ISO 10712:1995
(Main)Water quality — Pseudomonas putida growth inhibition test (Pseudomonas cell multiplication inhibition test)
Water quality — Pseudomonas putida growth inhibition test (Pseudomonas cell multiplication inhibition test)
Describes a test method for determining the inhibitory effect of surface, ground and waste water on Pseudomonas putida growth. Not suitable for highly coloured samples or samples containing undissolved or volatile substances which react with the nutrient solution or undergo changes such as biochemical degradation. Also suitable for testing substances soluble in water.
Qualité de l'eau — Essai d'inhibition de la croissance de Pseudomonas putida (Essai d'inhibition de la multiplication des cellules de Pseudomonas)
La présente Norme internationale prescrit une méthode d'essai pour la détermination de l'effet inhibiteur de l'eau de surface, de l'eau souterraine et des eaux usées vis-à-vis de Pseudomonas putida. La méthode n'est pas applicable aux échantillons de forte coloration, ou contenant des matières non dissoutes ou volatiles ou des substances réagissant avec le milieu nutritif ou qui subissent des changements pendant l'essai (par exemple par précipitation, ou dégradation biochimique ou photochimique), et peuvent donner des résultats faux, et/ou affecter la reproductibilité. La méthode permet également d'expérimenter les substances solubles dans l'eau (voir annexe A).
General Information
Relations
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Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL
IS0
STANDARD
10712
First edition
1995-l 2-15
Water quality - Pseudomonas putida
growth inhibition test (Pseudomonas cell
multiplication inhibition test)
Qualit6 de I’eau - Essai d’inhibition de la croissance de Pseudomonas
putida (essai d’inhibition de la multiplication des cellules de
Pseudomonas)
Reference number
IS0 10712:1995(E)
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IS0 10712:1995(E)
Foreword
IS0 (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national standards bodies (IS0 member bodies). The work
of preparing International Standards is normally carried out through IS0
technical committees. Each member body interested in a subject for
which a technical committee has been established has the right to be
represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. IS0
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(I EC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard IS0 10712 was prepared by Technical Committee
ISODC 147, INater quality, Subcommittee SC 5, Biological methods.
Annexes A and B of this International Standard are for information only.
0 IS0 1995
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and
microfilm, without permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
Case Postale 56 l CH-1211 Geneve 20 l Switzerland
Printed in Switzerland
ii
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IS0 10712:1995(E)
Introduction
The bacterium Pseudomonas putida is used as an organism representative
of heterotrophic microorganisms in fresh water.
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INTERNATIONAL STANDARD 0 ISO IS0 10712:1995(E)
Water quality - Pseudomonas putida growth
inhibition test (Pseudomonas cell multiplication
inhibition test)
3.1 multiplication; growth: Increase in the number
1 Scope
of cells during the test period.
This International Standard specifies a test method for
determining the inhibitory effect of surface, ground 3.2 concentration-effect relationship: Depen-
and waste water on Pseudomonas putida. dence of cell multiplication inhibition on the concen-
tration of the test sample.
This method is not suitable for highly coloured test
samples, or samples containing undissolved or volatile
NOTE 1 The relationship is graphically represented by
materials or substances which react with the nutrient plotting the inhibition values along the ordinate against the
sample concentrations along the abscissa.
solution, or which undergo changes during the test
(for example by precipitation, or biochemical or
3.3 effective concentration (EC): Concentration of
photochemical degradation) and may give false results
the test sample giving a calculated or interpolated
and/or impair the reproducibility.
inhibition of cell multiplication of Pseudomonas putida
The method is also suitable for testing substances
within 16 h + 1 h, compared to that of the control
soluble in water (see annex A).
batch. -
The concentrations of test samples (EC10 and EC50)
2 Normative reference
are determined from the concentration-effect re-
lationship (3.2) at which cell multiplication is inhibited
The following standard contains provisions which,
by 10 % or 50 % respectively, compared to that of the
through reference in this text, constitute provisions
control batch.
of this International Standard. At the time of publi-
cation, the edition indicated was valid. All standards
3.4 stock culture: Bacterial culture obtained from
are subject to revision, and parties to agreements
the collection strain of the laboratory and intended to
based on this International Standard are encouraged
provide an inoculum for the preculture in the test
to investigate the possibility of applying the most re-
procedure.
cent edition of the standard indicated below. Mem-
bers of IEC and IS0 maintain registers of currently
3.5 preculture: Bacterial culture separately used to
valid International Standards.
adapt the test bacteria to the test conditions and to
IS0 7027:1990, Water quality - Determination of produce an adequate number of exponentially multi-
turbidity. plying bacteria as an inoculum for the test culture.
3.6 test culture: Inoculated test medium (3.9).
3 Definitions
For the purposes of this International Standard, the 3.7 inoculum: Suspension of bacteria used to in-
following definitions apply. oculate a nutrient solution.
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IS0 10712:1995(E)
NOTE 2 The two following strains are suitable for this
38 . nutrient solution: Aque ous solution of nutrients
test:
requi red for bacterial growth.
a) MIGULA, Berlin 33/Z strain (DSM 50026)
3.9 test medium: Mixture of test sample, dilution
This strain is available from the following collection:
water and nutrient solution (without inoculum).
German collection of microorganisms
3.10 sample: The surface, ground, or waste water
Mascheroder Weg 1 b
to be tested.
D-381 24 Braunschweig
Germany
3.11 test sample: The sample, after inclusion of all
b) NCIB strain 9494
preparatory steps such as homogenization, pH ad-
justment, filtration, centrifugation.
This strain is available from the following collection:
3.12 control: Mixture of dilution water, nutrient sol-
Tony Research Station
and inoculum (without test sample). P.O. Box 31
ution
Aberdeen, UK
3.13 formazine nephelometric unit (FNU): Forma-
may be suit-
Any other strain of equivalent sensitivity
zine turbidity units. The optical density of a bacterial
able.
cell suspension at L = 436 nm, measured as
formazine nephelometric units according to IS0 7027.
5.2 Hydrochloric acid, c(HCI) = 1 mol/l.
5.3 Sodium hydroxide solution,
c(NaOH) = 1 mol/l.
4 Principle
More diluted or concent rated acids and alkaline sol-
Determination of the inhibitory effect of the sample
utions are permi ssible to adjust the pH a s necessary.
on Pseudomonas putida by measurement of cell
growth under the influence of varying dilutions of the
test sample, compared to the cell growth of a culture
5.4 Nutrient solution
obtained under the same conditions, but without the
test sample. Prepare the stock solutions I-IV (see 5.4.1 to 5.4.4)
and then sterilize them, for example at 121 “C for
Determination of the cell concentration as optical
IO min.
density after a test period of 16 h + 1 h.
-
The solutions can be stored for several weeks in the
The concentrations of the test sample at which cell
refrigerator at 2 “C to 4 “C.
multiplication is inhibited by IO % and 50 % within
16 h + 1 h. are the basis for assessment.
-
5.4.1 Solution I
Dissolve the following in water and dilute to 500 ml.
- IO,0 g of sodium nitrate (NaNO,)
5 Reagents
- 2,40 g of dipotassium hydrogen phosphate
Use chemicals of analytical grade and deionized water
(K,HPO,)
or water of equivalent purity.
- I,20 g of potassium dihydrogen phosphate
KH2P0,)
5.1 Test organism
- I,0 g of yeast extract
Pseudomonas putida, a gram-negative aerobic bac-
terium of the Pseudomonadaceae family; mobile rods
5.4.2 Solution II
(diameter 0,7 pm to 1 ,I pm, length 2,0 pm to
4‘0 pm) with polar flagellation. It occurs ubiquitously
Dissolve the following in water and dilute to 500 ml.
in soil and surface water. The optimal growth tem-
- IO,0 g of sodium nitrate (NaNO,)
perature is between 25 “C and 30 “C.
2
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IS0 10712:1995(E)
- 2,40 g of dipotassium hydrogen phosphate Dispense 6 ml to IO ml portions of the nutrient me-
dium into culture tubes while still liquid, close the
(K,HPO,)
tubes with plugs and sterilize for IO min at 121 “C.
- I,20 g of potassium dihydrogen phosphate
Allow the nutrient medium to gel at a slant and store
KH,PO,)
at 2 “C to 4 “C.
5.4.3 Solution Ill, glucose solution
5.5.2 Handling of stock culture
Dissolve the following in water and dilute to 500 ml.
- 40,o g of D(+)-glucose monohydrate Store stock cultures of the test strain Pseudomonas
(C6H,206.H20) for biochemical and microbiological putida in slant-agar culture tubes on the solid nutrient
use medium for stock cultures (5.5.1).
Start new stock cultures at intervals of one week, to
5.4.4 Solution IV, magnesium sulfate-iron(lll)
preserve the test strain.
citrate solution
Incubate the inoculated stock cultures for 24 h at
Dissolve the following in water and dilute to
25 “C + 4 “C (and store at 25 “C & 4 “C) for this pur-
1 000 ml.
pose. Long-term recultivation of one strain may cause
changes in the sensitivity of the test organisms. In
- 4,0 g of magnesium sulfate heptahydrate
this case, a new culture of the test strain has to be
(MgSO,.7H,O)
used.
- 0,Ol g of granulated iron(lll) citrate
NOTE 4 A green pigment may be produced after incu-
bation for 24 h. This is normal and does not indicate con-
NOTE 3 In order to reduce the number of steps involved,
solutions I and III can be combined, following sterilization, tamination.
for the procedure in 5.5 and 8.1 and solutions II and Ill for
the procedure in 8.2.
6 Materials and equipment
5.5 Stock culture (see table 1)
Equipment which comes into contact with the test
5.5.1 Nutrient medium for the stock culture
material during preparation of the nutrient medium,
(slant agar)
or during the test period, shall consist of glass or an-
Dissolve 18 g of agar (high purity quality for micro- other chemically inert material.
biology) in water by heating.
All glass equipment and stoppers which come into
Add 50 ml of solution I (5.4.1), 125 ml of solution III contact with the test cultures shall be sterilized before
(5.4.3), 100 ml of solution IV (5.4.4) and dilute to use, if they are not sterilized together with the nutri-
I 000 ml with water.
ent solutions.
Table 1 - Final concentrations in the various media
Stock culture (5.5) Preculture (8.1) Test culture (8.2)
Nutrients
w/l
w/l w/l
I
NaNO, 1 000 500 500
K,HPO, 240 120 120
KH*PO, 120 60 60
100
Yeast extract 50
10 000
C6H,,06-H20 2 000
400
MgS0,.7H20 200
Iron(lll) citrate
ItO 0,5
Agar 18 000
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IS0 10712:1995(E)
6.1 Spectrometer or turbidimeter. Add 25 m each of solutions I and III (5.4.1 and 5.4.3)
plus 50 m of solution IV (5.4.4).
Alternatively, determine the state of growth of the
The pH of the preculture medium is 7,2 + 0,2.
culture by a different procedure, providing that this NOTE 5
-
method is sufficiently sensitive and if it can be shown
Dispense the preculture medium into the culture
that the correlation with turbidimetry is acceptable.
flasks under sterile conditions (e.g. in 90 ml portions
into conical flasks with nominal volumes of 250 ml).
6.2 Microscope of minimum magnification
x 100.
8.1.2 Preparation of inoculum for the preculture
6.3 pH-meter.
Prepare the inoculum for the preculture by using stock
culture (5.5.2) that is up to 7 days old.
6.4 Temperature-controlled cabinet.
Rinse the cells from the slant agar (5.5.1) with sterile
6.5 Culture flasks. preculture medium (8.1.1).
Dilute this cell suspension with sterile preculture me-
6.6 Autoclave.
dium to give a calculated turbidity of IO FNU in the
preculture.
7 Treatment of samples
EXAMPLE
Test the samples as soon as possible after collection
If the volume
...
NORME
IS0
I N T E R NAT I O NA L E
10712
Première édition
1995-1 2-1 5
Qualité de l'eau - Essai d'inhibition de la
croissance de Pseudomonas putida (essai
d'inhibition de la multiplication des cellules
de Pseudomonas)
Water quality - Pseudomonas putida growth inhibition test
(Pseudomonas cell multiplication inhibition test)
Numéro de référence
IS0 1071 2:1995(F)
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IS0 10712:1995(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d'organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I'ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec I'ISO participent également aux travaux. L'ISO colla-
bore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des co-
mités membres votants.
La Norme internationale IS0 1071 2 a été élaborée par le comité technique
ISOflC 147, Qualité de l'eau, sous-comité SC 5, Méthodes biologiques.
Les annexes A et B de la présente Norme internationale sont données
uniquement à titre d'information.
Q IS0 1995
Droits de reoroduction réserves. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord
écrit de I'éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 CH-1 21 1 Genève 20 Suisse
Imprimé en Suisse
II
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0 IS0
IS0 10712:1995(F)
Introduction
La bactérie Pseudomonas putida est utilisée comme organisme repré-
sentatif des micro-organismes hétérotrophes présents dans l'eau douce.
...
111
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NORME INTERNATIONALE Q IS0 IS0 107 12:1995(F)
Qualité de l'eau - Essai d'inhibition de la croissance
de Pseudomonas putida (essai d'inhibition de la
multiplication des cellules de Pseudomonas)
1 Domaine d'application 3 Définitions
Pour les besoins de la présente Norme internationale,
La présente Norme internationale prescrit une mé-
les définitions suivantes s'appliquent.
thode d'essai pour la détermination de l'effet inhibi-
teur de l'eau de surface, de l'eau souterraine et des
eaux usées vis-à-vis de Pseudomonas putida.
3.1 multiplication; croissance: Augmentation du
nombre de cellules pendant la durée de l'essai.
La méthode n'est pas applicable aux échantillons de
forte coloration, ou contenant des matières non dis-
3.2 relation concentration/effet: Relation entre
soutes ou volatiles ou des substances réagissant avec
l'inhibition de la multiplication des cellules et la
le milieu nutritif ou qui subissent des changements
concentration de I'échantillon d'essai.
pendant l'essai (par exemple par précipitation, ou dé-
gradation biochimique ou photochimique), et peuvent
NOTE 1 Cette relation est représentée graphiquement
donner des résultats faux, et/ou affecter la reproduc-
en plaçant les valeurs d'inhibition sur l'axe des ordonnées,
tibilité.
et celles de la concentration de I'échantillon sur l'axe des
abscisses.
La méthode permet également d'expérimenter les
substances solubles dans l'eau (voir annexe A).
3.3 concentration réelle (CE): Concentration de
I'échantillon soumis à l'essai donnant une valeur cal-
culée ou interpolée d'inhibition de la multiplication de
cellules de Pseudornonas putida dans les 16 h f 1 h,
comparée avec le lot témoin.
Les concentrations de I'échantillon soumis à l'essai
2 Référence normative
(CE1 O et CE50) sont déterminées à partir de la relation
concentrationleffet (3.2) à partir de laquelle la multi-
La norme suivante contient des dispositions qui, par
plication des cellules est inhibée de 10 %, respec-
suite de la référence qui en est faite, constituent des
tivement 50 %, par rapport au lot témoin.
dispositions valables pour la présente Norme inter-
nationale. Au moment de la publication, I'édition indi-
3.4 culture mère: Culture bactérienne obtenue à
quée était en vigueur. Toute norme est sujette à
partir de la souche de collection du laboratoire et
révision et les parties prenantes des accords fondés
destinée à fournir un inoculum pour la préculture du
sur la présente Norme internationale sont invitées à
mode opératoire.
rechercher la possibilité d'appliquer I'édition la plus
récente de la norme indiquée ci-après. Les membres
3.5 préculture: Culture bactérienne destinée à ac-
de la CE1 et de I'ISO possèdent le registre des Nor-
climater la bactérie d'essai aux conditions de l'essai
mes internationales en vigueur à un moment donné.
et à fournir un nombre approprié de bactéries ayant
une croissance exponentielle comme inoculum pour
IS0 7027:1990, Qualité de l'eau - Détermination de
la culture d'essai.
la turbidité.
1
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IS0 107 12:1995(F) 0 IS0
3.6. culture d'essai: Milieu d'essai (3.9) ensemencé. 2,O pm à 4,O pm de longueur) à flagellation polaire.
Elle est présente partout dans le sol et l'eau de sur-
3.7 inoculum: Suspension de bactéries destinée à
face. Sa température de croissance optimale se situe
ensemencer une solution nutritive.
entre 25 "C et 30 "C.
NOTE 2 Les deux souches suivantes conviennent pour
3.8 solution nutritive: Solution aqueuse de sub-
l'essai:
stances nutritives nécessaires à la croissance
bactérienne.
souche MIGULA, Berlin 33/2 (DSM 50026)
3.9 milieu d'essai: Mélange d'échantillon soumis à
Cette souche est disponible B partir de la collection
l'essai, d'eau de dilution et de solution nutritive (sans
suivante:
inoculum).
Collection allemande de micro-organismes
1 b
Mascheroder Weg
3.10 échantillon: Eau de surface, eau souterraine
D-38124 Braunschweig
ou eau usée à exDérimenter.
Allemagne
3.1 1 échantillon d'essai: Échantillon, après toutes
souche NClB 9494
les étapes préparatoires telles que homogénéisation,
ajustement du pH, filtration, centrifugation.
Cette souche est disponible B partir de la collection
suivante:
3.12 témoin: Mélange d'eau de dilution, de solution
Torry Research Station
nutritive et d'inoculum (sans échantillon d'essai).
P.O. Box 31
Aberdeen, Royaume-Uni
3.13 unités néphélométriques formazine, FNU:
Unités de turbidité formazine. Densité optique d'une
Toute autre souche de sensibilité équivalente peut être
suspension de cellules bactériennes à une longueur
utiliske.
d'onde de 436 nm, mesurée en unités néphélomé-
triques formazine conformément à I'ISO 7027.
5.2 Acide chlorhydrique, c(HCI) = 1 molil.
4 Principe 5.3 Solution d'hydroxyde de sodium,
c(Na0H) = 1 mol/l.
Détermination de l'effet inhibiteur d'un échantillon sur
Des solutions plus diluées ou plus concentrées
Pseudomonas putida par mesurage de la croissance
d'acide ou de base peuvent être utilisées pour ajuster
cellulaire de diverses dilutions de I'échantillon d'essai,
le pH si nécessaire.
par rapport à la croissance cellulaire obtenue pour une
culture réalisée dans les mêmes conditions mais qui
5.4 Solutions nutritives
ne contient pas I'échantillon d'essai.
Préparer les solutions mères I à IV (voir 5.4.1 à 5.4.41,
Détermination de la concentration cellulaire par den-
puis les stériliser, par exemple à 121 "C pendant
sité optique après une période d'essai de
10 min.
16hF:l h.
Les solutions peuvent être conservées pendant plu-
L'évaluation se fait sur la base des concentrations de
sieurs semaines dans un réfrigérateur à une tempé-
I'échantillon d'essai pour lesquelles la multiplication
rature commise entre 2 "C et 4 OC.
des cellules est inhibée de 10 % et de 50 % dans les
16h11 h.
5.4.1 Solution I
5 Réactifs
Dissoudre les composants suivants dans de l'eau et
compléter à 500 ml avec de l'eau.
Utiliser des réactifs de qualité analytique et de l'eau
déionisée ou de l'eau de pureté équivalente.
- 10,O g de nitrate de sodium (NaNo,);
- 2,40 g d'hydrogénophosphate de dipotassium
5.1 Organisme d'essai
(K2H PO,);
Pseudomonas putida, bactérie aérobie Gram négatif
- 1,20 g de dihydrogénophosphate de potassium
de la famille des Pseudomonadaceae; possédant des
(KHzPO4);
1,l pm de diamètre, et de
flagelles (de 0,7 pm à
2
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0 IS0
IS0 10712:1995( F)
solution II à la solution 111, pour le mode opératoire décrit en
- 1,0 g d'extrait de levure.
8.2.
5.4.2 Solution II
5.5 Culture mère (voir tableau 1)
Dissoudre les composants suivants dans de l'eau et
5.5.1 Milieu nutritif de la culture mère (gélose
compléter à 500 ml avec de l'eau.
inclinée)
- 10,O g de nitrate de sodium (NaNo,);
Dissoudre 18 g d'agar (qualité de haute pureté pour
microbiologie) dans de l'eau, en chauffant.
- 2,40 g d'hydrogénophosphate de dipotassium
(K2H PO,);
Ajouter 50 mI de la solution I (5.4.1), 125 ml de la so-
lution III (5.4.31, 100 ml de la solution IV (5.4.4) et
- 1,20 g de dihydrogénophosphate de potassium
corndéter à 1 O00 ml avec de l'eau.
(KH2POJ.
Lorsqu'il est encore liquide, répartir le milieu nutritif
en volumes de 6 ml à 1 O ml dans les tubes de culture,
5.4.3 Solution 111, solution de glucose
boucher les tubes et les stériliser pendant 10 min à
121 OC.
Dissoudre le composant suivant dans de l'eau et
compléter à 500 ml avec de l'eau.
Laisser le milieu nutritif se solidifier en position incli-
née et conserver à une température comprise entre
- 40,O g de D(+)-glucose monohydraté
2 "C et 4 "C.
(C,H,,0,,H20), pour utilisation biochimique et mi-
c ro b i o log iqu e.
5.5.2 Maintien de la culture mère
Conserver les cultures mères de la souche d'essai
5.4.4 Solution IV, solution de sulfate de
Pseudornonas putida dans des tubes de culture
magnésium-citrate de fer(lll1
contenant une gélose inclinée sur le milieu nutritif
solide des cultures mères (5.5.1 1.
Dissoudre les composants suivants dans de l'eau et
compléter à 1 O00 mI avec de l'eau.
Faire de nouvelles cultures mères à intervalles d'une
semaine, pour préserver la souche d'essai.
- 4,O g de sulfate de magnésium heptahydraté
(MgS0,,7H,O);
Incuber les cultures mères ensemencées pendant
24 h à 25 "C 5 4 "C (et conserver à 25 "C 4 OC)
- 0,Ol g de citrate de fer(lll) en granulés.
dans ce but. À long terme, la remise en culture d'une
souche peut provoquer des modifications de la sensi-
NOTE 3 Afin de réduire le nombre d'étapes nécessaires,
bilité des organismes d'essai. Dans ce cas, utiliser
la solution I peut être mélangée à la solution III, aprbs sté-
rilisation, pour le mode opératoire décrit en 5.5 et 8.1, et la une nouvelle culture de la souche d'essai.
Tableau 1 - Concentrations finales dans les différents milieux
Préculture (8.1)
Culture mère (5.5)
Substances
nutritives
mgil
mgil
500
1 O00 500
NaNO,
240 120 120
K,HPO,
60 60
KH2P0, 120
-
O0 50
Extrait de levure 1
2 O00 2 O00
10 O00
C6H1206,H20
200 200
400
MgS0,,7H,O
0,5
1 ,O 0,5
Citrate de fer(lll)
- -
18 O00
Agar
3
---------------------- Page: 6 ----------------------
IS0 10712:1995(F) 0 IS0
NOTE 4 Un pigment vert peut &re produit après
7,4 rt 0,3 avec de l'acide chlorhydrique (5.2) ou avec
incubation pendant 24 h. Cela est normal et n'indique pas
une solution d'hydroxyde de sodium (5.3); veiller à
une contamination.
modifier aussi peu que possible la concentration de
I'échantillon d'eau. Si nécessaire, par exemple pour
les échantillons contaminés à un niveau élevé par des
6 Appareillage et matériel
microbes, ils peuvent être stérilisés par filtration, mais
cela peut entraîner des modifications de l'effet
L'appareillage qui doit entrer en contact avec l'échan-
toxicologique de I'échantillon.
tillon d'essai pendant la préparation du milieu nutritif
ou pendant la période d'essai doit être en verre ou
tout autre matériau chimiauement inerte.
8 Mode opératoire
Tout le matériel et les bouchons en verre entrant en
contact avec les cultures d'essai doivent être stérili- 8.1 Préparation de la préculture (3.5)
sés avant emploi, s'ils n'ont pas été stérilisés en
même temps que les solutions nutritives.
8.1.1 Préparation du milieu de préculture
Verser 900 ml d'eau stérilisée dans un récipient stéri-
6.1 Spectromètre ou turbidimètre
lisé ou stériliser 900 mI d'eau dans un récipient ap-
L'état de croissance des cultures peut également être
proprié.
déterminé par une méthode différente si celle-ci a une
Ajouter 25 ml des solutions I et III (5.4.1
et 5.4.3) et
sensibilité suffisante et s'il est établi une corrélation
50 ml de la solution IV (5.4.4).
acceptable avec la turbidimétrie.
NOTE 5
Le pH du milieu de préculture est de 7,2 rt 0,2.
6.2 Microscope, de grossissement x 100 au mini-
mum.
Répartir le milieu de préc
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 10712
Première édition
1995-12-15
Qualité de l’eau - Essai d’inhibition de la
croissance de Pseudomonas putida (essai
d’inhibition de la multiplication des cellules
de Pseudomonas)
Wa ter quality - Pseudomonas putida growth inhibition test
(Pseudomonas ce// multiplication inhibition test)
Numéro de référence
ISO 10712:1995(F)
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ISO 10712:1995(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mités membres votants.
La Norme internationale ISO 10712 a été élaborée par le comité technique
ISOnC 147, Qualité de /‘eau, sous-comité SC 5, Méthodes biologiques.
Les annexes A et B de la prés ente No rme internationale sont données
I
uniquement à titre d information
0 60 1995
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-l 211 Genève 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
ii
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0 ISO
ISO 10712:1995(F)
Introduction
La bactérie Pseudomonas putida est utilisée comme organisme repré-
sentatif des micro-organismes hétérotrophes présents dans l’eau douce.
. . .
III
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Page blanche
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ISO 10712:1995(F)
NORME INTERNATIONALE 0 ISO
Qualité de l’eau - Essai d’inhibition de la croissance
de Pseucbrnonas putida (essai d’inhibition de la
multiplication des cellules de Pseudomonas)
3 Définitions
1 Domaine d’application
Pour les besoins de la présente Norme internationale,
La présente Norme internationale prescrit une mé-
les définitions suivantes s’appliquent.
thode d’essai pour la détermination de l’effet inhibi-
teur de l’eau de surface, de l’eau souterraine et des
eaux usées vis-à-vis de Pseudomonas putida.
3.1 multiplication; croissance: Augmentation du
nombre de cellules pendant la durée de l’essai.
La méthode n’est pas applicable aux échantillons de
forte coloration, ou contenant des matières non dis-
3.2 relation concentrationleffet: Relation entre
soutes ou volatiles ou des substances réagissant avec
l’inhibition de la multiplication des cellules et la
le milieu nutritif ou qui subissent des changements
concentration de l’échantillon d’essai.
pendant l’essai (par exemple par précipitation, ou dé-
gradation biochimique ou photochimique), et peuvent
NOTE 1 Cette relation est représentée graphiquement
donner des résultats faux, et/ou affecter la reproduc-
en plaçant les valeurs d’inhibition sur l’axe des ordonnées,
tibilité.
et celles de la concentration de l’échantillon sur l’axe des
abscisses.
La méthode permet également d’expérimenter les
substances solubles dans l’eau (voir annexe A).
3.3 concentration réelle (CE): Concentration de
l’échantillon soumis à l’essai donnant une valeur cal-
culée ou interpolée d’inhibition de la multiplication de
cellules de Pseudomonas putida dans les 16 h + 1 h,
-
comparée avec le lot témoin.
Les concentrations de l’échantillon soumis à l’essai
2 Référence normative
(CE10 et CE50) sont déterminées à partir de la relation
concentrationleffet (3.2) à partir de laquelle la multi-
La norme suivante contient des dispositions qui, par
plication des cellules est inhibée de 10 %, respec-
suite de la référence qui en est faite, constituent des
tivement 50 %, par rapport au lot témoin.
dispositions valables pour la présente Norme inter-
nationale. Au moment de la publication, l’édition indi-
3.4 culture mère: Culture bactérienne obtenue à
quée était en vigueur. Toute norme est sujette à
partir de la souche de collection du laboratoire et
révision et les parties prenantes des accords fondés
destinée à fournir un inoculum pour la préculture du
sur la présente Norme internationale sont invitées à
mode opératoire.
rechercher la possibilité d’appliquer l’édition la plus
récente de la norme indiquée ci-après. Les membres
3.5 préculture: Culture bactérienne destinée à ac-
de la CEI et de I’ISO possèdent le registre des Nor-
climater la bactérie d’essai aux conditions de l’essai
mes internationales en vigueur à un moment donné.
et à fournir un nombre approprié de bactéries ayant
une croissance exponentielle comme inoculum pour
ISO 7027:1990, Qualité de l’eau - Détermination de
la culture d’essai.
la turbidité.
1
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ISO 10712:1995(F)
2,0 prn à 4,0 prn de longueur) à flagellation polaire.
3.6 culture d’essai: Milieu d’essai (3.9) ensemencé.
Elle est présente partout dans le sol et l’eau de sur-
3.7 inoculum: Suspension de bactéries destinée à face. Sa température de croissance optimale se situe
entre 25 “C et 30 “C.
ensemencer une solution nutritive.
NOTE 2 Les deux souches suivantes conviennent pour
3.8 solution nutritive: Solution aqueuse de sub-
l’essai:
stances nutritives nécessaires à la croissance
bactérienne.
a) souche MIGULA, Berlin 33/2 (DSM 50026)
3.9 milieu d’essai: Mélange d’échantillon soumis à
Cette souche est disponible à partir de la collection
l’essai, d’eau de dilution et de solution nutritive (sans
suivante:
inoculum).
Collection allemande de micro-organismes
Mascheroder Weg 1 b
3.10 échantillon: Eau de surface, eau souterraine
D-381 24 Braunschweig
ou eau usée à expérimenter.
Allemagne
3.11 échantillon d’essai: Échantillon, après toutes
b) souche NCIB 9494
les étapes préparatoires telles que homogénéisation,
ajustement du pH, filtration, centrifugation.
Cette souche est disponible à partir de la collection
suivante:
3.12 témoin: Mélange d’eau de dilution, de solution
Ton-y Research Station
nutritive et d’inoculum (sans échantillon d’essai).
P.O. Box 31
Aberdeen, Royaume-Uni
3.13 unités néphélométriques formazine, FNU:
Unités de turbidité formazine. Densité optique d’une
Toute autre souche de sensibilité équivalente peut être
suspension de cellules bactériennes à une longueur
utilisée.
d’onde de 436 nm, mesurée en unités néphélomé-
triques formazine conformément à I’ISO 7027.
5.2 Acide chlorhydrique, C(H~I) = 1 mol/l.
4 Principe 5.3 Solution d’hydroxyde de sodium,
c(NaOH) = 1 mol/l.
Détermination de l’effet inhibiteur d’un échantillon sur
Des solutions plus diluées ou plus concentrées
Pseudomonas putida par mesurage de la croissance
d’acide ou de base peuvent être utilisées pour ajuster
cellulaire de diverses dilutions de l’échantillon d’essai,
le pH si nécessaire.
par rapport à la croissance cellulaire obtenue pour une
culture réalisée dans les mêmes conditions mais qui
5.4 Solutions nutritives
ne contient pas l’échantillon d’essai.
Détermination de la concentration cellulaire par den- Préparer les solutions mères I à IV (voir 5.4.1 à 5.4.4),
après une période d’essai de puis les stériliser, par exemple à 121 “C pendant
sité optique
10 min.
16h+l h.
-
Les solutions peuvent être conservées pendant plu-
L’évaluation se fait sur la base des concentrations de
sieurs semaines dans un réfrigérateur à une
l’échantillon d’essai pour lesquelles la multiplication tempé-
des cellules est inhibée de 10 % et de 50 % dans les rature comprise entre 2 “C et 4 “C.
16h+l h.
-
5.4.1 Solution I
5 Réactifs
Dissoudre les composants suivants dans de
‘eau et
compléter à 500 ml avec de l’eau.
Utiliser des réactifs de qualité analytique et de l’eau
déionisée ou de l’eau de pureté équivalente.
- 10,O g de nitrate de sodium (NaNO,);
- 2,40 g d’hydrogénophosphate de dipotassium
5.1 Organisme d’essai
(K,HPO,);
Pseudomonas putida, bactérie aérobie Gram négatif
- 1,20 g de dihydrogénophosphate de potassium
de la famille des Pseudomonadaceae; possédant des
flagelles (de 0,7 prn à 1 ,l prn de diamètre, et de KH,PO,);
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0 ISO
ISO 10712:1995(F)
solution II à la solution III, pour le mode opératoire décrit en
- 1,O g d’extrait de levure.
8.2.
5.4.2 Sol ution II
5.5 Culture mère (voir tableau 1)
Dissoudre les composants suivants dans de l’eau et
Milieu nutritif de la culture mère
5.5.1 (gélose
compléter à 500 ml avec de l’eau.
inclinée)
- 10,O g de nitrate de sodium (NaNO,);
Dissoudre 18 g d’agar (qualité de haute pureté pour
microbiologie) dans de l’eau, en chauffant.
- 2,40 g d’hydrogénophosphate de dipotassium
(K,HPO,);
Ajouter 50 ml de la solution I (5.4.1), 125 ml de la so-
lution III (5.4.3), 100 ml de la solution IV (5.4.4) et
- 1,20 g de dihydrogénophosphate de potassium
compléter à 1 000 ml avec de l’eau.
Lorsqu’il est encore liquide, répartir le milieu nutritif
en volumes de 6 ml à 10 ml dans les tubes de culture,
5.4.3 Solution Ill, solution de glucose
boucher les tubes et les stériliser pendant 10 min à
121 “C.
Dissoudre le composant suivant dans de l’eau et
compléter à 500 ml avec de l’eau.
Laisser le milieu nutritif se solidifier en position incli-
née et conserver à une température comprise entre
- 40,O g de D(+)-glucose monohydraté
2 OC et 4 “C.
(CGHIz06,H,0), pour utilisation biochimique et mi-
crobiologique.
5.5.2 Maintien de la culture mère
Conserver les cultures mères de la souche d’essai
5.4.4 Solution IV, solution de sulfate de
Pseudomonas putida dans des tubes de culture
magnésium-citrate de fer(lll)
contenant une gélose inclinée sur le milieu nutritif
Dissoudre les composants suivants dans de l’eau et solide des cultures mères (5.5.1).
com.pléter à 1 000 ml avec de l’eau.
Faire de nouvelles cultures mères à intervalles d’une
semaine, pour préserver la souche d’essai.
- 4,0 g de sulfate de magnésium heptahydraté
(MgS0,,7H,O)- I
Incuber les cultures mères ensemencées pendant
24 h à 25 “C + 4 “C (et conserver à 25 “C + 4 “C)
- 0,Ol g de citrate de fer(III) en granulés.
dans ce but. ÀÏong terme, la remise en culture d’une
souche peut provoquer des modifications de la sensi-
NOTE 3 Afin de réduire le nombre d’étapes nécessaires,
bilité des organismes d’essai. Dans ce cas, utiliser
la solution I peut être mélangée à la solution III, après sté-
rilisation, pour le mode opératoire décrit en 5.5 et 8.1, et la une nouvelle culture de la souche d’essai.
Tableau 1 - Concentrations finales dans les différents milieux
Culture mère (5.5) Préculture (8.1) Culture d’essai (8.2)
Substances
nutritives
WI
WI mg/1
NaNO, 1 000 500 500
K,HPO, 240 120 120
KH,PO, 120 60 60
Extrait de levure 100 50
C6H,206,H20 10 000 2 000 2 000
MgS0,,7H,O 400 200 200
Citrate de fer(III) 110 0,5 O,5
Agar 18 000
3
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0 ISO
ISO 10712:1995(F)
Un pigment vert peut être produit après
NOTE 4 7,4 + Of3 avec de l’acide chlorhydrique (5.2) ou avec
-
incubation pendant 24 h. Cela est normal et n’indique pas
une solution d’hydroxyde de sodium (5.3); veiller à
une contamination.
modifier aussi peu que possible la concentration de
l’échantillon d’eau. Si nécessaire, par exemple pour
les échantillons contaminés à un niveau élevé par des
6 Appareillage et matériel
microbes, ils peuvent être stérilisés par filtration, mais
cela peut entraîner des modifications de l’effet
L’appareillage qui doit entrer en contact avec I’échan-
toxicologique de l’échantillon.
tillon d’essai pendant la préparation du milieu nutritif
ou pendant la période d’essai doit être en verre ou
tout autre matériau chimiquement inerte.
8 Mode opératoire
Tout le matériel et les bouchons en verre entrant en
contact avec les cultures d’essai doivent être stérili- 8.1 Préparation de la préculture (3.5)
sés avant emploi, s’ils n’ont pas été stérilisés en
même temps que les solutions nutritives.
8.1.1 Préparation du milieu de préculture
Verser 900 ml d’eau stérilisée dans un récipient stéri-
6.1 Spectromètre ou turbidimètre
lisé ou stériliser 900 ml d’eau dans un récipient ap-
L’état de croissance des cultures peut également être
proprié.
déterminé par une méthode différente si celle-ci a une
Ajouter 25 ml des solutions I et III (5.4.1 et 5.4.3) et
sensibilité suffisante et s’il est établi une corrélation
50 ml de la solution IV (5.4.4).
acceptable avec la turbidimétrie.
NOTE 5 Le pH du milieu de préculture est de 7,2 + 0,2.
-
6.2 Microscope, de grossissement x 100 au mini-
mum.
Répartir le milieu de préculture dans les fioles de
culture dans des conditions stériles (par exemp
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.