ISO/FDIS 6888-2

Microbiology of the food chain -- Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species)

Microbiologie de la chaîne alimentaire -- Méthode horizontale pour le dénombrement des staphylocoques à coagulase positive (Staphylococcus aureus et autres espèces)

General Information

• Status: Published
• ICS: 07.100.30 - Food microbiology
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 9 - Microbiology
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 9/WG 13 - Coagulase positive staphylococci
• Current Stage: 5020 - FDIS ballot initiated: 2 months. Proof sent to secretariat
• Start Date: 29-Jan-2021
• Completion Date: 29-Jan-2021

RELATIONS

• Revised: ISO 6888-2:1999 - Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species)
• Effective Date: 23-Apr-2020
• Revised: ISO 6888-2:1999/Amd 1:2003 - Inclusion of precision data
• Effective Date: 23-Apr-2020

Standards Content (sample)

FINAL
INTERNATIONAL ISO/FDIS
DRAFT
STANDARD 6888-2
ISO/TC 34/SC 9
Microbiology of the food chain —
Secretariat: AFNOR
Horizontal method for the
Voting begins on:
2021-01-29 enumeration of coagulase-positive
staphylococci (Staphylococcus aureus
Voting terminates on:
2021-03-26
and other species) —
Part 2:
Method using rabbit plasma
fibrinogen agar medium
ISO/CEN PARALLEL PROCESSING
RECIPIENTS OF THIS DRAFT ARE INVITED TO
SUBMIT, WITH THEIR COMMENTS, NOTIFICATION
OF ANY RELEVANT PATENT RIGHTS OF WHICH
THEY ARE AWARE AND TO PROVIDE SUPPOR TING
DOCUMENTATION.
IN ADDITION TO THEIR EVALUATION AS
Reference number
BEING ACCEPTABLE FOR INDUSTRIAL, TECHNO-
ISO/FDIS 6888-2:2021(E)
LOGICAL, COMMERCIAL AND USER PURPOSES,
DRAFT INTERNATIONAL STANDARDS MAY ON
OCCASION HAVE TO BE CONSIDERED IN THE
LIGHT OF THEIR POTENTIAL TO BECOME STAN-
DARDS TO WHICH REFERENCE MAY BE MADE IN
NATIONAL REGULATIONS. ISO 2021
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ISO/FDIS 6888-2:2021(E)
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be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting

on the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address

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ISO/FDIS 6888-2:2021(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ................................................................................................................................................................................................................................vi

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 2

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 2

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

4.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 2

4.2 Incubation ................................................................................................................................................................................................... 2

4.3 Enumeration ............................................................................................................................................................................................. 3

5 Culture media and reagents ...................................................................................................................................................................... 3

6 Equipment and consumables .................................................................................................................................................................. 3

7 Sampling ........................................................................................................................................................................................................................ 4

8 Preparation of the test sample ............................................................................................................................................................... 4

9 Procedure (see Figure A.1) ........................................................................................................................................................................ 4

9.1 Test portion, initial suspension and dilutions .............................................................................................................. 4

9.2 Inoculation and incubation .......................................................................................................................................................... 4

9.3 Counting of colonies ........................................................................................................................................................................... 5

9.3.1 General description of colonies growing on RPFA medium ....................................................... 5

9.3.2 Colonies counting procedure ................................................................................................................................ 5

10 Expression of results ........................................................................................................................................................................................ 5

11 Performance characteristics of the method ............................................................................................................................. 5

11.1 Interlaboratory study ........................................................................................................................................................................ 5

11.2 Repeatability limit ................................................................................................................................................................................ 5

11.3 Reproducibility limit .......................................................................................................................................................................... 6

12 Test report ................................................................................................................................................................................................................... 7

13 Quality assurance ................................................................................................................................................................................................ 7

Annex A (normative) Flow diagram of the procedure ........................................................................................................................ 8

Annex B (normative) Culture media and reagents ................................................................................................................................ 9

Annex C (informative) Results of the interlaboratory study .....................................................................................................12

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................14

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ISO/FDIS 6888-2:2021(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www .iso .org/

iso/ foreword .html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,

Microbiology, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN) Technical

Committee CEN/TC 463, Microbiology of the food chain, in accordance with the Agreement on technical

cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).

This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 6888-2:1999), which has been technically

revised. It also incorporates the Amendment ISO 6888-2:1999/Amd 1:2003. The main changes compared

with the previous edition are as follows:
— the title has been changed to relate to the “food chain”;
— the status of ISO 6888-1 and this document has been clarified;

— the document has been aligned with ISO 7218:2007, i.e. and pour molten agar medium at 44 °C to 47 °C;

— all occurrences, when appropriate, have been changed from “35 °C or 37 °C” to “34 °C to 38 °C”;

— all occurrences of incubation time, when appropriate, have been changed from “18 h to 24 h” to

“24 h ± 2 h”;
— requirements have been added to use ISO 11133;
— all available standards related to sampling techniques have been updated;
— flow diagram procedure in Annex A has been updated;

— culture media and reagent with performance testing has been added and moved in Annex B;

— performance testing for rabbit plasma fibrinogen agar (RPFA) medium has been added;

— results of the interlaboratory study (from ISO 6888-2:1999/Amendment 1:2003 Precision data) has

been updated;
— the Bibliography has been updated.
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ISO/FDIS 6888-2:2021(E)
A list of all parts in the ISO 6888 series can be found on the ISO website.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
© ISO 2021 – All rights reserved v
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ISO/FDIS 6888-2:2021(E)
Introduction

ISO 6888-1, this document and ISO 6888-3 describe three horizontal methods for the detection

and enumeration of coagulase-positive staphylococci among which enterotoxinogenic strains are

encountered. It is mainly concerned with Staphylococcus aureus, but also with S. intermedius and certain

strains of S. hyicus.

For the purposes of this document, the characterization of staphylococci is based on a positive coagulase

reaction, but it is recognized that some strains of Staphylococcus aureus give weakly positive coagulase

reactions. These latter strains can be confused with other bacteria but they can be distinguished from

such other bacteria by the use of additional tests not included in this document, such as the sensitivity

to lysostaphin, the production of haemolysin, thermostable nuclease and acid from mannitol (see

ISO 7218 and Reference [13]).

The main technical changes listed in the Foreword, introduced in this document compared with the

previous edition, are considered as minor (see ISO 17468). They have a minor impact on the performance

characteristics of the method.

Results of the interlaboratory study and tested samples are described in Annex C.

vi © ISO 2021 – All rights reserved
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FINAL DRAFT INTERNATIONAL STANDARD ISO/FDIS 6888-2:2021(E)
Microbiology of the food chain — Horizontal method
for the enumeration of coagulase-positive staphylococci
(Staphylococcus aureus and other species) —
Part 2:
Method using rabbit plasma fibrinogen agar medium

WARNING — In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that tests

for enumerating staphylococci are only undertaken in properly equipped laboratories, under

the control of a skilled microbiologist and that great care is taken in the disposal of all incubated

materials. Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.

This document does not purport to address all of the safety aspects, if any, associated with its

use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices.

1 Scope

This document specifies a horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci

by counting the colonies obtained on a solid medium (rabbit plasma fibrinogen medium) after aerobic

incubation at 34 °C to 38 °C (see Reference [10]).
This document is applicable to:
— products intended for human consumption;
— products intended for animal feeding;
— environmental samples in the area of food and feed production and handling;
— samples from the primary production stage.

This horizontal method was originally developed for the examination of all samples belonging to the

food chain.

Because of the large variety of products in the food chain, it is possible that this horizontal method is not

appropriate in every detail for all products. Nevertheless, it is expected that the required modifications

are minimized so that they do not result in a significant deviation from this horizontal method.

Based on the information available at the time of publication of this document, this method is not

considered to be (fully) suited to the examination of fermented products or other products containing

technological flora based on Staphylococcus spp. (e.g. S. xylosus) (such as cheeses made from raw milk

and certain raw meat products) likely to be contaminated by:
— staphylococci forming atypical colonies on a Baird-Parker agar medium;
— background flora that can obscure the colonies being sought.
Nevertheless, both ISO 6888-1 and this document are given equivalent status.
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ISO/FDIS 6888-2:2021(E)
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 6887 (all parts), Microbiology of the food chain — Preparation of test samples, initial suspension and

decimal dilutions for microbiological examination

ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for

microbiological examinations

ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and

performance testing of culture media
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
3.1
coagulase-positive staphylococci

bacteria that form typical colonies in a selective culture medium (rabbit plasma fibrinogen agar medium)

Note 1 to entry: The typical colonies are described in 9.3.
3.2
enumeration of coagulase-positive staphylococci

determination of the number of coagulase-positive staphylococci (3.1) per gram, per millilitre, per square

centimetre or per sampling device/sampled area.

Note 1 to entry: A sampled area is an area not defined by a numerical size, for example, a hot tap, a door handle.

4 Principle
4.1 General

Preparation of poured plate of the rabbit plasma fibrinogen agar medium, with a specified quantity of

the test sample if the product is liquid or with a specified quantity of the initial suspension in the case

of other products.

Inoculation, under the same conditions, using decimal dilutions of the test sample, follow the

procedure(s) in accordance with ISO 7218.

NOTE The volume of rabbit plasma and fibrinogen agar medium to be added to the inoculum is a critical

point for the coagulase method and reaction.
4.2 Incubation

Aerobic incubation of the plates at 34 °C to 38 °C and examination after 24 h and, if necessary, after 48 h.

2 © ISO 2021 – All rights reserved
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ISO/FDIS 6888-2:2021(E)
4.3 Enumeration

Calculation of the number of coagulase-positive staphylococci per gram, per millilitre, per square

centimetre or per sampling device of sample from the number of typical colonies obtained on plates

at dilution levels chosen to give a significant result within the counting limits of the method and in

accordance with ISO 7218.
NOTE See Annex A for a flow diagram.
5 Culture media and reagents
Follow current laboratory practices in accordance with ISO 7218.

The composition of culture media and reagents and their preparation are specified in Annex B.

For performance testing of culture media and reagents, follow the procedures in accordance with either

Annex B or ISO 11133, or both.
For the diluent(s), see the relevant part of the ISO 6887 series.
6 Equipment and consumables

Disposable equipment is an acceptable alternative to reusable glassware if it has suitable specifications.

Usual microbiological laboratory equipment (see ISO 7218) and, in particular, the following.

6.1 Apparatus for dry sterilization (oven) and wet sterilization (autoclave).
See ISO 7218.

6.2 Incubator, capable for maintaining the inoculated media, within the temperature range 34 °C

to 38 °C.

NOTE The range 34 °C to 38 °C for incubation of media includes the use of incubators set at 35 °C ± 1 °C,

36 °C ± 2 °C or 37 °C ± 1 °C.

6.3 Water bath, or similar apparatus, capable of being maintained at 44 °C to 47 °C.

6.4 Sterile Petri dishes, with a diameter of approximately 90 mm, made of glass or plastic.

6.5 Sterile graduated pipettes or automatic pipettes of nominal capacities 1 ml, 2 ml and 10 ml,

graduated in 0,1 ml, 0,1 ml and 0,5 ml divisions, respectively. See ISO 7218.

Graduated pipettes and pipettor tips should be fitted with a non-absorbent cotton wool plug to prevent

contamination when used to manipulate microbial cultures.

6.6 pH-meter, it shall be capable of being read to the nearest 0,01 pH unit, enabling measurements

to be made with a tolerance of ±0,1 pH unit. The pH meter shall be equipped with either manual or

automatic temperature compensation. See ISO 7218.
6.7 Refrigerator, capable of operating at 5 °C ± 3 °C.

6.8 Sterile tubes, bottles or flasks with caps, of appropriate capacity. Bottles or flasks with non-toxic

metallic or plastic screw-caps may be used.
6.9 Membranes, with 0,2 µm pore size.
© ISO 2021 – All rights reserved 3
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ISO/FDIS 6888-2:2021(E)
7 Sampling

Sampling is not part of the method specified in this document. Follow the specific International

Standard dealing with the product concerned. If there is no specific International Standard dealing

with the sampling of the product concerned, the parties concerned should come to an agreement on this

subject.
Recommended sampling techniques are given in the following documents:
— ISO/TS 17728 for food and animal feed;
— ISO 707 for milk and milk products;
— ISO 6887-3 for fish and fishery products;
— ISO 13307 for the primary production stage;
— ISO 17604 for carcasses;
— ISO 18593 for surfaces.

It is important that the laboratory receive a sample that is representative. The sample should not have

been damaged or changed during transport or storage.
8 Preparation of the test sample

Prepare the test sample from the laboratory sample in accordance with the specific International

Standard dealing with the product concerned: follow the procedures specified in the ISO 6887 series

and if necessary ISO 18593. If there is no specific International Standard available, the parties concerned

should come to an agreement on this subject.
9 Procedure (see Figure A.1)
9.1 Test portion, initial suspension and dilutions
See the relevant part of the ISO 6887 series.
9.2 Inoculation and incubation

Transfer, by means of a sterile pipette (6.5), 1 ml of the test sample if liquid, or 1 ml of the initial

suspension (10 dilution) in the case of other products, to a Petri dish (see Annex B). For enumeration

techniques in microbiology of the food chain, the number of Petri dishes to be used according tested

dilutions is stated in ISO 7218. Repeat the procedure for further decimal dilutions if necessary.

Into each Petri dish (6.4), immediately pour 18 ml to 20 ml freshly prepared complete medium (B.2.3)

to obtain a depth of at least 3 mm.
Carefully mix
...

PROJET
NORME ISO/FDIS
FINAL
INTERNATIONALE 6888-2
ISO/TC 34/SC 9
Microbiologie de la chaîne
Secrétariat: AFNOR
alimentaire — Méthode horizontale
Début de vote:
2021-01-29 pour le dénombrement des
staphylocoques à coagulase positive
Vote clos le:
2021-03-26
(Staphylococcus aureus et autres
espèces) —
Partie 2:
Méthode utilisant le milieu gélosé au
plasma de lapin et au fibrinogène
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the
enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus
aureus and other species) —
Part 2: Method using rabbit plasma fibrinogen agar medium
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET SONT
INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS OBSER-
VATIONS, NOTIFICATION DES DROITS DE PRO-
TRAITEMENT PARALLÈLE ISO/CEN
PRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT ÉVENTUELLEMENT
CONNAISSANCE ET À FOURNIR UNE DOCUMEN-
TATION EXPLICATIVE.
OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR
ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES FINS
INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET COM-
Numéro de référence
MERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE
ISO/FDIS 6888-2:2021(F)
DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE
CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR POSSI-
BILITÉ DE DEVENIR DES NORMES POUVANT
SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA RÉGLEMENTA-
TION NATIONALE. ISO 2021
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ISO/FDIS 6888-2:2021(F)
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Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette

publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,

y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut

être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.

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CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: [phone]
E-mail: [e-mail]
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Publié en Suisse
ii © ISO 2021 – Tous droits réservés
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ISO/FDIS 6888-2:2021(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ................................................................................................................................................................................................................................vi

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 2

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 2

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

4.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 2

4.2 Incubation ................................................................................................................................................................................................... 3

4.3 Dénombrement ....................................................................................................................................................................................... 3

5 Milieux de culture et réactifs ................................................................................................................................................................... 3

6 Équipement et consommables ............................................................................................................................................................... 3

7 Échantillonnage ..................................................................................................................................................................................................... 4

8 Préparation de l’échantillon pour essai ....................................................................................................................................... 4

9 Mode opératoire (voir la Figure A.1) ............................................................................................................................................... 4

9.1 Prise d’essai, suspension mère et dilutions ................................................................................................................... 4

9.2 Ensemencement et incubation .................................................................................................................................................. 4

9.3 Comptage des colonies ..................................................................................................................................................................... 5

9.3.1 Description générale des colonies en croissance sur un milieu RPFA............................... 5

9.3.2 Mode opératoire de comptage des colonies ............................................................................................. 5

10 Expression des résultats............................................................................................................................................................................... 5

11 Caractéristiques de performance de la méthode ............................................................................................................... 5

11.1 Étude interlaboratoiress ................................................................................................................................................................. 5

11.2 Limite de répétabilité ........................................................................................................................................................................ 6

11.3 Limite de reproductibilité ............................................................................................................................................................. 6

12 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................... 7

13 Assurance qualité ................................................................................................................................................................................................ 7

Annexe A (normative) Logigramme du mode opératoire ............................................................................................................... 8

Annexe B (normative) Milieux de culture et réactifs ........................................................................................................................... 9

Annexe C (informative) Résultats de l’étude interlaboratoiress ..........................................................................................12

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................15

© ISO 2021 – Tous droits réservés iii
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ISO/FDIS 6888-2:2021(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/ directives).

L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion

de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/ iso/ fr/ avant -propos.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-

comité SC 9, Microbiologie, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 463, Microbiologie de la

chaîne alimentaire, du Comité européen de normalisation (CEN), conformément à l’Accord de coopération

technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).

Cette seconde édition annule et remplace la première édition (ISO 6888-2:1999), qui a fait l’objet

d’une révision technique. Elle intègre également l’Amendement de l’ISO 6888-2:1999/Amd 1:2003. Les

principales modifications par rapport à l’édition précédente sont les suivantes:
— le titre a été modifié pour faire référence à la « chaîne alimentaire »;
— le statut de l’ISO 6888-1 et du présent document a été clarifié;

— le document a été aligné sur l’ISO 7218:2007, c’est-à-dire qu’il indique de verser le milieu gélosé

fondu à une température comprise entre 44 °C et 47 °C;

— toutes les occurrences de « 35 °C ou 37 °C », le cas échéant, ont été remplacées par « entre 34 °C

et 38 °C »;

— toutes les occurrences des durées d’incubation « 18 h à 24 h », le cas échéant, ont été remplacées

par « 24 h ± 2 h »;
— des exigences ont été ajoutées pour utiliser l’ISO 11133;

— toutes les normes disponibles concernant les techniques de prélèvement ont été mises à jour;

— le mode opératoire sous forme de logigramme à l’Annexe A a été mis à jour;
iv © ISO 2021 – Tous droits réservés
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ISO/FDIS 6888-2:2021(F)

— les milieux de culture et les réactifs avec essais de performance ont été ajoutés et déplacés à

l’Annexe B;

— les essais de performance pour le milieu gélosé au plasma de lapin et au fibrinogène (RPFA) ont été

ajoutés;

— les résultats de l’étude interlaboratoires (selon les données de fidélité de l’ISO 6888-2:1999/

Amendement 1:2003) ont été mis à jour;
— la Bibliographie a été mise à jour.

Une liste de toutes les parties de la série ISO 6888 se trouve sur le site web de l’ISO.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
© ISO 2021 – Tous droits réservés v
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ISO/FDIS 6888-2:2021(F)
Introduction

L’ISO 6888-1, le présent document et l’ISO 6888-3 décrivent trois méthodes horizontales pour la

détection et le dénombrement de staphylocoques à coagulase positive parmi lesquels se trouvent

les souches entérotoxinogènes. Il s’agit principalement de Staphylococcus aureus, mais également

de S. intermedius et de certaines souches de S. hyicus.

Pour les besoins du présent document, la caractérisation des staphylocoques repose sur une réaction

positive à la coagulase, mais il est reconnu que certaines souches de Staphylococcus aureus donnent

une réaction faiblement positive à la coagulase. Ces dernières souches peuvent être confondues avec

d’autres bactéries, mais elles peuvent être distinguées de ces autres bactéries en utilisant des essais

complémentaires non inclus dans le présent document, tels que la sensibilité à la lysostaphine, la

production d’hémolysine, de nucléase thermostable et d’acide à partir de mannitol (voir l’ISO 7218 et

la Référence [13]).

Les principales modifications techniques listées dans l’avant-propos qui ont été apportées au présent

document par rapport à la précédente édition sont considérées comme mineures (voir l’ISO 17468).

Ils ont un impact mineur sur les caractéristiques de performance de la méthode.

Les résultats de l’étude interlaboratoires et les échantillons soumis à essai sont décrits à l’Annexe C.

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PROJET FINAL DE NORME INTERNATIONALE ISO/FDIS 6888-2:2021(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode
horizontale pour le dénombrement des staphylocoques
à coagulase positive (Staphylococcus aureus et autres
espèces) —
Partie 2:
Méthode utilisant le milieu gélosé au plasma de lapin et au
fibrinogène

AVERTISSEMENT — Afin de préserver la santé du personnel de laboratoire, il est essentiel que

les essais de dénombrement des staphylocoques ne soient effectués que dans des laboratoires

correctement équipés, sous la surveillance d’un microbiologiste expérimenté, et qu’un grand

soin soit apporté à l’élimination de tous les matériaux incubés. Il convient que les utilisateurs

du présent document maîtrisent les pratiques courantes de laboratoire. Le présent document

ne prétend pas aborder la totalité des aspects liés à la sécurité qui pourraient découler de son

utilisation. Il incombe à l’utilisateur de ce document d’établir des pratiques appropriées en

matière d’hygiène et de sécurité.
1 Domaine d’application

Le présent document spécifie une méthode horizontale de dénombrement des staphylocoques à

coagulase positive par comptage des colonies obtenues en milieu solide (milieu au plasma de lapin et au

fibrinogène) après incubation en aérobiose entre 34 °C et 38 °C (voir la Référence [10]).

Le présent document s’applique aux:
— produits destinés à la consommation humaine;
— produits destinés à l’alimentation des animaux;

— échantillons environnementaux prélevés dans les secteurs de la production et de la distribution des

aliments; et
— échantillons prélevés au stade de production primaire.

Cette méthode horizontale a été élaborée à l’origine pour l’examen de tous les échantillons appartenant

à la chaîne alimentaire.

En raison de la grande diversité des produits de la chaîne alimentaire, il est possible que cette méthode

horizontale ne soit pas entièrement appropriée à tous les produits. Néanmoins, il est attendu que les

modifications requises soient réduites le plus possible afin de ne pas s’écarter de manière significative

de cette méthode horizontale.

D’après les informations disponibles au moment de la publication du présent document, cette méthode

n’est pas considérée comme étant (complètement) adaptée à l’examen des produits fermentés ou d’autres

produits contenant une flore technologique fondée sur Staphylococcus spp. (par exemple, S. xylosus)

(tels que les fromages à base de lait cru et certains produits à base de viande crue) susceptibles d’être

contaminés par:

— des staphylocoques formant des colonies non caractéristiques sur un milieu gélosé de Baird-Parker;

— une flore annexe pouvant masquer les colonies recherchées.
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Néanmoins, l’ISO 6888-1 et le présent document bénéficient d’un statut équivalent.

2 Références normatives

Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur

contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.

Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les

éventuels amendements).

ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie de la chaîne alimentaire — Préparation des échantillons, de la

suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations

ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l'eau — Préparation, production,

stockage et essais de performance des milieux de culture
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp;

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/ .
3.1
staphylocoques à coagulase positive

bactéries formant des colonies caractéristiques dans un milieu de culture sélectif (milieu gélosé au

plasma de lapin et au fibrinogène)
Note 1 à l'article: Les colonies caractéristiques sont décrites en 9.3.
3.2
dénombrement des staphylocoques à coagulase positive

détermination du nombre de staphylocoques à coagulase positive (3.1) par gramme, millilitre,

centimètre carré ou dispositif de prélèvement/zone de prélèvement

Note 1 à l'article: Une zone de prélèvement est une zone qui n’est pas définie par une taille numérique, par exemple

un robinet d’eau chaude ou une poignée de porte.
4 Principe
4.1 Généralités

Ensemencement en profondeur du milieu gélosé au plasma de lapin et au fibrinogène, avec une quantité

déterminée de l’échantillon pour essai si le produit est liquide, ou avec une quantité déterminée de la

suspension mère dans le cas d’autres produits.

Dans les mêmes conditions, ensemencement des dilutions décimales obtenues à partir de l’échantillon

pour essai en suivant le ou les modes opératoires conformément à l’ISO 7218.

NOTE Le volume de milieu gélosé au plasma de lapin et au fibrinogène à ajouter à l’inoculum joue un rôle

essentiel dans la méthode et la réaction de coagulase.
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4.2 Incubation

Incubation des boîtes entre 34 °C et 38 °C en aérobiose et examen après 24 h et, si nécessaire, après 48 h.

4.3 Dénombrement

Calcul du nombre de staphylocoques à coagulase positive par gramme, par millilitre, par centimètre

carré ou par dispositif de prélèvement à partir du nombre de colonies caractéristiques, obtenues sur les

boîtes retenues aux niveaux de dilution donnant un résultat significatif dans les limites de comptage de

la méthode et conformément à l’ISO 7218.
NOTE Voir l’Annexe A relative au logigramme.
5 Milieux de culture et réactifs
Suivre les pratiques courantes de laboratoire conformément à l’ISO 7218.

La composition des milieux de culture et des réactifs et leur préparation sont décrites à l’Annexe B.

Pour les essais de performance des milieux de culture et des réactifs, suivre les modes opératoires

conformément à l’Annexe B ou à l’ISO 11133, ou aux deux.
Pour les diluants, voir la partie correspondante de la série de normes ISO 6887.
6 Équipement et consommables

Le matériel à usage unique est acceptable au même titre que la verrerie réutilisable, à condition que ses

spécifications soient convenables.

Matériel courant de laboratoire de microbiologie (voir l’ISO 7218) et, en particulier, ce qui suit.

6.1 Appareil pour la stérilisation en chaleur sèche (four) et en chaleur humide (autoclave).

Voir l’ISO 7218.

6.2 Étuve permettant de maintenir les milieux ensemencés à l’intérieur d’une plage de température

comprise entre 34 °C et 38 °C.

NOTE La plage de température comprise entre 34 °C et 38 °C pour l’incubation de milieux inclut l’utilisation

d’étuves réglées à 35 °C ± 1 °C, à 36 °C ± 2 °C ou à 37 °C ± 1 °C.

6.3 Bain d’eau, ou dispositif similaire, pouvant être maintenu à une température entre 44 °C et 47 °C.

6.4 Boîtes de Petri, stériles, d’environ 90 mm de diamètre, en verre ou en matière plastique.

6.5 Pipettes graduées ou pipettes automatiques stériles, d’une capacité nominale de 1 ml, 2 ml

et 10 ml, graduées respectivement en 0,1 ml, 0,1 ml et 0,5 ml. Voir l’ISO 7218.

Il convient que les pipettes graduées et les cônes des pipettes soient munis d’un bouchon en coton

non absorbant pour empêcher la contamination lors de la manipulation de cultures microbiennes.

6.6 pH-mètre ayant une précision de lecture de ± 0,01 unité pH, permettant de réaliser des mesures

précises à ± 0,1 unité pH. Le pH-mètre doit être équipé d’un système de compensation de température

soit manuel, soit automatique. Voir l’ISO 7218.
6.7 Réfrigérateur, pouvant fonctionner à 5 °C ± 3 °C.
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6.8 Tubes à essai, flacons ou fioles avec bouchons, de capacités appropriées. Des flacons ou fioles

avec bouchons à vis métalliques ou plastiques non toxiques peuvent être utilisés.

6.9 Membranes, d’une porosité de 0,2 µm.
7 Échantillonnage

L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document. Suivre la Norme

internationale spécifique du produit concerné. S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique

traitant de l’échantillonnage du produit concerné, il convient que les parties concernées se mettent

d’accord à ce sujet.

Des techniques d’échantillonnage recommandées sont décrites dans les documents suivants:

— ISO/TS 17728 pour les aliments et les aliments pour animaux;
— ISO 707 pour le lait et les produits laitiers;
— ISO 6887-3 pour les produits de la pêche;
— ISO 13307 pour le stade de production primaire;
— ISO 17604 pour les carcasses;
— ISO 18593 pour les surfaces.

Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon représentatif. Il convient que l’échantillon n’ait

pas été endommagé ni modifié au cours du transport ou du stockage.
8 Préparation de l’échantillon pour essai

Préparer l’échantillon pour essai à partir de l’échantillon de laboratoire, conformément à la Norme

internationale spécifique du produit concerné: suivre les modes opératoires spécifiés dans la série de

normes ISO 6887 et, si nécessaire, dans l’ISO 18593. S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique,

il convient que les parties concernées se mettent d’accord à ce sujet.
9 Mode opératoire (voir la Figure A.1)
9.1 Prise d’essai, suspension mère et dilutions
Voir la partie correspondante de la série de normes ISO 6887.
9.2 Ensemencement et incubation

Transférer, à l’aide d’une pipette stérile (6.5), 1 ml de l’échantillon pour essai s’il est liquide ou 1 ml de

la suspension mère (dilution 10 ) pour les autres produits, dans une boîte de Petri (voir l’Annexe B).

Pour les techniques de dénombrement en microbiologie de la chaîne alimentaire, le nombre de boîtes de

Petri à utiliser en fonction des dilutions soumises à essai est indiqué dans l’ISO 7218. Répéter le mode

opératoire pour les dilutions décimales suivantes si nécessaire.

Dans chaque boîte de Petri (6.4), verser immédiatement 18 ml à 20 ml de milieu complet (B.2.3) préparé

extemporanément de manière à obtenir une profondeur d’au moins 3 mm.

Mélanger soigneusement l’inoculum au milieu de culture et laisser solidifier en posant les boîtes de

Petri sur une surface horizontale.

Après solidification complète, retourner les boîtes préparées selon les instructions ci-dessus et les

placer dans l’étuve (6.2) réglée à une température comprise entre 34 °C et 38 °C pendant 24 h ± 2 h.

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Après 24 h ± 2 h d’incubation, marquer sur le fond des boîtes les emplacements des colonies

caractéristiques éventuellement présentes. Si nécessaire, incuber à nouveau toutes les boîtes entre

34 °C et 38 °C pendant 24 h ± 2 h supplémentaires et marquer les nouvelles colonies caractéristiques.

NOTE Même si le milieu RPFA contient un inhibiteur de trypsine, les colonies d’apparence caractéristique

après 24 h ± 2 h d’incubation peuvent perdre leur aspect caractéristique au bout de 48 h ± 4 h d’incubation,

[11]

en raison de processus enzymatiques (trypsine) ou d’une croissance secondaire . Un seul comptage au bout

de 24 h ± 2 h peut entraîner des dénombrements trop faibles ou l’absence totale de dénombrement.

9.3 Comptage des colonies
9.3.1 Description générale des colonies en croissance sur un milieu RPFA

Les colonies caractéristiques sont noires ou grises, petites et entourées d’un halo opaque de

précipitation, indiquant une activité de coagulase. Les colonies de Proteus peuvent ressembler à

celles des staphylocoques à coagulase positive au début de l’incubation. Cependant, elles peuvent être

distinguées des staphylocoques après 24 h ± 2 h et 48 h ± 4 h d’incubation, car leurs colonies deviennent

plus ou moins brunâtres et commencent à s’étendre.
9.3.2 Mode opératoire de comptage des colonies

À la fin de la période d’incubation (voir 9.2), compter les colonies caractéristiques dans chaque boîte.

Lors de la lecture des boîtes après 24 h, marquer sur le fond des boîtes les emplacements des colonies

caractéristiques éventuellement présentes, avant de poursuivre l’incubation.

Si les boîtes sont à nouveau incubées entre 34 °C et 38 °C pendant 24 h ± 2 h, marquer les nouvelles

colonies caractéristiques.

Pour le dénombrement, retenir uniquement les boîtes contenant 300 colonies maximum,

dont 100 colonies caractéristiques.
L’une des boîtes doit renfermer au moins 10 colonies.

NOTE Comme la gélose au plasma de lapin et au fibrinogène est fondée sur une réaction de coagulase, il n’est

pas nécessaire de confirmer cette activité.

Lorsqu’il est attendu que le nombre d’ufc soit au niveau ou proche de la limite de détermination, il

est préférable d’utiliser des boîtes en double. En cas d’utilisation de boîtes en double exemplaire, il

convient que le minimum pour la somme de colonies soit 10. Dans ce cas, il est attendu que le niveau de

contamination soit supérieur à 5 ufc/ml pour les échantillons liquides ou supérieur à 50 ufc/g pour les

échantillons solides.
10 Expression des résultats

Pour le calcul des résultats, suivre le ou les modes opératoires de l’ISO 7218. Calculer et reporter les

résultats comme le nombre de staphylocoques à coagulase positive, exprimé en ufc (unité formant

colonie), par gramme, millilitre, centimètre carré ou dispositif de prélèvement.

Si aucune colonie du micro-organisme cible n’a été détectée, suivre l’ISO 7218 pour exprimer les

résultats des cas particuliers.
11 Caractéristiques de performance de la méthode
11.1 Étude interlaboratoiress

Les résultats de l’étude interlaboratoires visant à déterminer la fidélité de la méthode sont résumés

à l’Annexe C. Les limites de répétabilité et de reproductibilité ont été déterminées à l’aide de quatre

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types d’échantillons (fromage, viande, poudre d’œuf et matériaux de référence) présentant différents

niveaux de contamination.

Les valeurs obtenues dans l’étude interlaboratoires peuvent ne pas être applicables aux plages de

concentrations et aux types d’échantillons autres que ceux donnés à l’Annexe C.
11.2 Limite de répétabilité

La différence absolue entre deux résultats d’essai individuels indépendants (transformés en log )

(nombre de staphylocoques à coagulase positive par gramme ou par millilitre) ou le rapport, sur une

échelle normale, entre le plus élevé et le plus bas des deux résultats d’essai obtenus à l’aide de la même

méthode sur un matériau identique soumis à l’essai dans le même laboratoire par le même opérateur

utilisant le même appareillage dans un intervalle de temps le plus court possible, n’excédera que

dans 5 % des cas au plus la limite de répétabilité r.

Les valeurs suivantes (médianes des valeurs par matrice et par niveau de contamination, voir

l’Annexe C) pour la limite de répétabilité r sont données à titre indicatif et peuvent être utilisées dans

un cadre général d’analyse des aliments:

— r = 0,22, plage [0,13; 0,33] (exprimé en différence absolue de log entre les résultats d’analyse); ou

— r = 1,70, plage [1,35; 2,14] (exprimé comme rapport, sur une échelle normale, entre

...