ISO 11268-2:1998
(Main)Soil quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) — Part 2: Determination of effects on reproduction
Soil quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) — Part 2: Determination of effects on reproduction
Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre (Eisenia fetida) — Partie 2: Détermination des effets sur la reproduction
General Information
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11268-2
First edition
1998-07-01
Soil quality — Effects of pollutants on
earthworms (Eisenia fetida) —
Part 2:
Determination of effects on reproduction
Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre (Eisenia
fetida)
Partie 2: Détermination des effets sur la reproduction
A
Reference number
ISO 11268-2:1998(E)
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ISO 11268-2:1998(E)
Contents
1 Scope .1
2 Normative references .1
3 Definitions .1
4 Principle.2
5 Reagents.3
6 Apparatus .4
7 Procedure .4
8 Calculation and expression of results.6
9 Validity of the test.6
10 Test report .6
Annex A (informative) Example of a breeding technique for Eisenia fetida fetida and E. fetida andrei.8
Annex B (informative) Techniques for counting juvenile worms hatched from cocoons .9
Annex C (informative) Determination of water-holding capacity of artificial soil.10
Annex D (informative) Laboratory test for sublethal effects of pesticides on Eisenia fetida fetida
or E. fetida andrei.11
Annex E (informative) Determination of effects on earthworm reproduction in contaminated soil.12
Annex F (informative) Performance of the method.14
Annex G (informative) Bibliography .16
© ISO 1998
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or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from the publisher.
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Printed in Switzerland
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ISO ISO 11268-2:1998(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
International Standard ISO 11268-2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee
SC 4, Biological methods.
ISO 11268 consists of the following parts, under the general title Soil quality — Effects of pollutants on earthworms
(Eisenia fetida):
— Part 1: Determination of acute toxicity using artificial soil substrate
— Part 2: Determination of effects on reproduction
— Part 3: Guidance on field testing.
Annexes A to G of this part of ISO 11268 are for information only.
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ISO 11268-2:1998(E)
Introduction
This part of ISO 11268 describes a method for testing the effects of chemicals on earthworm reproduction and
mortality in an artificial soil. It can also be adapted for testing or comparing soils to assess, for example, the effects
of remediation treatments, and for assessing sublethal effects and no-effect levels for pesticides or other added
chemicals.
This part of ISO 11268 has been drawn up taking into consideration test procedures recommended by the
Organization for Economic Cooperation and Development and by the European Union (see references in annex G).
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INTERNATIONAL STANDARD ISO ISO 11268-2:1998(E)
Soil quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia
fetida) —
Part 2:
Determination of effects on reproduction
1 Scope
This part of ISO 11268 describes a method for determining the effects of substances on the reproduction, mortality,
and growth of Eisenia fetida fetida and Eisenia fetida andrei by dermal and alimentary uptake using an artificial soil
substrate.
The method is not applicable to volatile substances, i.e. substances for which H (Henry`s constant) or the air/water
0
partition coefficient is greater than 1, or for which the vapour pressure exceeds 0,0133 Pa at 25 C.
NOTE 1 No provision is made in the test method for monitoring the persistence of the substance under test.
NOTE 2 Recommendations for adapting the method for comparing or monitoring soil quality or agricultural practice, e.g. for
assessing the effect of pesticides, are given in annexes D and E.
2 Normative references
The following standards contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of this part of
ISO 11268. At the time of publication, the editions indicated were valid. All standards are subject to revision, and
parties to agreements based on this part of ISO 11268 are encouraged to investigate the possibility of applying the
most recent editions of the standards indicated below. Members of IEC and ISO maintain registers of currently valid
International Standards.
ISO 10390:1994, Soil quality — Determination of pH.
ISO 11268-1:1993, Soil quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) — Part 1: Determination of
acute toxicity using artificial soil substrate.
1)
ISO 11274:— , Soil quality — Determination of water retention characteristics — Laboratory methods
ISO 11465:1993, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis — Gravimetric
method.
3 Definitions
For the purposes of this part of ISO 11268, the following definitions apply.
1) To be published.
1
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3.1
growth
increase in biomass (i.e. the fresh mass of organisms) expressed as a percentage of the fresh mass of organisms
at the start of the test
3.2
reproduction
increase in the mean number of offspring per test vessel after 8 weeks incubation under the specified test
conditions
3.3
reproduction rate
mean numbers of offspring hatched from the cocoons and surviving until the end of the test period per adult
earthworm remaining alive after four weeks
3.4
lowest observed effect concentration
LOEC
lowest concentration of the test substance which is observed to have a significant effect when compared with the
control, expressed as mass of the test substance per dry mass of the test substrate
3.5
no observed effect concentration
NOEC
highest tested concentration of a test substance at which no lethal or other effect (such as mass alteration) is
observed, expressed as mass of test substance per dry mass of the test substrate
3.6
EC50
concentration estimated to reduce the reproduction rate at the end of the test to 50 % compared to the control,
expressed as mass of test substance per dry mass of the test substrate
4 Principle
The effects on reproduction, growth, and percent mortality of adult earthworms (species Eisenia fetida fetida or
E. fetida andrei) placed in a defined artificial soil substrate containing the test substance in different concentrations,
are determined. A single application of test substance is made and the effects on mortality and biomass are
determined after 4 weeks. The effect on reproduction is measured by counting the number of offspring hatched from
the cocoons after an additional period of 4 weeks.
All test concentrations above the LOEC must have a harmful effect equal to, or greater than, that observed at the
LOEC. Where there is no prior knowledge of the concentration of the test substance likely to have an effect, then it
is useful to conduct the test in two steps:
a preliminary acute toxicity test is carried out, as described in ISO 11268-1, to give an indication of the effect
concentration, and the concentration giving total mortality. Concentrations to be used in the final test can then
be selected;
the final test on reproduction to determine the concentration of a chemical which, when evenly mixed into the
artficial soil, causes no significant effects on numbers of offsprings hatched from cocoons compared with the
control (NOEC), and the lowest concentration causing effects (LOEC).
2
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5 Reagents
5.1 Biological material
The biological material consists of adult earthworms of the species Eisenia fetida fetida or Eisenia fetida andrei
(see references in annex F), which are between two months and 1 year old, with a clitellum, and a wet mass
between 300 mg and 600 mg.
Synchronization of breeding is achieved by placing adult worms in breeding containers (see annex A) and removing
them after not more than 4 weeks. Offspring of the remaining cocoons reach an adult stage after at least 2 months.
Condition the selected worms for 1 d to 7 d in an artificial soil before use.The food, which is also used as food
source in the test (see 5.3), shall be given in a sufficient amount (see 5.2.1).
5.2 Test substrate
5.2.1 Soil substrate
The substrate used to make artificial soil (5.2.2) shall have the following composition:
Artificial soil component Percentage expressed on dry
mass basis
Sphagnum peat, air-dried, finely ground and with no visible plant 10%
remains
Kaolinite clay, air-dried, containing not less than 30 % kaolinite 20%
Industrial quartz sand, air-dried, (predominantly fine sand with 70%
more than 50 % by mass of particle size 0,05 mm to 0,2 mm),
dependent on CaCO needed
3
Before the experiment, mix the test substrate with the food. When dried cow manure (see 5.3) is used, an amount of
5 g per 500 g dry mass of soil is recommended.
Add sufficient (about 0,5 %) calcium carbonate (CaCO ), pulverized, and of recognized analytical grade, to bring the
3
pH of the wetted substrate to 6,0 ± 0,5 at the start of the test.
NOTE The amount of calcium carbonate required will depend on the components of the soil substrate, including food, and
should be determined by measurements on subsamples immediately before the test.
Use 500 g to 600 g dry mass of soil substrate per test container (6.1) to make the artificial soil.
5.2.2 Artificial soil
Prepare the artificial soil by wetting the soil substrate (5.2.1) with deionized or distilled water to reach a water
content of between 40 % and 60 % by mass of the total water-holding capacity determined in accordance with
ISO 11274.
NOTE The artificial soil should be wetted to a point where there is no standing water or free water appearing when the soil is
compressed. If ISO 11274 has not yet been published, use the interim method given in annex C to determine water-holding
capacity .
Determine the water content and the pH in the presence of 1 mol/l KCl, in accordance with ISO 11465 and
ISO 10390 respectively, of the artificial soil in a mixed sample, immediately before the start of the test and at the
end of the test in one sample of the control and one sample of each concentration tested (when acid or basic
substances are tested, do not adjust the pH).
3
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5.3 Food
Any food source of a quality shown to be capable of at least maintaining the earthworm population shall be used.
To achieve sufficient reproduction it is essential to feed the earthworms during the experiment. Air-dried finely
ground cow manure has been found to be a suitable food. Each charge of food shall be tested to determine whether
the earthworms will feed on it, and whether any adverse effects (e.g. by ammonia and other potentially harmful
additives) occur. Growth and cocoon production should not be reduced compared to worms kept in a substrate
without food. (Conditions as described in ISO 11268-1).
6 Apparatus
Standard laboratory equipment, and:
2
6.1 Containers, of 1 litre to 2 litre capacity with a cross-sectional area of about 200 cm , such that a depth of 5 cm
to 6 cm of the soil substrate contains 500 g to 600 g dry mass. Test containers shall permit gaseous exchange
between the medium and the atmosphere and access of light (e.g. by means of a perforated transparent cover),
and shall have provisions to prevent worms from escaping (e.g. by using a tape to fix the cover).
6.2 Apparatus capable of measuring the pH and water content of a substrate.
6.3 Test environment
0 0
6.3.1 Enclosure, capable of being controlled to a temperature of 20 C ± 2 C.
6.3.2 Light source, capable of delivering a constant light intensity of 400 lx to 800 lx on the containers at a
controlled light/ dark cycle of between 12 h:12 h and 16 h:8 h.
7 Procedure
7.1 Preliminary test
If it is necessary to determine the range of concentrations for use in the final test, perform a preliminary acute test in
accordance with ISO 11268-1 for four concentrations of the test substance and a control (for example 0 mg/kg,
1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg and 1000 mg/kg, the concentrations being expressed in milligrams of test substance
per kilogram of dried soil substrate (5.2.1)) using ten worms per concentration and per container.
7.2 Final test
7.2.1 Introduction of the test substances
Use either method a), b) or c), as appropriate.
a) Water-soluble substance
Immediately before starting the test, dissolve the quantity of the test substance in the water required for the
replicates of one concentration in water (or that portion of it necessary to wet the soil substrate) in order to meet
the requirements of 5.2.2, and mix it thoroughly with the soil substrate before introducing it into a test container.
4
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b) Substances insoluble in water but soluble in organic solvents
Dissolve the quantity of test substance required to obtain the desired concentration in a volatile solvent (such as
acetone or hexane) and mix it with a portion of the quartz sand required. After evaporating the solvent by
placing the container under a fume hood, add the remainder of the basic substrate and the water and mix it
thoroughly before introducing it into the test containers. Continue as described in 7.2.3.
NOTE Ultrasonic dispersion, organic solvents, emulsifiers or dispersants may be used to disperse substances with low
aqueous solubility. When such auxiliary substances are used, all test concentrations and an additional control should
contain the same minimum amount of auxiliary substance.
WARNING: Take appropriate precautions when dealing with solvent vapour to avoid danger from
inhalation or explosion, and to avoid damage to extraction equipment, pumps etc.
c) Substances insoluble in water or organic solvents
For a substance insoluble in a volatile solvent, prepare a mixture of 10 g of finely ground industrial quartz sand
(see 5.2.1) and the quantity of the test substance required to obtain the desired concentration. Place the
mixture, the remainder of the soil substrate (5.2.1) and the water into the test container (6.1) and mix
thoroughly.
Mix the test substance into the artificial soil substrate in accordance with ISO 11268-1 before the earthworms are
added.
Base the concentrations selected to provide the LOEC/NOEC on the results of the preliminary test. Space the
concentrations by a factor not exceeding 2.
Substances mixed into the substrate do not need to be tested at concentrations higher than 1000 mg/kg mass of
test substrate.
Proceed simultaneously with at least four replicates per concentration and the control(s).
7.2.2 Control container
Prepare control containers in the same way as the test containers but without the test substance. If the preparation
of the test requires the use of auxiliary substances (see 8.2.1) use additional control containers similar to the test
containers without the test substance. Treat these containers in the same way as those without the test substance.
7.2.3 Addition of the biological material
For each test container and the control container prepare, wash and wipe (using absorbent paper) ten worms (5.1).
To avoid
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 11268-2
Première édition
1998-07-01
Qualité du sol — Effets des polluants vis-
à-vis des vers de terre (Eisenia fetida) —
Partie 2:
Détermination des effets sur la reproduction
Soil quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) —
Part 2: Determination of effects on reproduction
A
Numéro de référence
ISO 11268-2:1998(F)
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ISO 11268-2:1998(F)
Sommaire Page
1 Domaine d’application.1
2 Références normatives.1
3 Définitions.2
4 Principe .2
5 Réactifs .3
6 Appareillage.4
7 Mode opératoire .5
8 Calcul et expression des résultats.6
9 Validité de l’essai .7
10 Rapport d’essai .7
Annexes
A Exemple de technique d’élevage des Eisenia fetida fetida et E. fetida andrei.9
B Technique de comptage des vers de terre juvéniles éclos des cocons.10
C Détermination de la capacité de rétention d’eau du sol artificiel.11
D Essai en laboratoire sur les effets sublétaux des pesticides vis-à-vis des Eisenia fetida fetida
ou des E. fetida andrei.12
E Détermination des effets des sols contaminés sur la reproduction des vers de terre.13
F Performance de la méthode.15
G Bibliographie .18
© ISO 1998
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque
forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit de l'éditeur.
Organisation internationale de normalisation
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Imprimé en Suisse
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ISO ISO 11268-2:1998(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO, participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
La Norme internationale ISO 11268-2 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-
comité SC 4, Méthodes biologiques.
L’ISO 11268 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité du sol — Effets des polluants
vis-à-vis des vers de terre (Eisenia fetida)
— Partie 1: Détermination de la toxicité aiguë en utilisant des substrats de sol artificiel
— Partie 2: Détermination des effets sur la reproduction
— Partie 3: Lignes directrices concernant les effets sur site.
Les annexes A à G de la présente partie de l’ISO 11268 sont données uniquement à titre d’information.
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ISO 11268-2:1998(F) ISO
Introduction
La présente partie de l’ISO 11268 décrit une méthode permettant d'expérimenter les effets des produits chimiques
sur la reproduction et la mortalité des vers de terre dans un sol artificiel. Elle peut également être adaptée pour
expérimenter ou comparer les sols, dans le but, par exemple, d'évaluer l'effet de leur traitement ainsi que les effets
sublétaux et les niveaux sans effet des pesticides ou de tous autres produits chimiques ajoutés.
La présente partie de l’ISO 11268 a été élaborée en tenant compte des méthodes d'essai recommandées par
l'Organisation de coopération pour le développement économique et par l'Union européenne (voir références dans
l'annexe G).
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NORME INTERNATIONALE ISO ISO 11268-2:1998(F)
Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre
(Eisenia fetida) —
Partie 2:
Détermination des effets sur la reproduction
1 Domaine d'application
La présente partie de l’ISO 11268 décrit une méthode de détermination des effets de certaines substances sur la
reproduction, la mortalité et la croissance des Eisenia fetida fetida et Eisenia fetida andrei par absorption cutanée
ou orale, à l'aide d'un substrat de sol artificiel.
La méthode n'est pas applicable aux substances volatiles, c'est-à-dire les substances pour lesquelles H (la
constante de Henry) ou le coefficient de partage air/eau est supérieur à 1, ou encore pour lesquelles la pression de
vapeur est supérieure à 0,013 3 Pa à 25 °C.
NOTE 1 Cette méthode d'essai n'a prévu aucune disposition particulière visant à surveiller la stabilité de la substance
soumise à l'essai.
NOTE 2 Les recommandations concernant l'adaptation de cette méthode à la comparaison ou à la surveillance de la qualité
des sols, ou à l'agriculture, pour évaluer par exemple les effets des pesticides, sont données dans les annexes D et E.
2 Références normatives
Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente partie de l’ISO 11268. Au moment de la publication, les éditions indiquées
étaient en vigueur. Toute norme est sujette à révision et les parties prenantes des accords fondés sur la présente
partie de l’ISO 11268 sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer les éditions les plus récentes des normes
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de l'ISO possèdent le registre des Normes internationales en vigueur
à un moment donné.
ISO 10390:1994, Qualité du sol — Détermination du pH
ISO 11268-1:1993, Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre (Eisenia fetida) — Partie 1:
Détermination de la toxicité aiguë en utilisant des substrats de sol artificiel
1)
ISO 11274:— , Qualité du sol — Détermination des caractéristiques de la rétention d'eau — Méthodes de
laboratoire
ISO 11465:1993, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau —
Méthode gravimétrique
1)
À publier.
1
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ISO 11268-2:1998(F) ISO
3 Définitions
Pour les besoins de la présente partie de l’ISO 11268, les définitions suivantes s'appliquent.
3.1
croissance
augmentation de la biomasse, c'est-à-dire la masse fraîche des organismes exprimée en pourcentage de la masse
fraîche des organismes au début de l'essai
3.2
reproduction
augmentation du nombre moyen de larves écloses des cocons par récipient d'essai après huit semaines
d'incubation dans des conditions spécifiées pour l'essai
3.3
taux de reproduction
nombre moyen de larves écloses des cocons et ayant survécu jusqu'à la fin de la période d'essai, par ver adulte
encore vivant après quatre semaines
3.3
concentration la plus faible ayant un effet observé
LOEC
concentration la plus faible de la substance à expérimenter à laquelle un effet significatif a été observé par
comparaison avec l'échantillon témoin, exprimée en masse de la substance expérimentée par masse sèche du
substrat d'essai
3.4
concentration sans effet observé
NOEC
concentration d'essai la plus élevée d'une substance expérimentée à laquelle aucun effet létal ou autre (une
diminution de la masse par exemple) n'a été observé, exprimée en masse de la substance expérimentée par masse
sèche du substrat d'essai
3.5
CE50
concentration estimée pour avoir un effet inhibiteur de 50 % sur le taux de reproduction, à la fin de l'essai, par
comparaison avec le témoin, exprimée en masse de la substance expérimentée par masse sèche du substrat
d'essai
4 Principe
On détermine les effets sur la croissance et la reproduction, ainsi que le pourcentage de mortalité des vers de terre
adultes (espèce Eisenia fetida fetida ou E. fetida andrei) placés dans un substrat de sol artificiel défini contenant la
substance d'essai à diverses concentrations. La substance d'essai est ajoutée en une seule fois. Les effets sur la
mortalité et la biomasse sont déterminés après quatre semaines. L'effet sur la reproduction est mesuré en comptant
le nombre de larves écloses des cocons après quatre autres semaines.
Toutes les concentrations d’essai supérieures à la LOEC doivent avoir un effet nuisible supérieur ou égal à celui de
la LOEC. Lorsqu'on ne connaît pas la concentration à laquelle la substance étudiée est susceptible de produire un
effet, il est utile de conduire l'essai en deux étapes:
2
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ISO ISO 11268-2:1998(F)
— un essai préliminaire de toxicité aiguë, comme décrit dans l'ISO 11268-1, qui donne une indication de la
concentration produisant un effet et de la concentration responsable de la mortalité totale. Les concentrations
pour l'essai définitif peuvent alors être retenues;
— un essai définitif sur la reproduction pour déterminer la concentration d'un produit chimique qui, lorsqu'il est
uniformément réparti dans le sol artificiel, n'a pas d'effet significatif sur le nombre de larves écloses des cocons
comparé au témoin (NOEC) et la plus faible concentration produisant un effet (LOEC).
5 Réactifs
5.1 Réactif biologique
Le réactif biologique est constitué de vers de terre adultes de l'espèce ou
Eisenia fetida fetida Eisenia fetida andrei
(voir références données à l'annexe G) âgés de deux mois à 1 an, possédant un clitellum, et une masse humide
comprise entre 300 mg et 600 mg.
Les vers à utiliser doivent être choisis dans un élevage synchrone pour former une population aussi homogène que
possible du point de vue de la taille, de l'âge et de la masse. L'âge des vers ne doit pas varier de plus de
quatre semaines.
La synchronisation de l'élevage s'obtient en plaçant des vers adultes dans des récipients d'élevage (voir annexe A)
et en les retirant quatre semaines après, au plus tard. Les larves des cocons restants atteignent l'âge adulte au
bout de deux mois au moins.
Conditionner avant l'emploi les vers sélectionnés dans un sol artificiel, pendant 1 j à 7 j. La nourriture, qui est
également utilisée comme source d'alimentation dans le cadre de l'essai (voir 5.3), doit être dispensée en quantité
suffisante (voir 5.2.1).
5.2 Substrat d'essai
5.2.1 Substrat de sol
Le substrat utiliser pour la préparation du sol artificiel (5.2.2) doit avoir la composition suivante:
Composant du sol artificiel En pourcentage
de la masse sèche
Tourbe de sphaignes séchée à l'air, finement moulue, exempte 10 %
de tout résidu végétal visible
Argile kaolinique (séchée à l'air), contenant au moins 30 % de 20 %
kaolinite
Sable de quartz industriel (séché à l'air), (contenant en majorité 70 %
du sable fin, constitué à plus de 50 % en masse de grains dans
la classe granulométrie de 0,05 mm à 0,2 mm), en fonction du
CaCO nécessaire.
3
Avant l'expérience, le substrat soumis à l'essai doit être mélangé à la nourriture. S'il s'agit de bouse de vache
séchée (voir 5.3), la quantité recommandée est de 5 g par 500 g de sol en masse sèche.
Ajouter une quantité suffisante (environ 0,5 %) de carbonate de calcium (CaCO ), pulvérisé, de qualité analytique
3
reconnue, pour amener le pH du substrat humidifié à 6,0 ± 0,5 au début de l'essai.
3
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ISO 11268-2:1998(F) ISO
NOTE La quantité de carbonate de calcium nécessaire va dépendre des constituants du substrat de sol, nourriture comprise.
Il convient qu'elle soit déterminée par des mesurages effectués sur des sous échantillons immédiatement avant l'essai.
La masse du substrat de sol utilisée pour fabriquer le sol artificiel doit être de 500 g à 600 g en masse sèche par
récipient d'essai (6.1).
5.2.2 Sol artificiel
Préparer le sol artificiel en humidifiant le substrat de sol (5.2.1) avec de l'eau déionisée ou distillée pour atteindre
une teneur en eau comprise entre 40 % et 60 % en masse de la capacité totale de rétention en eau, déterminée
conformément à l'ISO 11274.
NOTE Il convient que le degré d'humidification du sol artificiel ne dépasse pas le degré au delà duquel de l'eau stagnante ou
libre apparaîtrait à la compression. En attendant la publication de l'ISO 11274, l'annexe C propose une méthode permettant de
déterminer la capacité de rétention en eau.
Immédiatement au début et à la fin de l'essai, déterminer la teneur en eau et le pH (conformément à l'ISO 11465 et
à l'ISO 10390) en présence de KCl à 1 mol/l, dans un échantillon témoin et dans un échantillon de chacune des
concentrations expérimentées (lorsque les essais portent sur des substances acides ou basiques, ne pas ajuster
le pH).
5.3 Alimentation
Utiliser tout régime alimentaire dont on a démontré que la qualité permet, au minimum, le maintien à un niveau
constant de la population des vers de terre.
NOTE Pour obtenir une reproduction suffisante, il est essentiel de nourrir les vers de terre pendant l'expérience. La bouse de
vache séchée à l’air finement moulue s'est avérée appropriée. Il est recommandé d'effectuer des essais sur chaque ration de
nourriture afin de vérifier que les vers de terre s'en nourrissent sans effet négatif (dû, par exemple, à la présence
d'ammoniaque ou de tout autre additif potentiellement nuisible). Il convient que la croissance et la production de cocons ne
diminuent pas par rapport à celles de vers élevés dans un substrat sans nourriture (les conditions sont décrites dans
l'ISO 11268-1).
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire, et:
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6.1 Récipients, de capacité comprise entre 1 l et 2 l, dont la section transversale mesure environ 200 cm de
sorte qu'à une profondeur de 5 cm à 6 cm de substrat de sol corresponde une masse sèche de 500 g à 600 g. Les
récipients pour essai doivent permettre des échanges gazeux entre le milieu et l'atmosphère, ainsi que le passage
de la lumière (par exemple, au moyen d'un couvercle transparent perforé). Ils doivent être conçus de manière à
empêcher les vers de terre de s’échapper (en fixant le couvercle à l'aide de ruban adhésif, par exemple).
6.2 Appareil pouvant mesurer le pH et la teneur en eau d'un substrat.
6.3 Environnement de l'essai
6.3.1 Enceinte thermostatée à 20 °C ± 2 °C.
6.3.2 Source lumineuse, permettant de fournir un éclairage constant de 400 lx à 800 lx sur le récipient, réglé pour
un cycle lumière/obscurité compris entre 12h/12 h et 16h/8 h.
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ISO ISO 11268-2:1998(F)
7 Mode opératoire
7.1 Essai préliminaire
S'il est nécessaire de déterminer la gamme des concentrations à utiliser lors de l'essai définitif, effectuer un essai
préliminaire conformément à l'ISO 11268-1 pour quatre concentrations de la substance d'essai et un témoin [par
exemple: 0 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg et 1 000 mg/kg, les concentrations étant exprimées en
milligrammes de substance d'essai par kilogramme de substrat de sol séché (5.2.1)] sur 10 vers par concentration
et par récipient.
7.2 Essai définitif
7.2.1 Introduction des substances d'essai
Choisir, selon le cas, la méthode a), b) ou c).
a) Substances solubles dans l'eau
Immédiatement avant le début de l'essai, dissoudre une quantité de la substance d'essai dans une quantité
d'eau suffisante pour effectuer des répétitions d'une concentration dans l'eau (ou la quantité nécessaire pour
humidifier le substrat de sol) de façon à satisfaire aux exigences de 5.2.2, puis la mélanger soigneusement avec
le substrat d'essai avant d'introduire le tout dans un récipient d'essai.
b) Substances insolubles dans l'eau mais solubles dans les solvants organiques
Dissoudre dans un solvant volatil (tel que l'acétone ou l'hexane) la quantité de substance à expérimenter
nécessaire pour obtenir la concentration désirée, et la mélanger avec la quantité nécessaire de sable de quartz.
Après avoir évaporé le solvant en installant le récipient sous une hotte aspirante, ajouter le reste du substrat de
base et l'eau et mélanger soigneusement le tout avant de l'introduire dans les récipients d'essai. Continuer la
procédure comme décrite en 7.2.3.
NOTE Pour disperser une substance peu soluble, il est possible d'avoir recours aux ultrasons, à des solvants organiques,
des émulsifiants ou des dispersants. Si tel est le cas, il convient que les concentrations soumises à l'essai contiennent la
même quantité minimale de substance auxiliaire. Il convient également d'effectuer un autre témoin.
AVERTISSEMENT: Les vapeurs de solvant imposent que l'on prenne des précautions appropriées pour
éviter les risques d'inhalation ou d'explosion, ou d'endommager le matériel pour extraction, les pompes,
etc.
c) Substances insolubles dans l'eau ou dans les solvants organiques
Pour une substance insoluble dans un solvant volatil, préparer un mélange de 10 g de sable de quartz industriel
finement moulu (voir 5.2.1) et la quantité de substance d'essai nécessaire pour obtenir la concentration
souhaitée. Placer le mélange, le reste du substrat de sol (5.2.1) et l'eau dans un récipient d'essai (6.1) et
mélanger soigneusement.
Mélanger la substance d'essai au substrat de sol artificiel conformément à l'ISO 11268-1 avant d'ajouter les vers de
terre.
Les concentrations permettant d'obtenir la LOEC/NOEC sont choisies sur la base des résultats de l'essai
préliminaire. Les concentrations doivent être espacées par un facteur inférieur ou égal à 2.
Il n'est pas nécessaire de soumettre à l'essai les substances mélangées au substrat à des concentrations
supérieures à 1 000 mg/kg de substrat d'essai.
Effectuer l'essai simultanément sur, au moins, quatre réplicats par concentration et sur un témoin.
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ISO 11268-2:1998(F) ISO
7.2.2 Récipient témoin
Préparer des récipients témoins de la même manière que les récipients d'essai mais sans la substance à
expérimenter. Si la préparation de l'essai implique l'utilisation de substances auxiliaires (voir 8.2.1), utiliser des
récipients témoins supplémentaires, analogues aux récipients d'essai mais ne contenant pas la substance d'essai.
Traiter ces récipients de la même manière que les récipients ne contenant pas la substance d'essai.
7.2.3 Ajout du réactif biologique
Pour chaque récipient d'essai ainsi que pour le récipient témoin, préparer, laver et essuyer (à l'aide de papier
absorbant) 10 vers (5.1). Pour éviter
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