ISO 16387:2023
(Main)Soil quality — Effects of contaminants on Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) — Determination of effects on reproduction
Soil quality — Effects of contaminants on Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) — Determination of effects on reproduction
This document specifies one of the methods for evaluating the habitat function of soils and determining effects of soil contaminants and substances on the reproduction of Enchytraeus sp. by dermal and alimentary uptake in a chronic test. It is applicable to soils and soil materials of unknown quality, for example, from contaminated sites, amended soils, soils after remediation, agricultural or other sites under concern and waste materials. This document provides information on how to use this method for testing substances under temperate conditions. The method is not applicable to substances, for which the air/soil partition coefficient is greater than 1, or to substances for which the vapour pressure exceeds 300 Pa at 25 °C. NOTE No provision is made in the test method for monitoring the persistence of the substance under test.
Qualité du sol — Effets des contaminants sur les Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) — Détermination des effets sur la reproduction
Le présent document spécifie l’une des méthodes permettant d’évaluer la fonction d’habitat des sols et de déterminer les effets des contaminants du sol et des substances sur la reproduction d’Enchytraeus sp. par absorption cutanée et ingestion au cours d’un essai chronique. Il est applicable aux sols et aux matériaux de type sol de qualité inconnue provenant, par exemple, de sites contaminés, de sols amendés, de sols après remédiation, de sols agricoles ou d’autres sites d’intérêt, et de déchets. Le présent document fournit des informations sur la manière d’utiliser cette méthode pour évaluer des substances en conditions tempérées. Cette méthode ne s’applique pas aux substances pour lesquelles le coefficient de partage air/sol est supérieur à 1, ou pour lesquelles la pression de vapeur à 25 °C est supérieure à 300 Pa. NOTE La méthode d’essai ne contient aucune disposition permettant de surveiller la persistance de la substance soumise à essai.
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16387
Third edition
2023-03
Soil quality — Effects of contaminants
on Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) —
Determination of effects on
reproduction
Qualité du sol — Effets des contaminants sur les Enchytraeidae
(Enchytraeus sp.) — Détermination des effets sur la reproduction
Reference number
ISO 16387:2023(E)
© ISO 2023
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 16387:2023(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2023
All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may
be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on
the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below
or ISO’s member body in the country of the requester.
ISO copyright office
CP 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Geneva
Phone: +41 22 749 01 11
Email: copyright@iso.org
Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii
© ISO 2023 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 16387:2023(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 3
5 Reagents and material . 3
6 Apparatus . 6
7 Test environment . 6
8 Procedure .7
8.1 Experimental design . 7
8.1.1 General . 7
8.1.2 Range-finding test . 7
8.1.3 Definitive test . 7
8.2 Preparation of test mixtures . 8
8.2.1 Testing contaminated soil . 8
8.2.2 Testing substances added to the test substrate . 8
8.2.3 Preparation of control container . 9
8.3 Addition of food . 9
8.4 Addition of the biological material . 9
8.5 Test conditions and measurements . 9
8.6 Reference substance . 9
9 Calculation and expression of results .10
9.1 Calculation . 10
9.2 Expression of results . . 10
10 Validity of the test .10
11 Statistical analysis .10
11.1 General . 10
11.2 Range-finding test . 10
11.3 Definitive test . 11
12 Test report .11
Annex A (informative) Conditions for culture of Enchytraeus sp .13
Annex B (informative) Test procedure using other Enchytraeus species .15
Annex C (normative) Determination of total water holding capacity .17
Annex D (informative) Detailed description of extraction techniques .18
Annex E (informative) Overview of the statistical assessment of data (NOEC determination) .20
Bibliography .21
iii
© ISO 2023 – All rights reserved
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 16387:2023(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to
the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see
www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,
Biological characterization, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN)
Technical Committee CEN/TC 444, Environmental characterization of solid matrices, in accordance with
the Agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This third edition cancels and replaces the second edition (ISO 16387:2014), which has been technically
revised.
The main changes are as follows:
— correction of the vapor pressure value to update Clause 1 according to the recommendations of
ECHA/OECD;
— addition (in Annex D) of an extraction method of enchytraeids with colloidal silica, suitable for
Enchytraeus crypticus.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iv
© ISO 2023 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 16387:2023(E)
Introduction
Ecotoxicological test systems are applied to obtain information about the effects of contaminants in
[38]
soil and are proposed to complement conventional chemical analysis. ISO 15799 includes a list and
short characterization of recommended and standardized test systems. Aquatic test systems with soil
eluate are applied to obtain information about the fraction of contaminants potentially reaching the
groundwater by the water path (retention function of soils), whereas terrestrial test systems are used
to assess the habitat function of soils. For the latter, a standardized test system using Enchytraeidae (a
chronic test with end-point reproduction) is proposed.
This document describes a method that is based on the determination of acute and sublethal effects of
contaminated soils to adult Enchytraeidae of the genus Enchytraeus. Optionally, the method can be used
for testing substances added to standard soils (e.g. artificial soil) for their sublethal hazard potential to
Enchytraeidae.
Soil-dwelling annelids of the genus Enchytraeus are ecologically relevant, i.e. they are abundant in
many soils where earthworms are scarce but can also reach high population densities in soils well
inhabited by earthworms. Enchytraeidae can be used in laboratory tests as well as in semi-field and
field studies. From a practical point of view, many Enchytraeus species are easy to handle and breed,
and their generation time is significantly shorter than that of earthworms [the test duration for a
reproduction test with Enchytraeidae is four weeks to six weeks, compared to eight weeks (12 weeks
including synchronization) with earthworms]. In addition, a much smaller volume of soil is needed in
the enchytraeid test compared to the amount needed in earthworm tests.
This document has been drawn up taking into consideration test procedures recommended by the
[24],[25]
Organization for Economic Co-operation and Development (OECD ).
v
© ISO 2023 – All rights reserved
---------------------- Page: 5 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 16387:2023(E)
Soil quality — Effects of contaminants on Enchytraeidae
(Enchytraeus sp.) — Determination of effects on
reproduction
1 Scope
This document specifies one of the methods for evaluating the habitat function of soils and determining
effects of soil contaminants and substances on the reproduction of Enchytraeus sp. by dermal and
alimentary uptake in a chronic test. It is applicable to soils and soil materials of unknown quality, for
example, from contaminated sites, amended soils, soils after remediation, agricultural or other sites
under concern and waste materials.
This document provides information on how to use this method for testing substances under temperate
conditions.
The method is not applicable to substances, for which the air/soil partition coefficient is greater than 1,
or to substances for which the vapour pressure exceeds 300 Pa at 25 °C.
NOTE No provision is made in the test method for monitoring the persistence of the substance under test.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 10390, Soil, treated biowaste and sludge – Determination of pH
ISO 10694, Soil quality — Determination of organic and total carbon after dry combustion (elementary
analysis)
ISO 11260, Soil quality — Determination of effective cation exchange capacity and base saturation level
using barium chloride solution
ISO 11277, Soil quality — Determination of particle size distribution in mineral soil material — Method by
sieving and sedimentation
ISO 11465, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis — Gravimetric
method
ISO 18400-206, Soil quality — Sampling — Part 206: Collection, handling and storage of soil under aerobic
conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
1
© ISO 2023 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 16387:2023(E)
3.1
reproduction
mean number of offspring per test vessel after incubation under the specified test conditions
Note 1 to entry: The test period for the determination of the reproduction (definitive test) is six weeks.
Note 2 to entry: Offspring refers to hatched juvenile enchytraeids.
3.2
ECx
effect concentration for x % effect
concentration (mass fraction) of a test substance that causes x % of an effect on a given endpoint within
a given exposure period when compared with a control
EXAMPLE An EC is a concentration estimated to cause an effect on a test end point in 50 % of an exposed
50
population over a defined exposure period.
Note 1 to entry: The ECx is expressed as a percentage of soil to be tested (dry mass) per soil mixture (dry mass).
When substances are tested, the ECx is expressed as mass of the test substance per dry mass of soil, in milligrams
per kilogram.
3.3
LOEC
lowest observed effect concentration
lowest test substance concentration that has a statistically significant effect (probability p < 0,05)
Note 1 to entry: In this test, the LOEC is expressed as a mass of test substance per dry mass of the soil to be
tested. All test concentrations above the LOEC should usually show an effect that is statistically different from
the control.
3.4
NOEC
no observed effect concentration
highest test substance concentration immediately below the LOEC (3.3) at which no effect is observed
Note 1 to entry: In this test, the concentration corresponding to the NOEC, has no statistically significant effect
(p < 0,05) within a given exposure period when compared with the control.
3.5
test mixture
mixture of contaminated soil or test substance (e.g. chemical, biosolid, waste) with control soil (3.10)
3.6
test mixture ratio
ratio between the soil to be tested and the control soil (3.10) in a test mixture (3.5)
3.7
contaminant
substance or agent present in the soil as a result of human activity
3.8
reference soil
uncontaminated soil with comparable pedological properties (nutrient concentrations, pH, organic
carbon content and texture) to the soil being studied
3.9
standard soil
field-collected soil or artificial soil whose main properties (pH, texture, organic matter content) are
within a known range
EXAMPLE Euro soils, artificial soil, LUFA Standard soil.
Note 1 to entry: The properties of standard soils can differ from the soil to be tested.
2
© ISO 2023 – All rights reserved
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 16387:2023(E)
3.10
control soil
reference (3.8) or standard soil (3.9) used as a control and as a medium for preparing dilution series
with soils to be tested or a reference substance, which fulfils the validity criteria
Note 1 to entry: In the case of natural soil, it is advisable to demonstrate its suitability for a test and for achieving
the test validity criteria before using the soil in a definitive test.
4 Principle
The effects on survival and reproduction of adult Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) exposed to a dilution
range of contaminated soil or range of concentrations of a test substance are determined. Test mixtures
are prepared at the start of the test and are not renewed within the test period.
The test can be divided into two distinct steps: a short (two weeks) test in which the range of toxic
effects (mainly mortality) is determined, and a long-term (six weeks) definitive test in which the
survival of parental worms and the fecundity (number of juveniles) are measured. The results obtained
from the tests are compared with a control and are used to determine the dilutions or concentrations
which cause no effects on survival and reproduction (NOEC) and the concentration (dilution) resulting
in x % reduction of juveniles hatched from cocoons compared to the control (ECx, 42 d).
All test dilutions/concentrations above the LOEC have a harmful effect equal to, or greater than that
observed at the LOEC. Where there is no prior knowledge of the dilution/concentration of the test
substance likely to have an effect, then it is useful to conduct the test in two steps:
— an acute toxicity test (range-finding test) to give an indication of the effect dilution/concentration,
and the dilution/concentration giving no mortality (NOEC). Dilutions/concentrations to be used in
the definitive test can then be selected;
— a definitive test on reproduction to determine sublethal effects of (dilutions of) contaminated
soil or the concentration of a substance which, when evenly mixed into the standard soil, causes
no significant effects on numbers of offspring hatched from cocoons compared with the control
(NOEC), and the lowest concentration causing effects (LOEC).
NOTE A suitable reference soil is used to demonstrate the appropriate status of the test population and to
avoid misinterpretation of results.
Effects of substances are assessed using a standard soil, preferably a defined artificial soil substrate.
For contaminated soils, the effects are determined in the soil to be tested and in a control soil. According
to the objective of the study, the control and dilution substrate (dilution series of contaminated soil) are
either an uncontaminated soil comparable to the soil to be tested (reference soil) or a standard soil (e.g.
artificial soil).
5 Reagents and material
5.1 Biological material, recommended test species is Enchytraeus albidus Henle 1837 (white
potworm; Enchytraeidae, subclass: Oligochaeta, phylum: Annelida). E. albidus is one of the largest
enchytraeid species, measuring 15 mm to 40 mm, and has a world-wide distribution (see, for example,
References [22] and [32]). It can be easily recognized by two characteristics: four setae per bundle
ventrally, and the very long seminal duct in the clitellum region as well as some segments behind
it. The species can be found in marine, limnic and terrestrial habitats, mainly in decaying organic
matter (seaweed, compost) and only rarely in meadows. This broad ecological tolerance and some
morphological variations indicate that the species probably consists of several races (or ecotypes).
E. albidus can be obtained commercially, since it is sold as food for fish. It should be verified whether
such a culture is contaminated by other, usually smaller species (see, for example, References [7], [10]
and [33]). If contamination of the culture occurs, all worms are washed in water in a Petri dish. With
the help of a stereomicroscope, large adult specimens of E. albidus are selected to start a new culture.
All other worms of the original culture are discarded. E. albidus can be bred easily in a wide range of
3
© ISO 2023 – All rights reserved
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 16387:2023(E)
organic materials (see Annex A) and has a short life cycle, reaching maturity between 33 d (at 18 °C)
and 74 d (at 12 °C). Only cultures which have been kept in the laboratory for at least five weeks (one
generation cycle) without problems shall be used for testing purposes.
Other species of the genus Enchytraeus, especially the true soil-inhabiting but smaller species E. crypticus
Westheide and Graefe 1992 or E. buchholzi Vejdovsky 1879, are also suitable as test organisms (see
Annex B). If other species of Enchytraeus are used, they shall be clearly identified and the rationale for
the selection of the species as well as deviations of the experimental method should be reported in this
case.
The worms used in the tests should be adult with eggs (white spots) in the clitellum region and
should have approximately the same size (approximately 15 mm for E. albidus). A synchronisation of
the breeding culture is not necessary. The Enchytraeidae should be acclimatised in the reference soil,
the standard soil or the untreated artificial soil under test conditions for at least 24 h prior to testing.
During this period, the same food which is used as a food source in the test should be given in sufficient
amount.
For one test, an excess number of adult clitellate worms should be taken from the culture box without
observing them in detail in order to get enough suitable worms. At the end of the acclimatization period,
only worms with eggs and behaving as usual (e.g. not trying to leave the artificial soil) are selected
for the test. This selection is made by placing the worms in a Petri dish filled with a small amount of
water under a stereomicroscope and discarding the animals without eggs. A freshwater medium (e.g.
reconstituted water as described in Reference [23]) should preferably be used, since demineralized
water or tap water (risk of copper contamination) can harm the Enchytraeidae. During this process,
other organisms living in the cultures, such as mites, are also removed from the worms.
NOTE An example of culturing Enchytraeus sp. is given in Annex A.
5.2 Test mixture, which may consist of field-collected soil or control soil amended by the test
substance.
5.2.1 Field-collected soil or waste
The sample(s) can be field-collected soil from an industrial, agricultural or other site of concern, or
waste materials (e.g. dredged material, municipal sludge from a wastewater treatment plant, composed
material, or manure) under consideration for possible land disposal.
The fields soils used in the test shall be passed through a sieve of 4 mm square mesh to remove coarse
fragments and thoroughly mixed. If necessary, soil may be air-dried without heating before sieving.
Storage of soils to be tested should be as short as possible. The soil shall be stored in accordance
with ISO 18400-206 using containers that minimize losses of soil contaminants by volatilisation and
sorption to the container walls. Soil pH should not be corrected as it can influence bioavailability of soil
contaminants.
For interpretation of test results, the following characteristics shall be determined for each soil sampled
from a field site:
a) pH in accordance with ISO 10390;
b) texture (sand, loam, silt) in accordance with ISO 11277;
c) water content in accordance with ISO 11465;
d) water holding capacity in accordance with Annex C;
e) cation exchange capacity in accordance with ISO 11260;
f) organic carbon in accordance with ISO 10694.
The water holding capacity of all mixtures used in the test should also be measured.
4
© ISO 2023 – All rights reserved
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 16387:2023(E)
5.2.2 Control soil, either a) reference (3.8) or b) standard soil (3.9) that allows the presence of
Enchytraeidae (at least the validity criteria shall be fulfilled). Control soil and soil used for dilution shall
not differ in one test (either a) or b)).
a) If reference soils from uncontaminated areas near a contaminated site are available, they should
be treated and characterized like the soils to be tested. If a toxic contamination or unusual soil
properties cannot be ruled out, standard control soils should be preferred.
b) For testing the effects of substances mixed into soil, standard soil (e.g. artificial soil, LUFA) shall be
used as test substrate. The properties of the field-collected standard soil shall be reported.
The substrate called artificial soil can be used as a standard soil and has the following composition:
Percentage expressed
on dry mass basis
— Sphagnum peat finely ground and with no visible plant remains 10 %
— Kaolinite clay containing not less than 30 % kaolinite 20 %
— Industrial quartz sand (dominant fine sand with more than 69 %
50 % of particle size 0,05 mm to 0,2 mm)
Approximately 0,3 % to 1,0 % calcium carbonate (CaCO , pulverised, analytical grade) are necessary to
3
get a pH of 6,0 ± 0,5.
NOTE Taking the properties of highly non-polar (log K > 2, where K is the octanol/water coefficient) or
ow ow
ionizing substances into account, 5 % of peat have proven to be sufficient for maintaining the desired structure
[25]
of the artificial soil .
Prepare the artificial soil at least three days prior to start the test, by mixing the dry constituents
listed above thoroughly in a large-scale laboratory mixer. A portion of the deionized water required
is added while mixing is continued. The amount of calcium carbonate required can vary, depending
on properties of the individual batch of sphagnum peat and should be determined by measuring sub-
samples immediately before the test. Store the mixed artificial soil at room temperature for at least two
days to equilibrate acidity. To determine pH and the total water holding capacity, the dry artificial soil
is pre-moistened one or two days before starting the test by adding deionised water to obtain half of
the required final water content of 40 % to 60 % of the total water holding capacity.
The total water holding capacity is determined according to Annex C; the pH is determined in accordance
with ISO 10390.
5.3 Food
Rolled oats, preferably autoclaved (heating is also possible) before use to avoid infection with other
[32]
organisms, were found to be suitable . The first feeding is made by mixing 50 mg of ground rolled
oats per test vessel into the soil (after application of the test substance but before adding the worms);
additional feedings (25 mg per vessel per week except after 28 d) are made only on the surface to avoid
harming the worms. Since the need for food can vary in the different vessels, feeding should be adjusted
to demand (i.e. over-feeding shall be avoided). Some soil particles should be placed on top of the rolled
oats in order to reduce fungal growth.
5.4 Reagents
5.4.1 Bengal red.
5.4.2 Ethanol.
5.4.3 Boric acid, suitable as reference substance.
5
© ISO 2023 – All rights reserved
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 16387:2023(E)
6 Apparatus
The usual laboratory equipment and the following shall be used.
6.1 Test container, of capacity 0,20 l to 0,25 l, with a diameter (e.g. 5 cm) enabli
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 16387
Troisième édition
2023-03
Qualité du sol — Effets des
contaminants sur les Enchytraeidae
(Enchytraeus sp.) — Détermination
des effets sur la reproduction
Soil quality — Effects of contaminants on Enchytraeidae
(Enchytraeus sp.) — Determination of effects on reproduction
Numéro de référence
ISO 16387:2023(F)
© ISO 2023
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 16387:2023(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2023
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
© ISO 2023 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 16387:2023(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 3
5 Réactifs et matériel . 4
6 Appareillage . 6
7 Environnement d’essai .7
8 Mode opératoire . 7
8.1 Dispositif expérimental . 7
8.1.1 Généralités . 7
8.1.2 Essai préliminaire . 7
8.1.3 Essai définitif . 7
8.2 Préparation des mélanges d’essai . 8
8.2.1 Essais sur sol contaminé . 8
8.2.2 Essais sur substances ajoutées au substrat d’essai . 9
8.2.3 Préparation du récipient témoin . 9
8.3 Ajout de nourriture . 10
8.4 Ajout du matériel biologique . 10
8.5 Conditions d’essai et mesurages . 10
8.6 Substance de référence . 10
9 Calcul et expression des résultats .11
9.1 Calculs . 11
9.2 Expression des résultats . 11
10 Validité de l’essai .11
11 Analyse statistique .11
11.1 Généralités . 11
11.2 Essai préliminaire. 11
11.3 Essai définitif .12
12 Rapport d’essai .12
Annexe A (informative) Conditions de culture d’Enchytraeus sp. .14
Annexe B (informative) Mode opératoire d’essais menés avec d’autres espèces du genre
Enchytraeus . .16
Annexe C (normative) Détermination de la capacité totale de rétention d’eau .18
Annexe D (informative) Description détaillée des techniques d’extraction .20
Annexe E (informative) Présentation de l’évaluation statistique des données (détermination
de la CSEO) .22
Bibliographie .23
iii
© ISO 2023 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 16387:2023(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a
été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Caractérisation biologique, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 444, Méthodes d'essai pour
la caractérisation environnementale des matrices solides, du Comité européen de normalisation (CEN),
conformément à l'Accord de coopération technique entre l'ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette troisième édition annule et remplace la deuxième édition (ISO 16387:2014), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
Les principales modifications sont les suivantes:
— correction des valeurs de pression de vapeur aux fins de mise à jour de l’Article 1, conformément
aux recommandations de l’Agence européenne des produits chimiques (ECHA)/de l’Organisation de
coopération et de développement économiques (OCDE);
— ajout (à l’Annexe D) d’une méthode d’extraction des enchytréides, appropriée à l’extraction
d’Enchytraeus crypticus, et utilisant la silice colloïdale.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iv
© ISO 2023 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 16387:2023(F)
Introduction
Les systèmes d’essais écotoxicologiques sont mis en œuvre pour obtenir des informations sur les effets
des contaminants du sol et sont proposés en complément des analyses chimiques conventionnelles.
[38]
L’ISO 15799 comporte une liste ainsi qu’une brève caractérisation des systèmes d’essais
recommandés et normalisés. Les systèmes d’essais aquatiques mis en œuvre sur éluat de sol sont
utilisés pour obtenir des informations sur la fraction de contaminants susceptible d’atteindre les eaux
souterraines du fait de la circulation de l’eau (fonction de rétention des sols), tandis que les systèmes
d’essais terrestres servent à évaluer la fonction d’habitat des sols. Concernant les seconds, un système
d’essai normalisé utilisant des Enchytraeidae (un essai chronique prenant la reproduction comme
critère d’effet) est proposé.
Le présent document décrit une méthode basée sur la détermination des effets aigus et sublétaux des
sols contaminés sur les Enchytraeidae adultes du genre Enchytraeus. La méthode peut éventuellement
être utilisée pour évaluer le potentiel toxique sublétal sur les Enchytraeidae de substances ajoutées à un
sol standard (par exemple, un sol artificiel).
Les annélides endogés du genre Enchytraeus sont pertinents sur le plan écologique, car ils abondent
dans un grand nombre de sols dans lesquels les vers de terre sont rares; cependant, ils peuvent
également atteindre de fortes densités de population dans des sols largement peuplés de vers de terre.
Les Enchytraeidae peuvent être soumis à des essais en laboratoire ainsi qu’à des études en conditions
semi-naturelles et à des études in situ. D’un point de vue pratique, de nombreuses espèces d’Enchytraeus
sont faciles à manipuler et à élever et leur temps de génération est nettement plus court que celui des
vers de terre [la durée des essais de reproduction des Enchytraeidae est de quatre à six semaines, contre
huit semaines (12 semaines en incluant la synchronisation) pour les vers de terre]. De plus, le volume de
sol nécessaire pour les essais menés sur les enchytréides est nettement inférieur au volume nécessaire
pour les essais sur les vers de terre.
Le présent document a été rédigé en tenant compte des protocoles d’essai recommandés par
[24],[25]
l’Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE ).
v
© ISO 2023 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 5 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 16387:2023(F)
Qualité du sol — Effets des contaminants sur les
Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) — Détermination des
effets sur la reproduction
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie l’une des méthodes permettant d’évaluer la fonction d’habitat des sols et
de déterminer les effets des contaminants du sol et des substances sur la reproduction d’Enchytraeus sp.
par absorption cutanée et ingestion au cours d’un essai chronique. Il est applicable aux sols et aux
matériaux de type sol de qualité inconnue provenant, par exemple, de sites contaminés, de sols amendés,
de sols après remédiation, de sols agricoles ou d’autres sites d’intérêt, et de déchets.
Le présent document fournit des informations sur la manière d’utiliser cette méthode pour évaluer des
substances en conditions tempérées.
Cette méthode ne s’applique pas aux substances pour lesquelles le coefficient de partage air/sol est
supérieur à 1, ou pour lesquelles la pression de vapeur à 25 °C est supérieure à 300 Pa.
NOTE La méthode d’essai ne contient aucune disposition permettant de surveiller la persistance de la
substance soumise à essai.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l'édition citée s'applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 10390, Sols, biodéchets traités et boues — Détermination du pH
ISO 10694, Qualité du sol — Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche
(analyse élémentaire)
ISO 11260, Qualité du sol — Détermination de la capacité d'échange cationique et du taux de saturation en
bases échangeables à l'aide d'une solution de chlorure de baryum
ISO 11277, Qualité du sol — Détermination de la répartition granulométrique de la matière minérale des
sols — Méthode par tamisage et sédimentation
ISO 11465, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau — Méthode
gravimétrique
ISO 18400-206, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 206: Collecte, manipulation et conservation de
sols destinés à l'évaluation de paramètres biologiques fonctionnels et structurels en laboratoire
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L'ISO et l'IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l'adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l'adresse https:// www .electropedia .org/
1
© ISO 2023 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 16387:2023(F)
3.1
reproduction
nombre moyen de jeunes produits par récipient d’essai après incubation dans les conditions d’essai
spécifiées
Note 1 à l'article: La période d’essai d’évaluation de la reproduction (essai définitif) est de six semaines.
Note 2 à l'article: Les «jeunes produits» désignent les jeunes enchytréides ayant éclos.
3.2
CEx
concentration efficace à x %
concentration (fraction massique) d’une substance soumise à essai qui, par rapport à un témoin,
engendre x % d’un effet sur un critère d’effet donné pendant une période d’exposition définie
EXEMPLE Une CE est une concentration estimée produire un effet, pour le critère d’effet de l’essai,
50
chez 50 % d’une population exposée sur une période d’exposition définie.
Note 1 à l'article: La CEx est exprimée en pourcentage du sol soumis à essai (masse sèche) par mélange de sols
(masse sèche). Lorsque des substances sont soumises à essai, la CEx est exprimée en masse de la substance
soumise à essai par masse sèche de sol, en milligrammes par kilogramme.
3.3
CMEO
concentration minimale avec effet observé
plus faible concentration de substance soumise à essai ayant un effet statistiquement significatif
(probabilité p < 0,05)
Note 1 à l'article: Dans le présent essai, la CMEO est exprimée en masse de substance soumise à essai par masse
sèche du sol soumis à essai. Il convient généralement que toutes les concentrations d’essai supérieures à la CMEO
aient un effet statistiquement différent du témoin.
3.4
CSEO
concentration sans effet observé
plus haute concentration de substance soumise à essai immédiatement inférieure à la CMEO (3.3), pour
laquelle aucun effet n’est observé
Note 1 à l'article: Dans le présent essai, la concentration correspondant à la CSEO n’a aucun effet statistiquement
significatif (p < 0,05) par rapport au témoin au cours d’une période d’exposition définie.
3.5
mélange d’essai
mélange de sol contaminé ou de substance soumise à essai (par exemple, substance chimique, biosolide,
déchet) et de sol témoin (3.10)
3.6
ratio de mélange d’essai
ratio entre le sol soumis à essai et le sol témoin (3.10) dans un mélange d’essai (3.5)
3.7
contaminant
substance ou agent présent(e) dans le sol du fait de l’activité humaine
3.8
sol de référence
sol non contaminé dont les propriétés pédologiques (concentrations en éléments nutritifs, pH, teneur en
carbone organique et texture) sont similaires à celles du sol analysé
2
© ISO 2023 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 16387:2023(F)
3.9
sol standard
sol prélevé sur le terrain ou sol artificiel dont les propriétés principales (pH, texture, teneur en matières
organiques) se situent dans une gamme connue
EXEMPLE Euro sols, sol artificiel, sol standard LUFA.
Note 1 à l'article: Les propriétés des sols standard peuvent être différentes de celles du sol soumis à essai.
3.10
sol témoin
sol de référence (3.8) ou sol standard (3.9) satisfaisant aux critères de validité, et utilisé comme témoin
et comme milieu pour la préparation des gammes de dilutions avec les sols soumis à essai ou avec une
substance de référence
Note 1 à l'article: Dans le cas d’un sol naturel, il est recommandé de démontrer son aptitude aux essais et sa
capacité à satisfaire aux critères de validité de l’essai avant de l’utiliser dans un essai définitif.
4 Principe
Les effets sur la survie et la reproduction d’Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) adultes exposés à une série
de dilutions d’un sol contaminé ou à une gamme de concentrations d’une substance soumise à essai
sont déterminés. Les mélanges d’essai sont préparés au début de l’essai et ne sont pas renouvelés au
cours de la période d’essai.
L’essai peut être scindé en deux étapes distinctes: un essai de courte durée (deux semaines), au cours
duquel la gamme de concentrations entraînant des effets toxiques (principalement la mortalité) est
déterminée, et un essai définitif à long terme (six semaines), au cours duquel la survie des vers adultes
et la fécondité (nombre de jeunes) sont mesurées. Les résultats obtenus lors des essais sont comparés
à ceux obtenus avec un témoin et utilisés pour déterminer les dilutions ou les concentrations qui ne
provoquent pas d’effet sur la survie et la reproduction (CSEO) ainsi que la concentration (dilution) qui
entraîne une réduction de x % du nombre de jeunes éclos des cocons par rapport au témoin (CEx, 42 j).
Toutes les dilutions/concentrations d’essai supérieures à la CMEO ont un effet nocif égal ou supérieur
à celui observé à la CMEO. Lorsque la dilution/concentration à laquelle la substance soumise à essai
est susceptible de produire un effet n’est pas connue au préalable, il est utile de réaliser l’essai en
deux étapes:
— un essai de toxicité aiguë (essai préliminaire), pour obtenir une indication de la dilution/
concentration produisant un effet et de la dilution/concentration n’entraînant pas de mortalité
(CSEO). Les dilutions/concentrations à utiliser pour l’essai définitif peuvent ensuite être choisies;
— un essai définitif sur la reproduction, pour déterminer les effets sublétaux (des dilutions) du sol
contaminé ou de la concentration d’une substance qui, mélangé(e) de façon homogène dans le sol
standard, n’a pas d’effet significatif sur le nombre de jeunes produits éclos des cocons comparé au
témoin (CSEO), ainsi que la plus faible concentration produisant un effet (CMEO).
NOTE Un sol de référence approprié est utilisé pour démontrer le bon état de la population soumise à essai
et pour éviter toute erreur d’interprétation des résultats.
Les effets des substances sont évalués à l’aide d’un sol standard, de préférence un substrat de sol
artificiel défini. Pour les sols contaminés, les effets sont déterminés dans le sol soumis à essai et dans
un sol témoin. Selon l’objectif de l’étude, les substrats témoin et de dilution (série de dilutions d’un sol
contaminé) correspondent à un sol non contaminé comparable au sol soumis à essai (sol de référence)
ou à un sol standard (par exemple, sol artificiel).
3
© ISO 2023 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 16387:2023(F)
5 Réactifs et matériel
5.1 Matériel biologique, l’espèce recommandée pour l’essai est Enchytraeus albidus Henle 1837
(enchytréide; Enchytraeidae, sous-classe: Oligochaeta, embranchement: Annelida). E. albidus, l’une des
plus grandes espèces d’enchytréides, se caractérise par une taille de 15 mm à 40 mm et une répartition
géographique mondiale (voir, par exemple, les Références [22] et [32]). Cette espèce est facilement
reconnaissable grâce à deux caractéristiques: quatre soies par faisceau sur la face ventrale et un très
long canal séminal dans la région du clitellum et de quelques segments postérieurs. Cette espèce peut
être présente en habitat marin, limnique et terrestre, principalement dans les matières organiques en
décomposition (varech, compost) et seulement rarement dans les prairies. Cette tolérance écologique
très étendue, ainsi que certaines variations morphologiques, indiquent que cette espèce englobe
probablement plusieurs races (ou écotypes). E. albidus peut être obtenue dans le commerce, puisqu’elle
est vendue comme nourriture pour poissons. Il convient de vérifier si ce type de culture n’est pas
contaminé par d’autres espèces de taille généralement inférieure (voir, par exemple, les Références [7],
[10] et [33]). En cas de contamination de la culture, tous les vers sont lavés à l’eau dans une boîte de Petri.
Les spécimens adultes d’E. albidus de grande taille sont sélectionnés à l’aide d’un stéréomicroscope pour
démarrer une nouvelle culture. Tous les autres vers issus de la culture initiale sont éliminés. E. albidus
peut être facilement élevée dans un grand nombre de matériaux organiques (voir l’Annexe A); cette
espèce présente un cycle de vie court, la maturité étant atteinte entre 33 j (à 18 °C) et 74 j (à 12 °C).
Seules les cultures ayant été conservées au laboratoire pendant au moins cinq semaines (soit un cycle
de génération) sans problème doivent être utilisées pour les essais.
D’autres espèces du genre Enchytraeus, telles que E. crypticus Westheide et Graefe 1992 ou E. buchholzi
Vejdovsky 1879, espèces vivant spécifiquement dans le sol, mais plus petites, sont également admises
en tant qu’organismes soumis à essai (voir l’Annexe B). Si d’autres espèces du genre Enchytraeus
sont utilisées, elles doivent être clairement identifiées et il convient de mentionner les raisons pour
lesquelles ces espèces ont été choisies, ainsi que les écarts par rapport à la méthode d’essai.
Il convient que les vers soumis aux essais soient des individus adultes porteurs d’œufs (points blancs)
dans la région du clitellum et qu’ils soient de taille approximativement égale (environ 15 mm pour
E. albidus). Il n’est pas nécessaire de synchroniser la culture d’élevage. Il convient d’acclimater les
Enchytraeidae dans le sol de référence, dans le sol standard ou dans un sol artificiel non traité, dans les
conditions de l’essai, pendant au moins 24 h avant l’essai. Durant cette période, il convient de distribuer,
en quantité suffisante, la nourriture qui sera également utilisée comme source d’alimentation durant
l’essai.
Pour un essai, il convient de prélever dans la boîte d’élevage un échantillon surnuméraire de vers adultes
possédant un clitellum, sans les observer en détail, afin de disposer d’une population de vers appropriée
suffisante. Au terme de la période d’acclimatation, seuls les vers porteurs d’œufs et présentant un
comportement habituel (par exemple, n’essayant pas de s’échapper du sol artificiel) sont sélectionnés
pour l’essai. La sélection est effectuée en observant au stéréomicroscope les vers placés dans une boîte
de Petri contenant une faible quantité d’eau et en éliminant les animaux dépourvus d’œufs. Il convient
d’utiliser, de préférence, un milieu d’eau douce (par exemple, de l’eau reconstituée selon la méthode
décrite dans la Référence [23]), car l’eau déminéralisée ou l’eau du robinet (risque de contamination
au cuivre) peut s’avérer nocive pour les Enchytraeidae. Au cours de ce processus, les autres organismes
vivant dans les cultures, tels que les acariens, sont également séparés des vers.
NOTE Un exemple d’élevage d’Enchytraeus sp. figure à l’Annexe A.
5.2 Mélange d’essai, qui peut être constitué d’un sol prélevé sur le terrain ou d’un sol témoin amendé
par la substance soumise à essai.
5.2.1 Sol prélevé sur le terrain ou déchets
Le ou les échantillons de sol peuvent être un sol prélevé sur un site industriel, agricole ou un autre
site d’intérêt, ou des déchets (par exemple, matériau de dragage, boues de station d’épuration des eaux
usées urbaines, matériau composite ou fumier) dont une éventuelle mise en décharge est envisagée.
4
© ISO 2023 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 16387:2023(F)
Les sols prélevés sur le terrain et utilisés pour l’essai doivent être tamisés au moyen d’un tamis à
mailles carrées de 4 mm pour éliminer les fragments grossiers; ils doivent être ensuite soigneusement
mélangés. Si nécessaire, le sol peut être séché à l’air, sans chauffage, avant d’être tamisé. Il convient que
la durée de conservation des sols soumis à essai soit la plus courte possible. Le sol doit être conservé
conformément à l’ISO 18400-206, en utilisant des récipients qui réduisent au minimum les pertes de
contaminants du sol par volatilisation et par sorption sur les parois du récipient. Il convient de ne pas
corriger le pH du sol car il peut influer sur la biodisponibilité des contaminants du sol.
Pour l’interprétation des résultats d’essai, les caractéristiques suivantes doivent être déterminées pour
chaque échantillon de sol prélevé sur site:
a) le pH conformément à l’ISO 10390;
b) la texture (sable, limon, vase) conformément à l’ISO 11277;
c) la teneur en eau conformément à l’ISO 11465;
d) la capacité de rétention d’eau selon l’Annexe C;
e) la capacité d’échange cationique conformément à l’ISO 11260;
f) la teneur en carbone organique conformément à l’ISO 10694.
Il convient également de mesurer la capacité de rétention d’eau de tou
...
© ISO 2022- All right reserved
2022-07-1112-12
ISO/DISFDIS 16387:2022(E)
ISO/TC 190/SC 4/WG 2
Secretariat: AFNOR
Soil quality — Effects of contaminants on Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) —
Determination of effects on reproduction
Qualité du sol — Effets des contaminants sur les Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) —
Détermination des effets sur la reproduction
Document type:
Document subtype:
Document stage:
Document language:
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO/DISFDIS 16387:2022(E)
© ISO 2022
All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation,
no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet,
without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address
below or ISO's member body in the country of the requester.
ISO Copyright Office
CP 401 • CH-1214 Vernier, Geneva
Phone: + 41 22 749 01 11
Email: copyright@iso.org
Website: www.iso.org
Published in Switzerland.
ii © ISO 2022 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO/DISFDIS 16387:2022(E)
Contents Page
Foreword . iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 3
5 Reagents and material . 3
6 Apparatus . 6
7 Test environment . 6
8 Procedure . 7
9 Calculation and expression of results . 10
10 Validity of the test . 10
11 Statistical analysis . 11
12 Test report . 12
Annex A (informative) Conditions for culture of Enchytraeus sp . 13
Annex B (informative) Test procedure using other Enchytraeus species . 15
Annex C (normative) Determination of maximum water-holding capacity . 17
Annex D (informative) Detailed description of extraction techniques . 19
Annex E (informative) Overview of the statistical assessment of data (NOEC determination) . 22
Bibliography . 24
© ISO 2022 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO/DISFDIS 16387:2022(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national
standards bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally
carried out through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a
technical committee has been established has the right to be represented on that committee.
International organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in
the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all
matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see
www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee [or Project Committee] ISO/TC 190, Soil quality,
Subcommittee SC 4, Biological characterization, in collaboration with the European Committee for
Standardization (CEN) Technical Committee CEN/TC 444, Environmental characterization, in
accordance with the Agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This third edition cancels and replaces the second edition (ISO 16387:2014), which has been technically
revised.
The main changes are as follows:
— correction of the vapor pressure value to update Clause 1 according to the recommendations of
ECHA/OECD;
— addition (in Annex D) of an extraction method of enchytraeids with colloidal silica, suitable for
Enchytraeus crypticus.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iv © ISO 2022 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO/DISFDIS 16387:2022(E)
Introduction
Ecotoxicological test systems are applied to obtain information about the effects of contaminants in soil
[38]
and are proposed to complement conventional chemical analysis. ISO 15799 includes a list and short
characterization of recommended and standardized test systems. Aquatic test systems with soil eluate
are applied to obtain information about the fraction of contaminants potentially reaching the
groundwater by the water path (retention function of soils), whereas terrestrial test systems are used
to assess the habitat function of soils. For the latter, a standardized test system using Enchytraeidae (a
chronic test with end-point reproduction) is proposed.
This document describes a method that is based on the determination of acute and sublethal effects of
contaminated soils to adult Enchytraeidae of the genus Enchytraeus. Optionally, the method can be used
for testing substances added to standard soils (e.g. artificial soil) for their sublethal hazard potential to
Enchytraeidae.
Soil-dwelling annelids of the genus Enchytraeus are ecologically relevant, i.e. they are abundant in many
soils where earthworms are scarce but can also reach high population densities in soils well inhabited
by earthworms. Enchytraeidae can be used in laboratory tests as well as in semi-field and field studies.
From a practical point of view, many Enchytraeus species are easy to handle and breed, and their
generation time is significantly shorter than that of earthworms [the test duration for a reproduction
test with Enchytraeidae is four weeks to six weeks, compared to eight weeks (12 weeks including
synchronization) with earthworms]. In addition, a much smaller volume of soil is needed in the
enchytraeid test compared to the amount needed in earthworm tests.
This document has been drawn up taking into consideration test procedures recommended by the
[24],[25]
Organization for Economic Co-operation and Development (OECD ).
© ISO 2022 – All rights reserved v
---------------------- Page: 5 ----------------------
FINAL DRAFT INTERNATONAL STANDARD ISO/DISFDIS 16387:2022(E)
Soil quality — Effects of contaminants on Enchytraeidae
(Enchytraeus sp.) — Determination of effects on reproduction
1 Scope
This document specifies one of the methods for evaluating the habitat function of soils and determining
effects of soil contaminants and substances on the reproduction of Enchytraeus sp. by dermal and
alimentary uptake in a chronic test. It is applicable to soils and soil materials of unknown quality, for
example, from contaminated sites, amended soils, soils after remediation, agricultural or other sites
under concern and waste materials.
This document provides information on how to use this method for testing substances under temperate
conditions.
The method is not applicable to substances, for which the air/soil partition coefficient is greater than 1,
or to substances for which the vapour pressure exceeds 300 Pa at 25 °C.
NOTE No provision is made in the test method for monitoring the persistence of the substance under test.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 10390, Soil, treated biowaste and sludge – Determination of pH
ISO 10694, Soil quality — Determination of organic and total carbon after dry combustion (elementary
analysis)
ISO 11260, Soil quality — Determination of effective cation exchange capacity and base saturation level
using barium chloride solution
ISO 11277, Soil quality — Determination of particle size distribution in mineral soil material — Method by
sieving and sedimentation
ISO 11465, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis — Gravimetric
method
ISO 18400-206, Soil quality — Sampling — Part 206: Collection, handling and storage of soil under
aerobic conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https://www.iso.org/obp
— IEC Electropedia: available at https://www.electropedia.org/
© ISO 2022 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO/DISFDIS 16387:2022(E)
3.1
reproduction
mean number of offspring per test vessel after incubation under the specified test conditions
Note 1 to entry: The test period for the determination of the reproduction (definitive test) is six weeks.
Note 2 to entry: Offspring =refers to hatched juvenile enchytraeids.
3.2
ECx
effect concentration for x % effect
concentration (mass fraction) of a test substance that causes x % of an effect on a given endpoint within
a given exposure period when compared with a control
EXAMPLE An EC is a concentration estimated to cause an effect on a test end point in 50 % of an exposed
50
population over a defined exposure period.
Note 1 to entry: The ECx is expressed as a percentage of soil to be tested (dry mass) per soil mixture (dry mass).
When substances are tested, the ECx is expressed as mass of the test substance per dry mass of soil, in milligrams
per kilogram.
3.3
LOEC
lowest observed effect concentration
lowest test substance concentration that has a statistically significant effect (probability p < 0,05)
Note 1 to entry: In this test, the LOEC is expressed as a mass of test substance per dry mass of the soil to be tested.
All test concentrations above the LOEC should usually show an effect that is statistically different from the control.
3.4
NOEC
no observed effect concentration
highest test substance concentration immediately below the LOEC (3.3) at which no effect is observed
Note 1 to entry: In this test, the concentration corresponding to the NOEC, has no statistically significant effect
(p < 0,05) within a given exposure period when compared with the control.
3.5
test mixture
mixture of contaminated soil or test substance (e.g. chemical, biosolid, waste) with control soil (3.10)
3.6
test mixture ratio
ratio between the soil to be tested and the control soil (3.10) in a test mixture (3.5)
3.7
contaminant
substance or agent present in the soil as a result of human activity
3.8
reference soil
uncontaminated soil with comparable pedological properties (nutrient concentrations, pH, organic
carbon content and texture) to the soil being studied
3.9
2 © ISO 2022 – All rights reserved
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO/DISFDIS 16387:2022(E)
standard soil
field-collected soil or artificial soil whose main properties (pH, texture, organic matter content) are
within a known range
EXAMPLE Euro soils, artificial soil, LUFA Standard soil.
Note 1 to entry: The properties of standard soils can differ from the soil to be tested.
3.10
control soil
reference (3.8) or standard soil (3.9) used as a control and as a medium for preparing dilution series
with soils to be tested or a reference substance, which fulfils the validity criteria
Note 1 to entry: In the case of natural soil, it is advisable to demonstrate its suitability for a test and for achieving
the test validity criteria before using the soil in a definitive test.
4 Principle
The effects on survival and reproduction of adult Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) exposed to a dilution
range of contaminated soil or range of concentrations of a test substance are determined. Test mixtures
are prepared at the start of the test and are not renewed within the test period.
The test can be divided into two distinct steps: a short (two weeks) test in which the range of toxic
effects (mainly mortality) is determined, and a long-term (six weeks) definitive test in which the
survival of parental worms and the fecundity (number of juveniles) are measured. The results obtained
from the tests are compared with a control and are used to determine the dilutions or concentrations
which cause no effects on survival and reproduction (NOEC) and the concentration (dilution) resulting
in x % reduction of juveniles hatched from cocoons compared to the control (ECx, 42 d).
All test dilutions/concentrations above the LOEC have a harmful effect equal to, or greater than that
observed at the LOEC. Where there is no prior knowledge of the dilution/concentration of the test
substance likely to have an effect, then it is useful to conduct the test in two steps:
— an acute toxicity test (range-finding test) is carried out, to give an indication of the effect
dilution/concentration, and the dilution/concentration giving no mortality (NOEC).
Dilutions/concentrations to be used in the definitive test can then be selected;
— thea definitive test on reproduction to determine sublethal effects of (dilutions of) contaminated
soil or the concentration of a substance which, when evenly mixed into the standard soil, causes no
significant effects on numbers of offspring hatched from cocoons compared with the control
(NOEC), and the lowest concentration causing effects (LOEC).
NOTE The use of aA suitable reference soil is an essential requirementused to demonstrate the
presentappropriate status of the test population, and to avoid misinterpretation of results.
Effects of substances are assessed using a standard soil, preferably a defined artificial soil substrate. For
contaminated soils, the effects are determined in the soil to be tested and in a control soil. According to
the objective of the study, the control and dilution substrate (dilution series of contaminated soil) are
either an uncontaminated soil comparable to the soil to be tested (reference soil) or a standard soil (e.g.
artificial soil).
5 Reagents and material
5.1 Biological material, recommended test species is Enchytraeus albidus Henle 1837 (white
potworm; Enchytraeidae, subclass: Oligochaeta, phylum: Annelida). E. albidus is one of the largest
enchytraeid species, measuring 15 mm to 40 mm, and has a world-wide distribution (see, for example,
© ISO 2022 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO/DISFDIS 16387:2022(E)
References [22] and [32]). It can be easily recognized by two characteristics: four setae per bundle
ventrally, and the very long seminal duct in the clitellum region as well as some segments behind it. The
species can be found in marine, limnic and terrestrial habitats, mainly in decaying organic matter
(seaweed, compost) and only rarely in meadows. This broad ecological tolerance and some
morphological variations indicate that the species probably consists of several races (or ecotypes). E.
albidus can be obtained commercially, since it is sold as food for fish. It should be verified whether such
a culture is contaminated by other, usually smaller species (see, for example, References [7], [10] and
[33]). If contamination of the culture occurs, all worms are washed in water in a Petri dish. With the
help of a stereomicroscope, large adult specimens of E. albidus are selected to start a new culture. All
other worms of the original culture are discarded. E. albidus can be bred easily in a wide range of
organic materials (see Annex A) and has a short life cycle, reaching maturity between 33 d (at 18 °C)
and 74 d (at 12 °C). Only cultures which have been kept in the laboratory for at least five weeks (one
generation cycle) without problems shall be used for testing purposes.
Other species of the genus Enchytraeus, especially the true soil-inhabiting but smaller species
E. crypticus Westheide and Graefe 1992 or E. buchholzi Vejdovsky 1879, are also suitable as test
organisms (see Annex B). If other species of Enchytraeus are used, they shall be clearly identified and
the rationale for the selection of the species as well as deviations of the experimental method should be
reported in this case.
The worms used in the tests should be adult with eggs (white spots) in the clitellum region and should
have approximately the same size (approximately 15 mm for E. albidus). A synchronisation of the
breeding culture is not necessary. The Enchytraeidae should be acclimatised in the reference soil, the
standard soil or the untreated artificial soil under test conditions for at least 24 h prior to testing.
During this period, the same food which is used as a food source in the test should be given in sufficient
amount.
For one test, an excess number of adult clitellate worms should be taken from the culture box without
observing them in detail in order to get enough suitable worms. At the end of the acclimatization period,
only worms with eggs and behaving as usual (e.g. not trying to leave the artificial soil) are selected for
the test. This selection is made by placing the worms in a Petri dish filled with a small amount of water
under a stereomicroscope and discarding the animals without eggs. A freshwater medium (e.g.
reconstituted water as described in Reference [23]) should preferably be used, since demineralized
water or tap water (risk of copper contamination) can harm the Enchytraeidae. During this process,
other organisms living in the cultures, such as mites, are also removed from the worms.
NOTE An example of culturing Enchytraeus sp. is given in Annex A.
5.2 Test mixture, which may consist of field-collected soil or control soil amended by the test
substance.
5.2.1 Field-collected soil or waste
The sample(s) can be field-collected soil from an industrial, agricultural or other site of concern, or
waste materials (e.g. dredged material, municipal sludge from a wastewater treatment plant, composed
material, or manure) under consideration for possible land disposal.
The fields soils used in the test shall be passed through a sieve of 4 mm square mesh to remove coarse
fragments and thoroughly mixed. If necessary, soil may be air-dried without heating before sieving.
Storage of soils to be tested should be as short as possible. The soil shall be stored in accordance with
ISO 18400-206 using containers that minimize losses of soil contaminants by volatilisation and sorption
to the container walls. Soil pH should not be corrected as it can influence bioavailability of soil
contaminants.
For interpretation of test results, the following characteristics shall be determined for each soil sampled
from a field site:
4 © ISO 2022 – All rights reserved
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO/DISFDIS 16387:2022(E)
a) pH in accordance with ISO 10390;
b) texture (sand, loam, silt) in accordance with ISO 11277;
c) water content in accordance with ISO 11465;
d) water holding capacity according toin accordance with Annex C;
e) cation exchange capacity in accordance with ISO 11260;
f) organic carbon in accordance with ISO 10694.
NOTE It is also important to measure theThe water holding capacity of all mixtures used in the test
should also be measured.
5.2.2 Control soil, either a) reference (3.8) or b) standard soil (3.9) that allows the presence of
Enchytraeidae (at least the validity criteria shall be fulfilled). Control soil and soil used for dilution shall
not differ in one test (either a) or b)).
a) If reference soils from uncontaminated areas near a contaminated site are available, they should be
treated and characterized like the soils to be tested. If a toxic contamination or unusual soil
properties cannot be ruled out, standard control soils should be preferred.
b) For testing the effects of substances mixed into soil, standard soil (e.g. artificial soil, LUFA) shall be
used as test substrate. The properties of the field-collected standard soil shall be reported.
The substrate called artificial soil can be used as a standard soil and has the following composition:
Percentage expressed
on dry mass basis
— Sphagnum peat finely ground and with no visible plant remains 10 %
— Kaolinite clay containing not less than 30 % kaolinite 20 %
— Industrial quartz sand (dominant fine sand with more than 69 %
50 % of particle size 0,05 mm to 0,2 mm)
Approximately 0,3 % to 1,0 % calcium carbonate (CaCO , pulverised, analytical grade) are necessary to
3
get a pH of 6,0 ± 0,5.
NOTE Taking the properties of highly non-polar (log Kow > 2, where Kow is the octanol/water coefficient) or
ionizing substances into account, 5 % of peat have proven to be sufficient for maintaining the desired structure of
[25]
the artificial soil .
Prepare the artificial soil at least three days prior to start the test, by mixing the dry constituents listed
above thoroughly in a large-scale laboratory mixer. A portion of the deionized water required is added
while mixing is continued. The amount of calcium carbonate required can vary, depending on
properties of the individual batch of sphagnum peat and should be determined by measuring sub-
samples immediately before the test. Store the mixed artificial soil at room temperature for at least two
days to equilibrate acidity. To determine pH and the maximum water holding capacity, the dry artificial
soil is pre-moistened one or two days before starting the test by adding deionised water to obtain half
of the required final water content of 40 % to 60 % of the maximum water holding capacity.
The total water holding capacity is determined according to Annex C,; the pH is determined according
toin accordance with ISO 10390.
5.3 Food
© ISO 2022 – All rights reserved 5
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO/DISFDIS 16387:2022(E)
Rolled oats, preferably autoclaved (heating is also possible) before use to avoid infection with other
[ [32] ]
organisms, were found to be suitable . . The first feeding is made by mixing 50 mg of ground rolled
oats per test vessel into the soil (after application of the test substance but before adding the worms);
additional feedings (25 mg per vessel per week except after 28 d) are made only on the surface to avoid
harming the worms. Since the need for food can vary in the different vessels, feeding should be adjusted
to demand (i.e. over-feeding shall be avoided). Some soil particles should be placed on top of the rolled
oats in order to reduce fungal growth.
5.4 Reagents
5.4.1 Bengal red.
5.4.2 Ethanol.
5.4.3 Boric acid, suitable as reference substance.
6 Apparatus
UsualThe usual laboratory equipment and the following shall be used.
6.1 Test container, of capacity 0,20 l to 0,25 l, with a diameter (e.g. 5 cm) enabling a depth of 1,5 cm to
2 cm of soil, with lids (e.g. glass or perforated plastic film). The beakers shall be suitable as test vessels,
containing an amount of artificial soil corresponding to 20 g dry mass. The lids shall permit gaseous
exchange between the soil substrate and the atmosphere.
6.2 Drying cabinet.
6.3 Stereomicroscope.
6.4 Balances with a weighing range of 50 g to 32 kg; precision at least 1 g.
6.5 Analytical balance with a weighing range of 10 mg to 200 g; precision at least 1 mg.
6.6 pH-meter.
6.7 Temperature registration (e.g. temperature/humidity recorder).
6.8 Lux meter.
6.9 Mixer.
6.10 Incubator or small room with air-conditioner.
6.11 Jeweller’s tweezers, hooks, loops or a small brush.
6.12 Photo basins with ribbed bottoms.
7 Test environment
Cover the test vessels with lids (6.1) to prevent the test substrate from drying, and keep under test
conditions for two weeks (range-finding test) or six weeks (definitive test). The test temperature shall
be (20 ± 2) °C; higher temperatures can affect reproduction. Carry out testing in a controlled light-dark
cycle of long-day conditions, preferably 16 h to 8 h at 400 lx to 800 lx in the area of the test vessels, to
prevent the worms from escaping from the soil.
6 © ISO 2022 – All rights reserved
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO/DISFDIS 16387:2022(E)
Weigh the vessels at the beginning of the test and thereafter once a week. Replenish the mass loss with
the appropriate amount of deionized water. This loss can be minimized by maintaining a high humidity
(>80 %) in the test incubator (6.10). Place all test vessels in the test incubator in a random order, which
should be changed every week.
At the beginning and the end of both the range-finding test and the definitive test, the water content and
the pH should be measured. To facilitate checking of the pH and water content of the test substrate, use
of additional containers (replicates) for each concentration and for the control is recommended.
8 Procedure
8.1 Experimental design
8.1.1 General
A sample of field-collected soil can be tested at a single concentration (typically 100 %) or evaluated for
toxicity in a multi-concentration test whereby a series of concentrations (dilutions) are prepared by
mixing measured quantities with a control soil (5.2.2). Depending on the knowledge of relevant
response levels a range-finding test may precede the definitive test. Each definitive test consists of a
series of soil mixtures (treatments). Each treatment is replicated at least four times.
8.1.2 Range-finding test
A test to find the range of mixture ratio affecting Enchytraeidae is optional. If it is necessary to
determine the range of concentrations (dilutions) for use in the definitive test, perform a range-finding
(acute) test in a large range of concentrations (dilutions) of the contaminated soil, e. g. 0 % – 1 % – 5 %
– 25 % – 50 % – 75 % – 100 %, or of the test substance, e.g. 0 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg
and 1 000 mg/kg (the concentrations being expressed in milligrams of test substance per kilogram of
dried standard soil (5.2.2) and a control using 10 worms per container.
The range-finding test is conducted without replication.
8.1.3 Definitive test
The design of the definitive test depends on the test objectives. Typically, the habitat properties of
samples of a field-collected soil are characterized by a comparison of the biological effects for the soil(s)
to be tested with the effects found in a reference soil or, if not available or not appropriate due to
toxicity or atypical physicochemical characteristics, in a standard soil. Results for the standard soil
assist in distinguishing contaminant effects from non-contaminant effects cau
...
FINAL
INTERNATIONAL ISO/FDIS
DRAFT
STANDARD 16387
ISO/TC 190/SC 4
Soil quality — Effects of contaminants
Secretariat: AFNOR
on Enchytraeidae (Enchytraeus
Voting begins on:
2022-12-26 sp.) — Determination of effects on
reproduction
Voting terminates on:
2023-02-20
Qualité du sol — Effets des contaminants sur les Enchytraeidae
(Enchytraeus sp.) — Détermination des effets sur la reproduction
ISO/CEN PARALLEL PROCESSING
RECIPIENTS OF THIS DRAFT ARE INVITED TO
SUBMIT, WITH THEIR COMMENTS, NOTIFICATION
OF ANY RELEVANT PATENT RIGHTS OF WHICH
THEY ARE AWARE AND TO PROVIDE SUPPOR TING
DOCUMENTATION.
IN ADDITION TO THEIR EVALUATION AS
Reference number
BEING ACCEPTABLE FOR INDUSTRIAL, TECHNO-
ISO/FDIS 16387:2022(E)
LOGICAL, COMMERCIAL AND USER PURPOSES,
DRAFT INTERNATIONAL STANDARDS MAY ON
OCCASION HAVE TO BE CONSIDERED IN THE
LIGHT OF THEIR POTENTIAL TO BECOME STAN-
DARDS TO WHICH REFERENCE MAY BE MADE IN
NATIONAL REGULATIONS. © ISO 2022
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO/FDIS 16387:2022(E)
FINAL
INTERNATIONAL ISO/FDIS
DRAFT
STANDARD 16387
ISO/TC 190/SC 4
Soil quality — Effects of contaminants
Secretariat: AFNOR
on Enchytraeidae (Enchytraeus
Voting begins on:
sp.) — Determination of effects on
reproduction
Voting terminates on:
Qualité du sol — Effets des contaminants sur les Enchytraeidae
(Enchytraeus sp.) — Détermination des effets sur la reproduction
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2022
ISO/CEN PARALLEL PROCESSING
All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may
be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on
the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below
or ISO’s member body in the country of the requester.
RECIPIENTS OF THIS DRAFT ARE INVITED TO
ISO copyright office
SUBMIT, WITH THEIR COMMENTS, NOTIFICATION
OF ANY RELEVANT PATENT RIGHTS OF WHICH
CP 401 • Ch. de Blandonnet 8
THEY ARE AWARE AND TO PROVIDE SUPPOR TING
CH-1214 Vernier, Geneva
DOCUMENTATION.
Phone: +41 22 749 01 11
IN ADDITION TO THEIR EVALUATION AS
Reference number
Email: copyright@iso.org
BEING ACCEPTABLE FOR INDUSTRIAL, TECHNO
ISO/FDIS 16387:2022(E)
Website: www.iso.org
LOGICAL, COMMERCIAL AND USER PURPOSES,
DRAFT INTERNATIONAL STANDARDS MAY ON
Published in Switzerland
OCCASION HAVE TO BE CONSIDERED IN THE
LIGHT OF THEIR POTENTIAL TO BECOME STAN
DARDS TO WHICH REFERENCE MAY BE MADE IN
ii
© ISO 2022 – All rights reserved
NATIONAL REGULATIONS. © ISO 2022
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO/FDIS 16387:2022(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 3
5 Reagents and material . 3
6 Apparatus . 6
7 Test environment . 6
8 Procedure .7
8.1 Experimental design . 7
8.1.1 General . 7
8.1.2 Range-finding test . 7
8.1.3 Definitive test . 7
8.2 Preparation of test mixtures . 8
8.2.1 Testing contaminated soil . 8
8.2.2 Testing substances added to the test substrate . 8
8.2.3 Preparation of control container . 9
8.3 Addition of food . 9
8.4 Addition of the biological material . 9
8.5 Test conditions and measurements . 9
8.6 Reference substance . 9
9 Calculation and expression of results .10
9.1 Calculation . 10
9.2 Expression of results . . 10
10 Validity of the test .10
11 Statistical analysis .10
11.1 General . 10
11.2 Range-finding test . 10
11.3 Definitive test . 11
12 Test report .11
Annex A (informative) Conditions for culture of Enchytraeus sp .13
Annex B (informative) Test procedure using other Enchytraeus species .15
Annex C (normative) Determination of maximum water holding capacity .17
Annex D (informative) Detailed description of extraction techniques .18
Annex E (informative) Overview of the statistical assessment of data (NOEC determination) .20
Bibliography .21
iii
© ISO 2022 – All rights reserved
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO/FDIS 16387:2022(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and nongovernmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to
the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see
www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,
Biological characterization, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN)
Technical Committee CEN/TC 444, Environmental characterization, in accordance with the Agreement
on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This third edition cancels and replaces the second edition (ISO 16387:2014), which has been technically
revised.
The main changes are as follows:
— correction of the vapor pressure value to update Clause 1 according to the recommendations of
ECHA/OECD;
— addition (in Annex D) of an extraction method of enchytraeids with colloidal silica, suitable for
Enchytraeus crypticus.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iv
© ISO 2022 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO/FDIS 16387:2022(E)
Introduction
Ecotoxicological test systems are applied to obtain information about the effects of contaminants in
[38]
soil and are proposed to complement conventional chemical analysis. ISO 15799 includes a list and
short characterization of recommended and standardized test systems. Aquatic test systems with soil
eluate are applied to obtain information about the fraction of contaminants potentially reaching the
groundwater by the water path (retention function of soils), whereas terrestrial test systems are used
to assess the habitat function of soils. For the latter, a standardized test system using Enchytraeidae (a
chronic test with endpoint reproduction) is proposed.
This document describes a method that is based on the determination of acute and sublethal effects of
contaminated soils to adult Enchytraeidae of the genus Enchytraeus. Optionally, the method can be used
for testing substances added to standard soils (e.g. artificial soil) for their sublethal hazard potential to
Enchytraeidae.
Soildwelling annelids of the genus Enchytraeus are ecologically relevant, i.e. they are abundant in
many soils where earthworms are scarce but can also reach high population densities in soils well
inhabited by earthworms. Enchytraeidae can be used in laboratory tests as well as in semi-field and
field studies. From a practical point of view, many Enchytraeus species are easy to handle and breed,
and their generation time is significantly shorter than that of earthworms [the test duration for a
reproduction test with Enchytraeidae is four weeks to six weeks, compared to eight weeks (12 weeks
including synchronization) with earthworms]. In addition, a much smaller volume of soil is needed in
the enchytraeid test compared to the amount needed in earthworm tests.
This document has been drawn up taking into consideration test procedures recommended by the
[24],[25]
Organization for Economic Cooperation and Development (OECD ).
v
© ISO 2022 – All rights reserved
---------------------- Page: 5 ----------------------
FINAL DRAFT INTERNATIONAL STANDARD ISO/FDIS 16387:2022(E)
Soil quality — Effects of contaminants on Enchytraeidae
(Enchytraeus sp.) — Determination of effects on
reproduction
1 Scope
This document specifies one of the methods for evaluating the habitat function of soils and determining
effects of soil contaminants and substances on the reproduction of Enchytraeus sp. by dermal and
alimentary uptake in a chronic test. It is applicable to soils and soil materials of unknown quality, for
example, from contaminated sites, amended soils, soils after remediation, agricultural or other sites
under concern and waste materials.
This document provides information on how to use this method for testing substances under temperate
conditions.
The method is not applicable to substances, for which the air/soil partition coefficient is greater than 1,
or to substances for which the vapour pressure exceeds 300 Pa at 25 °C.
NOTE No provision is made in the test method for monitoring the persistence of the substance under test.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 10390, Soil, treated biowaste and sludge – Determination of pH
ISO 10694, Soil quality — Determination of organic and total carbon after dry combustion (elementary
analysis)
ISO 11260, Soil quality — Determination of effective cation exchange capacity and base saturation level
using barium chloride solution
ISO 11277, Soil quality — Determination of particle size distribution in mineral soil material — Method by
sieving and sedimentation
ISO 11465, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis — Gravimetric
method
ISO 18400206, Soil quality — Sampling — Part 206: Collection, handling and storage of soil under aerobic
conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
1
© ISO 2022 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO/FDIS 16387:2022(E)
3.1
reproduction
mean number of offspring per test vessel after incubation under the specified test conditions
Note 1 to entry: The test period for the determination of the reproduction (definitive test) is six weeks.
Note 2 to entry: Offspring refers to hatched juvenile enchytraeids.
3.2
ECx
effect concentration for x % effect
concentration (mass fraction) of a test substance that causes x % of an effect on a given endpoint within
a given exposure period when compared with a control
EXAMPLE An EC is a concentration estimated to cause an effect on a test end point in 50 % of an exposed
50
population over a defined exposure period.
Note 1 to entry: The ECx is expressed as a percentage of soil to be tested (dry mass) per soil mixture (dry mass).
When substances are tested, the ECx is expressed as mass of the test substance per dry mass of soil, in milligrams
per kilogram.
3.3
LOEC
lowest observed effect concentration
lowest test substance concentration that has a statistically significant effect (probability p < 0,05)
Note 1 to entry: In this test, the LOEC is expressed as a mass of test substance per dry mass of the soil to be
tested. All test concentrations above the LOEC should usually show an effect that is statistically different from
the control.
3.4
NOEC
no observed effect concentration
highest test substance concentration immediately below the LOEC (3.3) at which no effect is observed
Note 1 to entry: In this test, the concentration corresponding to the NOEC, has no statistically significant effect
(p < 0,05) within a given exposure period when compared with the control.
3.5
test mixture
mixture of contaminated soil or test substance (e.g. chemical, biosolid, waste) with control soil (3.10)
3.6
test mixture ratio
ratio between the soil to be tested and the control soil (3.10) in a test mixture (3.5)
3.7
contaminant
substance or agent present in the soil as a result of human activity
3.8
reference soil
uncontaminated soil with comparable pedological properties (nutrient concentrations, pH, organic
carbon content and texture) to the soil being studied
3.9
standard soil
field-collected soil or artificial soil whose main properties (pH, texture, organic matter content) are
within a known range
EXAMPLE Euro soils, artificial soil, LUFA Standard soil.
Note 1 to entry: The properties of standard soils can differ from the soil to be tested.
2
© ISO 2022 – All rights reserved
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO/FDIS 16387:2022(E)
3.10
control soil
reference (3.8) or standard soil (3.9) used as a control and as a medium for preparing dilution series
with soils to be tested or a reference substance, which fulfils the validity criteria
Note 1 to entry: In the case of natural soil, it is advisable to demonstrate its suitability for a test and for achieving
the test validity criteria before using the soil in a definitive test.
4 Principle
The effects on survival and reproduction of adult Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) exposed to a dilution
range of contaminated soil or range of concentrations of a test substance are determined. Test mixtures
are prepared at the start of the test and are not renewed within the test period.
The test can be divided into two distinct steps: a short (two weeks) test in which the range of toxic
effects (mainly mortality) is determined, and a long-term (six weeks) definitive test in which the
survival of parental worms and the fecundity (number of juveniles) are measured. The results obtained
from the tests are compared with a control and are used to determine the dilutions or concentrations
which cause no effects on survival and reproduction (NOEC) and the concentration (dilution) resulting
in x % reduction of juveniles hatched from cocoons compared to the control (ECx, 42 d).
All test dilutions/concentrations above the LOEC have a harmful effect equal to, or greater than that
observed at the LOEC. Where there is no prior knowledge of the dilution/concentration of the test
substance likely to have an effect, then it is useful to conduct the test in two steps:
— an acute toxicity test (range-finding test) to give an indication of the effect dilution/concentration,
and the dilution/concentration giving no mortality (NOEC). Dilutions/concentrations to be used in
the definitive test can then be selected;
— a definitive test on reproduction to determine sublethal effects of (dilutions of) contaminated
soil or the concentration of a substance which, when evenly mixed into the standard soil, causes
no significant effects on numbers of offspring hatched from cocoons compared with the control
(NOEC), and the lowest concentration causing effects (LOEC).
NOTE A suitable reference soil is used to demonstrate the appropriate status of the test population and to
avoid misinterpretation of results.
Effects of substances are assessed using a standard soil, preferably a defined artificial soil substrate.
For contaminated soils, the effects are determined in the soil to be tested and in a control soil. According
to the objective of the study, the control and dilution substrate (dilution series of contaminated soil) are
either an uncontaminated soil comparable to the soil to be tested (reference soil) or a standard soil (e.g.
artificial soil).
5 Reagents and material
5.1 Biological material, recommended test species is Enchytraeus albidus Henle 1837 (white
potworm; Enchytraeidae, subclass: Oligochaeta, phylum: Annelida). E. albidus is one of the largest
enchytraeid species, measuring 15 mm to 40 mm, and has a world-wide distribution (see, for example,
References [22] and [32]). It can be easily recognized by two characteristics: four setae per bundle
ventrally, and the very long seminal duct in the clitellum region as well as some segments behind
it. The species can be found in marine, limnic and terrestrial habitats, mainly in decaying organic
matter (seaweed, compost) and only rarely in meadows. This broad ecological tolerance and some
morphological variations indicate that the species probably consists of several races (or ecotypes).
E. albidus can be obtained commercially, since it is sold as food for fish. It should be verified whether
such a culture is contaminated by other, usually smaller species (see, for example, References [7], [10]
and [33]). If contamination of the culture occurs, all worms are washed in water in a Petri dish. With
the help of a stereomicroscope, large adult specimens of E. albidus are selected to start a new culture.
All other worms of the original culture are discarded. E. albidus can be bred easily in a wide range of
3
© ISO 2022 – All rights reserved
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO/FDIS 16387:2022(E)
organic materials (see Annex A) and has a short life cycle, reaching maturity between 33 d (at 18 °C)
and 74 d (at 12 °C). Only cultures which have been kept in the laboratory for at least five weeks (one
generation cycle) without problems shall be used for testing purposes.
Other species of the genus Enchytraeus, especially the true soilinhabiting but smaller species E. crypticus
Westheide and Graefe 1992 or E. buchholzi Vejdovsky 1879, are also suitable as test organisms (see
Annex B). If other species of Enchytraeus are used, they shall be clearly identified and the rationale for
the selection of the species as well as deviations of the experimental method should be reported in this
case.
The worms used in the tests should be adult with eggs (white spots) in the clitellum region and
should have approximately the same size (approximately 15 mm for E. albidus). A synchronisation of
the breeding culture is not necessary. The Enchytraeidae should be acclimatised in the reference soil,
the standard soil or the untreated artificial soil under test conditions for at least 24 h prior to testing.
During this period, the same food which is used as a food source in the test should be given in sufficient
amount.
For one test, an excess number of adult clitellate worms should be taken from the culture box without
observing them in detail in order to get enough suitable worms. At the end of the acclimatization period,
only worms with eggs and behaving as usual (e.g. not trying to leave the artificial soil) are selected
for the test. This selection is made by placing the worms in a Petri dish filled with a small amount of
water under a stereomicroscope and discarding the animals without eggs. A freshwater medium (e.g.
reconstituted water as described in Reference [23]) should preferably be used, since demineralized
water or tap water (risk of copper contamination) can harm the Enchytraeidae. During this process,
other organisms living in the cultures, such as mites, are also removed from the worms.
NOTE An example of culturing Enchytraeus sp. is given in Annex A.
5.2 Test mixture, which may consist of field-collected soil or control soil amended by the test
substance.
5.2.1 Field-collected soil or waste
The sample(s) can be field-collected soil from an industrial, agricultural or other site of concern, or
waste materials (e.g. dredged material, municipal sludge from a wastewater treatment plant, composed
material, or manure) under consideration for possible land disposal.
The fields soils used in the test shall be passed through a sieve of 4 mm square mesh to remove coarse
fragments and thoroughly mixed. If necessary, soil may be air-dried without heating before sieving.
Storage of soils to be tested should be as short as possible. The soil shall be stored in accordance
with ISO 18400206 using containers that minimize losses of soil contaminants by volatilisation and
sorption to the container walls. Soil pH should not be corrected as it can influence bioavailability of soil
contaminants.
For interpretation of test results, the following characteristics shall be determined for each soil sampled
from a field site:
a) pH in accordance with ISO 10390;
b) texture (sand, loam, silt) in accordance with ISO 11277;
c) water content in accordance with ISO 11465;
d) water holding capacity in accordance with Annex C;
e) cation exchange capacity in accordance with ISO 11260;
f) organic carbon in accordance with ISO 10694.
The water holding capacity of all mixtures used in the test should also be measured.
4
© ISO 2022 – All rights reserved
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO/FDIS 16387:2022(E)
5.2.2 Control soil, either a) reference (3.8) or b) standard soil (3.9) that allows the presence of
Enchytraeidae (at least the validity criteria shall be fulfilled). Control soil and soil used for dilution shall
not differ in one test (either a) or b)).
a) If reference soils from uncontaminated areas near a contaminated site are available, they should
be treated and characterized like the soils to be tested. If a toxic contamination or unusual soil
properties cannot be ruled out, standard control soils should be preferred.
b) For testing the effects of substances mixed into soil, standard soil (e.g. artificial soil, LUFA) shall be
used as test substrate. The properties of the field-collected standard soil shall be reported.
The substrate called artificial soil can be used as a standard soil and has the following composition:
Percentage expressed
on dry mass basis
— Sphagnum peat finely ground and with no visible plant remains 10 %
— Kaolinite clay containing not less than 30 % kaolinite 20 %
— Industrial quartz sand (dominant fine sand with more than 69 %
50 % of particle size 0,05 mm to 0,2 mm)
Approximately 0,3 % to 1,0 % calcium carbonate (CaCO , pulverised, analytical grade) are necessary to
3
get a pH of 6,0 ± 0,5.
NOTE Taking the properties of highly nonpolar (log K > 2, where K is the octanol/water coefficient) or
ow ow
ionizing substances into account, 5 % of peat have proven to be sufficient for maintaining the desired structure
[25]
of the artificial soil .
Prepare the artificial soil at least three days prior to start the test, by mixing the dry constituents
listed above thoroughly in a large-scale laboratory mixer. A portion of the deionized water required
is added while mixing is continued. The amount of calcium carbonate required can vary, depending
on properties of the individual batch of sphagnum peat and should be determined by measuring sub
samples immediately before the test. Store the mixed artificial soil at room temperature for at least two
days to equilibrat
...
PROJET
NORME ISO/FDIS
FINAL
INTERNATIONALE 16387
ISO/TC 190/SC 4
Qualité du sol — Effets des
Secrétariat: AFNOR
contaminants sur les Enchytraeidae
Début de vote:
2022-12-26 (Enchytraeus sp.) — Détermination
des effets sur la reproduction
Vote clos le:
2023-02-20
Soil quality — Effects of contaminants on Enchytraeidae
(Enchytraeus sp.) — Determination of effects on reproduction
TRAITEMENT PARALLÈLE ISO/CEN
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET SONT
INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS OBSER-
VATIONS, NOTIFICATION DES DROITS DE PRO-
PRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT ÉVENTUELLEMENT
CONNAISSANCE ET À FOURNIR UNE DOCUMEN-
TATION EXPLICATIVE.
OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR
ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES FINS
INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET COM-
Numéro de référence
MERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE
ISO/FDIS 16387:2022(F)
DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE
CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR POSSI-
BILITÉ DE DEVENIR DES NORMES POUVANT
SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA RÉGLEMENTA-
TION NATIONALE. © ISO 2022
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO/FDIS 16387:2022(F)
PROJET
NORME ISO/FDIS
FINAL
INTERNATIONALE 16387
ISO/TC 190/SC 4
Qualité du sol — Effets des
Secrétariat: AFNOR
contaminants sur les Enchytraeidae
Début de vote:
2022-12-26 (Enchytraeus sp.) — Détermination
des effets sur la reproduction
Vote clos le:
2023-02-20
Soil quality — Effects of contaminants on Enchytraeidae
(Enchytraeus sp.) — Determination of effects on reproduction
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2022
TRAITEMENT PARALLÈLE ISO/CEN
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET SONT
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS OBSER-
VATIONS, NOTIFICATION DES DROITS DE PRO-
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
PRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT ÉVENTUELLEMENT
ISO copyright office
CONNAISSANCE ET À FOURNIR UNE DOCUMEN-
TATION EXPLICATIVE.
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR
ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES FINS
Tél.: +41 22 749 01 11
INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET COM-
Numéro de référence
E-mail: copyright@iso.org
MERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE
ISO/FDIS 16387:2022(F)
Web: www.iso.org
DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE
Publié en Suisse
CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR POSSI-
BILITÉ DE DEVENIR DES NORMES POUVANT
SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA RÉGLEMENTA-
ii
© ISO 2022 – Tous droits réservés
TION NATIONALE. © ISO 2022
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO/FDIS 16387:2022(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 3
5 Réactifs et matériel . 4
6 Appareillage . 6
7 Environnement d’essai .7
8 Mode opératoire . 7
8.1 Dispositif expérimental . 7
8.1.1 Généralités . 7
8.1.2 Essai préliminaire . 7
8.1.3 Essai définitif . 7
8.2 Préparation des mélanges d’essai . 8
8.2.1 Essais sur sol contaminé . 8
8.2.2 Essais sur substances ajoutées au substrat d’essai . 9
8.2.3 Préparation du récipient témoin . 9
8.3 Ajout de nourriture . 10
8.4 Ajout du matériel biologique . 10
8.5 Conditions d’essai et mesurages . 10
8.6 Substance de référence . 10
9 Calcul et expression des résultats .11
9.1 Calculs . 11
9.2 Expression des résultats . 11
10 Validité de l’essai .11
11 Analyse statistique .11
11.1 Généralités . 11
11.2 Essai préliminaire. 11
11.3 Essai définitif .12
12 Rapport d’essai .12
Annexe A (informative) Conditions de culture d’Enchytraeus sp. .14
Annexe B (informative) Mode opératoire d’essais menés avec d’autres espèces du genre
Enchytraeus . .16
Annexe C (normative) Détermination de la capacité maximale de rétention d’eau .18
Annexe D (informative) Description détaillée des techniques d’extraction .20
Annexe E (informative) Présentation de l’évaluation statistique des données (détermination
de la CSEO) .22
Bibliographie .23
iii
© ISO 2022 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO/FDIS 16387:2022(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient en particulier de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document
a été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www.iso.org/brevets).
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l'Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www.iso.org/iso/fr/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Caractérisation biologique, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 444, Caractérisation
environnementale, du Comité européen de normalisation (CEN), conformément à l'Accord de coopération
technique entre l'ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette troisième édition annule et remplace la deuxième édition (ISO 16387:2014), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
Les principales modifications sont les suivantes:
— correction des valeurs de pression de vapeur aux fins de mise à jour de l’Article 1, conformément
aux recommandations de l’Agence européenne des produits chimiques (ECHA)/de l’Organisation de
coopération et de développement économiques (OCDE);
— ajout (à l’Annexe D) d’une méthode d’extraction des enchytréides, appropriée à l’extraction
d’Enchytraeus crypticus, et utilisant la silice colloïdale.
Il convient que l'utilisateur adresse tout retour d'information ou toute question concernant le présent
document à l'organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/members.html.
iv
© ISO 2022 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO/FDIS 16387:2022(F)
Introduction
Les systèmes d’essais écotoxicologiques sont mis en œuvre pour obtenir des informations sur les effets
des contaminants du sol et sont proposés en complément des analyses chimiques conventionnelles.
[38]
L’ISO 15799 comporte une liste ainsi qu’une brève caractérisation des systèmes d’essais
recommandés et normalisés. Les systèmes d’essais aquatiques mis en œuvre sur éluat de sol sont
utilisés pour obtenir des informations sur la fraction de contaminants susceptible d’atteindre les eaux
souterraines du fait de la circulation de l’eau (fonction de rétention des sols), tandis que les systèmes
d’essais terrestres servent à évaluer la fonction d’habitat des sols. Concernant les seconds, un système
d’essai normalisé utilisant des Enchytraeidae (un essai chronique prenant la reproduction comme
critère d’effet) est proposé.
Le présent document décrit une méthode basée sur la détermination des effets aigus et sublétaux des
sols contaminés sur les Enchytraeidae adultes du genre Enchytraeus. La méthode peut éventuellement
être utilisée pour évaluer le potentiel toxique sublétal sur les Enchytraeidae de substances ajoutées à un
sol standard (par exemple, un sol artificiel).
Les annélides endogés du genre Enchytraeus sont pertinents sur le plan écologique, car ils abondent
dans un grand nombre de sols dans lesquels les vers de terre sont rares; cependant, ils peuvent
également atteindre de fortes densités de population dans des sols largement peuplés de vers de terre.
Les Enchytraeidae peuvent être soumis à des essais en laboratoire ainsi qu’à des études en conditions
semi-naturelles et à des études in situ. D’un point de vue pratique, de nombreuses espèces d’Enchytraeus
sont faciles à manipuler et à élever et leur temps de génération est nettement plus court que celui des
vers de terre [la durée des essais de reproduction des Enchytraeidae est de quatre à six semaines, contre
huit semaines (12 semaines en incluant la synchronisation) pour les vers de terre]. De plus, le volume de
sol nécessaire pour les essais menés sur les enchytréides est nettement inférieur au volume nécessaire
pour les essais sur les vers de terre.
Le présent document a été rédigé en tenant compte des protocoles d’essai recommandés par
[24],[25]
l’Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE ).
v
© ISO 2022 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 5 ----------------------
PROJET FINAL DE NORME INTERNATIONALE ISO/FDIS 16387:2022(F)
Qualité du sol — Effets des contaminants sur les
Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) — Détermination des
effets sur la reproduction
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie l’une des méthodes permettant d’évaluer la fonction d’habitat des sols et
de déterminer les effets des contaminants du sol et des substances sur la reproduction d’Enchytraeus sp.
par absorption cutanée et ingestion au cours d’un essai chronique. Il est applicable aux sols et aux
matériaux de type sol de qualité inconnue provenant, par exemple, de sites contaminés, de sols amendés,
de sols après remédiation, de sols agricoles ou d’autres sites d’intérêt, et de déchets.
Le présent document fournit des informations sur la manière d’utiliser cette méthode pour évaluer des
substances en conditions tempérées.
Cette méthode ne s’applique pas aux substances pour lesquelles le coefficient de partage air/sol est
supérieur à 1, ou pour lesquelles la pression de vapeur à 25 °C est supérieure à 300 Pa.
NOTE La méthode d’essai ne contient aucune disposition permettant de surveiller la persistance de la
substance soumise à essai.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l'édition citée s'applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 10390, Sols, biodéchets traités et boues — Détermination du pH
ISO 10694, Qualité du sol — Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche
(analyse élémentaire)
ISO 11260, Qualité du sol — Détermination de la capacité d'échange cationique et du taux de saturation en
bases échangeables à l'aide d'une solution de chlorure de baryum
ISO 11277, Qualité du sol — Détermination de la répartition granulométrique de la matière minérale des
sols — Méthode par tamisage et sédimentation
ISO 11465, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau — Méthode
gravimétrique
ISO 18400-206, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 206: Collecte, manipulation et conservation de
sols destinés à l'évaluation de paramètres biologiques fonctionnels et structurels en laboratoire
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L'ISO et l'IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l'adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l'adresse https:// www .electropedia .org/
1
© ISO 2022 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO/FDIS 16387:2022(F)
3.1
reproduction
nombre moyen de jeunes produits par récipient d’essai après incubation dans les conditions d’essai
spécifiées
Note 1 à l'article: La période d’essai d’évaluation de la reproduction (essai définitif) est de six semaines.
Note 2 à l'article: Les «jeunes produits» désignent les jeunes enchytréides ayant éclos.
3.2
CEx
concentration efficace à x %
concentration (fraction massique) d’une substance soumise à essai qui, par rapport à un témoin,
engendre x % d’un effet sur un critère d’effet donné pendant une période d’exposition définie
EXEMPLE Une CE est une concentration estimée produire un effet, pour le critère d’effet de l’essai,
50
chez 50 % d’une population exposée sur une période d’exposition définie.
Note 1 à l'article: La CEx est exprimée en pourcentage du sol soumis à essai (masse sèche) par mélange de sols
(masse sèche). Lorsque des substances sont soumises à essai, la CEx est exprimée en masse de la substance
soumise à essai par masse sèche de sol, en milligrammes par kilogramme.
3.3
CMEO
concentration minimale avec effet observé
plus faible concentration de substance soumise à essai ayant un effet statistiquement significatif
(probabilité p < 0,05)
Note 1 à l'article: Dans le présent essai, la CMEO est exprimée en masse de substance soumise à essai par masse
sèche du sol soumis à essai. Il convient généralement que toutes les concentrations d’essai supérieures à la CMEO
aient un effet statistiquement différent du témoin.
3.4
CSEO
concentration sans effet observé
plus haute concentration de substance soumise à essai immédiatement inférieure à la CMEO (3.3), pour
laquelle aucun effet n’est observé
Note 1 à l'article: Dans le présent essai, la concentration correspondant à la CSEO n’a aucun effet statistiquement
significatif (p < 0,05) par rapport au témoin au cours d’une période d’exposition définie.
3.5
mélange d’essai
mélange de sol contaminé ou de substance soumise à essai (par exemple, substance chimique, biosolide,
déchet) et de sol témoin (3.10)
3.6
ratio de mélange d’essai
ratio entre le sol soumis à essai et le sol témoin (3.10) dans un mélange d’essai (3.5)
3.7
contaminant
substance ou agent présent(e) dans le sol du fait de l’activité humaine
3.8
sol de référence
sol non contaminé dont les propriétés pédologiques (concentrations en éléments nutritifs, pH, teneur en
carbone organique et texture) sont similaires à celles du sol analysé
2
© ISO 2022 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO/FDIS 16387:2022(F)
3.9
sol standard
sol prélevé sur le terrain ou sol artificiel dont les propriétés principales (pH, texture, teneur en matières
organiques) se situent dans une gamme connue
EXEMPLE Euro sols, sol artificiel, sol standard LUFA.
Note 1 à l'article: Les propriétés des sols standard peuvent être différentes de celles du sol soumis à essai.
3.10
sol témoin
sol de référence (3.8) ou sol standard (3.9) satisfaisant aux critères de validité, et utilisé comme témoin
et comme milieu pour la préparation des gammes de dilutions avec les sols soumis à essai ou avec une
substance de référence
Note 1 à l'article: Dans le cas d’un sol naturel, il est recommandé de démontrer son aptitude aux essais et sa
capacité à satisfaire aux critères de validité de l’essai avant de l’utiliser dans un essai définitif.
4 Principe
Les effets sur la survie et la reproduction d’Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) adultes exposés à une série
de dilutions d’un sol contaminé ou à une gamme de concentrations d’une substance soumise à essai
sont déterminés. Les mélanges d’essai sont préparés au début de l’essai et ne sont pas renouvelés au
cours de la période d’essai.
L’essai peut être scindé en deux étapes distinctes: un essai de courte durée (deux semaines), au cours
duquel la gamme de concentrations entraînant des effets toxiques (principalement la mortalité) est
déterminée, et un essai définitif à long terme (six semaines), au cours duquel la survie des vers adultes
et la fécondité (nombre de jeunes) sont mesurées. Les résultats obtenus lors des essais sont comparés
à ceux obtenus avec un témoin et utilisés pour déterminer les dilutions ou les concentrations qui ne
provoquent pas d’effet sur la survie et la reproduction (CSEO) ainsi que la concentration (dilution) qui
entraîne une réduction de x % du nombre de jeunes éclos des cocons par rapport au témoin (CEx, 42 j).
Toutes les dilutions/concentrations d’essai supérieures à la CMEO ont un effet nocif égal ou supérieur
à celui observé à la CMEO. Lorsque la dilution/concentration à laquelle la substance soumise à essai
est susceptible de produire un effet n’est pas connue au préalable, il est utile de réaliser l’essai en
deux étapes:
— un essai de toxicité aiguë (essai préliminaire), pour obtenir une indication de la dilution/
concentration produisant un effet et de la dilution/concentration n’entraînant pas de mortalité
(CSEO). Les dilutions/concentrations à utiliser pour l’essai définitif peuvent ensuite être choisies;
— un essai définitif sur la reproduction, pour déterminer les effets sublétaux (des dilutions) du sol
contaminé ou de la concentration d’une substance qui, mélangé(e) de façon homogène dans le sol
standard, n’a pas d’effet significatif sur le nombre de jeunes produits éclos des cocons comparé au
témoin (CSEO), ainsi que la plus faible concentration produisant un effet (CMEO).
NOTE Un sol de référence approprié est utilisé pour démontrer le bon état de la population soumise à essai
et pour éviter toute erreur d’interprétation des résultats.
Les effets des substances sont évalués à l’aide d’un sol standard, de préférence un substrat de sol
artificiel défini. Pour les sols contaminés, les effets sont déterminés dans le sol soumis à essai et dans
un sol témoin. Selon l’objectif de l’étude, les substrats témoin et de dilution (série de dilutions d’un sol
contaminé) correspondent à un sol non contaminé comparable au sol soumis à essai (sol de référence)
ou à un sol standard (par exemple, sol artificiel).
3
© ISO 2022 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO/FDIS 16387:2022(F)
5 Réactifs et matériel
5.1 Matériel biologique, l’espèce recommandée pour l’essai est Enchytraeus albidus Henle 1837
(enchytréide; Enchytraeidae, sous-classe: Oligochaeta, embranchement: Annelida). E. albidus, l’une des
plus grandes espèces d’enchytréides, se caractérise par une taille de 15 mm à 40 mm et une répartition
géographique mondiale (voir, par exemple, les références bibliographiques [22] et [32]). Cette espèce
est facilement reconnaissable grâce à deux caractéristiques: quatre soies par faisceau sur la face
ventrale et un très long canal séminal dans la région du clitellum et de quelques segments postérieurs.
Cette espèce peut être présente en habitat marin, limnique et terrestre, principalement dans les
matières organiques en décomposition (varech, compost) et seulement rarement dans les prairies.
Cette tolérance écologique très étendue, ainsi que certaines variations morphologiques, indiquent que
cette espèce englobe probablement plusieurs races (ou écotypes). E. albidus peut être obtenue dans le
commerce, puisqu’elle est vendue comme nourriture pour poissons. Il convient de vérifier si ce type de
culture n’est pas contaminé par d’autres espèces de taille généralement inférieure (voir, par exemple,
les références bibliographiques [7], [10] et [33]). En cas de contamination de la culture, tous les vers
sont lavés à l’eau dans une boîte de Petri. Les spécimens adultes d’E. albidus de grande taille sont
sélectionnés à l’aide d’un stéréomicroscope pour démarrer une nouvelle culture. Tous les autres vers
issus de la culture initiale sont éliminés. E. albidus peut être facilement élevée dans un grand nombre de
matériaux organiques (voir l’Annexe A); cette espèce présente un cycle de vie court, la maturité étant
atteinte entre 33 j (à 18 °C) et 74 j (à 12 °C). Seules les cultures ayant été conservées au laboratoire
pendant au moins cinq semaines (soit un cycle de génération) sans problème doivent être utilisées pour
les essais.
D’autres espèces du genre Enchytraeus, telles que E. crypticus Westheide et Graefe 1992 ou E. buchholzi
Vejdovsky 1879, espèces vivant spécifiquement dans le sol, mais plus petites, sont également admises
en tant qu’organismes soumis à essai (voir l’Annexe B). Si d’autres espèces du genre Enchytraeus
sont utilisées, elles doivent être clairement identifiées et il convient de mentionner les raisons pour
lesquelles ces espèces ont été choisies, ainsi que les écarts par rapport à la méthode d’essai.
Il convient que les vers soumis aux essais soient des individus adultes porteurs d’œufs (points blancs)
dans la région du clitellum et qu’ils soient de taille approximativement égale (environ 15 mm pour
E. albidus). Il n’est pas nécessaire de synchroniser la culture d’élevage. Il convient d’acclimater les
Enchytraeidae dans le sol de référence, dans le sol standard ou dans un sol artificiel non traité, dans les
conditions de l’essai, pendant au moins 24 h avant l’essai. Durant cette période, il convient de distribuer,
en quantité suffisante, la nourriture qui sera également utilisée comme source d’alimentation durant
l’essai.
Pour un essai, il convient de prélever dans la boîte d’élevage un échantillon surnuméraire de vers adultes
possédant un clitellum, sans les observer en détail, afin de disposer d’une population de vers appropriée
suffisante. Au terme de la période d’acclimatation, seuls les vers porteurs d’œufs et présentant un
comportement habituel (par exemple, n’essayant pas de s’échapper du sol artificiel) sont sélectionnés
pour l’essai. La sélection est effectuée en observant au stéréomicroscope les vers placés dans une boîte
de Petri contenant une faible quantité d’eau et en éliminant les animaux dépourvus d’œufs. Il convient
d’utiliser, de préférence, un milieu d’eau douce (par exemple, de l’eau reconstituée selon la méthode
décrite dans la référence bibliographique [23]), car l’eau déminéralisée ou l’eau du robinet (risque de
contamination au cuivre) peut s’avérer nocive pour les Enchytraeidae. Au cours de ce processus, les
autres organismes vivant dans les cultures, tels que les acariens, sont également séparés des vers.
NOTE Un exemple d’élevage d’Enchytraeus sp. figure à l’Annexe A.
5.2 Mélange d’essai, qui peut être constitué d’un sol prélevé sur le terrain ou d’un sol témoin amendé
par la substance soumise à essai.
5.2.1 Sol prélevé sur le terrain ou déchets
Le ou les échantillons de sol peuvent être un sol
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.