Растворяют при охлаждении 130 г гидроксида калия (5.1) в 200 мл дистиллированной воды, а затем
разбавляют до 1 л этанолом (5.9). Хранят раствор в хорошо укупоренной бутылке из темного стекла в
течение максимум 2 дней.
5.3 Гидроксид калия, этанольный раствор, концентрация, c, приблизительно 0,2 моль/л.
Растворяют 13 г гидроксида калия (5.1) в 20 мл дистиллированной воды и разбавляют до 1 л этанолом
(5.9).
5.4 Диэтиловый эфир, для хроматографии.
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ — Диэтиловый эфир легко воспламеняется и может образовывать
взрывчатые пероксиды. Пределы взрываемости на воздухе от 1,7 % до 48 % (объемная доля).
Необходимо соблюдать меры предосторожности при его использовании.
5.5 Безводный сульфат натрия.
5.6 Пластинки с силикагелем для тонкослойной хроматографии (TLC), имеющиеся в продаже,
размеры 20 см 20 см, толщина слоя 0,25 мм, без флуоресцентного индикатора.
5.7 Ацетон, для хроматографии.
5.8 н-Гексан, для хроматографии.
5.9 Этанол 96 %, минимальная объемная доля φ = 95 %.
5.10 Этилацетат.
5.11 Стандартный раствор для тонкослойной хроматографии, холестерин или смесь
фитостеринов и раствор эритродиола в этилацетате (5.10), массовая концентрация, = 5 %.
5.12 2,7-дихлорфлуоресцеин, этанольный раствор, массовая концентрация, = 0,2 %.
Слегка подщелачивают раствор, добавляя несколько капель этанольного раствора гидроксида калия
концентрацией 2 моль/л (5.2). Хранят максимум в течение 1 года.
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ISO 12228-2:2014(R)
5.13 Раствор α-холестанола в качестве внутреннего стандарта, массовая концентрация,
= 0,2 г/100 мл, в этилацетате (5.10).
5.14 Раствор фенолфталеина, массовая концентрация, = 10 г/л, в этаноле (5.9).
5.15 Газ-носитель для газовой хроматографии, гелий или, предпочтительно, водород.
5.16 Вспомогательные газы для газовой хроматографии, водород, гелий азот и воздух.
5.17 Проявляющий растворитель, смесь н-гексана и диэтилового эфира, объемные концентрации:
(н-гексан) = 65 мл/100 мл, (диэтиловый эфир) = 35 мл/100 мл.
5.18 Гексаметилдисилазан.
5.19 Триметихлорсилан.
5.20 Реактив для силилирования, смесь пиридина, гексаметилдисилазана и триметихлорсилана.
Объемные концентрации: (пиридин) = 9 мл/13 мл, (гексаметилдисилазан) = 3 мл/13 мл,
(триметихлорсилан) = 1 мл/13 мл. Готовят свежеприготовленную смесь ежедневно.
ПРИМЕЧАНИЕ Могут использоваться другие реактивы для силилирования, например, смесь
N,O-бис-триметилсилилтрифторацетамида (BSTFA) с триметилхлорсиланом (TMCS), (BSTFA) = 99 мл/100 мл
и (TMCS) = 1 мл/100мл.
6 Аппаратура
Обычное лабораторное оборудование и, в частности, следующее.
6.1 Круглодонные колбы, вместимостью 250 мл, с пришлифованным горлом.
6.2 Обратный холодильник, со стеклянным шлифом, пригнанным к колбе (6.1).
6.3 Делительная воронка, вместимостью 500 мл.
6.4 Проявительная камера, изготовленная из стекла, с пришлифованной стеклянной крышкой,
пригодная для проявления пластинок размерами 20 см 20 см.
6.5 Ультрафиолетовая лампа, длина волны 366 нм или 254 нм.
6.6. Микрошприц, для подачи 100 мкл, 500 мкл и 1000 мкл.
6.7 Цилиндрическая фильтровальная воронка, с фильтром из спеченного стекла (G3, пористость
от 15 мкм до 40 мкм), диаметр приблизительно 2 см, глубина 5 см, пригодная для фильтрования под
вакуумом, со стеклянным шлифом.
6.8 Коническая колба, пригодная для работы под вакуумом, вместимостью 50 мл, со стеклянным
шлифом, присоединяемым к фильтровальной воронке (6.7).
6.9 Пробирка, вместимостью 10 мл, с конусообразным низом и герметичной стеклянной пробкой.
6.10 Газовый хроматограф, для капиллярных колонок, с инжектором с делением потока,
состоящий из:
― термостата колонки, способного поддерживать температуру с точностью ± 1 °С;
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ISO 12228-2:2014(R)
― терморегулируемого блока для впрыска проб, с обработанным силаном стеклянным
испарителем и системой деления потока;
― пламенно-ионизационного детектора (FID);
― системы сбора данных.
6.11 Капиллярная колонка, изготовленная из плавленого диоксида кремния, длиной от 20 м до 30 м,
внутренним диаметром от 0,25 мм до 0,32 мм, покрытая (5 %) дифенил- (95 %)
диметилполисилоксаном (SE-52 или SE-54 или эквивалентная неподвижная фаза), с диапазоном
температур в пределах не менее 280 – 300 °С, и толщиной пленки от 0,1 мкм до 0,30 мкм.
6.12 Микрошприц для газовой хроматографии, вместимостью 1 мкл и 10 мкл, для газовой
хроматографии, с твердосплавной иглой, пригодный для впрыска пробы с делением потока.
6.13 Эксикатор, содержащий эффективный осушитель, для хранения пластинок, например, хлорид
кальция.
6.14 Сушильный шкаф, поддерживающий температуру 103 °С ± 2 °С.
6.15 Роторный испаритель, соединенный с вакуумным насосом и водяной баней, отрегулированной
на температуру 40 °С.
6.16 Аналитические весы, способные взвешивать с точностью до 0,001 г и отображать показание
0,000 1 г.
7 Проба
7.1 Отбор проб
Отбор проб не является частью метода, рассматриваемого в данной части ISO 12228. Рекомендуемый
[2]
метод отбора проб приводится в стандарте ISO 5555 .
Важно, чтобы лаборатория получила пробу, которая является представительной и не была
повреждена или изменена при транспортировке или хранении.
7.2 Приготовление пробы для испытания
Готовят пробу для испытания в соответствии с ISO 661. Сушат пробы, если необходимо, путем
фильтрации.
8 Методика
8.1 Проба для анализа
С помощью микрошприца (6.6) переносят 500 мкл (в случае оливкового масла) или 1500 мкл (в случае
жмыхового оливкового масла) раствора внутреннего стандарта (5.13) в колбу вместимостью
250 мл (6.1). Выпаривают досуха в слабом потоке азота на теплой водяной бане и охлаждают колбу.
Взвешивают с точностью до 10 мг приблизительно 5 г оливкового масла или жмыхового оливкового
масла в той же самой колбе и продолжают методику в соответствии с 8.2.
ПРИМЕЧАНИЕ Жмыховое оливковое масло, содержащее существенные количества холестерина, может
давать пик с временем удерживания, идентичным холестанолу. В этих случаях фракция стеринов должна
анализироваться параллельно с добавлением внутреннего стандарта и без него.
4 © ISO 2014 – Все права сохраняются
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ISO 12228-2:2014(R)
8.2 Получение неомыляемого вещества
8.2.1 Добавляют 50 мл этанольного раствора гидроксида калия (5.2) концентрацией 2 моль/л и
немного пемзы, присоединяют обратный холодильник к колбе и нагревают содержимое при умеренном
кипении до тех пор, пока раствор не станет прозрачным (конец омыления). Продолжают кипение еще в
течение 20 мин, добавляют 50 мл дистиллированной воды через верхнюю часть холодильника,
отсоединяют холодильник и охлаждают колбу приблизительно до температуры 30 °С.
8.2.2 Количественно переносят содержимое колбы в делительную воронку (6.3) вместимостью
500 мл, используя несколько порций дистиллированной воды (50 мл). Добавляют приблизительно
80 мл диэтилового эфира (5.4), энергично встряхивают приблизительно в течение 60 с, периодически
выпуская давление путем переворачивания делительной воронки и открывания запорного крана. Дают
возможность постоять до полного разделения двух фаз.
Сливают, как можно полнее, мыльный раствор во вторую делительную воронку. Выполняют еще две
дополнительные экстракции водно-спиртовой фазы тем же способом, используя от 60 мл до 70 мл
диэтилового эфира (5.4).
Необходимо разрушить эмульсию путем добавления небольшого количества этанола (5.9) и
осторожного взбалтывания.
8.2.3 Объединяют три эфирных экстракта в делительной воронке, содержащей 50 мл воды.
Продолжают промывку водой (50 мл) до тех пор, пока промывные воды не будут больше окрашиваться
в розовый цвет при добавлении капли раствора фенолфталеина (5.14).
После удаления промывных вод фильтруют через безводный сульфат натрия (5.5) в предварительно
взвешенную колбу вместимостью 250 мл, промывая воронку и фильтр небольшими количествами
диэтилового эфира (5.4).
8.2.4 Удаляют растворитель из колбы с помощью роторного испарителя при температуре 30 °С под
вакуумом. Добавляют 5 мл ацетона (5.7) и полностью испаряют летучий растворитель в слабом потоке
воздуха. Сушат остаток в сушильном шкафу (6.14) при температуре 103 °С ± 2 °С в течение 15 мин.
Охлаждают в эксикаторе и взвешивают с точностью до 0,1 мг.
8.3 Разделение фракций стеринов и двухатомных тритерпеновых спиртов
(эритродиола, уваола) тонкослойной хроматографией (TLC)
8.3.1 Погружают пластинки с силикагелем (5.6) на глубину приблизительно 4 см в этанольный
раствор гидроксида калия (5.3) концентрацией 0,2 моль/л на 10 с, оставляют для высушивания в
вытяжном шкафу на два часа и помещают в сушильный шкаф при температуре 100 °С на 1 ч.
Вынимают пластинки из сушильного шкафа и хранят в эксикаторе (6.13) до использования (пластинки
должны храниться максимум в течение 15 дней).
ПРИМЕЧАНИЕ Если для разделения фракции стеринов используют пластинки с щелочным силикагелем, то
все соединения, имеющие кислую реакцию (жирные кислоты и другие), удерживаются на линии нанесения проб, а
зона стеринов четко отделяется от зоны алифатических и двухатомных тритерпеновых спиртов.
8.3.2 Заполняют проявительную камеру (6.4) проявляющим раст
...
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 12228-2
First edition
2014-10-01
Determination of individual
and total sterols contents — Gas
chromatographic method —
Part 2:
Olive oils and olive pomace oils
Détermination de la teneur en stérols individuels et totaux —
Méthode par chromatographie en phase gazeuse —
Partie 2: Huile d’olive et huile de grignons d’olive
Reference number
ISO 12228-2:2014(E)
©
ISO 2014
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ISO 12228-2:2014(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2014
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form
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Published in Switzerland
ii © ISO 2014 – All rights reserved
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ISO 12228-2:2014(E)
Contents Page
Foreword .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Reagents . 2
6 Apparatus . 3
7 Sample . 4
7.1 Sampling . 4
7.2 Preparation of the test sample . 4
8 Procedure. 4
8.1 Test portion . 4
8.2 Preparation of unsaponifiable matter. 4
8.3 Separation of the sterol and triterpene dialcohols (erythrodiol, uvaol) fractions by TLC . 5
8.4 Preparation of the trimethylsilyl ethers . 6
8.5 Gas chromatographic analysis . 6
9 Expression of results . 7
9.1 Quantitative evaluation . 7
9.2 Determination of the total sterol content . 8
9.3 Composition of sterols . 8
9.4 Composition of triterpene dialcohols . 8
10 Precision . 9
10.1 Interlaboratory test. 9
10.2 Repeatability limit, r . 9
10.3 Reproducibility limit, R . 9
11 Test report . 9
Annex A (informative) Figures .10
Annex B (informative) Interlaborative trial .13
Bibliography .16
© ISO 2014 – All rights reserved iii
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ISO 12228-2:2014(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of any
patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or on
the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical Barriers
to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 11, Animal
and vegetable fats and oils.
This first edition of ISO 12228-2 cancels and replaces ISO 12228:1999, which has been technically
revised.
ISO 12228 consists of the following parts, under the general title Determination of individual and total
sterols contents — Gas chromatographic method:
— Part 1: Animal and vegetable fats and oils
— Part 2: Olive oils and olive pomace oils
iv © ISO 2014 – All rights reserved
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 12228-2:2014(E)
Determination of individual and total sterols contents —
Gas chromatographic method —
Part 2:
Olive oils and olive pomace oils
1 Scope
This part of ISO 12228 specifies a procedure for the gas chromatographic determination of the contents
and composition of sterols and triterpene dialcohols in olive and olive pomace oils. For the determination
of the contents and composition of sterols in all other animal and vegetable fats and oils, ISO 12228-1 is
to be used.
NOTE This part of ISO 12228 is technically identical to IOC Standard COI/T.20/Doc. No. 30 (November 2011).
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 661, Animal and vegetable fats and oils — Preparation of test sample
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
composition of sterols
composition of individual sterols in the sample, beginning with cholesterol and ending with ∆7-avenasterol
(see Table 1) under the conditions specified in this part of ISO 12228
Note 1 to entry: The composition is expressed as a percentage of all peak areas, normalized to 100 %.
3.2
total sterol content
mass fraction of the sum of all individual sterols, as determined in accordance with the method specified
in this part of ISO 12228, beginning with cholesterol and ending with ∆7-avenasterol (see Table 1),
divided by the mass of the test portion
Note 1 to entry: The content is expressed in milligrams per kilogram.
3.3
composition of triterpene dialcohols
composition of erythrodiol and uvaol in the sample under the conditions specified in this part of
ISO 12228
Note 1 to entry: The composition is expressed as a percentage of all peak areas, beginning with cholesterol and
ending with uvaol (see Table 1) under the conditions specified in this part of ISO 12228, normalized to 100 %.
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4 Principle
A test portion is saponified by boiling under reflux with an ethanolic potassium hydroxide solution. The
unsaponifiable matter is extracted with diethyl ether. The sterol and triterpene dialcohol fractions are
separated from the unsaponifiable matter by thin-layer chromatography on a basic silica gel plate. The
qualitative and quantitative compositions of the sterol and triterpene dialcohol fractions are determined
by gas chromatography of the trimethylsilyl ethers using cholestanol as internal standard.
5 Reagents
WARNING — Attention is drawn to the regulations which specify the handling of hazardous
substances. Technical, organizational and personal safety measures shall be followed.
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise stated, and water complying with
[1]
grade 3 of ISO 3696.
5.1 Potassium hydroxide, minimum mass fraction w = 85 g/100 g.
5.2 Potassium hydroxide, ethanolic solution, amount concentration, c, approximately 2 mol/l.
While cooling, dissolve 130 g of potassium hydroxide (5.1) in 200 ml of distilled water and then make up
to 1 l with ethanol (5.9). Keep the solution in well-stoppered dark glass bottles and store for a maximum
of 2 d.
5.3 Potassium hydroxide, ethanolic solution, amount concentration, c, approximately 0,2 mol/l.
Dissolve 13 g of potassium hydroxide (5.1) in 20 ml of distilled water and make up to 1 l with ethanol
(5.9).
5.4 Diethyl ether, for chromatography.
WARNING — Diethyl ether is highly flammable and can form explosive peroxides. Explosive
limits in air are 1,7 % to 48 % (volume fraction). Take special precautions when using it.
5.5 Anhydrous sodium sulfate.
5.6 Silica gel thin-layer chromatography (TLC) plates, commercially available, dimensions
20 cm × 20 cm, thickness of layer 0,25 mm, without fluorescence indicator.
5.7 Acetone, for chromatography.
5.8 n-Hexane, for chromatography.
5.9 Ethanol 96 %, minimum volume fraction φ = 95 %.
5.10 Ethyl acetate.
5.11 Reference solution for thin-layer chromatography, cholesterol or mixture of phytosterols, and
erythrodiol solution in ethyl acetate (5.10), mass concentration, ρ = 5 %.
5.12 2,7-dichlorofluorescein, ethanolic solution, mass concentration, ρ = 0,2 %.
Make slightly basic by adding a few drops of 2 mol/l alcoholic potassium hydroxide solution (5.2). Store
for a maximum of 1 year.
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5.13 α-cholestanol internal standard solution, mass concentration, ρ = 0,2 g/100 ml, in ethyl acetate
(5.10).
5.14 Phenolphthalein solution, mass concentration, ρ = 10 g/l, in ethanol (5.9).
5.15 Carrier gas for gas chromatography, helium or preferably hydrogen.
5.16 Auxiliary gases for gas chromatography, hydrogen, helium, nitrogen, and air.
5.17 Developing solvent, mixture of n-hexane and diethyl ether, volume concentrations are: σ(n-
hexane) = 65 ml/100 ml, σ(diethyl ether) = 35 ml/100 ml.
5.18 Hexamethyldisilazane.
5.19 Trimethylchlorosilane.
5.20 Silylation reagent, mixture of pyridine, hexamethyldisilazane, and trimethylchlorosilane.
Volume concentration σ(pyridine) = 9 ml/13 ml, σ(hexamethyl disilazane) = 3 ml/13 ml,
σ(trimethylchlorosilane) = 1 ml/13 ml. Prepare the mixture fresh daily.
NOTE Other silylation reagents can be used, e. g., mixture of N,O-bis-trimethylsilyl-trifluoroacetamide
(BSTFA) and trimethylchlorosilane (TMCS), σ(BSTFA) = 99 ml/100 ml and σ(TMSC) = 1 ml/100ml.
6 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
6.1 Round-bottomed flasks, of 250 ml, with ground neck.
6.2 Reflux condenser, with ground glass joint to fit the flask (6.1).
6.3 Separating funnel, of 500 ml capacity.
6.4 Developing tank, made of glass, with a ground glass lid, suitable for use with plates of dimensions
20 cm × 20 cm.
6.5 Ultraviolet lamp, wavelength of 366 nm or 254 nm.
6.6 Microsyringe, to deliver 100 µl, 500 µl, and 1000 µl.
6.7 Cylindrical filter funnel, with sintered-glass filter (G3, porosity 15 µm to 40 µm), diameter
approximately 2 cm, depth 5 cm, suitable for filtration under vacuum with male ground glass joint.
6.8 Conical flask, for operation under a vacuum, 50 ml with ground glass female joint to fit to the filter
funnel (6.7).
6.9 Test tube, 10 ml with a tapering bottom and a sealing glass stopper.
6.10 Gas chromatograph, for capillary columns, with split injector, consisting of:
— column oven, capable of maintaining the temperature with an accuracy of ±1°C;
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— temperature-controlled injection unit, with persilanised glass vaporising element and split
system;
— flame ionization detector (FID);
— data acquisition system.
6.11 Capillary column, made of fused silica, length 20 m to 30 m, internal diameter 0,25 mm to 0,32 mm,
coated with 5 % Diphenyl, 95 % Dimethyl polysiloxane (SE-52 or SE-54 or equivalent stationary phase),
with a temperature limit of at least 280 °C to 300 °C, film thickness between 0,1 µm and 0,30 µm.
6.12 Microsyringe for gas chromatography, of 1 µl and 10 µl capacity, for gas chromatography, with
cemented needle suitable for split injection.
6.13 Desiccator, containing an efficient desiccant, for storing the plates, e.g. calcium dichloride.
6.14 Oven, maintained at 103 °C ± 2 °C.
6.15 Rotary evaporator, attached to a vacuum pump and water bath maintained at 40 °C.
6.16 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 0,001 g and displaying 0,000 1 g.
7 Sample
7.1 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this part of ISO 12228. A recommended sampling method
[2]
is given in ISO 5555.
It is important that the laboratory receives a sample which is truly representative and has not been
damaged or changed during transport or storage.
7.2 Preparation of the test sample
Prepare the test sample in accordance with ISO 661. Dry the samples if necessary by filtration.
8 Procedure
8.1 Test portion
By means of a micro syringe (6.6), fill 500 µl (for olive oils) or 1 500 µl (for olive pomace oils) of the
internal standard solution (5.13) in a 250 ml flask (6.1). Evaporate until dryness with a gentle current of
nitrogen in a warm water bath and cool the flask.
Weigh, to the nearest 10 mg, about 5 g of olive or olive pomace oil into the same flask and proceed with
8.2.
NOTE Olive (pomace) oils, containing appreciable quantities of cholesterol, might show a peak having a
retention time identical to cholestanol. In these cases, the sterol fraction shall be analysed in duplicate with and
without the addition of the internal standard.
8.2 Preparation of unsaponifiable matter
8.2.1 Add 50 ml of 2 mol/l ethanolic potassium hydroxide solution (5.2) and some pumice stones, fit
the reflux condenser, and heat to gentle boiling until the solution becomes clear (end of saponification).
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Continue heating for a further 20 min, add 50 ml of distilled water through the top of the condenser,
detach the condenser, and cool the flask to approximately 30 °C.
8.2.2 Transfer the contents of the flask quantitatively into a 500 ml separating funnel (6.3) using several
portions of distilled water (50 ml). Add approximately 80 ml of diethyl ether (5.4), shake vigorously for
approximately 60 s, periodically releasing the pressure by inverting the separating funnel and opening
the stopcock. Allow to stand until the separation of two phases is complete.
Draw off the soap solution as completely as possible into a second separating funnel. Perform two further
extractions on the water-alcohol phase in the same way using 60 ml to 70 ml of diethyl ether (5.4).
Emulsions shall be destroyed by adding small quantities of ethanol (5.9) and swirling gently.
8.2.3 Combine the three diethyl ether extracts in one separating funnel containing 50 ml of water.
Continue to wash with water (50 ml) until the wash water no longer turns pink on the addition of a drop
of phenolphthalein solution (5.14).
After the removal of the wash water, filter through anhydrous sodium sulfate (5.5) into a previously
weighed 250 ml flask, washing the funnel and filter with small quantities of diethyl ether (5.4).
8.2.4 Evaporate the solvent with a rota
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 12228-2
Première édition
2014-10-01
Détermination de la teneur en stérols
individuels et totaux — Méthode par
chromatographie en phase gazeuse —
Partie 2:
Huile d’olive et huile de grignons
d’olive
Determination of individual and total sterols contents — Gas
chromatographic method —
Part 2: Olive oils and olive pomace oils
Numéro de référence
ISO 12228-2:2014(F)
©
ISO 2014
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ISO 12228-2:2014(F)
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sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
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Publié en Suisse
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Réactifs . 2
6 Appareillage . 3
7 Échantillon . 4
7.1 Échantillonnage . 4
7.2 Préparation de l’échantillon pour essai . 4
8 Mode opératoire. 5
8.1 Prise d’essai . 5
8.2 Préparation de l’insaponifiable. 5
8.3 Séparation de la fraction stérolique et des dialcools triterpéniques (érythrodiol, uvaol)
par CCM . 6
8.4 Préparation des triméthylsilyléthers . 6
8.5 Analyse par chromatographie en phase gazeuse . 7
9 Expression des résultats. 8
9.1 Évaluation quantitative . 8
9.2 Détermination de la teneur en stérols totaux . 9
9.3 Composition des stérols . 9
9.4 Composition des dialcools triterpéniques . 9
10 Fidélité .10
10.1 Essai interlaboratoires .10
10.2 Limite de répétabilité, r .10
10.3 Limite de reproductibilité, R .10
11 Rapport d’essai .10
Annexe A (informative) Figures .11
Annexe B (informative) Essai interlaboratoires .14
Bibliographie .18
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ISO 12228-2:2014(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration
du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par
l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de
la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de l’OMC concernant
les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos — Informations
supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 11, Corps gras d’origines animale et végétale.
Cette première édition de l’ISO 12228-2 annule et remplace l’ISO 12228:1999, qui a fait l’objet d’une
révision technique.
L’ISO 12228 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Détermination de la teneur
en stérols individuels et totaux — Méthode par chromatographie en phase gazeuse:
— Partie 1: Corps gras d’origines animale et végétale
— Partie 2: Huile d’olive et huile de grignons d’olive
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NORME INTERNATIONALE ISO 12228-2:2014(F)
Détermination de la teneur en stérols individuels et
totaux — Méthode par chromatographie en phase
gazeuse —
Partie 2:
Huile d’olive et huile de grignons d’olive
1 Domaine d’application
La présente partie de l’ISO 12228 spécifie un mode opératoire de détermination de la teneur et de la
composition des stérols et des dialcools triterpéniques contenus dans l’huile d’olive et l’huile de grignons
d’olive par chromatographie en phase gazeuse. Pour déterminer la teneur et la composition des stérols
dans tout autre corps gras d’origine animale ou végétale, l’ISO 12228-1 doit être utilisée.
NOTE La présente partie de l’ISO 12228 est techniquement identique à la norme du Conseil Oléicole
International COI/T.20/Doc. n° 30 (novembre 2011).
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 661, Corps gras d’origines animale et végétale — Préparation de l’échantillon pour essai
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
composition des stérols
composition des stérols individuels contenus dans l’échantillon, en commençant par le cholestérol et en
terminant par le ∆7-avénastérol (voir Tableau 1) dans les conditions spécifiées par la présente partie de
l’ISO 12228
Note 1 à l’article: La composition est exprimée en pourcentage de la somme de toutes les aires de pic, ramenée à
100 %.
3.2
teneur en stérols totaux
fraction massique de la somme de tous les stérols individuels, déterminée selon la méthode spécifiée
dans la présente partie de l’ISO 12228, en commençant par le cholestérol et en terminant par le
∆7-avénastérol (voir Tableau 1), divisée par la masse de la prise d’essai
Note 1 à l’article: La teneur est exprimée en milligrammes par kilogramme.
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ISO 12228-2:2014(F)
3.3
composition des dialcools triterpéniques
composition de l’érythrodiol et de l’uvaol dans l’échantillon dans les conditions spécifiées par la présente
partie de l’ISO 12228
Note 1 à l’article: La composition est exprimée en pourcentage de la somme des aires de pic, en commençant par
le cholestérol et en terminant par l’uvaol (voir Tableau 1) dans les conditions spécifiées par la présente partie de
l’ISO 12228, ramenée à 100 %.
4 Principe
Saponification d’une prise d’essai par une solution éthanolique d’hydroxyde de potassium à ébullition
sous reflux. Extraction de l’insaponifiable par l’éther diéthylique. Séparation des fractions contenant
les stérols et les dialcools triterpéniques de l’insaponifiable par chromatographie sur couche mince
(CCM) sur plaque de gel de silice basique. Détermination de la composition qualitative et quantitative
des fractions contenant les stérols et les dialcools triterpéniques par chromatographie en phase gazeuse
des triméthylsilyléthers en utilisant du cholestanol comme étalon interne.
5 Réactifs
AVERTISSEMENT — L’attention des lecteurs est attirée sur les règles qui spécifient la manipulation
des substances dangereuses. Les mesures de sécurité sur les plans technique, organisationnel et
personnel doivent être suivies.
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l’eau
[1]
de qualité 3 conformément à l’ISO 3696.
5.1 Hydroxyde de potassium, avec une fraction massique d’au moins w = 85 g/100 g.
5.2 Hydroxyde de potassium, solution éthanolique, avec une concentration, c, d’environ 2 mol/l.
Dissoudre 130 g d’hydroxyde de potassium (5.1), en refroidissant, dans 200 ml d’eau distillée et compléter
à 1 l avec de l’éthanol (5.9). Conserver la solution dans des flacons en verre opaque bien bouchés pendant
2 jours au maximum.
5.3 Hydroxyde de potassium, solution éthanolique, avec une concentration, c, d’environ 0,2 mol/l.
Dissoudre 13 g d’hydroxyde de potassium (5.1) dans 20 ml d’eau distillée et compléter à 1 l avec de
l’éthanol (5.9).
5.4 Éther diéthylique, pour chromatographie.
AVERTISSEMENT — L’éther diéthylique est hautement inflammable et peut engendrer la formation
de peroxydes explosifs. Les limites d’explosion dans l’air sont comprises entre 1,7 % et 48 %
(v/v). Des précautions particulières doivent être prises lors de l’utilisation de cette substance.
5.5 Sulfate de sodium anhydre.
5.6 Plaques de gel de silice pour chromatographie sur couche mince (CCM), disponibles dans le
commerce, de 20 cm × 20 cm, avec une épaisseur de couche de 0,25 mm, sans indicateur de fluorescence.
5.7 Acétone, pour chromatographie.
5.8 n-hexane, pour chromatographie.
5.9 Éthanol à 96 %, avec une fraction volumique d’au moins φ = 95 %.
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5.10 Acétate d’éthyle.
5.11 Solution de référence pour CCM, cholestérol ou mélange de phytostérols et solution d’érythrodiol
dans l’acétate d’éthyle (5.10), de concentration massique ρ = 5 %.
5.12 2,7-dichlorofluorescéine, solution éthanolique, de concentration massique ρ = 0,2 %.
La rendre légèrement basique par ajout de quelques gouttes de solution alcoolique d’hydroxyde de
potassium à 2 mol/l (5.2). Conserver pendant 1 an au maximum.
5.13 Solution étalon interne de α-cholestanol, de concentration massique ρ = 0,2 g/100 ml, dans
l’acétate d’éthyle (5.10).
5.14 Solution de phénolphtaléine, de concentration massique ρ = 10 g/l dans l’éthanol (5.9).
5.15 Gaz vecteur pour chromatographie en phase gazeuse, hélium ou, de préférence, hydrogène.
5.16 Gaz auxiliaires pour chromatographie en phase gazeuse, hydrogène, hélium, azote et air.
5.17 Solvant de développement, mélange de n-hexane et d’éther diéthylique, de concentrations
volumiques: σ(n-hexane) = 65 ml/100 ml, σ(éther diéthylique) = 35 ml/100 ml.
5.18 Hexaméthyldisilazane.
5.19 Triméthylchlorosilane.
5.20 Réactif silylant, mélange de pyridine, d’hexaméthyldisilazane et de triméthylchlorosilane.
Concentration volumique σ(pyridine) = 9 ml/13 ml, σ(hexaméthyldisilazane) = 3 ml/13 ml,
σ(triméthylchlorosilane) = 1 ml/13 ml. Préparer le mélange fraîchement chaque jour.
NOTE D’autres réactifs silylants peuvent être utilisés tels que, par exemple, un mélange N-O-bis-
triméthylsilytrifluoroacétamide (BSTFA) et triméthylchlorosilane (TMCS), σ(BSTFA) = 99 ml/100 ml et
σ(TMSC) = 1 ml/100 ml.
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Ballons à fond rond, de 250 ml, à col rodé.
6.2 Réfrigérant à reflux, muni d’un joint rodé s’adaptant aux ballons (6.1).
6.3 Ampoule à décanter, d’une capacité de 500 ml.
6.4 Cuve de développement, en verre, munie d’un couvercle en verre rodé, pouvant être utilisée avec
des plaques de 20 cm × 20 cm.
6.5 Émetteur ultraviolet, avec une longueur d’onde de 366 nm ou 254 nm.
6.6 Microseringue, d’une capacité de 100 µl, 500 µl et 1 000 µl.
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6.7 Entonnoir cylindrique pour filtration, muni d’un filtre en verre fritté (G3, d’une porosité de
15 µm à 40 µm), d’environ 2 cm de diamètre, de 5 cm de profondeur, adapté à la filtration sous vide avec
embout rodé mâle.
6.8 Fiole conique, pour fonctionnement sous vide, de 50 ml avec embout rodé femelle adaptable à
l’entonnoir pour filtration (6.7).
6.9 Tube à essai, de 10 ml, à fond conique avec bouchon hermétique en verre.
6.10 Chromatographe en phase gazeuse, équipé pour colonnes capillaires, muni d’un injecteur-
diviseur, constitué des éléments suivants:
— four, permettant de maintenir la température désirée avec une précision de ± 1° C;
— ensemble d’injection thermoréglable, avec insert en verre persilanisé et diviseur;
— détecteur à ionisation de flamme (FID);
— système d’acquisition de données.
6.11 Colonne capillaire, en silice fondue, de 20 m à 30 m de longueur, de 0,25 mm à 0,32 mm de diamètre
intérieur, revêtu d’une phase 5 %-diphényl- 95 % diméthyl-polysiloxane (phase stationnaire SE-52, SE-54
ou équivalent), avec une température limite d’au moins 280 °C à 300 °C, et une épaisseur comprise entre
0,1 µm et 0,30 µm.
6.12 Microseringue pour chromatographie en phase gazeuse, d’une capacité de 1 µl et 10 µl, avec
une aiguille rigide adaptée à l’injecteur-diviseur.
6.13 Dessiccateur, contenant un déshydratant pour la conservation des plaques, par exemple du
chlorure de calcium.
6.14 Étuve, maintenue à 103 °C ± 2 °C.
6.15 Évaporateur rotatif, relié à une pompe à vide, avec un bain-marie maintenu à 40 °C.
6.16 Balance analytique, capable de peser à 0,001 g près et d’afficher les valeurs à 0,000 1 g près.
7 Échantillon
7.1 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente partie de l’ISO 12228. Une
[[2]]
méthode d’échantillonnage recommandée est donnée dans l’ISO 5555.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, qui n’ait été ni
endommagé ni modifié lors du transport ou de la conservation.
7.2 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l’échantillon pour essai conformément à l’ISO 661. Si nécessaire, sécher l’échantillon par
filtration.
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ISO 12228-2:2014(F)
8 Mode opératoire
8.1 Prise d’essai
Au moyen d’une microseringue (6.6), introduire dans un ballon de 250 ml (6.1) 500 µl (pour l’huile
d’olive) ou 1 500 µl (pour l’huile de grignons d’olive) de solution étalon interne (5.13). Évaporer sous un
léger courant d’azote dans un bain d’eau chaude jusqu’à dessiccation puis refroidir le flacon.
Peser, à 10 mg près, environ 5 g d’huile d’olive ou d’huile de grignons d’olive dans le même ballon et
passer à l’étape 8.2.
NOTE Dans le cas d’huiles d’olive ou de grignons d’olive contenant des quantités importantes de cholestérol,
il est possible qu’un pic ayant un temps de rétention identique à celui du cholestanol apparaisse. Le cas échéant, la
fraction stérolique doit être analysée en duplicata, avec et sans étalon interne.
8.2 Préparation de l’insaponifiable
8.2.1 Ajouter 50 ml de solution éthanolique d’hydroxyde de potassium à 2 mol/l (5.2) et de la pierre
ponce. Relier le réfrigérant à reflux et porter le contenu du ballon à légère ébullition jusqu’à ce que la
solution devienne limpide (fin de la saponification). Continuer à chauffer pendant 20 min supplémentaires
puis verser 50 ml d’eau distillée du haut du réfrigérant. Débrancher le réfrigérant et laisser refroidir le
ballon jusqu’à environ 30 °C.
8.2.2 Transvaser le contenu du ballon quantitativement dans une ampoule à décanter de 500 ml (6.3) en
faisant plusieurs lavages à l’eau distillée (50 ml). Ajouter environ 80 ml d’éther diéthylique (5.4) et agiter
énergiquement durant environ 60 s. Décompresser régulièrement en retournant l’ampoule à décanter et
en ouvrant le robinet. Laisser reposer jusqu’à complète séparation des deux phases.
Extraire la solution savonneuse le plus complètement possible dans une deuxième ampoule à décanter.
Procéder à deux autres extractions sur la phase hydro-alcoolique de la même manière au moyen du
60 ml à 70 ml d’éther diéthylique (5.4).
Les émulsions peuvent être éliminées en ajoutant de petites quantités d’éthanol (5.9) et en agitant
doucement par mouvements circulaires.
8.2.3 Verser les trois extraits éthérés dans une seule ampoule à décanter contenant 50 ml d’eau. Laver
à l’eau (50 ml) jusqu’à ce que la coloration rose de l’eau disparaisse lorsqu’une goutte de solution de
phénolphtaléine est ajoutée (5.14).
Après élimination de l’eau de lavage, filtrer sur du sulfate de sodium anhydre (5.5) dans un ballon de
250 ml préalablement pesé, en lavant l’ampoule et le filtre avec de petites quantités d’éther diéthylique
(5.4).
8.2.4 Évaporer le solvant avec un évaporateur rotatif à 30 °C sous vide. Ajouter 5 ml d’acétone (5.7) et
éliminer complètement le solvant volatil sous un léger courant d’air. Sécher le résidu à l’étuve (6.14) à
103 °C ± 2 °C pendant 15 min. Faire refroidir dans un dessiccateur et peser à 0,1 mg près.
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8.3 Séparation de la fraction stérolique et des dialcools triterpéniques (érythrodiol,
uvaol) par CCM
8.3.1 Immerger les plaques de gel de silice (5.6) dans environ 4 cm de solution éthanolique d’hydroxyde
de potassium à 0,2 mol/l (5.3) pendant 10 s puis les laisser sécher sous une hotte aspirante pendant deux
heures avant de les placer dans une étuve à 100 °C pendant 1 h.
Retirer les plaques de l’étuve et les placer dans un dessiccateur (6.13) jusqu’au moment de l’emploi (les
plaques doivent être utilisées dans les 15 jours).
NOTE Lorsque des plaques de gel de silice basiques sont utilisées pour la séparation de la fraction stérolique,
tous les composés de nature acide (acides gras et autres) sont retenus sur la ligne de dépôt et la bande des stérols
se distingue nettement de la bande des alcools aliphatiques et triterpéniques.
8.3.2 Remplir la cuve de développement (6.4) sur une profondeur d’environ 1 cm de solvant de
développement (5.17). Fermer la cuve à l’aide du couvercle et laisser ainsi pendant au moins une demi-
heure, dans un endroit frais, de façon que l’équilibre liquide/vapeur s’établisse. Il convient de placer
des bandes de papier filtre sur la surface intérieure de la cuve et de les faire tremper dans l’éluant afin
de réduire d’un tiers environ le temps de développement. De plus, cette mesure permet d’obtenir une
meilleure élution des composants.
Afin d’avoir des conditions d’élution plus reproductibles, le mélange doit être changé à chaque essai. Un
mélange de n-hexane et d’éther diéthylique (concentration volumique σ = 50 ml/100 ml) peut également
être utilisé comme solvant de développement.
8.3.3 Préparer une solution à 5 % d’insaponifiable (8.2.4) dans l’acétate d’éthyle (5.10). Au moyen de la
microseringue de 100 µl, déposer 0,3 ml de cette solution sous forme de bande, à une distance de 2 cm du
bord inférieur d’une plaque de CCM (5.6). Laisser un espace d’au moins 3 cm de chaque bord de la plaque.
Appliquer une goutte de 5 μl de solution de référence pour CCM (5.11) à 1,5 cm du bord.
8.3.4 Mettre la plaque dans la cuve de développement préparée comme indiqué en 8.3.2 et procéder
au développement jusqu’à ce que le solvant arrive à environ 1 cm à 2 cm du bord supérieur de la plaque
de CCM. Il convient que la température ambiante soit maintenue constante. Ôter la plaque de la cuve et
laisser le solvant s’évaporer sous une hotte aspirante.
8.3.5 Vaporiser légèrement et uniformément la plaque avec la solution de 2,7-dichlorofluorescéine
(5.12) et laisser sécher. Observer la plaque sous lumière ultra-violette (6.5) et identifier les bandes des
stérols et des dialcools triterpéniques à l’aide des taches obtenues pour la solution de référence (5.11).
Marquer les zones à hauteur des taches obtenues pour les étalons avec un crayon noir (voir Figure A.1).
8.3.6 Gratter entièrement la zone délimitée avec une spatule et recueillir quantitativement la silice dans
l’entonnoir pour filtration (6.7). Ajouter 10 ml d’acétate d’éthyle chaud (5.10), mélanger soigneusement
avec la spatule métallique et filtrer sous vide en recueillant le filtrat dans une fiole conique (6.8) reliée à l’
entonnoir pour filtration. Laver le résidu dans la fiole par trois fois avec 10 ml d’éther diéthylique (5.4) et
filtrer dans la même fiole adaptée à l’entonnoir. Évaporer les extraits d’éther combinés jusqu’à un volume
de 4 ml à 5 ml, transvaser la solution résiduelle dans le tube à essai de 10 ml (6.9) pesé au préalable et
éliminer le solvant en appliquant un léger courant d’azote. Ajouter quelques gouttes d’acétone (5.7) et
l’évaporer jusqu’au séchage. Le résidu contenu dans le tube à essai est constitué des fractions des stérols
et des dialcools triterpéniques.
8.4 Préparation des triméthylsilyléthers
8.4.1 Ajouter le réactif silylant (5.20) dans le tube à essai. Utiliser 50 µl de réactif pour 1 mg de stérols
et de dialcools triterpéniques.
NOTE Des solutions prêtes à l’emploi sont disponibles dans le commerce. La pyridine peut être remplacée par
l’acétonitrile.
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8.4.2 Boucher le tube, agiter soigneusement jusqu’à solubilisation complète. Laisser reposer pendant
au moins 15 min à température ambiante puis centrifuger pendant quelques minutes. La solution limpide
est prête pour l’analyse par chromatographie en phase gazeuse.
Lors de l’utilisation d’hexaméthyldisilazane et de triméthylchlorosilane, une légère opalescence peut
apparaître. La formation d’une floculation blanche ou l’apparition d’une coloration rose sont les indices
de la présence d’humidité ou de l’altération du réactif. Dans ce cas, l’essai doit être répété.
8.5 Analyse par chromatographie en phase gazeuse
8.5.1 Conditions de chromatographie en phase gazeuse
Optimiser le programme de température et le débit du gaz vecteur, de façon à obtenir des
chromatogrammes similaires à ceux des Figures A.2 et A.3. Faire un essai de séparation à l’aide des
fractions de stérols silylés provenant d’huiles connues (voir Tableau 1).
Les paramètres suivants ont fait l’objet d’essais et se sont révélés satisfaisants:
— température de la colonne: (260 ± 5) °C;
— température de l’injecteur: (280 à 300) °C;
— température du détecteur: (280 à 300) °C;
— vitesse linéaire du gaz vecteur: hélium: 20 cm/s à 35 cm/s, hydrogène: 30 cm/s à 50 cm/s;
— ratio de division: 1:50 à 1:100;
— volume d’injection: 0,5 µl à 1,0 µl de solution de triméthylsilyléthers;
— le temps de rétention du ß-sitostérol doit être de (20 ± 5) min;
— le pic du campestérol dans l’huile d’olive avec une teneur moyenne de 3 % doit représenter (20 ± 5) %
de la pleine échelle;
— le pic du campestérol dans l’huile de soja avec une teneur moyenne de 20 % doit représenter
(80 ± 10) % de la pleine échelle.
— tous les stérols présents doivent être séparés et leurs pics complètement résolus.
NOTE Effectuer un essai à blanc afin de dépister une contamination éventuelle (par exemple, du cholestérol
provenant des solvants, parois de verre, filtre, empreintes de doigts, etc).
Injecter 0,5 µl à 1 µl d’échantillon dans le chromatographe en phase gazeuse. Un injecteur automatique
peut également être employé.
Enregistrer les chromatogrammes jusqu’à élution complète des dialcools triterpéniques. Une ligne de
base horizontale, sans dérive positive ou négative, doit être obtenue.
8.5.2 Identification des pics
Identifier les pics individuels à l’aide des temps de rétention relatif (TRR) et par comparaison avec un
mélange de stérols et de dialcools triterpéniques préparé et analysé dans les mêmes conditions.
Les stérols et les dialcools triterpéniques sont élués conformément au Tableau 1, qui donne également les
TRR. Les TRR correspondants au ß-sitostérol avec les phases stationnaires SE-52 et SE-54 sont donnés
dans le Tableau 1.
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Tableau 1 — Identification des pics de CPG des stérols individuels, de l’érythrodiol et de l’uvaol
par TRR avec les phases stationnaires SE-52 et SE-54, sur la base du ß-sitostérol
Ordre TRR TRR
Nom usuel des stérols Nom sy
...
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