ISO 10272:1995
(Main)Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for detection of thermotolerant Campylobacter
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for detection of thermotolerant Campylobacter
Describes a horizontal method for the detection of thermotolerant Campylobacter in food and animal feeding stuffs.
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche de Campylobacter thermotolérants
La présente Norme internationale décrit une méthode horizontale pour la recherche de Campylobacter thermotolérants. La présente Norme internationale est applicable aux produits destinés à la consommation humaine ou à l'alimentation animale, avec les quelques restrictions signalées dans l'introduction.
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL
ISO
STANDARD
10272
First edition
1995-10-15
Microbiology of food and animal feeding
- Horizontal method for detection
stuffs
of thermotolerant Campylobacter
Microbiologie des alimen ts - Methode horizontale pour Ia recherche de
Campylobacter thermotokrants
Reference number
ISO 10272: 1995(E)
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ISO 10272:1995(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national Standards bodies (ISO member bodies). The work
of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Esch member body interested in a subject for
which a technical committee has been established has the right to be
represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard ISO 10272 was prepared by Technical Committee
Agrkultural food products, sc 9,
lSO/TC 34, Subcommittee
Microbiology.
Annexes A and B form an integral part of this International Standard.
0 ISO 1995
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronie or mechanical, including photocopying and
microfilm, without Permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
Case Postale 56 l CH-I 211 Geneve 20 l Switzerland
Printed in Switzerland
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0 ISO
ISO 10272:1995(E)
Introduction
Because of the large variety of food and feed products, this horizontal
method may not be appropriate in every detail for certain products, and for
some other products it may be necessary to use different methods.
Nevertheless, it is hoped that in all cases every attempt will be made to
apply this horizontal method as far as possible and that deviations from
this will only be made if absolutely necessary for technical reasons.
When this International Standard is next reviewed, account will be taken
of all information then available regarding the extent to which this hori-
zontal method has been followed and the reasons for deviations from this
in the case of particular products.
The harmonization of test methods cannot be immediate and, for certain
group of products, International Standards and/or national Standards may
already exist that do not comply with this horizontal method. lt is hoped
that when such Standards are reviewed they will be changed to comply
with this International Standard so that eventually the only remaining de-
partures from this horizontal method will be those necessary for well-
established technical reasons.
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INTERNATIONAL STANDARD 0 ISO ISO 10272:1995(E)
Microbiology of food and animal feeding stuffs -
Horizontal method for detection of thermotolerant
Campylobacter
3.1 thermotolerant Campylobacter: Microorgan-
1 Scope
isms forming characteristic colonies on solid selective
media when incubated at 42 “C and which possess
This International Standard describes a horizontal
the characteristic motility and biochemical properties
method for the detection of thermotolerant Campylo-
described when the test is conducted in accordance
bacter.
with this International Standard.
It is applicable to products intended for human con-
sumption or for the feeding of animals, subject to the
3.2 detection of thermotolerant Campylobacter:
Iimitations started in the introduction.
Determination of the presence or absence of these
microorganisms in a defined quantity of product,
when the test is conducted in accordance with this
International Standard.
2 Normative references
The following Standards contain provisions which,
4 Principle
through reference in this text, constitute provisions
of this International Standard. At the time of publica-
In general, the detection of thermotolerant
tion, the editions indicated were valid. All Standards
Campylobacter requires the following stages (see an-
are subject to revision, and Parties to agreements
nex A for a diagram of the procedure):
based on this International Standard are encouraged
to investigate the possibility of applying the most re-
cent editions of the Standards indicated below.
4.1 Enrichment in the liquid medium
Members of IEC and ISO maintain registers of cur-
rently valid International Standards.
Inoculation of the test Portion in one of two liquid
enrichment media:
ISO 6887: 1983, Microbiology - General guidance for
the preparation of dilutions for microbiological exam-
- Preston broth, or
ina tion.
- Park and Sanders broth when the Sample or the
ISO 7218: -J) Microbiology of food and animal feed-
product it Comes from has received some physical
ing stuffs - ’ General rules for microbiological exam-
treatment, for example freezing, which could entail
ina tions.
bacterial stress.
Incubation in a microaerophilic atmosphere (5 % oxy-
3 Definitions
gen and, for example, IO % carbon dioxide and 85 %
nitrogen):
For the purposes of this International Standard, the
following definitions apply. - at 42” C for 18 h for the Preston broth;
1) To be published. (Revision of ISO 7218:1985)
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ISO 10272:1995(E)
- at 32 “C for 4 h, then at 37 "C for 2 h and, finally, 5.3 Selective plating-out media
at 42 “C for 40 h to 42 h for the Park and Sanders
broth.
53.1 Karmali agar
NOTE 1 Since Campylobacter spp. are very sensitive, it
See B.3.
is recommended that they should not be frozen, that they
should be stored at + 3 "C + 2 OC, and subjected to analy-
sis as rapidly as possible.
5.3.2 Modified Butzler agar
See B.4.
4.2 Plating out and identification
From the cultures obtained in 4.1, inoculation of solid 5.3.3 Skirrow agar
selective media:
See B.5.
- Karmali agar and another solid selective medium
[modified Butzler agar, Skirrow agar, charcoal
53.4 Charcoal cefoperazone deoxycholate agar
cefoperazone deoxycholate agar (CCDA) or
(CCDA)
Preston agar].
See B.6.
Incubation at 42 “C in a microaerophilic atmosphere
(5 % Oxygen and, for example, 10 % carbon dioxide
and 85 % nitrogen) and inspection after 48 h, 72 h
5.3.5 Preston agar
and, if necessary, 5 days, to detect the presence of
colonies presumed to be thermotolerant Campylo-
See B.7.
bacter.
5.4 Identification media and reagents
4.3 Confirmation
5.4.1 Baucella broth
Subculturing of the colonies presumed to be
thermotolerant Campylobacter and which were plated
See B.8.
out in 4.2, then confirmation by means of appropriate
biochemical tests.
5.4.2 Columbia blood agar
See B.9.
5 Culture media and reagents
5.4.3 Reagent for the detection of oxidase
5.1 General
See B.lO.
For current laboratory practice, see ISO 7218.
NOTE 2 Because of the large number of culture media
5.4.4 Triple sugar/iron(lll) agar (TSI agar)
and reagents, it is considered preferable for the clarity of the
text to give their compositions and preparations in
See B.11.
annex B.
5.4.5 Hydrogen peroxide Solution, 3 %
5.2 Liquid enrichment media
5.4.6 Reagents for the detection of the hydrolysis
5.2.1 Preston broth of hippurate
See B.12.
See B.I.
5.2.2 Park and Sanders broth 5.4.7 Mueller Hinton blood agar
See B.13.
See B.2.
2
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0 ISO ISO 10272:1995(E)
6.12 Forceps, fine, round-ended, of stainless steel.
6 Apparatus and glassware
NOTE 3 Disposable apparatus is an acceptable alterna-
6.13 Microscope, if possible with Phase contrast
tive to re-u seable glassware, if it has similar specifications.
the characteristic movement of
(for observing
Campylobacter-).
Usual microb ological laboratory equipment and, in
particular, the followin .
4
6.14 Appropriate apparatus for growth in a
microaerophilic atmosphere and for allowing a con-
sterilization (oven) or wet
6.1 Apparatus for dry
stant Oxygen content of 5 % and, for example, a car-
steril ization (autoclave)
bon dioxide content of 10 % and nitrogen content of
85 % to be maintained throughout the incubation.
See ISO 7218.
Use appropriate gastight Containers able to hold
NOTE 5
6.2 Drying cabinet or oven, ventilated by con-
Petri dishes and/or flasks or bottles of about 350 ml ca-
vection, capable of operating between 37 “C + 1 “C
-
pacity used for the enrichment broth; e.g. bacteriological
and 55 “C + 1 “C.
-
anaerobic jars. A microaerophilic atmosphere with an oxy-
gen content of between 3 % and 6 % may be obtained
using commercially available gas-generating kits (follow
6.3 Incubator, capable of operating at
precisely the manufacturers instructions, particularly those
42 “C + 1 OC.
-
relating to the volume of the jar and the capacity of the
gas-generating kit). Alternatively, sparging of the jar Prior to
6.4 Water baths, capable of operating at
incubation with a gas mixture containing 5 % Oxygen in
“C + 1 “C, 32 “C + 1 “C, 37 “C + 1 “C and
25 - -
IO % carbon dioxide and 85 % nitrogen may be used.
42 “C T 1 “C, or incubators capable of operating at
25 “C + 1 “C, 32 “C + 1 “C and 37 “C + 1 “C.
- - -
7 Sampling
bath, capable of operating at
6.5 Water
lt is important that the laboratory receive a Sample
47 “C + 2 “C.
-
which is truly representative and has not been dam-
aged or changed during transport or storage.
6.6 pH-meter, capable of being read to the nearest
0,Ol pH unit at 25 “C.
Sampling is not part of the method specified in this
International Standard. If there is no specific Inter-
6.7 Containers, in particular culture tubes of di-
national Standard dealing with sampling of the product
mensions 18 mm x 180 mm and 9 mm x 180 mm,
concerned, it is recommended that the Parties con-
haemolysis tubes of dimensions 13 mm x 75 mm,
cerned come to an agreement on this subject.
bottles with non-toxic metal closures and/or flasks
of appropriate capacity with appropriate covers or
8 Preparation of test Sample
plugged with cotton wool to allow gases to pass so
that a microaerophilic atmosphere tan be achieved
Prepare the test Sample in accordance with the
when needed.
specific International Standard dealing with the prod-
uct concerned. If there is no specific International
Petri dishes, in glass or plastic, with a diameter
6.8
Standard, it is recommended that the Parties con-
between 90 mm and 100 mm.
cerned come to an agreement on this subject.
6.9 Total-delivery graduated pipettes, with a wide
opening, and a nominal capacity of 1 ml and 10 ml,
9 Procedure
graduated respectively in 0,l ml and 0,5 ml divisions,
and Pasteur pipettes.
9.1 Test Portion, initial Suspension and
dilutions
6.10 Rubber teats, or any other safety System
capable of being adapted to the graduated pipettes.
9.1.1 See ISO 6887 and the specific Internationa
Standard dealing with the product concerned.
6.11 Loops, of platinum/iridium or nickel/chromium,
approximately 3 mm in diameter, and wires of the
9.1.2 In general, for preparing the initial Suspension,
same material, or a glass rod.
introduce a quantity x of the test Portion (mass or
volume) into a 9x volume of the enrichment medium,
NOTE 4 A nickel/chromium loop is not suitable for use in
the oxidase test (see 9.5.5.1). Preston broth (5.2.1) or Park and Sanders broth
3
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0 ISO
ISO 10272:1995(E)
spread. On the Butzler and Skirrow agars, the
(5.2.2), so as to obtain a test portion/enrichment me-
dium ratio of 1 /IO (mass/volume or volume/volume characteristic colonies have a greyish to brownish
ratio). colour, and may be of different sizes on the two me-
dia .
9.2 Direct plating out
9.5 Confirmation
For those products suspected of containing a large
As the bacteria need a microaerophilic atmosphere to
quantity of thermotolerant Campylobacter, use a loop
(6.11) to plate the non-incubated initial Suspension survive, follow the procedure described in 9.5.1 to
9.5.2.4 without any delay.
(9.1.2) onto the surface of the Karmali agar (5.3.1) and
another medium (5.3.2, 5.3.3, 5.3.4 or 5.3.5).
9.5.1 Selection of colonies for confirmation
Incubate at 42 “C in a microaerophilic atmosphere
(6.14) with inspection after 48 h, 72 h and, if necess-
Select, for confirmation tests, a total of five typical
ary, 5 days to detect the presence of colonies pre-
and/or suspect colonies from all the inoculated dishes
sumed to be thermotolerant Campylobacter.
(9.2, 9.4.3). If there are less than five, select all the
colonies.
Then proceed as described in 9.4.3 and 9.5.
9.5.2 Examination of morphology and motility
9.3 Enrichment
9.5.2.1 Using a weil-isolated colony, conduct a
9.3.1 If the Preston broth is used, incubate the initial
Gram ’s stain on each of the dishes (9.4.3).
Suspension (9.1.2) at 42 “C in a microaerophilic at-
mosphere (6.14) for 18 h.
9.5.2.2 Emulsify separately each of the colonies
selected in 9.5.1 in 1 ml of Brucella broth (5.4.1).
9.3.2 If the Park and Sanders broth is used, incubate
in a microaerophilic atmosphere (6.14) the initial sus-
9.5.2.3 Examine each of the selected colonies for
Pension (9.1.2) at 32 “C for 4 h, then add the antibiotic
morphology and motility using the microscope (6.13).
Solution B (B.2.4) at a concentration of 5 % (WV). In-
cubate at 37 “C for 2 h, then at 42 “C for 40 h to
9.5.2.4 Retain for further examination all suspen-
42 h.
sions (9.5.2.2) in which curved Gram-negative bacilli
(9.5.2.1) with a spiralling “corkscrew” motility are
found (9.5.2.3).
9.4 Plating out and identification
9.5.3 Study of morphology in a Gram% strain
9.4.1 Using the culture obtained in the enrichment
medium (9.3.1 or 9.3.2) inoculate with a loop (6.11)
Using each selected Suspension (9.5.2.4) inoculate
the surface of the first selective isolation medium, the
with a loop (6.11) the surface of a Columbia blood
Karmali agar (5.3.1).
agar plate (5.4.2) in Order to allow the development
Proceed in the same manner with the second selec- of weil-isolated colonies.
tive isolation medium Chosen (5.3.2, 5.3.3, 5.3.4 or
Incubate the inoculated dishes in a microaerophilic
5.3.5).
atmosphere (6.14) at 42 “C for 24 h and use the pure
cultures for the biochemical tests.
9.4.2 Incubate the dishes (9.4.1) at 42 “C in a
microaerophilic atmosphere (6.14).
9.5.4 Study of growth at 25 “C
9.4.3 After 24 h or, more generally, 48 h and even
Using the colonies isolated in 9.5.3, inoculate, using
3 to 5 days of incubation, examine the dishes to de-
a loop (6.11) a tube of Brucella broth (5.4.1).
tect the presence of characteristic colonies of
thermotolerant Campylobacter. Incubate at 25 “C in a microaerophilic atmosphere
(6.14) for 2 to 5 days.
On the Karmali agar, the characteristic colonies are
greyish, flat and moistened, with a tendency to Examine to check whether or not there is growth.
4
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0 ISO ISO 10272:1995(E)
9.5.5.4 Detection of sensitivity to nalidixic acid
9.5.5 Biochemical tests
and to cephalothin*)
9.5.5.1 Detection of oxidase
Inoculate, using a loop (6.1 l), the colonies selected in
Using a platinum/iridum loop or glass rod (6.11), take
9.5.2.4, in a Suspension of density 0,5 on the Mac-
a Portion of a weil-isolated colony from each individual
Farland scale, into the Brucella broth.
plate (9.5.3) and streak onto a filter Paper moistened
with the oxidase reagent (5.4.3); the appearance of a Then dilute this Suspension 1:lO with the Same broth.
mauve, violet or deep blue colour within 10 s is a
positive reaction. If a commercially available oxidase Flood the surface of a Mueller Hinton 5 % blood agar
in-
test kit is used, follow the manufacturer ’s plate (5.4.7) with the Suspension.
structions.
Leave in contact for 5 min, then drain off excess
Confirm the results using positive and negative con-
Suspension.
trols.
Dry the dishes in the oven (6.2) set at 37 “C for
9.5.5.2 TSI agar (5.4.4)
10 min.
Using the wire (6.11), inoculate the agar with each of
On the surface of the agar, place a disc of nalidixic
the colonies selected in 9.5.3.
acid (30 pg) and a disc of cephalothin (30 pg).
Inoculate the agar slant in longitudinal streaks and
Incubate at 37 “C for 24 h in a microaerophilic atmos-
stab the butt.
phere (6.14).
Incubate at 42 “C for 24 h and extend the incubation
Interpret the bacterial growth in the followi ng manner:
to 5 days if necessary in a microaerophilic atmosphere
(6.14).
- growth that is in contact with the disc is classified
as resistant;
Interpret the reactions in the following manner:
- the presence of a zone of any size due to inhibition
Butt
of growth is classified as sensitive.
Yellow glucose positive (fermen-
tation of glucose)
glucose negative (no fer-
Red or unchanged
mentation of glucose)
9.5.5.5 Detection of hydrolysis of hippurate*)
Black formation of hydrogen sul-
fide (H,S)
In a haemolysis tube (6.7) containing 0,4 ml of the
sodium hippurate Solution (5.4.6), inoculate, using a
Bubbles or Cracks gas formation from
loop (6.11), the colonies selected in 9.5.3 taking care
glucose
not to incorporate any agar.
Slant surface
Shake in Order to mix thoroughly and incubate for
Yellow lactose and/or sucrose
2 h in the water bath (6.4) set at 37 “C.
positive (one or both
sugars used)
Carefully add 0,2 ml of the ninhydrin Solution (B.12.2)
on the top of the sodium hippurate Solution. DO not
Red or unchanged lactose and sucrose nega
Shake.
tive (no sugar used)
Interpret after an additional incubation of 10 min in the
9.5.5.3 Detection of catalase
water bath (6.4) set at 37 “C.
Deposit a loop of culture from the TSI agar (9.5.5.2)
The reaction is positive when the colour is dark violet.
into a drop of hydrogen peroxide Solution (5.4.5) on a
clean microscope slide.
A pale violet colour or no colour Change indicates a
The test is positive if bubbles appear in 30 s. negative reaction.
These tests are useful for differentiating the species of thermotolerant Campylobacter.
2)
5
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0 ISO
ISO 10272:1995(E)
9.6 Interpretation of results 10 Expression of results
Thermotolerant Campylobacter give the following re-
According to the interpretation of the results, indicate
sults:
absence of thermotolerant
the presence or
Campylobacter in a test Portion of x g or x ml of
Campylobacter spp.
product.
Morphology (9.5.2.3) small curved bacilli
Motility (9.5.2.3) characteristic
-
11 Test report
Gram ’s strain (9.5.3)
+
Oxidase (9.5.5.1)
The test report shall indicate
-
Glucose (9.5.5.2)
-
- the method in accordance with which sampling
Lactose (9.5.5.2)
was carried out, if known;
-
Sucrose (9.5.5.2)
-
Gas (9.5.5.2)
- the method used;
Campylobacter spp. are present if at least one co
...
NORME
Iso
INTERNATIONALE
10272
Première édition
1995-10-15
Microbiologie des aliments - Méthode
horizontale pour la recherche de
Campylobacter thermotolérants
Microbiology of food and an lima/ feeding stu fis - Horizontal method for
de tee tion of thermo toleran t Campylobacter
Numéro de référence
ISO 10272: 1995(F)
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 10272:1995(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mités membres votants.
La Norme internationale ISO 10272 a été élaborée par le comité technique
Produits agricoles alimentaires, sous-comité SC 9,
ISO/TC 34,
Microbiologie.
Les annexes A et B font partie intégrante de la présente Norme interna-
tionale.
0 ISO 1995
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-l 211 Genève 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
---------------------- Page: 2 ----------------------
0 ISO
ISO 10272:1995(F)
Introduction
En raison de la grande diversité des produits alimentaires, il est possible
que cette méthode horizontale ne convienne pas exactement, dans tous
ses détails, à certains produits et que, pour certains autres produits, il
puisse être nécessaire d’employer des méthodes différentes. Néanmoins,
il est à espérer que, dans tous les cas, tous les efforts seront faits pour
appliquer, chaque fois qu’il sera possible, cette méthode horizontale, et
qu’on n’aura recours à des dérogations que si cela est absolument né-
cessaire pour des raisons techniques.
Lorsque la présente Norme internationale sera réexaminée, il sera tenu
compte de tous les renseignements disponibles à ce moment-là, à savoir
dans quelle mesure cette méthode horizontale aura été suivie et les rai-
sons pour lesquelles il aura été nécessaire d’y déroger dans le cas de
produits particuliers.
L’harmonisation des méthodes d’essai ne peut être immédiate et, pour
certains groupes de produits, des Normes internationales et/ou des nor-
mes nationales qui ne concordent pas avec cette méthode horizontale
existent peut-être. II serait souhaitable que, lorsque de telles normes
viendront en révision, elles soient alignées sur la présente Norme inter-
nationale, si bien que, finalement, les seules divergences restantes seront
celles qui sont nécessaires pour des raisons techniques bien établies.
. . .
III
---------------------- Page: 3 ----------------------
Page blanche
---------------------- Page: 4 ----------------------
NORME INTERNATIONALE 0 ISO ISO 10272:1995(F)
- Méthode horizontale
Microbiologie des aliments
pour la recherche de Campylobacter thermotolérants
3.1 Campylobacter thermotolérants: Micro-
1 Domaine d’application
organismes formant des colonies caractéristiques sur
milieux sélectifs solides lorsqu’ils sont incubés à
La présente Norme internationale décrit une méthode
42 “C et possédant la mobilité caractéristique et les
horizontale pour la recherche de Campylobacter
propriétés biochimiques décrites lorsque l’essai est
thermotolérants.
exécuté conformément à la présente Norme interna-
La présente Norme internationale est applicable aux
tionale.
produits destinés à la consommation humaine ou à
l’alimentation animale, avec les quelques restrictions 3.2 recherche de Campylobacter thermotolé-
signalées dans l’introduction.
rants: Détermination de la présence ou de l’absence
de ces micro-organismes dans une quantité détermi-
née de produit, lorsque l’essai est exécuté conformé-
ment à la présente Norme internationale.
2 Références normatives
Les normes suivantes contiennent des dispositions
4 Principe
qui, par suite de la référence qui en est faite, consti-
tuent des dispositions valables pour la présente
En général, la recherche de Campyobacter
Norme internationale. Au moment de la publication,
thermotolérants nécessite les phases suivantes (voir
les éditions indiquées étaient en vigueur. Toute
dans l’annexe A pour une représentation schémati-
norme est sujette à révision et les parties prenantes
que du mode opératoire):
des accords fondés sur la présente Norme internatio-
nale sont invitées à rechercher la possibilité d’appli-
quer les éditions les plus récentes des normes
4.1 Enrichissement en milieu liquide
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de I’ISO
possèdent le registre des Normes internationales en
Ensemencement de la prise d’essai dans un des deux
vigueur à un moment donné.
milieux d’enrichissement liquides suivants:
ISO 6887: 1983, Microbiologie - Directives générales
- bouillon de Preston, ou
pour la préparation des dilutions en vue de l’examen
microbiologique.
- bouillon de Park et Sanders, lorsque l’échantillon
ou le produit dont il est issu a subi un traitement
-J), Microbiologie des aliments - Règles
ISO 7218:
physique, par exemple une congélation, pouvant
générales pour les examens microbiologiques.
entraîner un stress bactérien.
Incubation en atmosphère microaérophile (5 % d’oxy-
3 Définitions
gène et, par exemple, 10 % de dioxyde de carbone
et 85 % d’azote):
Pour les besoins de la présente Norme internationale,
les définitions suivantes s’appliquent. - à 42” C pendant 18 h pour le bouillon de Preston;
1) À publier. (Révision de I’ISO 7X8:1985)
1
---------------------- Page: 5 ----------------------
0 ISO
ISO 10272:1995(F)
- à 32 “C pendant 4 h, puis à 37 “C pendant 2 h et 5.3 Milieux d’isolement sélectifs
enfin, à 42 “C pendant 40 h à 42 h pour le bouillon
de Park et Sanders. 5.3.1 Gélose Karmali
NOTE 1 Sachant que les germes de Campylobactersont
Voir B.3.
particulièrement sensibles, il est recommandé de ne pas
congeler les échantillons, de les conserver à + 3 “C + 2 “C
5.3.2 Gélose Butzler modifiée
et de mener l’analyse le plus rapidement possible. -
Voir B.4.
4.2 Isolement et identification
5.3.3 Gélose Skirrow
À partir des cultures obtenues en 4.1, ensemen-
Voir B.5.
cernent de milieux solides:
5.3.4 Gélose à la céfopérazone, au charbon et au
- gélose Karmali et un autre milieu sélectif solide
désoxycholate (CCDA)
[gélose Butzler modifiée; gélose Skirrow; gélose
à la céfopérazone, au charbon et au désoxycholate
Voir B.6.
(CCDA) ou gélose Preston].
Incubation à 42 “C en atmosphère microaérophile 5.3.5 Gélose Preston
(5 % d’oxygène et, par exemple, 10 % de dioxyde de
Voir B.7.
carbone et 85 % d’azote) et examen après 48 h,
72 h et éventuellement, 5 jours, pour contrôler s’il y
de colonies présumées être des
a présence
5.4 Milieux d’identification et réactifs
Campyobacter thermotolérants en raison de leurs
caractéristiques visibles.
5.4.1 Bouillon Bruce&
Voir B.8.
4.3 Confirmation
5.4.2 Gélose Columbia au sang
des colonies présumées être des
Repiquage
Campylobacter thermotolérants et qui ont été isolées
Voir B.9.
en 4.2, puis confirmation au moyen d’essais biochi-
miques appropriés.
5.4.3 Réactif pour la recherche de l’oxydase
Voir B.10.
5 Milieux de culture et réactifs
5.4.4 Gélose au citrate de fer(lll) et aux trois
sucres (gélose TSI)
5.1 Généralités
Voir B.11.
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir
I’ISO 7218.
5.4.5 Solution de peroxyde d‘hydrogène, à 3 %
NOTE 2 En raison du nombre important de milieux de
culture et de réactifs, il a été jugé préférable, pour la clarté
5.4.6 Réactifs pour la recherche de l’hydrolyse de
du texte, de donner leur composition et leur préparation
I’hyppurate
dans l’annexe B.
Voir B.12.
5.2 Milieux d’enrichissement liquides
5.4.7 Gélose Mueller Hinton au sang
5.2.1 Bouillon de Preston
Voir B. 13.
Voir B.l .
6 Appareillage et verrerie
5.2.2 Bouillon de Park et Sanders
NOTE 3 Le matériel à usage unique est acceptable au
même titre que la verrerie réutilisable, si ses spécifications
Voir 8.2. sont similaires.
2
---------------------- Page: 6 ----------------------
0 ISO ISO 10272: 1995(F)
6.14 Appareillage approprié, pour la culture en at-
Matériel courant de laboratoire de microbiologie et,
mosphère microaérophile et permettant de maintenir
en particulier, ce qui suit.
des teneurs constantes en oxygène de 5 % et, par
exemple, en dioxyde de carbone de 10 % et en azote
6.1 Appareils pour la stérilisation en chaleur
de 85 % tout au long de l’incubation.
séche (four) ou en chaleur humide (autoclave)
NOTE 5 II convient d’utiliser des récipients appropriés
Voir I’ISO 7218.
hermétiques capables de contenir les boîtes de Petri et/ou
fioles ou flacons d’environ 350 ml de capacité, utilisés pour
6.2 Enceinte de séchage ou étuve, ventilée par
les milieux d’enrichissement; par exemple, flacons bacté-
entre 37 “C + 1 “C et
convection, réglable -
riologiques anaérobies. Une atmosphère microaérophile
55 “C &- 1 “C.
ayant une teneur en oxygène de 3 % à 6 % peut être obte-
nue en utilisant un appareillage de production de gaz dispo-
nible sur le marché (suivre précisément les instructions du
6.3 Étuve, réglable à 42 “C + - 1 “C.
fabricant, en particulier celles relatives au volume du flacon
et à la capacité de l’appareillage). Alternativement, le
6.4 Bains d’eau, réglables à 25 “C ~fr 1 “C,
barbotage des flacons avant l’incubation dans un mélange
étuves
32 “C & 1 “C, 37 “C + 1 “C, 42 “C k 1 “C ou
de gaz contenant 5 % d’oxygène, 10 % de dioxyde de car-
réglables à 25 “C + 1 “C, 32 “C + - 1 “C,
bone et 85 % d’azote peut être effectué.
37 “C + 1 “C.
-
7 Échantillonnage
6.5 Bain d’eau, réglable à 47 “C + 2 “C.
II est important que le laboratoire reçoive un échan-
6.6 pH-mètre, ayant une précision de lecture de
tillon réellement représentatif, non endommagé ou
+ 0,Ol unité de pH à 25 “C.
-
modifié lors du transport et de l’entreposage.
6.7 Récipients, notamment tubes à essai de
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode
18 mm x 180 mm et de 9 mm x 180 mm, tubes à
spécifiée dans la présente Norme internationale. S’il
hémolyse de 13 mm x 75 mm, flacons avec des
n’existe aucune Norme internationale spécifique sur
fermetures métalliques non toxiques et/ou fioles de
l’échantillonnage du produit concerné, il est recom-
avec des couvercles appro-
capacités appropriées,
mandé que les parties concernées se mettent d’ac-
priés ou fermées par des tampons de coton de façon
cord à ce sujet.
à permettre un passage de gaz et à réaliser une at-
mosphère microaérophile, si nécessaire.
8 Préparation de l’échantillon pour essai
6.8 Boîtes de Petri, en verre ou en matière plasti-
Préparer l’échantillon pour essai conformément à la
que, de 90 mm à 100 mm de diamètre.
Norme internationale spécifique du produit concerné.
S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique,
6.9 Pipettes à écoulement total, à larges ouvertu-
il est recommandé que les parties concernées se
res, de capacités nominales de 1 ml et 10 ml, gra-
mettent d’accord à ce sujet.
duées respectivement en 0,l ml et 0,5 ml, et
pipettes Pasteur.
9 Mode opératoire
6.10 Poires en caoutchouc, ou tout autre système
de sécurité pouvant s’adapter aux pipettes graduées.
9.1 Prise d’essai, suspension mère et
dilutions
6.11 Anses bouclées, d’environ 3 mm de diamètre,
et fils droits, en platine iridié ou en nickel-chrome, ou
9.1.1 Voir I’ISO 6887 et la Norme internationale
baguette de verre.
concernant le produit à examiner.
NOTE 4 Le nickel-chrome ne convient pas pour l’essai
de recherche de l’oxydase (voir 9.5.5.1).
9.1.2 En général, pour préparer la suspension mère,
introduire une quantité x de prise d’essai (masse ou
6.12 Pinces, fines, à bout rond, en acier inoxydable.
volume) dans un volume de 9x du milieu d’enrichis-
sement, bouillon de Preston (5.2.1) ou bouillon de
Park et Sanders (5.2.2), de façon à obtenir un rapport
6.13 Microscope, si possible à contraste de phase
prise d’essai/milieu d’enrichissement de 1 /lO (rapport
(pour observer le mouvement caractéristique des
Campylobacterh masse/volume ou volume/volume).
---------------------- Page: 7 ----------------------
0 ISO
ISO 10272:1995(F)
9.5 Confirmation
9.2 Isolement direct
Pour les produits suspectés de contenir une quantité Comme les germes ne survivent qu’en atmosphère
importante de Campylobacter thermotolérants, pro- microaérophile, appliquer le mode opératoire décrit de
céder à un isolement en ensemençant à l’aide d’une 9.5.1 à 9.5.2.4 sans délai.
anse bouclée (6.1 l), la suspension mère non incubée
(9.1.2) sur la surface de la gélose Karmali (5.3.1) et
9.5.1 Sélection des colonies pour la confirmation
d’un autre milieu (5.3.2, 5.3.3, 5.3.4 ou 5.3.5).
Sélectionner pour les essais de confirmation, un total
Incuber à 42 “C en atmosphère microaérophile (6.14)
de cinq colonies typiques et/ou suspectes sur I’en-
et examen après 48 h, 72 h et, éventuellement,
semble des boîtes ensemencées (9.2, 9.4.3). S’il y en
5 jours, pour contrôler s’il y a présence de colonies
a moins de cinq, retenir toutes les colonies.
présumées être des Campylobacter thermotolérants.
Procéder ensuite comme décrit en 9.4.3 et 9.5.
9.5.2
Examen de la morphologie et de la mobilité
9.3 Enrichissement
9.5.2.1 À partir d’une colonie bien isolée, réaliser
une coloration de Gram sur chacune des boîtes
(9.4.3).
9.3.1 Si le bouillon de Preston est utilisé, incuber la
suspension mère (9.1.2) à 42 “C en atmosphère
microaérophile (6.14) pendant 18 h. 9.5.2.2 Mettre en suspension séparément chacune
des colonies sélectionnées en 9.5.1 dans 1 ml de
bouillon Brucella (5.4.1).
9.3.2 Si le bouillon de Park et Sanders est utilisé,
incuber la suspension mère (9.1.2) à 32 “C en atmos-
9.5.2.3 Examiner au microscope (6.13) la morpholo-
phère microaérophile (6.14) pendant 4 h, puis ajouter
gie et la mobilité de chacune des colonies retenues.
la solution d’antibiotiques B (B.2.4) à une concen-
tration de 5 % (WV). Incuber à 37 “C en atmosphère
microaérophile pendant 2 h, puis à 42 “C pendant
9.5.2.4 Retenir, pour les observations ultérieures,
40 h à 42 h.
toutes les suspensions (9.5.2.2) dans lesquelles on
observe des bacilles incurvés Gram négatif (9.5.2.1)
dont le mouvement de déplacement en vrille est ca-
9.4 Isolement et identification
ractéristique (9.5.2.3).
9.4.1 Ensemencer, à l’aide d’une anse bouclée
9.5.3 Examen de la morphologie sur une culture
(6.11), la surface du premier milieu d’isolement sé-
de Gram
lectif, la gélose Karmali (5.3.1) avec la culture obtenue
dans le milieu d’enrichissement (9.3.1 ou 9.3.2).
Ensemencer, à l’aide d’une anse bouclée (6.1 l), la
surface d’une gélose Columbia au sang (5.4.2) avec
Opérer de même avec le second milieu d’isolement
chaque suspension retenue (9.5.2.4) afin de permet-
sélectif choisi (5.3.2, 5.3.3, 5.3.4 ou 5.3.5).
tre le développement de colonies bien isolées.
9.4.2 Incuber les boîtes (9.4.1) à 42 “C en atmos-
Incuber les boîtes ensemencées à 42 “C en atmos-
phère microaérophile (6.14).
phère microaérophile (6.14) pendant 24 h et utiliser
les cultures pures pour les essais biochimiques.
9.4.3 Après 24 h, ou plus généralement, 48 h et
même 3 jours à 5 jours d’incubation, examiner les
9.5.4 Examen de la croissance à 25 “C
boîtes afin de rechercher la présence de colonies ca-
ractéristiques de Campylobacter thermotolérants.
À partir des colonies isolées en 9.5.3, ensemencer, à
l’aide d’une anse bouclée (6.11) un tube de bouillon
Sur la gélose Karmali, les colonies caractéristiques
Brucella (5.4.1).
sont grises, humides et plates, avec une tendance à
l’étalement. Sur les géloses Butzler et Skirrow, les
Incuber à 25 “C en atmosphère microaérophile (6.14)
colonies caractéristiques apparaissent grises à bru-
pendant 2 jours a5 jours.
nes, et peuvent être de tailles différentes sur les deux
milieux. Examiner s’il y a ou non croissance.
4
---------------------- Page: 8 ----------------------
63 ISO
ISO 10272:1995(F)
L’essai est positif si des bulles apparaissent dans les
9.5.5 Essais biochimiques
30 s.
9.5.5.1 Recherche de l’oxydase
9.5.5.4 Recherche de la sensibilité à l’acide
A l’aide de l’anse bouclée ou d’un fil en platine iridié nalidixique et à la céphalotine*)
ou d’une baguette de verre (6.11), prendre une frac-
tion de colonie bien isolée de chaque boîte (9.5.3) et Ensemencer, à l’aide d’une anse bouclée (6.11) les
la déposer en stries sur un papier filtre humecté de colonies isolées en 9.5.2.4 dans une suspension de
réactif pour la recherche de l’oxydase (5.4.3). L’appa- densité 0,5 sur l’échelle de Mac Farland dans le
rition d’une couleur bleue intense, mauve ou violette bouillon Brucella.
dans les 10 s indique une réaction positive. Si un test
Diluer ensuite cette suspension au I/l0 dans le
de l’oxydase disponible dans le commerce est utilisé,
même bouillon.
suivre les instructions du fabricant.
Inonder la surface d’une boîte de gélose Mueller
Confirmer les résultats avec des contrôles positifs ou
Hinton à 5 % de sang (5.4.7) avec la suspension.
négatifs.
Laisser en contact 5 min, puis rejeter l’excès de sus-
9.5.5.2 Gélose TSI (5.4.4)
pension.
À l’aide du fil (6.11), ensemencer la gélose avec cha-
Sécher les boîtes à l’étuve (6.2) à 37 “C pendant
cune des colonies sélectionnées en 9.5.3.
10 min.
Ensemencer en stries longitudinales la pente du mi-
Placer à la surface de la gélose un disque d’acide
lieu et le culot par piqûre jusqu’au fond de la gélose.
nalidixique (30 pg) et un disque de céphalotine
(30 pg).
Incuber à 42 “C en atmosphère microaérophile (6.14)
pendant 24 h et prolonger jusqu’à 5 jours si néces-
Incuber à 37 “C en atmosphère microaérophile (6.14)
saire.
pendant 24 h.
Interpréter les réactions de la façon suivante:
Interpréter la croissance bactérienne de la façon sui-
vante:
Culot
- une croi ssance
au c ontact du disque est cl
Jaune glucose positif (fermen-
comme résista nte;
tation du glucose)
Rouge ou inchangé glucose négatif (pas de
- une présence d’une zone d’inhibition de la crois-
fermentation du glucose)
sance (quelle que soit l’importance de la zone) est
Noir formation de sulfure d’hy- classée comme sensible.
drogène (H,S)
Bulles ou fissures formation de gaz à partir 9.5.5.5 Recherche de l’hydrolyse de I’hippurate*)
du glucose
Dans un tube à hémolyse (6.7) contenant 0,4 ml de la
solution d’hippurate de sodium (5.4.6) ensemencer,
Pente de la gélose
à l’aide d’une anse bouclée (6.1 l), les colonies isolées
Jaune lactose et/ou saccharose
en 9.5.3, en prenant soin de ne pas incorporer de
positifs [un ou les deux
gélose.
sucres utilisé(s)]
Agiter pour homogénéiser et incuber 2 h dans un bain
Rouge ou inchangée
lactose et saccharose né-
d’eau (6.4) réglé à 37 “C.
gatifs (aucun sucre utilisé)
Ajouter avec précaution 0,2 ml de la solution de
9.5.5.3 Recherche de la catalase
ninhydrine
(B.12.2) au-dessus de la solution
d’hippurate de sodium. Ne pas agiter.
Déposer une anse de culture prélevée sur la gélose
(9.5.5.2) dans une goutte de solution de peroxyde Interpréter, après une nouvelle incubation de 10 min
d’hydrogène (5.4.5) sur une lame porte-objet propre. dans un bain d’eau réglé à 37 “C.
Ces essais sont adaptés pour différencier les espèces Campylobacter thermotolérants.
2
---------------------- Page: 9 ----------------------
0 ISO
ISO 10272:1995(F)
Campylobacter CO/;. Cependant, d’autres espèces ont
Une couleur violette foncée indique une réaction po-
été décrites (Campylobacter lari et Campylobacter
sitive.
upsaliensis); les caractéristiques données dans le ta-
Une couleur violette pâle ou l’absence de chan-
bleau 1 permettent de les différencier.
gement de couleur indique une réaction négative.
10 Expression des résultats
9.6 Interprétation des résultats
Selon l’interprétation des résultats, indiquer la pré-
Les Campyobacter thermotolérants donnent les ré-
sence ou l’absence de Campylobacter thermotolé-
sultats suivants:
rants dans une prise d’essai de x g ou x ml de produit.
Campyobacter spp.
11 Rapport d’essai
petits bacilles
Morphologie (9.5.2.3)
incurvés
Le rapport d’essai doit indiquer
Mobilité (9.5.2.3) caractéristique
-
Gram (9.5.3) - la méthode selon laquelle l’échantillonnage a été
effectué, si elle est connue,
Oxydase (9.5.5.1) +
-
Glucose (9.5.5.2)
- la méthode utilisée,
-
Lactose (9.5.
...
NORME
Iso
INTERNATIONALE
10272
Première édition
1995-10-15
Microbiologie des aliments - Méthode
horizontale pour la recherche de
Campylobacter thermotolérants
Microbiology of food and an lima/ feeding stu fis - Horizontal method for
de tee tion of thermo toleran t Campylobacter
Numéro de référence
ISO 10272: 1995(F)
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 10272:1995(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mités membres votants.
La Norme internationale ISO 10272 a été élaborée par le comité technique
Produits agricoles alimentaires, sous-comité SC 9,
ISO/TC 34,
Microbiologie.
Les annexes A et B font partie intégrante de la présente Norme interna-
tionale.
0 ISO 1995
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-l 211 Genève 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
---------------------- Page: 2 ----------------------
0 ISO
ISO 10272:1995(F)
Introduction
En raison de la grande diversité des produits alimentaires, il est possible
que cette méthode horizontale ne convienne pas exactement, dans tous
ses détails, à certains produits et que, pour certains autres produits, il
puisse être nécessaire d’employer des méthodes différentes. Néanmoins,
il est à espérer que, dans tous les cas, tous les efforts seront faits pour
appliquer, chaque fois qu’il sera possible, cette méthode horizontale, et
qu’on n’aura recours à des dérogations que si cela est absolument né-
cessaire pour des raisons techniques.
Lorsque la présente Norme internationale sera réexaminée, il sera tenu
compte de tous les renseignements disponibles à ce moment-là, à savoir
dans quelle mesure cette méthode horizontale aura été suivie et les rai-
sons pour lesquelles il aura été nécessaire d’y déroger dans le cas de
produits particuliers.
L’harmonisation des méthodes d’essai ne peut être immédiate et, pour
certains groupes de produits, des Normes internationales et/ou des nor-
mes nationales qui ne concordent pas avec cette méthode horizontale
existent peut-être. II serait souhaitable que, lorsque de telles normes
viendront en révision, elles soient alignées sur la présente Norme inter-
nationale, si bien que, finalement, les seules divergences restantes seront
celles qui sont nécessaires pour des raisons techniques bien établies.
. . .
III
---------------------- Page: 3 ----------------------
Page blanche
---------------------- Page: 4 ----------------------
NORME INTERNATIONALE 0 ISO ISO 10272:1995(F)
- Méthode horizontale
Microbiologie des aliments
pour la recherche de Campylobacter thermotolérants
3.1 Campylobacter thermotolérants: Micro-
1 Domaine d’application
organismes formant des colonies caractéristiques sur
milieux sélectifs solides lorsqu’ils sont incubés à
La présente Norme internationale décrit une méthode
42 “C et possédant la mobilité caractéristique et les
horizontale pour la recherche de Campylobacter
propriétés biochimiques décrites lorsque l’essai est
thermotolérants.
exécuté conformément à la présente Norme interna-
La présente Norme internationale est applicable aux
tionale.
produits destinés à la consommation humaine ou à
l’alimentation animale, avec les quelques restrictions 3.2 recherche de Campylobacter thermotolé-
signalées dans l’introduction.
rants: Détermination de la présence ou de l’absence
de ces micro-organismes dans une quantité détermi-
née de produit, lorsque l’essai est exécuté conformé-
ment à la présente Norme internationale.
2 Références normatives
Les normes suivantes contiennent des dispositions
4 Principe
qui, par suite de la référence qui en est faite, consti-
tuent des dispositions valables pour la présente
En général, la recherche de Campyobacter
Norme internationale. Au moment de la publication,
thermotolérants nécessite les phases suivantes (voir
les éditions indiquées étaient en vigueur. Toute
dans l’annexe A pour une représentation schémati-
norme est sujette à révision et les parties prenantes
que du mode opératoire):
des accords fondés sur la présente Norme internatio-
nale sont invitées à rechercher la possibilité d’appli-
quer les éditions les plus récentes des normes
4.1 Enrichissement en milieu liquide
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de I’ISO
possèdent le registre des Normes internationales en
Ensemencement de la prise d’essai dans un des deux
vigueur à un moment donné.
milieux d’enrichissement liquides suivants:
ISO 6887: 1983, Microbiologie - Directives générales
- bouillon de Preston, ou
pour la préparation des dilutions en vue de l’examen
microbiologique.
- bouillon de Park et Sanders, lorsque l’échantillon
ou le produit dont il est issu a subi un traitement
-J), Microbiologie des aliments - Règles
ISO 7218:
physique, par exemple une congélation, pouvant
générales pour les examens microbiologiques.
entraîner un stress bactérien.
Incubation en atmosphère microaérophile (5 % d’oxy-
3 Définitions
gène et, par exemple, 10 % de dioxyde de carbone
et 85 % d’azote):
Pour les besoins de la présente Norme internationale,
les définitions suivantes s’appliquent. - à 42” C pendant 18 h pour le bouillon de Preston;
1) À publier. (Révision de I’ISO 7X8:1985)
1
---------------------- Page: 5 ----------------------
0 ISO
ISO 10272:1995(F)
- à 32 “C pendant 4 h, puis à 37 “C pendant 2 h et 5.3 Milieux d’isolement sélectifs
enfin, à 42 “C pendant 40 h à 42 h pour le bouillon
de Park et Sanders. 5.3.1 Gélose Karmali
NOTE 1 Sachant que les germes de Campylobactersont
Voir B.3.
particulièrement sensibles, il est recommandé de ne pas
congeler les échantillons, de les conserver à + 3 “C + 2 “C
5.3.2 Gélose Butzler modifiée
et de mener l’analyse le plus rapidement possible. -
Voir B.4.
4.2 Isolement et identification
5.3.3 Gélose Skirrow
À partir des cultures obtenues en 4.1, ensemen-
Voir B.5.
cernent de milieux solides:
5.3.4 Gélose à la céfopérazone, au charbon et au
- gélose Karmali et un autre milieu sélectif solide
désoxycholate (CCDA)
[gélose Butzler modifiée; gélose Skirrow; gélose
à la céfopérazone, au charbon et au désoxycholate
Voir B.6.
(CCDA) ou gélose Preston].
Incubation à 42 “C en atmosphère microaérophile 5.3.5 Gélose Preston
(5 % d’oxygène et, par exemple, 10 % de dioxyde de
Voir B.7.
carbone et 85 % d’azote) et examen après 48 h,
72 h et éventuellement, 5 jours, pour contrôler s’il y
de colonies présumées être des
a présence
5.4 Milieux d’identification et réactifs
Campyobacter thermotolérants en raison de leurs
caractéristiques visibles.
5.4.1 Bouillon Bruce&
Voir B.8.
4.3 Confirmation
5.4.2 Gélose Columbia au sang
des colonies présumées être des
Repiquage
Campylobacter thermotolérants et qui ont été isolées
Voir B.9.
en 4.2, puis confirmation au moyen d’essais biochi-
miques appropriés.
5.4.3 Réactif pour la recherche de l’oxydase
Voir B.10.
5 Milieux de culture et réactifs
5.4.4 Gélose au citrate de fer(lll) et aux trois
sucres (gélose TSI)
5.1 Généralités
Voir B.11.
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir
I’ISO 7218.
5.4.5 Solution de peroxyde d‘hydrogène, à 3 %
NOTE 2 En raison du nombre important de milieux de
culture et de réactifs, il a été jugé préférable, pour la clarté
5.4.6 Réactifs pour la recherche de l’hydrolyse de
du texte, de donner leur composition et leur préparation
I’hyppurate
dans l’annexe B.
Voir B.12.
5.2 Milieux d’enrichissement liquides
5.4.7 Gélose Mueller Hinton au sang
5.2.1 Bouillon de Preston
Voir B. 13.
Voir B.l .
6 Appareillage et verrerie
5.2.2 Bouillon de Park et Sanders
NOTE 3 Le matériel à usage unique est acceptable au
même titre que la verrerie réutilisable, si ses spécifications
Voir 8.2. sont similaires.
2
---------------------- Page: 6 ----------------------
0 ISO ISO 10272: 1995(F)
6.14 Appareillage approprié, pour la culture en at-
Matériel courant de laboratoire de microbiologie et,
mosphère microaérophile et permettant de maintenir
en particulier, ce qui suit.
des teneurs constantes en oxygène de 5 % et, par
exemple, en dioxyde de carbone de 10 % et en azote
6.1 Appareils pour la stérilisation en chaleur
de 85 % tout au long de l’incubation.
séche (four) ou en chaleur humide (autoclave)
NOTE 5 II convient d’utiliser des récipients appropriés
Voir I’ISO 7218.
hermétiques capables de contenir les boîtes de Petri et/ou
fioles ou flacons d’environ 350 ml de capacité, utilisés pour
6.2 Enceinte de séchage ou étuve, ventilée par
les milieux d’enrichissement; par exemple, flacons bacté-
entre 37 “C + 1 “C et
convection, réglable -
riologiques anaérobies. Une atmosphère microaérophile
55 “C &- 1 “C.
ayant une teneur en oxygène de 3 % à 6 % peut être obte-
nue en utilisant un appareillage de production de gaz dispo-
nible sur le marché (suivre précisément les instructions du
6.3 Étuve, réglable à 42 “C + - 1 “C.
fabricant, en particulier celles relatives au volume du flacon
et à la capacité de l’appareillage). Alternativement, le
6.4 Bains d’eau, réglables à 25 “C ~fr 1 “C,
barbotage des flacons avant l’incubation dans un mélange
étuves
32 “C & 1 “C, 37 “C + 1 “C, 42 “C k 1 “C ou
de gaz contenant 5 % d’oxygène, 10 % de dioxyde de car-
réglables à 25 “C + 1 “C, 32 “C + - 1 “C,
bone et 85 % d’azote peut être effectué.
37 “C + 1 “C.
-
7 Échantillonnage
6.5 Bain d’eau, réglable à 47 “C + 2 “C.
II est important que le laboratoire reçoive un échan-
6.6 pH-mètre, ayant une précision de lecture de
tillon réellement représentatif, non endommagé ou
+ 0,Ol unité de pH à 25 “C.
-
modifié lors du transport et de l’entreposage.
6.7 Récipients, notamment tubes à essai de
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode
18 mm x 180 mm et de 9 mm x 180 mm, tubes à
spécifiée dans la présente Norme internationale. S’il
hémolyse de 13 mm x 75 mm, flacons avec des
n’existe aucune Norme internationale spécifique sur
fermetures métalliques non toxiques et/ou fioles de
l’échantillonnage du produit concerné, il est recom-
avec des couvercles appro-
capacités appropriées,
mandé que les parties concernées se mettent d’ac-
priés ou fermées par des tampons de coton de façon
cord à ce sujet.
à permettre un passage de gaz et à réaliser une at-
mosphère microaérophile, si nécessaire.
8 Préparation de l’échantillon pour essai
6.8 Boîtes de Petri, en verre ou en matière plasti-
Préparer l’échantillon pour essai conformément à la
que, de 90 mm à 100 mm de diamètre.
Norme internationale spécifique du produit concerné.
S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique,
6.9 Pipettes à écoulement total, à larges ouvertu-
il est recommandé que les parties concernées se
res, de capacités nominales de 1 ml et 10 ml, gra-
mettent d’accord à ce sujet.
duées respectivement en 0,l ml et 0,5 ml, et
pipettes Pasteur.
9 Mode opératoire
6.10 Poires en caoutchouc, ou tout autre système
de sécurité pouvant s’adapter aux pipettes graduées.
9.1 Prise d’essai, suspension mère et
dilutions
6.11 Anses bouclées, d’environ 3 mm de diamètre,
et fils droits, en platine iridié ou en nickel-chrome, ou
9.1.1 Voir I’ISO 6887 et la Norme internationale
baguette de verre.
concernant le produit à examiner.
NOTE 4 Le nickel-chrome ne convient pas pour l’essai
de recherche de l’oxydase (voir 9.5.5.1).
9.1.2 En général, pour préparer la suspension mère,
introduire une quantité x de prise d’essai (masse ou
6.12 Pinces, fines, à bout rond, en acier inoxydable.
volume) dans un volume de 9x du milieu d’enrichis-
sement, bouillon de Preston (5.2.1) ou bouillon de
Park et Sanders (5.2.2), de façon à obtenir un rapport
6.13 Microscope, si possible à contraste de phase
prise d’essai/milieu d’enrichissement de 1 /lO (rapport
(pour observer le mouvement caractéristique des
Campylobacterh masse/volume ou volume/volume).
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0 ISO
ISO 10272:1995(F)
9.5 Confirmation
9.2 Isolement direct
Pour les produits suspectés de contenir une quantité Comme les germes ne survivent qu’en atmosphère
importante de Campylobacter thermotolérants, pro- microaérophile, appliquer le mode opératoire décrit de
céder à un isolement en ensemençant à l’aide d’une 9.5.1 à 9.5.2.4 sans délai.
anse bouclée (6.1 l), la suspension mère non incubée
(9.1.2) sur la surface de la gélose Karmali (5.3.1) et
9.5.1 Sélection des colonies pour la confirmation
d’un autre milieu (5.3.2, 5.3.3, 5.3.4 ou 5.3.5).
Sélectionner pour les essais de confirmation, un total
Incuber à 42 “C en atmosphère microaérophile (6.14)
de cinq colonies typiques et/ou suspectes sur I’en-
et examen après 48 h, 72 h et, éventuellement,
semble des boîtes ensemencées (9.2, 9.4.3). S’il y en
5 jours, pour contrôler s’il y a présence de colonies
a moins de cinq, retenir toutes les colonies.
présumées être des Campylobacter thermotolérants.
Procéder ensuite comme décrit en 9.4.3 et 9.5.
9.5.2
Examen de la morphologie et de la mobilité
9.3 Enrichissement
9.5.2.1 À partir d’une colonie bien isolée, réaliser
une coloration de Gram sur chacune des boîtes
(9.4.3).
9.3.1 Si le bouillon de Preston est utilisé, incuber la
suspension mère (9.1.2) à 42 “C en atmosphère
microaérophile (6.14) pendant 18 h. 9.5.2.2 Mettre en suspension séparément chacune
des colonies sélectionnées en 9.5.1 dans 1 ml de
bouillon Brucella (5.4.1).
9.3.2 Si le bouillon de Park et Sanders est utilisé,
incuber la suspension mère (9.1.2) à 32 “C en atmos-
9.5.2.3 Examiner au microscope (6.13) la morpholo-
phère microaérophile (6.14) pendant 4 h, puis ajouter
gie et la mobilité de chacune des colonies retenues.
la solution d’antibiotiques B (B.2.4) à une concen-
tration de 5 % (WV). Incuber à 37 “C en atmosphère
microaérophile pendant 2 h, puis à 42 “C pendant
9.5.2.4 Retenir, pour les observations ultérieures,
40 h à 42 h.
toutes les suspensions (9.5.2.2) dans lesquelles on
observe des bacilles incurvés Gram négatif (9.5.2.1)
dont le mouvement de déplacement en vrille est ca-
9.4 Isolement et identification
ractéristique (9.5.2.3).
9.4.1 Ensemencer, à l’aide d’une anse bouclée
9.5.3 Examen de la morphologie sur une culture
(6.11), la surface du premier milieu d’isolement sé-
de Gram
lectif, la gélose Karmali (5.3.1) avec la culture obtenue
dans le milieu d’enrichissement (9.3.1 ou 9.3.2).
Ensemencer, à l’aide d’une anse bouclée (6.1 l), la
surface d’une gélose Columbia au sang (5.4.2) avec
Opérer de même avec le second milieu d’isolement
chaque suspension retenue (9.5.2.4) afin de permet-
sélectif choisi (5.3.2, 5.3.3, 5.3.4 ou 5.3.5).
tre le développement de colonies bien isolées.
9.4.2 Incuber les boîtes (9.4.1) à 42 “C en atmos-
Incuber les boîtes ensemencées à 42 “C en atmos-
phère microaérophile (6.14).
phère microaérophile (6.14) pendant 24 h et utiliser
les cultures pures pour les essais biochimiques.
9.4.3 Après 24 h, ou plus généralement, 48 h et
même 3 jours à 5 jours d’incubation, examiner les
9.5.4 Examen de la croissance à 25 “C
boîtes afin de rechercher la présence de colonies ca-
ractéristiques de Campylobacter thermotolérants.
À partir des colonies isolées en 9.5.3, ensemencer, à
l’aide d’une anse bouclée (6.11) un tube de bouillon
Sur la gélose Karmali, les colonies caractéristiques
Brucella (5.4.1).
sont grises, humides et plates, avec une tendance à
l’étalement. Sur les géloses Butzler et Skirrow, les
Incuber à 25 “C en atmosphère microaérophile (6.14)
colonies caractéristiques apparaissent grises à bru-
pendant 2 jours a5 jours.
nes, et peuvent être de tailles différentes sur les deux
milieux. Examiner s’il y a ou non croissance.
4
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63 ISO
ISO 10272:1995(F)
L’essai est positif si des bulles apparaissent dans les
9.5.5 Essais biochimiques
30 s.
9.5.5.1 Recherche de l’oxydase
9.5.5.4 Recherche de la sensibilité à l’acide
A l’aide de l’anse bouclée ou d’un fil en platine iridié nalidixique et à la céphalotine*)
ou d’une baguette de verre (6.11), prendre une frac-
tion de colonie bien isolée de chaque boîte (9.5.3) et Ensemencer, à l’aide d’une anse bouclée (6.11) les
la déposer en stries sur un papier filtre humecté de colonies isolées en 9.5.2.4 dans une suspension de
réactif pour la recherche de l’oxydase (5.4.3). L’appa- densité 0,5 sur l’échelle de Mac Farland dans le
rition d’une couleur bleue intense, mauve ou violette bouillon Brucella.
dans les 10 s indique une réaction positive. Si un test
Diluer ensuite cette suspension au I/l0 dans le
de l’oxydase disponible dans le commerce est utilisé,
même bouillon.
suivre les instructions du fabricant.
Inonder la surface d’une boîte de gélose Mueller
Confirmer les résultats avec des contrôles positifs ou
Hinton à 5 % de sang (5.4.7) avec la suspension.
négatifs.
Laisser en contact 5 min, puis rejeter l’excès de sus-
9.5.5.2 Gélose TSI (5.4.4)
pension.
À l’aide du fil (6.11), ensemencer la gélose avec cha-
Sécher les boîtes à l’étuve (6.2) à 37 “C pendant
cune des colonies sélectionnées en 9.5.3.
10 min.
Ensemencer en stries longitudinales la pente du mi-
Placer à la surface de la gélose un disque d’acide
lieu et le culot par piqûre jusqu’au fond de la gélose.
nalidixique (30 pg) et un disque de céphalotine
(30 pg).
Incuber à 42 “C en atmosphère microaérophile (6.14)
pendant 24 h et prolonger jusqu’à 5 jours si néces-
Incuber à 37 “C en atmosphère microaérophile (6.14)
saire.
pendant 24 h.
Interpréter les réactions de la façon suivante:
Interpréter la croissance bactérienne de la façon sui-
vante:
Culot
- une croi ssance
au c ontact du disque est cl
Jaune glucose positif (fermen-
comme résista nte;
tation du glucose)
Rouge ou inchangé glucose négatif (pas de
- une présence d’une zone d’inhibition de la crois-
fermentation du glucose)
sance (quelle que soit l’importance de la zone) est
Noir formation de sulfure d’hy- classée comme sensible.
drogène (H,S)
Bulles ou fissures formation de gaz à partir 9.5.5.5 Recherche de l’hydrolyse de I’hippurate*)
du glucose
Dans un tube à hémolyse (6.7) contenant 0,4 ml de la
solution d’hippurate de sodium (5.4.6) ensemencer,
Pente de la gélose
à l’aide d’une anse bouclée (6.1 l), les colonies isolées
Jaune lactose et/ou saccharose
en 9.5.3, en prenant soin de ne pas incorporer de
positifs [un ou les deux
gélose.
sucres utilisé(s)]
Agiter pour homogénéiser et incuber 2 h dans un bain
Rouge ou inchangée
lactose et saccharose né-
d’eau (6.4) réglé à 37 “C.
gatifs (aucun sucre utilisé)
Ajouter avec précaution 0,2 ml de la solution de
9.5.5.3 Recherche de la catalase
ninhydrine
(B.12.2) au-dessus de la solution
d’hippurate de sodium. Ne pas agiter.
Déposer une anse de culture prélevée sur la gélose
(9.5.5.2) dans une goutte de solution de peroxyde Interpréter, après une nouvelle incubation de 10 min
d’hydrogène (5.4.5) sur une lame porte-objet propre. dans un bain d’eau réglé à 37 “C.
Ces essais sont adaptés pour différencier les espèces Campylobacter thermotolérants.
2
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Campylobacter CO/;. Cependant, d’autres espèces ont
Une couleur violette foncée indique une réaction po-
été décrites (Campylobacter lari et Campylobacter
sitive.
upsaliensis); les caractéristiques données dans le ta-
Une couleur violette pâle ou l’absence de chan-
bleau 1 permettent de les différencier.
gement de couleur indique une réaction négative.
10 Expression des résultats
9.6 Interprétation des résultats
Selon l’interprétation des résultats, indiquer la pré-
Les Campyobacter thermotolérants donnent les ré-
sence ou l’absence de Campylobacter thermotolé-
sultats suivants:
rants dans une prise d’essai de x g ou x ml de produit.
Campyobacter spp.
11 Rapport d’essai
petits bacilles
Morphologie (9.5.2.3)
incurvés
Le rapport d’essai doit indiquer
Mobilité (9.5.2.3) caractéristique
-
Gram (9.5.3) - la méthode selon laquelle l’échantillonnage a été
effectué, si elle est connue,
Oxydase (9.5.5.1) +
-
Glucose (9.5.5.2)
- la méthode utilisée,
-
Lactose (9.5.
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.