ISO 18763:2016
(Main)Soil quality — Determination of the toxic effects of pollutants on germination and early growth of higher plants
Soil quality — Determination of the toxic effects of pollutants on germination and early growth of higher plants
ISO 18763:2016 describes a technique for determining the effects of soil and soil-related materials on the seed germination and early growth of higher plants. These endpoints are useful indicators for the assessment of the quality of a soil as a habitat for organisms. It is applicable to all soils in which soil organisms are active and may be used to evaluate: - the effects on plants due to toxicity of solid or liquid chemicals contaminating soil or materials (compost, sludge, waste) and chemicals added to soil; - the changes in the soil effect on plants after restoration measures.
Qualité du sol — Détermination des effets toxiques des polluants sur la germination et les premiers stades de croissance des végétaux supérieurs
La présente Norme internationale décrit une méthode permettant de déterminer les effets de sols et de matériaux apparentés aux sols sur la germination des semences et les premiers stades de la croissance des végétaux supérieurs. Ces critères d'effet sont des indicateurs utiles pour l'évaluation de la qualité d'un sol en tant qu'habitat pour des organismes. La présente Norme internationale est applicable à tous les sols dans lesquels des organismes sont actifs et peut être utilisée pour évaluer: — les effets sur les végétaux dus à la toxicité des produits chimiques solides ou liquides polluant les sols ou les matériaux (compost, boues, déchets) ainsi que les produits chimiques ajoutés aux sols; — les variations dans les effets sur les végétaux du sol après des actions de réhabilitation.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 18763
First edition
2016-07-01
Soil quality — Determination of
the toxic effects of pollutants on
germination and early growth of
higher plants
Qualité du sol — Détermination des effets toxiques des polluants sur
la germination et la croissance primaire des plantes supérieures
Reference number
ISO 18763:2016(E)
©
ISO 2016
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ISO 18763:2016(E)
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ISO 18763:2016(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 3
5 Reagents, test organisms and media . 3
6 Apparatus and materials. 4
7 Treatment and preparation of samples . 6
8 Procedure. 6
9 Measurement . 8
10 Calculation of the percentage inhibition . 9
11 Reference chemical .10
12 Precision .10
13 Validity criteria .11
14 Test report .11
Annex A (informative) Application of the phytotoxicity test in transparent test plates on
natural and artificial soils and soil materials, with different plant species .12
Annex B (informative) Assemblage of test plates for the phytotoxicity test .14
Annex C (informative) International interlaboratory comparisons on the phytotoxicity test .15
Bibliography .20
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ISO 18763:2016(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical
Barriers to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4, Biological
methods.
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ISO 18763:2016(E)
Introduction
Ecotoxicological testing of test soils or waste materials to be disposed on soil are required to assess
the potential environmental risk resulting from soil pollution or the disposal of wastes such as sewage
sludge on farmland. There is also a need to monitor the quality of soil after reclamation of industrial
sites. Therefore, a very practical and rapid germination and growth test has been developed based on
seed germination and seedling growth in controlled environmental conditions.
The assay, which does not require any pretreatment of the seeds, is performed in “transparent test plates”,
incubated vertically, to allow the roots and the shoots of the germinated seeds to be seen. After 72 h
exposure, a picture of the transparent test plates is taken and can be analysed “by image analysis” for
multiple endpoints, such as percentage of seed germination and of length of roots and shoots. To account
for the plant species variability in sensitivity, the assays are performed with the seeds of three plant
species: one monocotyl (Sorghum saccharatum) and two dicotyls (Lepidium sativum and Sinapis alba).
A major advantage of this test is that after the shooting and storing of the pictures of the test plates, the
measurements by image analysis can be postponed to any appropriate timing.
Reference or standard soils can be used as negative controls, such as, for example, the ISO standard
artificial soil according to ISO 11269-1 and ISO 11269-2.
Commercially available seeds, with a shelf life longer than one year, allow the use of this test at any time
of the year.
Two International interlaboratory comparisons demonstrated that the test provides good results.
A substantial number of studies report data on the application of this test on various types of soils and
soil materials with several types of plant species.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 18763:2016(E)
Soil quality — Determination of the toxic effects of
pollutants on germination and early growth of higher plants
1 Scope
This International Standard describes a technique for determining the effects of soil and soil-related
materials on the seed germination and early growth of higher plants. These endpoints are useful
indicators for the assessment of the quality of a soil as a habitat for organisms. This International
Standard is applicable to all soils in which soil organisms are active and may be used to evaluate:
— the effects on plants due to toxicity of solid or liquid chemicals contaminating soil or materials
(compost, sludge, waste) and chemicals added to soil;
— the changes in the soil effect on plants after restoration measures.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 11269-1, Soil quality — Determination of the effects of pollutants on soil flora — Part 1: Method for the
measurement of inhibition of root growth
ISO 11269-2, Soil quality — Determination of the effects of pollutants on soil flora — Part 2: Effects of
contaminated soil on the emergence and early growth of higher plants
ISO/TS 20281, Water quality — Guidance on statistical interpretation of ecotoxicity data
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
artificial soil
mixture of sand, kaolinite, peat and calcium carbonate prepared according to ISO 11269-1 and
ISO 11269-2
3.2
control soil
reference or standard soil used as a control and as a medium for preparing dilution series with test
soils or a reference substance
3.3
reference soil
uncontaminated site-specific soil (e.g. collected in the vicinity of a contaminated site) with similar
properties (nutrient concentrations, pH, organic carbon content and texture) as the test soil
3.4
standard soil
field-collected soil or artificial soil whose main properties (e.g. pH, texture, organic matter content) are
within a known range
Note 1 to entry: The properties of standard soils can differ from the test soil.
© ISO 2016 – All rights reserved 1
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ISO 18763:2016(E)
1)
[1] [2]
EXAMPLE Euro-soils , artificial soil , LUFA soil.
3.5
test soil
either a natural or an artificial clean soil that is spiked with the test substance or a contaminated
[5]
natural soil (a site soil)
3.6
seeding emergence
appearance of a visible seedling above the surface of the cover material
[SOURCE: ISO 17126:2005, 3.1, modified]
3.7
germination
appearance of a root of at least 1 mm of length
3.8
pure water
grade of water, produced, for example, by single distillation, by de-ionization, by ultra-filtration or by
[5]
reverse osmosis
3.9
root length
length of the root from seed to root tip
3.10
shoot length
length of the part that grows upward, from seed to tip
3.11
water saturation
maximum water content that a soil can retain against gravity under undisturbed soil conditions,
conventionally stated as water content two days to three days after full saturation with water
[SOURCE: ISO 11074:2015, 2.1.5 field capacity, modified]
3.12
water saturated soil
soil which has reached its maximum water content
3.13
water-holding capacity
mass of water that evaporates from soil saturated with water when the soil is dried to constant mass at
[7]
105 °C, divided by the dry mass of the soil
3.14
negative control
any well-characterized material or substance that, when tested by a specific procedure, demonstrates
the suitability of the procedure to yield a reproducible, appropriately negative, non-reactive or minimal
response in the test system
[SOURCE: ISO 10993-10:2010, 3.12, modified]
3.15
effect percentage
percentage decrease of the seed germination and the growth of the plant roots and/or shoots in the test
soil in comparison to the control soil
1) Euro-soils, artificial soil and LUFA soil are examples of suitable products available commercially. This information
is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of these
products.
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ISO 18763:2016(E)
4 Principle
This method compares the seed germination and early growth of monocotyledonous and dicotyledonous
plants in a test soil and/or a series of mixtures with a control soil. This method may also be used for the
testing of compost, sludge or waste.
Seeds of one monocotyledonous plant, such as Sorghum saccharatum (L.) Moench, and two
dicotyledonous plants, such as Lepidium sativum L. and Sinapis alba L., are exposed to the test material
under controlled conditions. After (72 ± 1) h, the number of germinated seeds is recorded and the
length of the roots of the test plants is measured in the test soil and in the control soil.
If different seed species are used, the length of the incubation period may be adjusted, depending on the
time of germination of the seeds and the growth speed of the roots.
The test makes use of unique flat and shallow transparent test plates (6.3) composed of two
compartments, the lower one of which contains hydrated soil.
Seeds of the selected test plants are positioned at equal distance near the middle ridge of the test plate
(6.3) on a black filter paper (6.5) placed on top of the hydrated soil.
After closing the test plates (6.3) with their transparent cover, the test plates are placed vertically in a
holder (6.4) and incubated at (25 ± 1) °C for (72 ± 1) h.
At the end of the incubation period, the length of each root (and shoot, if wished) can be measured
directly with a ruler and recorded.
Alternatively, a “digital” picture is taken of the test plates (6.3) with the germinated plants (either
with a digital camera, a webcam camera or a flatbed paper scanner) for storage in a computer file. The
subsequent root length measurements are performed by image analysis. The analyses on germination
and root growth can then be made immediately or postponed to any appropriate timing.
NOTE The same procedure can be applied to also measure the shoot height, if wished. Calculation of the
shoot/root length ratio is a possible additional effect parameter.
5 Reagents, test organisms and media
5.1 Water.
Pure water having a conductivity below 10 μS/cm.
5.2 Test organisms.
The test organisms are seeds of one monocotyledonous plant, such as Sorghum saccharatum (L.)
Moench, and two dicotyledonous plants, such as Lepidium sativum L. and Sinapis alba L.
Investigations have been performed not only with the three plant species indicated in 5.2 but also with
other monocotyl and dicotyl plant species. A synthesis on these published studies is given in Annex A.
Seeds coated with insecticides and/or fungicides should be avoided.
5.3 Control soil.
Either reference or standard soils can be used as the control soil, if unhindered growth of the test plants
in these soils can be expected.
When comparing the root elongation in soils of known and unknown quality, the control soil and soil
under test should be of the same textural class, and be as similar as practicable in all respects other
than the presence of the chemical or contaminant being investigated. Indeed, significant differences in
soil characteristics other than the presence of contaminant may lead to differences in root lengths and
may induce false positive test results.
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ISO 18763:2016(E)
Alternatively, artificial soil according to ISO 11269-1 and ISO 11269-2 may be used. The substrate called
“artificial soil” has the following composition:
Percentage
expressed on
dry-mass basis
Sphagnum peat finely ground and with no visible plant remains 10 %
Kaolinite clay containing not less than 30 % kaolinite 20 %
Industrial quartz sand (dominant fine sand with more than 50 % of particle size 69 %
0,05 mm to 0,2 mm)
NOTE As indicated in ISO 11269-1, 5 % peat have proven to be sufficient for maintaining the desired
structure of the artificial soil (with a corresponding increase of the sand percentage to 75 %). A lower percentage
of kaolinite clay (10 % instead of 20 %) is furthermore very close to the clay content of LUFA 2.2 and hence more
representative for a natural soil. The following composition of the artificial soil is therefore recommended: peat
5 %, kaolinite clay 10 % and sand 85 %.
Approximately 0,3 % to 1,0 % calcium carbonate (CaCO , pulverized, analytical grade) is necessary to
3
get a pH of 6,0 ± 0,5.
6 Apparatus and materials
6.1 Incubator or temperature controlled room, suitable for maintaining the specified conditions at
(25 ± 1) °C.
6.2 Digital camera, webcam camera or flatbed paper scanner, to shoot pictures of the test plates
with the germinated seeds, for storage in a computer file.
6.3 Test plates, transparent plates in polyvinylchloride (PVC).
The test plates are composed of a bottom part separated by a middle ridge into an upper part and a
lower part and a flat cover. Test plates can be “handmade” with the aid of transparent PVC sheet and
small rectangular sticks as described in Annex B.
2)
Alternatively, commercially available test plates can be used. The lower part of these test plates is
3
intended to hold approximately 90 cm of test soil. The latter test plates have on both parts on their
side small rectangular cavities for closing the plates tightly by a unique click system. The test plates
shall be provided with a label to record the specifics of each test plate (type of soil, type of seed, number
of the replicate).
2) The test plates supplied by MicroBioTests Inc. Mariakerke-Gent, Belgium are an example of a suitable product
available commercially. This information is given for the convenience of users of this International Standard and
does not constitute an endorsement by ISO of this product.
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ISO 18763:2016(E)
Figure 1 — Test plate with cavities on the side for tight closing of the plate
6.4 Test plate holders, cardboard holders for vertical incubation of six test plates (6.3) each.
2
6.5 Black filter papers, rectangular high purity black filter papers (e.g. 85 g/m , 0,17 mm thickness,
45 s filtration speed) fitting the lower part of the test plate, to be placed on top of the soil in the lower
compartment of the test plates (6.3).
6.6 Microsieve cylinder, small plastic cylinder provided at the bottom with a nylon gauze, to be used
for determination of the water to be added to the test soil.
6.7 Wide mouth micropipette, plastic micropipette to be used with the microsieve cylinder (6.6) for
determination of the water to be added to the test soil.
6.8 Sieve, sieve of 2 mm mesh for sieving the test soil prior to use for the tests.
6.9 Thin spatula, hand tool with a thin blade used to mix the test soil with water.
6.10 Flat spatula, hand tool with a broad, flat blade that is used to spread and flatten the test soil into
the lower compartment of the test plates (6.3).
6.11 Tweezers, small pincer-like tool for handling the seeds.
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ISO 18763:2016(E)
7 Treatment and preparation of samples
7.1 Soil samples
The assays are carried out at water saturation of the soils at the start of the tests.
7.1.1 Water-holding capacity determination
The water saturated soil can be obtained by adding to the soil mass the appropriate volume of pure
water determining the water-holding capacity.
7.1.2 Alternative procedure for determination of the volume of water to be added in the test
plates for hydration of air-dried soils
A simple and quick alternative procedure can be used to determine the volume of water to be added to
air-dried soils in the test plates (6.3).
For the artificial soil recommended in 5.3, the amount of water needed to be added for hydration has
been determined experimentally. Based on a water/soil ratio (on a vol/vol basis) of 0,39, one needs to
3
add 35 ml pure water to the 90 cm control soil in the test plate (6.3).
For other control soils, the amount of water needed to be added for hydration needs to be experimentally
determined, following the procedure indicated in the next paragraph for test soil samples.
For test soil samples, they first need to be air-dried, then the dry soil is sieved through a sieve (6.8) to
eliminate all coarse material.
NOTE Air drying is requested only on a separate soil sample for subsequent determination of the volume of
water to be added in the test plates.
3
Mix thoroughly 50 ml pure water and 90 cm test soil in a beaker with the aid of a thin spatula (6.9).
After 1 min to 2 min, two layers show up: the hydrated soil and a layer of water on top.
Lower vertically the microsieve cylinder (6.6) into the beaker, down to the surface of the hydrated soil,
and then lower it a little further down, so that it starts filling with supernatant.
With the wide mouth micropipette (6.7), suck up the water inside the microsieve and transfer it into a
graduated cylinder.
Put the microsieve cylinder (6.6) again into the beaker, and push it down a little further, so that it takes
up additional water from the soil. Transfer again the recovered water in the graduated cylinder and
repeat the former manipulations until no water comes out anymore from the soil.
Calculate how much water was needed for a complete hydration of the test soil. This volume (Vsat) is the
volume of water that has originally been added to the soil (= 50 ml) minus the volume of supernatant
water (S) which has been recovered in the graduated cylinder (Vsat = 50 − S).
8 Procedure
3
The procedure described hereafter is intended for use of 90 cm soil in the test plates (6.3).
In case of assessment of the dose-response relationship on an unknown solid sample, a full test shall be
performed comprising a number of mixtures of the control soil with the sample (e.g. compost, sludge,
waste). The dilutions shall be prepared within a geometric series with a separation factor not exceeding
2,0 (see ISO 11269-1). According to the selected dilution range, the test soil is mixed with the reference
soil or the standard soil thoroughly (either manually or by using a hand mixer). The homogeneity of the
mixture is checked visually. For each of the resulting dilutions, the volume of water to be added in the
test plates (6.3) shall be experimentally determined (7.1.2).
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ISO 18763:2016(E)
8.1 Test procedure for determination of the effects of contaminated soils
8.1.1 Addition of control soil and test soil to the test plates and hydration of the soils
8.1.1.1 Control soil
3
If the artificial soil (5.3) is used as control, put 90 cm control soil (5.3) in the lower compartment of a test
plate (6.3), then slowly drop 35 ml pure water over the whole surface of the control soil in the test plate.
If another control soil is used, add the amount of water experimentally determined (7.1.2).
Wait 1 min to 2 min so that the water hydrates the soil totally.
With the flat blade spatula (6.10), flatten the wet soil evenly over the total surface of the bottom
compartment of the test plate (6.3), in order to obtain a layer of uniform depth.
Repeat the former operations for all the negative control test plates (6.3) (= nine test plates).
8.1.1.2 Test soil
3
Put 90 cm of sieved test soil into the bottom compartment of a test plate (6.3), then hydrate the test
soil as indicated above for the control soil by dropping a volume of pure water equal to Vsat (7.1.2) on
the surface of the soil in the test plate and flattening it with the flat blade spatula (6.10).
Repeat the former operations for all the other plates with test soil (= nine test plates).
3
NOTE An alternative procedure to measuring repeatedly a volume of 90 cm of soil in a graduated vessel
3
is to determine the weight of test soil corresponding to 90 cm and prepare such weights for transfer into the
corresponding test plates (6.3).
8.1.2 Placing of the seeds
Place on top of the hydrated soil one black filter paper (6.5) in all the test plates (6.3), to avoid trapping
air bubbles under the filter, and wait 1 min to 2 min until the filter is totally wet.
The assay is performed in three replicates with three different seeds. This means that three test plates
(6.3) with control soil, and three test plates with test soil, shall be inoculated with each type of seed.
With the aid of tweezers (6.11), take 10 seeds of the same test plant and put them in one row on the
black filter paper (6.5) at equal distance of each other, and at about 1 cm from the middle ridge of the
test plate (6.3).
Put the cover part of the test plate on the bottom part, close the test plate tightly and label it indicating
the specifics of the test (type of soil, type of seed, number of the replicate).
Repeat the former operation for each seed for the three control test plates and the three replicates with
test soil.
8.1.3 Incubation of the test plates
Place the six test plates (6.3) inoculated with the same seed (three with test soil and three with control
soil) vertically in one test plate holder (6.4).
Repeat this operation for the two other seeds.
Put the three test plate holders (6.4) with their test plates (6.3) in the incubator (6.1) and incubate at
(25 ± 1) °C for (72 ± 1) h.
NOTE Light does not seem to have an influence on the germination of the seeds nor the growth of the roots
during the short (three days) incubation time. It is therefore advised not to provide illumination in the incubator
during the test period.
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8.1.4 Image recording
The picture of the test plates at the end of the exposure period can be taken either with a webcam
camera, a digital camera or a flatbed paper scanner. The picture shall then be transferred to a file in a
computer.
Any type of image analysis programme can be used for the subsequent analyses, provided it allows for
length measurements.
NOTE A convenient and practical image analysis programme is “Image J” which can be downloaded directly
from the Internet (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html).
9 Measurement
All the measurements should be made within (60 ± 10) min after the end of exposure period or can be
postponed to any appropriate timing by image recording (8.1.4) of the test plates (6.3).
9.1 Counting the number of germinated seeds
Count the number of germinated seeds, N , in the test plates (6.3) and record the figure on the results
s
sheet “Individual data”.
9.2 Measurement of the root lengths of the germinated seeds
9.2.1 Measurement of all the root lengths in each test plate
9.2.1.1 Procedure for direct visual length measurement
Transfer one germinated seed on a black paper sheet.
With the aid of the tweezers (6.11), stretch the root and measure its length LR to the closest millimetre
with a ruler. Record the figures for all the roots on the results sheet “individual data”.
Repeat the procedure for all seeds of a test plate (6.3) and for all the test plates.
The same procedure may be applied to measure the shoot height, in which case the shoot/root length
ratio can be calculated.
9.2.1.2 Procedure for image analysis of length measurement
Open the image analysis programme which allows to make length measurements.
Open the file with the saved pictures of the test plates (6.3) and select one of the saved pictures.
Calibrate the measurement unit for length measurement of the roots (in millimetres) following the
Image Analysis programme instructions.
Perform the length measurement LR on all the roots of the germinated seeds in the test plates (6.3),
record each length LR on the result sheet “individual data” (see Table 1).
Repeat these operations for all the test plates (6.3).
8 © ISO 2016 – All rights reserved
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ISO 18763:2016(E)
Table 1 — Result sheet “individual data” (for each plant species)
Seed number Control 1 Test
...
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Deleted: Date : 2016‐07‐01¶
ISO 18763:2016(F)
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Date: 2016‐07‐01
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Qualité du sol — Détermination des effets toxiques des polluants sur la germination et
les premiers stades de croissance des végétaux supérieurs
Soil quality — Determination of the toxic effects of pollutants on germination and early growth of
higher plants
Deleted: Type de document : Norme
européenne¶
Sous‐type de document : ¶
Stade du document : (60) Publication¶
Langue du document : F¶
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¶
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ISO 18763:2016(F)
Sommaire Page
Avant-propos . iv
Introduction . v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 3
5 Réactifs, organismes d’essai et milieux . 4
6 Appareillage et matériaux . 5
7 Traitement et préparation des échantillons . 7
8 Mode opératoire . 8
9 Mesurage . 9
10 Calcul du pourcentage d’inhibition . 11
11 Substance de référence . 12
12 Fidélité . 12
13 Critères de validité . 13
14 Rapport d’essai . 13
Deleted:
Annexe A (informative) Application de l’essai de phytotoxicité dans des plaques d’essai
transparentes sur des sols naturels et artificiels et des matériaux du sol, avec différentes
espèces végétales . 14
Deleted:
Annexe B (informative) Assemblage des plaques d’essai pour l’essai de phytotoxicité . 16
Deleted:
Annexe C (informative) Essais interlaboratoires internationaux relatifs à l’essai de phytotoxicité
. 17
Bibliographie . 22
© ISO 2016 – Tous droits réservés iii
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ISO 18763:2016(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le
droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation
de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion de l'ISO aux principes de
l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au commerce (OTC),
voir le lien suivant: https://www.iso.org/iso/fr/foreword.html. Deleted:
Field Code Changed
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous‐comité SC 4,
Deleted: http
Caractérisation biologique.
iv © ISO 2016 – Tous droits réservés
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ISO 18763:2016(F)
Introduction
Les essais écotoxicologiques sur les sols ou sur les déchets destinés à être épandus sur les sols sont
requis pour évaluer le risque environnemental potentiel résultant de la pollution du sol ou du rejet de
déchets tels que les boues d’épuration épandues sur les terres agricoles. Il est également nécessaire de
contrôler la qualité des sols après la réhabilitation des sites industriels. Par conséquent, un essai de
germination et de croissance, à la fois très pratique et rapide, reposant sur la germination des semences
et la croissance des semis dans des conditions environnementales contrôlées, a été développé.
Cet essai, qui ne nécessite aucun prétraitement des semences, est réalisé dans des «plaques d’essai Deleted:
transparentes», incubées à la verticale, afin de pouvoir observer les racines et les pousses des semences
Deleted:
ayant germé. À l’issue d’une période d’exposition de 72 h, les plaques d’essai transparentes sont
photographiées et une «analyse d’images» peut être effectuée pour déterminer divers critères d’effet Deleted:
tels que le pourcentage de germination des semences et la longueur des racines et des pousses. Pour
Deleted:
tenir compte de la sensibilité variable des espèces végétales, les essais sont réalisés avec les semences
de trois espèces végétales: une monocotylédone (Sorghum saccharatum) et deux dicotylédones Deleted:
(Lepidium sativum et Sinapis alba).
Un avantage important de cet essai réside dans le fait qu’après la capture et le stockage des
photographies des plaques d’essai, les mesurages par analyse d’images peuvent être différés à tout
moment opportun.
Des sols de référence ou des sols standards peuvent être utilisés comme témoins négatifs, tels que,
par exemple, le sol artificiel standard ISO selon l’ISO 11269‐1 et l’ISO 11269‐2.
Des semences disponibles dans le commerce, d’une durée de conservation supérieure à un an,
permettent de réaliser cet essai à toute période de l’année.
Deux essais interlaboratoires internationaux ont démontré que l’essai produit des résultats
satisfaisants.
Un grand nombre d’études ont rapporté des données relatives à l’application de cet essai sur divers
types de sols et de matériaux du sol, avec plusieurs types d’espèces végétales.
© ISO 2016 – Tous droits réservés v
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NORME INTERNATIONALE ISO 18763:2016(F)
Qualité du sol — Détermination des effets toxiques des polluants
sur la germination et les premiers stades de croissance des
végétaux supérieurs
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale décrit une méthode permettant de déterminer les effets de sols et de
matériaux apparentés aux sols sur la germination des semences et les premiers stades de la croissance
des végétaux supérieurs. Ces critères d’effet sont des indicateurs utiles pour l’évaluation de la qualité
d’un sol en tant qu’habitat pour des organismes. La présente Norme internationale est applicable à tous
les sols dans lesquels des organismes sont actifs et peut être utilisée pour évaluer: Deleted:
— les effets sur les végétaux dus à la toxicité des produits chimiques solides ou liquides polluant les
sols ou les matériaux (compost, boues, déchets) ainsi que les produits chimiques ajoutés aux sols; Deleted:
— les variations dans les effets sur les végétaux du sol après des actions de réhabilitation.
2 Références normatives
Les documents ci‐après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 11269‐1, Qualité du sol — Détermination des effets des polluants sur la flore du sol — Partie 1: Deleted:
Méthode de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines
Deleted:
Deleted:
ISO 11269‐2, Qualité du sol — Détermination des effets des polluants sur la flore du sol — Partie 2: Effets
Deleted:
des sols contaminés sur l'émergence et la croissance des végétaux supérieurs
Deleted: l’inhibition
ISO/TS 20281, Qualité de l'eau — Lignes directrices relatives à l'interprétation statistique de données Deleted: .
écotoxicologiques
Deleted:
Deleted:
3 Termes et définitions
Deleted:
Deleted:
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
Deleted: l’émergence
3.1
Deleted: .
sol artificiel
Deleted: l’eau
mélange de sable, de kaolinite, de tourbe et de carbonate de calcium préparé conformément à
Deleted: l’interprétation
l’ISO 11269‐1 et à l’ISO 11269‐2
Deleted: .
3.2
sol témoin
sol de référence ou sol standard utilisé comme témoin ou comme milieu pour préparer des gammes de
dilutions avec les sols d’essai ou une substance de référence
3.3
© ISO 2016 – Tous droits réservés 1
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ISO 18763:2016(F)
sol de référence
sol non pollué spécifique d’un site (par exemple collecté à proximité d’un site pollué) avec des
propriétés similaires (concentrations en nutriments, pH, teneur en carbone organique et texture) à
celles du sol d’essai
3.4
sol standard
sol collecté sur le terrain ou sol artificiel dont les principales propriétés (par exemple pH, texture,
teneur en matières organiques) se situent dans une gamme connue
Note 1 à l’article: Les propriétés du sol standard peuvent différer de celles du sol d’essai.
Deleted:
1
[1] [2]
)
EXEMPLE Sols Euro , sol artificiel , sol LUFA.
Deleted:
3.5
sol soumis à essai
sol propre, naturel ou artificiel, dans lequel la substance d’essai ou un sol naturel pollué (sol du site) est
[5]
introduit
3.6
émergence des plantules
apparition d’une plantule visible à la surface du matériau de couverture
[SOURCE: ISO 17126:2005, 3.1, modifiée] Deleted:
3.7
germination
apparition d’une racine d’au moins 1 mm de long
3.8
eau pure
qualité d’eau produite, par exemple, par monodistillation, déionisation, ultra‐filtration ou osmose
[5]
inverse
3.9
longueur d’une racine
longueur de la racine de la graine jusqu’à l’extrémité de la racine
3.10
longueur d’une pousse
longueur de la partie qui pousse vers le haut, de la graine jusqu’à l’extrémité
3.11
saturation en eau
1
Les sols Euro, le sol artificiel et le sol LUFA sont des exemples de produits appropriés disponibles sur le marché. Cette Deleted: )
information est donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne saurait
Deleted: du présent document
constituer un engagement de l’ISO à l’égard de ces produits.
2 © ISO 2016 – Tous droits réservés
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ISO 18763:2016(F)
teneur en eau maximale qu’un sol peut retenir contre l’entraînement par gravité, en conditions non
perturbées, ce qui correspond conventionnellement à la teneur en eau du sol restant de 2 jours à 3 jours
après une période de saturation
[SOURCE: ISO 11074:2015, 2.1.5 capacité au champ, modifiée] Deleted:
3.12
sol saturé d’eau
sol ayant atteint sa teneur maximale en eau
3.13
capacité de rétention d’eau
masse d’eau qui s’évapore du sol saturé d’eau lorsque le sol est séché jusqu’à une masse constante
[7]
à 105 °C, divisée par la masse sèche du sol
3.14
témoin négatif
matériau ou substance bien caractérisé(e) qui, soumis(e) à essai conformément à un mode opératoire
spécifique, démontre l’aptitude du mode opératoire à conduire à une réponse reproductible,
judicieusement négative, inactive ou minimale vis‐à‐vis d’un système d’essai particulier
[SOURCE: ISO 10993‐10:2010, 3.12, modifiée] Deleted:
Deleted: ‐
3.15
pourcentage d’effet
diminution du pourcentage de germination des semences et de croissance des racines et/ou des
pousses de plantes dans le sol d’essai par rapport au sol témoin
4 Principe
Cette méthode compare la germination des semences et les premiers stades de la croissance de plantes
monocotylédones et dicotylédones dans un sol d’essai et/ou dans une série de mélanges, avec un sol
témoin. Cette méthode peut également être utilisée pour évaluer des composts, des boues ou des
déchets.
Les semences d’une plante monocotylédone, telle que Sorghum saccharatum (L.) Moench, et de
deux plantes dicotylédones, telles que Lepidium sativum L. et Sinapis alba L., sont exposées au matériau
d’essai dans des conditions contrôlées. Au bout de (72 ± 1) h, le nombre de semences germées est
comptabilisé et la longueur des racines des plantes est mesurée dans le sol soumis à essai et dans le sol
témoin.
Si des variétés de semences différentes sont utilisées, la durée de la période d’incubation peut être
ajustée en fonction du temps nécessaire à la germination des semences et de la vitesse de croissance
des racines.
L’essai nécessite l’utilisation de plaques d’essai (6.3) spécifiques, transparentes, plates et creuses,
composées d’un compartiment supérieur et d’un compartiment inférieur contenant le sol hydraté.
Les semences des plantes sélectionnées pour l’essai sont positionnées à égale distance près de la bande
médiane de la plaque d’essai (6.3), sur un papier‐filtre noir (6.5) placé au‐dessus du sol hydraté.
Après avoir refermé les plaques d’essai (6.3) avec leur couvercle transparent, celles‐ci sont placées
verticalement dans un support (6.4) et incubées à (25 ± 1) °C pendant (72 ± 1) h.
© ISO 2016 – Tous droits réservés 3
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ISO 18763:2016(F)
Au terme de la période d’incubation, la longueur de chaque racine (et de chaque pousse, si cela est
souhaité) peut être mesurée directement à l’aide d’une règle et enregistrée.
Une autre méthode consiste à prendre une photo numérique des plaques d’essai (6.3) avec les plantes
germées (en utilisant un appareil photo numérique, une cybercaméra ou un scanneur à plat) en vue
d’un stockage dans un fichier informatique. Les mesurages de longueur de racine ultérieurs sont
réalisés par analyse d’images. Les analyses portant sur la germination et la croissance des racines
peuvent alors être effectuées immédiatement ou reportées à tout moment opportun.
NOTE Si cela est souhaité, le même mode opératoire peut être appliqué pour mesurer également la hauteur
des pousses. Le calcul du rapport des longueurs pousses/racines est un critère d’effet supplémentaire possible.
5 Réactifs, organismes d’essai et milieux
Deleted: .
5.1 Eau
Eau pure de conductivité inférieure à 10 μS/cm.
Deleted: .
5.2 Organismes d’essai
Les organismes d’essai sont les semences d’une plante monocotylédone, telle que Sorghum
saccharatum (L.) Moench, et de deux plantes dicotylédones, telles que Lepidium sativum L. et Sinapis
alba L.
Des études ont été menées non seulement avec les trois espèces végétales indiquées au 5.2, mais aussi
avec d’autres espèces monocotylédones et dicotylédones. L’Annexe A dresse une synthèse de ces études
publiées.
Il convient d’éviter les semences traitées avec des insecticides et/ou des fongicides.
Deleted: .
5.3 Sol témoin
Des sols de référence ou des sols standards peuvent être utilisés comme sol témoin, sous réserve que la
croissance attendue des plantes soumises à essai dans ces sols ne soit pas perturbée.
Lors de la comparaison de l’allongement des racines dans des sols de qualité connue et inconnue,
il convient que le sol témoin et le sol soumis à essai soient de la même classe texturale et, dans la
mesure du possible, qu’ils soient similaires à tous points de vue exceptée la présence du produit
chimique ou du polluant objet de l’étude. En effet, des différences significatives dans les caractéristiques
des sols autres que la présence de polluant peuvent engendrer des différences de longueurs des racines
et induire des faux positifs.
Il est également possible d’utiliser un sol artificiel conformément à l’ISO 11269‐1 et à l’ISO 11269‐2.
Le substrat dénommé «sol artificiel» présente la composition suivante: Deleted:
Deleted:
Pourcentage exprimé sur la
Deleted:
base de la masse sèche
Tourbe de sphaigne finement moulue et sans résidus végétaux apparents 10 %
Argile kaolinique contenant au moins 30 % de kaolinite 20 %
Sable de quartz industriel (principalement du sable fin dont plus de 50 % des
69 %
particules ont une taille comprise entre 0,05 mm et 0,2 mm)
4 © ISO 2016 – Tous droits réservés
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ISO 18763:2016(F)
NOTE Comme indiqué dans l’ISO 11269‐1, un pourcentage de 5 % de tourbe s’est avéré suffisant pour que le
sol artificiel conserve la structure désirée (avec une augmentation correspondante du pourcentage de sable
jusqu’à 75 %). Un pourcentage inférieur d’argile kaolinique (10 % au lieu de 20 %) est de plus très proche de la
teneur en argile du LUFA 2.2, et donc plus représentatif d’un sol naturel. Il est donc recommandé que le sol
Deleted:
artificiel présente la composition suivante: 5 % de tourbe, 10 % d’argile kaolinique et 85 % de sable.
Deleted:
Il est nécessaire d’ajouter environ 0,3 % à 1,0 % de carbonate de calcium (CaCO, pulvérisé, de qualité
3
analytique) pour obtenir un pH de 6,0 ± 0,5.
6 Appareillage et matériaux
6.1 Incubateur ou pièce thermorégulée, adaptée pour maintenir les conditions spécifiées: Deleted:
(25 ± 1) °C.
6.2 Appareil photo numérique, cybercaméra ou scanneur à plat, pour prendre des photographies
des plaques d’essai avec les semences germées, en vue d’un stockage dans un fichier informatique.
6.3 Plaques d’essai, transparentes en polychlorure de vinyle (PVC).
Les plaques d’essai se composent d’une partie inférieure séparée par une bande médiane séparant le
compartiment inférieur du compartiment supérieur, et d’un couvercle plat. Les plaques d’essai peuvent
être fabriquées de façon artisanale à l’aide d’une feuille de PVC transparente et de petites baguettes
rectangulaires, comme décrit à l’Annexe B.
2
)
Il est également possible d’utiliser des plaques d’essai disponibles dans le commerce. La partie
Deleted: .
3
inférieure de ces plaques d’essai est destinée à contenir environ 90 cm de sol soumis à essai. Ces
plaques disposent, sur les deux côtés, de petites cavités rectangulaires permettant de les fermer
hermétiquement au moyen d’un système d’encliquetage spécifique. Une étiquette doit être apposée sur
les plaques d’essai afin d’indiquer les détails de chaque plaque (type de sol et de semence, numéro de la
répétition).
2
Les plaques d’essai fournies par MicroBioTests Inc, Mariakerke‐Gent, Belgique, sont un exemple approprié de produit Deleted: )
disponible dans le commerce. Cette information est donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs de la présente
Norme internationale et ne saurait constituer un engagement de l’ISO à l’égard de ce produit.
© ISO 2016 – Tous droits réservés 5
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ISO 18763:2016(F)
Deleted:
Formatted: Font color: Black
Figure 1 — Plaque d’essai avec cavités sur le côté pour la fermeture hermétique de la plaque
Formatted: Font:
6.4 Supports de plaques d’essai, en carton pour l’incubation verticale de six plaques d’essai (6.3)
par support.
2
6.5 Papiers-filtres noirs, rectangulaires, de pureté élevée (par exemple 85 g/m, 0,17 mm
d’épaisseur, 45 s de vitesse de filtration) adaptés à la partie inférieure de la plaque d’essai, à placer au‐ Deleted: ‐
dessus du sol dans le compartiment inférieur des plaques d’essai (6.3).
6.6 Cylindre à micromailles, en plastique, de petite taille et muni, dans sa partie basse, d’une gaze
de nylon, à utiliser pour déterminer la quantité d’eau à ajouter au sol d’essai.
6.7 Micropipette à embouchure large, en plastique, à utiliser avec le cylindre à micromailles (6.6)
pour déterminer la quantité d’eau à ajouter au sol d’essai.
6.8 Tamis, à mailles de 2 mm pour tamiser le sol avant son utilisation pour les essais.
6.9 Spatule fine à lame mince, à utiliser pour mélanger le sol soumis à essai avec l’eau.
6.10 Spatule plate à lame plate et large, à utiliser pour étaler et aplanir le sol soumis à essai dans le
compartiment inférieur des plaques d’essai (6.3).
6.11 Pinces brucelles (petit outil analogue à une pince), pour manipuler les semences.
6 © ISO 2016 – Tous droits réservés
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ISO 18763:2016(F)
7 Traitement et préparation des échantillons
7.1 Échantillons de sol
Les essais sont réalisés avec des sols saturés en eau au début des essais.
7.1.1 Détermination de la capacité de rétention d’eau
Le sol saturé d’eau peut être obtenu en ajoutant à la masse de sol le volume approprié d’eau déterminé
par sa capacité de rétention d’eau.
7.1.2 Autre mode opératoire pour déterminer le volume d’eau à ajouter dans les plaques d’essai
pour l’hydratation des sols séchés à l’air
Un mode opératoire alternatif simple et rapide peut être utilisé pour déterminer le volume d’eau à
ajouter aux sols séchés à l’air présents dans les plaques d’essai (6.3).
Pour le sol artificiel recommandé au 5.3, la quantité d’eau à ajouter pour l’hydratation a été déterminée
expérimentalement. Sur la base d’un rapport eau/sol (sur une base vol/vol) de 0,39, il faut ajouter
3
35 ml d’eau pure aux 90 cm de sol témoin dans la plaque d’essai (6.3).
Pour les autres sols témoins, il est nécessaire de déterminer expérimentalement la quantité d’eau à
ajouter pour l’hydratation, selon le mode opératoire indiqué au paragraphe suivant pour les
échantillons de sol soumis à essai.
Les échantillons de sol soumis à essai doivent tout d’abord être séchés à l’air, puis le sol sec est tamisé à
travers un tamis (6.8) afin d’éliminer tous les fragments grossiers.
NOTE Le séchage à l’air est uniquement requis sur un échantillon de sol distinct en vue de la détermination
ultérieure du volume d’eau à ajouter dans les plaques d’essai.
3
À l’aide d’une spatule fine (6.9), mélanger soigneusement 50 ml d’eau pure et 90 cm du sol dans un
bécher. Après 1 min à 2 min, deux couches se forment: le sol hydraté surmonté d’une couche d’eau. Deleted:
Abaisser verticalement le cylindre à micromailles (6.6) dans le bécher, jusqu’à la surface du sol hydraté,
puis l’abaisser encore un peu plus afin qu’il commence à se remplir de surnageant.
À l’aide de la micropipette à embouchure large (6.7), aspirer l’eau à l’intérieur du cylindre à
micromailles et la transférer dans une éprouvette graduée.
Replacer le cylindre à micromailles (6.6) dans le bécher, et le presser un peu plus afin de récupérer une
quantité supplémentaire d’eau du sol. Transférer de nouveau l’eau récupérée dans l’éprouvette graduée
et répéter les premières manipulations jusqu’à ce qu’aucune eau ne ressorte plus du sol.
Calculer la quantité d’eau qui a été nécessaire pour obtenir une hydratation complète du sol soumis à
essai. Ce volume (Vsat) correspond au volume d’eau qui a été initialement ajouté au sol (= 50 ml) moins
le volume d’eau de la fraction surnageante (S) qui a été récupéré dans l’éprouvette graduée
(Vsat = 50 − S).
8 Mode opératoire
3
Le mode opératoire décrit ci‐dessous est destiné à être utilisé avec 90 cm de sol dans les plaques
d’essai (6.3).
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ISO 18763:2016(F)
En cas d’évaluation de la relation dose‐réponse sur un échantillon solide connu, un essai complet doit
être réalisé avec un certain nombre de mélanges du sol témoin avec l’échantillon (compost, boues ou
déchets, par exemple). Les dilutions doivent être préparées en suivant une suite géométrique avec un
facteur de séparation ne dépassant pas 2,0 (voir l’ISO 11269‐1). Selon la gamme de dilutions choisie, le
sol soumis à essai est soigneusement mélangé avec le sol de référence ou le sol standard (soit
manuellement soit en utilisant un batteur à main). L’homogénéité du mélange est contrôlée
visuellement. Pour chacune des dilutions résultantes, le volume d’eau à ajouter dans les plaques d’essai
(6.3) doit être déterminé par voie expérimentale (7.1.2).
8.1 Mode opératoire d’essai pour la détermination des effets de sols pollués
8.1.1 Addition du sol témoin et du sol soumis à essai aux plaques d’essai et hydratation des sols
8.1.1.1 Sol témoin
3
Si le sol artificiel (5.3) est utilisé comme témoin, placer 90 cm de sol artificiel (5.3) dans le
compartiment inférieur d’une plaque d’essai (6.3), puis verser lentement goutte à goutte 35 ml d’eau
pure sur toute la surface du sol témoin dans la plaque d’essai.
En cas d’utilisation d’un autre sol témoin, ajouter la quantité d’eau déterminée expérimentalement
(7.1.2).
Attendre 1 min à 2 min pour que le sol soit totalement hydraté.
À l’aide de la spatule à lame plate (6.10), aplanir le sol humide de façon homogène sur toute la surface
du compartiment inférieur de la plaque d’essai (6.3), afin d’obtenir une couche d’épaisseur uniforme.
Répéter les opérations précédentes pour toutes les plaques d’essai des témoins négatifs (6.3)
(= neuf plaques d’essai).
8.1.1.2 Sol d’essai
3
Placer 90 cm de sol soumis à essai tamisé dans le compartiment inférieur d’une plaque d’essai (6.3),
puis hydrater le sol soumis à essai suivant les indications données ci‐dessus pour le sol témoin en
versant goutte à goutte un volume d’eau pure égal à Vsat (7.1.2) sur la surface du sol dans la plaque
d’essai et en l’aplanissant avec la spatule à lame plate (6.10).
Répéter les premières opérations pour toutes les autres plaques contenant le sol soumis à essai
(= neuf plaques d’essai).
3
NOTE Un autre mode opératoire, permettant de mesurer à plusieurs reprises un volume de 90 cm de sol
3
dans un récipient gradué, consiste à déterminer le poids de sol soumis à essai correspondant à 90 cm et à
préparer des échantillons de ce poids pour les transférer dans les plaques d’essai (6.3) correspondantes.
8.1.2 Mise en place des semences
Placer un papier‐filtre noir (6.5) au‐dessus du sol hydraté dans toute
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 18763
Première édition
2016-07-01
Qualité du sol — Détermination des
effets toxiques des polluants sur la
germination et les premiers stades de
croissance des végétaux supérieurs
Soil quality — Determination of the toxic effects of pollutants on
germination and early growth of higher plants
Numéro de référence
ISO 18763:2016(F)
©
ISO 2016
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 18763:2016(F)
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Publié en Suisse
ii © ISO 2016 – Tous droits réservés
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ISO 18763:2016(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 3
5 Réactifs, organismes d’essai et milieux . 3
5.1 Eau . 3
5.2 Organismes d’essai . 4
5.3 Sol témoin . 4
6 Appareillage et matériaux . 4
7 Traitement et préparation des échantillons. 6
7.1 Échantillons de sol . 6
7.1.1 Détermination de la capacité de rétention d’eau . 6
7.1.2 Autre mode opératoire pour déterminer le volume d’eau à ajouter dans
les plaques d’essai pour l’hydratation des sols séchés à l’air . 6
8 Mode opératoire. 7
8.1 Mode opératoire d’essai pour la détermination des effets de sols pollués . 7
8.1.1 Addition du sol témoin et du sol soumis à essai aux plaques d’essai et
hydratation des sols . 7
8.1.2 Mise en place des semences . 7
8.1.3 Incubation des plaques d’essai . 8
8.1.4 Enregistrement des images . 8
9 Mesurage. 8
9.1 Comptage du nombre de semences germées . 8
9.2 Mesurage des longueurs de racines des semences germées . 8
9.2.1 Mesurage de toutes les longueurs de racines dans chaque plaque d’essai . 8
9.2.2 Mesurage de la longueur de la racine la plus longue dans chaque plaque d’essai . 9
10 Calcul du pourcentage d’inhibition .10
11 Substance de référence .10
12 Fidélité .11
13 Critères de validité .11
14 Rapport d’essai .11
Annexe A (informative) Application de l’essai de phytotoxicité dans des plaques d’essai
transparentes sur des sols naturels et artificiels et des matériaux du sol, avec
différentes espèces végétales .13
Annexe B (informative) Assemblage des plaques d’essai pour l’essai de phytotoxicité .15
Annexe C (informative) Essais interlaboratoires internationaux relatifs à l’essai de
phytotoxicité .16
Bibliographie .22
© ISO 2016 – Tous droits réservés iii
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ISO 18763:2016(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
. i s o . or g / d i r e c t i ve s).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir w w w . i s o . or g / br e ve t s).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation
de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion de l'ISO aux principes de l’Organisation
mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien
suivant: https:// www .iso .org/ iso/ fr/ foreword .html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Caractérisation biologique.
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ISO 18763:2016(F)
Introduction
Les essais écotoxicologiques sur les sols ou sur les déchets destinés à être épandus sur les sols sont
requis pour évaluer le risque environnemental potentiel résultant de la pollution du sol ou du rejet de
déchets tels que les boues d’épuration épandues sur les terres agricoles. Il est également nécessaire de
contrôler la qualité des sols après la réhabilitation des sites industriels. Par conséquent, un essai de
germination et de croissance, à la fois très pratique et rapide, reposant sur la germination des semences
et la croissance des semis dans des conditions environnementales contrôlées, a été développé.
Cet essai, qui ne nécessite aucun prétraitement des semences, est réalisé dans des «plaques d’essai
transparentes», incubées à la verticale, afin de pouvoir observer les racines et les pousses des semences
ayant germé. À l’issue d’une période d’exposition de 72 h, les plaques d’essai transparentes sont
photographiées et une «analyse d’images» peut être effectuée pour déterminer divers critères d’effet
tels que le pourcentage de germination des semences et la longueur des racines et des pousses. Pour
tenir compte de la sensibilité variable des espèces végétales, les essais sont réalisés avec les semences de
trois espèces végétales: une monocotylédone (Sorghum saccharatum) et deux dicotylédones (Lepidium
sativum et Sinapis alba).
Un avantage important de cet essai réside dans le fait qu’après la capture et le stockage des photographies
des plaques d’essai, les mesurages par analyse d’images peuvent être différés à tout moment opportun.
Des sols de référence ou des sols standards peuvent être utilisés comme témoins négatifs, tels que,
par exemple, le sol artificiel standard ISO selon l’ISO 11269-1 et l’ISO 11269-2.
Des semences disponibles dans le commerce, d’une durée de conservation supérieure à un an,
permettent de réaliser cet essai à toute période de l’année.
Deux essais interlaboratoires internationaux ont démontré que l’essai produit des résultats satisfaisants.
Un grand nombre d’études ont rapporté des données relatives à l’application de cet essai sur divers
types de sols et de matériaux du sol, avec plusieurs types d’espèces végétales.
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NORME INTERNATIONALE ISO 18763:2016(F)
Qualité du sol — Détermination des effets toxiques des
polluants sur la germination et les premiers stades de
croissance des végétaux supérieurs
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale décrit une méthode permettant de déterminer les effets de sols et de
matériaux apparentés aux sols sur la germination des semences et les premiers stades de la croissance
des végétaux supérieurs. Ces critères d’effet sont des indicateurs utiles pour l’évaluation de la qualité
d’un sol en tant qu’habitat pour des organismes. La présente Norme internationale est applicable à tous
les sols dans lesquels des organismes sont actifs et peut être utilisée pour évaluer:
— les effets sur les végétaux dus à la toxicité des produits chimiques solides ou liquides polluant les
sols ou les matériaux (compost, boues, déchets) ainsi que les produits chimiques ajoutés aux sols;
— les variations dans les effets sur les végétaux du sol après des actions de réhabilitation.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 11269-1, Qualité du sol — Détermination des effets des polluants sur la flore du sol — Partie 1: Méthode
de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines
ISO 11269-2, Qualité du sol — Détermination des effets des polluants sur la flore du sol — Partie 2: Effets
des sols contaminés sur l'émergence et la croissance des végétaux supérieurs
ISO/TS 20281, Qualité de l'eau — Lignes directrices relatives à l'interprétation statistique de données
écotoxicologiques
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
sol artificiel
mélange de sable, de kaolinite, de tourbe et de carbonate de calcium préparé conformément à
l’ISO 11269-1 et à l’ISO 11269-2
3.2
sol témoin
sol de référence ou sol standard utilisé comme témoin ou comme milieu pour préparer des gammes de
dilutions avec les sols d’essai ou une substance de référence
3.3
sol de référence
sol non pollué spécifique d’un site (par exemple collecté à proximité d’un site pollué) avec des
propriétés similaires (concentrations en nutriments, pH, teneur en carbone organique et texture) à
celles du sol d’essai
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3.4
sol standard
sol collecté sur le terrain ou sol artificiel dont les principales propriétés (par exemple pH, texture,
teneur en matières organiques) se situent dans une gamme connue
Note 1 à l'article: Les propriétés du sol standard peuvent différer de celles du sol d’essai.
[1] [2] 1)
EXEMPLE Sols Euro , sol artificiel , sol LUFA.
3.5
sol soumis à essai
sol propre, naturel ou artificiel, dans lequel la substance d’essai ou un sol naturel pollué (sol du site) est
[5]
introduit
3.6
émergence des plantules
apparition d’une plantule visible à la surface du matériau de couverture
[SOURCE: ISO 17126:2005, 3.1, modifiée]
3.7
germination
apparition d’une racine d’au moins 1 mm de long
3.8
eau pure
qualité d’eau produite, par exemple, par monodistillation, déionisation, ultra-filtration ou osmose
[5]
inverse
3.9
longueur d’une racine
longueur de la racine de la graine jusqu’à l’extrémité de la racine
3.10
longueur d’une pousse
longueur de la partie qui pousse vers le haut, de la graine jusqu’à l’extrémité
3.11
saturation en eau
teneur en eau maximale qu’un sol peut retenir contre l’entraînement par gravité, en conditions non
perturbées, ce qui correspond conventionnellement à la teneur en eau du sol restant de 2 jours à 3 jours
après une période de saturation
[SOURCE: ISO 11074:2015, 2.1.5 capacité au champ, modifiée]
3.12
sol saturé d’eau
sol ayant atteint sa teneur maximale en eau
3.13
capacité de rétention d’eau
masse d’eau qui s’évapore du sol saturé d’eau lorsque le sol est séché jusqu’à une masse constante
[7]
à 105 °C, divisée par la masse sèche du sol
1) Les sols Euro, le sol artificiel et le sol LUFA sont des exemples de produits appropriés disponibles sur le
marché. Cette information est donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs de la présente Norme
internationale et ne saurait constituer un engagement de l’ISO à l’égard de ces produits.
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ISO 18763:2016(F)
3.14
témoin négatif
matériau ou substance bien caractérisé(e) qui, soumis(e) à essai conformément à un mode opératoire
spécifique, démontre l’aptitude du mode opératoire à conduire à une réponse reproductible,
judicieusement négative, inactive ou minimale vis-à-vis d’un système d’essai particulier
[SOURCE: ISO 10993-10:2010, 3.12, modifiée]
3.15
pourcentage d’effet
diminution du pourcentage de germination des semences et de croissance des racines et/ou des pousses
de plantes dans le sol d’essai par rapport au sol témoin
4 Principe
Cette méthode compare la germination des semences et les premiers stades de la croissance de plantes
monocotylédones et dicotylédones dans un sol d’essai et/ou dans une série de mélanges, avec un sol
témoin. Cette méthode peut également être utilisée pour évaluer des composts, des boues ou des
déchets.
Les semences d’une plante monocotylédone, telle que Sorghum saccharatum (L.) Moench, et de deux plantes
dicotylédones, telles que Lepidium sativum L. et Sinapis alba L., sont exposées au matériau d’essai dans
des conditions contrôlées. Au bout de (72 ± 1) h, le nombre de semences germées est comptabilisé et la
longueur des racines des plantes est mesurée dans le sol soumis à essai et dans le sol témoin.
Si des variétés de semences différentes sont utilisées, la durée de la période d’incubation peut être
ajustée en fonction du temps nécessaire à la germination des semences et de la vitesse de croissance
des racines.
L’essai nécessite l’utilisation de plaques d’essai (6.3) spécifiques, transparentes, plates et creuses,
composées d’un compartiment supérieur et d’un compartiment inférieur contenant le sol hydraté.
Les semences des plantes sélectionnées pour l’essai sont positionnées à égale distance près de la bande
médiane de la plaque d’essai (6.3), sur un papier-filtre noir (6.5) placé au-dessus du sol hydraté.
Après avoir refermé les plaques d’essai (6.3) avec leur couvercle transparent, celles-ci sont placées
verticalement dans un support (6.4) et incubées à (25 ± 1) °C pendant (72 ± 1) h.
Au terme de la période d’incubation, la longueur de chaque racine (et de chaque pousse, si cela est
souhaité) peut être mesurée directement à l’aide d’une règle et enregistrée.
Une autre méthode consiste à prendre une photo numérique des plaques d’essai (6.3) avec les plantes
germées (en utilisant un appareil photo numérique, une cybercaméra ou un scanneur à plat) en vue d’un
stockage dans un fichier informatique. Les mesurages de longueur de racine ultérieurs sont réalisés par
analyse d’images. Les analyses portant sur la germination et la croissance des racines peuvent alors
être effectuées immédiatement ou reportées à tout moment opportun.
NOTE Si cela est souhaité, le même mode opératoire peut être appliqué pour mesurer également la hauteur
des pousses. Le calcul du rapport des longueurs pousses/racines est un critère d’effet supplémentaire possible.
5 Réactifs, organismes d’essai et milieux
5.1 Eau
Eau pure de conductivité inférieure à 10 μS/cm.
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5.2 Organismes d’essai
Les organismes d’essai sont les semences d’une plante monocotylédone, telle que Sorghum saccharatum (L.)
Moench, et de deux plantes dicotylédones, telles que Lepidium sativum L. et Sinapis alba L.
Des études ont été menées non seulement avec les trois espèces végétales indiquées au 5.2, mais aussi
avec d’autres espèces monocotylédones et dicotylédones. L’Annexe A dresse une synthèse de ces études
publiées.
Il convient d’éviter les semences traitées avec des insecticides et/ou des fongicides.
5.3 Sol témoin
Des sols de référence ou des sols standards peuvent être utilisés comme sol témoin, sous réserve que la
croissance attendue des plantes soumises à essai dans ces sols ne soit pas perturbée.
Lors de la comparaison de l’allongement des racines dans des sols de qualité connue et inconnue,
il convient que le sol témoin et le sol soumis à essai soient de la même classe texturale et, dans la mesure
du possible, qu’ils soient similaires à tous points de vue exceptée la présence du produit chimique ou du
polluant objet de l’étude. En effet, des différences significatives dans les caractéristiques des sols autres
que la présence de polluant peuvent engendrer des différences de longueurs des racines et induire des
faux positifs.
Il est également possible d’utiliser un sol artificiel conformément à l’ISO 11269-1 et à l’ISO 11269-2.
Le substrat dénommé «sol artificiel» présente la composition suivante:
Pourcentage exprimé sur la
base de la masse sèche
Tourbe de sphaigne finement moulue et sans résidus végétaux apparents 10 %
Argile kaolinique contenant au moins 30 % de kaolinite 20 %
Sable de quartz industriel (principalement du sable fin dont plus de 50 %
69 %
des particules ont une taille comprise entre 0,05 mm et 0,2 mm)
NOTE Comme indiqué dans l’ISO 11269-1, un pourcentage de 5 % de tourbe s’est avéré suffisant pour que
le sol artificiel conserve la structure désirée (avec une augmentation correspondante du pourcentage de sable
jusqu’à 75 %). Un pourcentage inférieur d’argile kaolinique (10 % au lieu de 20 %) est de plus très proche de
la teneur en argile du LUFA 2.2, et donc plus représentatif d’un sol naturel. Il est donc recommandé que le sol
artificiel présente la composition suivante: 5 % de tourbe, 10 % d’argile kaolinique et 85 % de sable.
Il est nécessaire d’ajouter environ 0,3 % à 1,0 % de carbonate de calcium (CaCO , pulvérisé, de qualité
3
analytique) pour obtenir un pH de 6,0 ± 0,5.
6 Appareillage et matériaux
6.1 Incubateur ou pièce thermorégulée, adaptée pour maintenir les conditions spécifiées:
(25 ± 1) °C.
6.2 Appareil photo numérique, cybercaméra ou scanneur à plat, pour prendre des photographies
des plaques d’essai avec les semences germées, en vue d’un stockage dans un fichier informatique.
6.3 Plaques d’essai, transparentes en polychlorure de vinyle (PVC).
Les plaques d’essai se composent d’une partie inférieure séparée par une bande médiane séparant le
compartiment inférieur du compartiment supérieur, et d’un couvercle plat. Les plaques d’essai peuvent
être fabriquées de façon artisanale à l’aide d’une feuille de PVC transparente et de petites baguettes
rectangulaires, comme décrit à l’Annexe B.
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2)
Il est également possible d’utiliser des plaques d’essai disponibles dans le commerce . La partie
3
inférieure de ces plaques d’essai est destinée à contenir environ 90 cm de sol soumis à essai. Ces
plaques disposent, sur les deux côtés, de petites cavités rectangulaires permettant de les fermer
hermétiquement au moyen d’un système d’encliquetage spécifique. Une étiquette doit être apposée sur
les plaques d’essai afin d’indiquer les détails de chaque plaque (type de sol et de semence, numéro de la
répétition).
Figure 1 — Plaque d’essai avec cavités sur le côté pour la fermeture hermétique de la plaque
6.4 Supports de plaques d’essai, en carton pour l’incubation verticale de six plaques d’essai (6.3)
par support.
2
6.5 Papiers-filtres noirs, rectangulaires, de pureté élevée (par exemple 85 g/m , 0,17 mm d’épaisseur,
45 s de vitesse de filtration) adaptés à la partie inférieure de la plaque d’essai, à placer au-dessus du sol
dans le compartiment inférieur des plaques d’essai (6.3).
6.6 Cylindre à micromailles, en plastique, de petite taille et muni, dans sa partie basse, d’une gaze de
nylon, à utiliser pour déterminer la quantité d’eau à ajouter au sol d’essai.
6.7 Micropipette à embouchure large, en plastique, à utiliser avec le cylindre à micromailles (6.6)
pour déterminer la quantité d’eau à ajouter au sol d’essai.
6.8 Tamis, à mailles de 2 mm pour tamiser le sol avant son utilisation pour les essais.
2) Les plaques d’essai fournies par MicroBioTests Inc, Mariakerke-Gent, Belgique, sont un exemple approprié
de produit disponible dans le commerce. Cette information est donnée par souci de commodité à l’intention des
utilisateurs de la présente Norme internationale et ne saurait constituer un engagement de l’ISO à l’égard de ce
produit.
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6.9 Spatule fine à lame mince, à utiliser pour mélanger le sol soumis à essai avec l’eau.
6.10 Spatule plate à lame plate et large, à utiliser pour étaler et aplanir le sol soumis à essai dans le
compartiment inférieur des plaques d’essai (6.3).
6.11 Pinces brucelles (petit outil analogue à une pince), pour manipuler les semences.
7 Traitement et préparation des échantillons
7.1 Échantillons de sol
Les essais sont réalisés avec des sols saturés en eau au début des essais.
7.1.1 Détermination de la capacité de rétention d’eau
Le sol saturé d’eau peut être obtenu en ajoutant à la masse de sol le volume approprié d’eau déterminé
par sa capacité de rétention d’eau.
7.1.2 Autre mode opératoire pour déterminer le volume d’eau à ajouter dans les plaques
d’essai pour l’hydratation des sols séchés à l’air
Un mode opératoire alternatif simple et rapide peut être utilisé pour déterminer le volume d’eau à
ajouter aux sols séchés à l’air présents dans les plaques d’essai (6.3).
Pour le sol artificiel recommandé au 5.3, la quantité d’eau à ajouter pour l’hydratation a été déterminée
expérimentalement. Sur la base d’un rapport eau/sol (sur une base vol/vol) de 0,39, il faut ajouter 35 ml
3
d’eau pure aux 90 cm de sol témoin dans la plaque d’essai (6.3).
Pour les autres sols témoins, il est nécessaire de déterminer expérimentalement la quantité d’eau à
ajouter pour l’hydratation, selon le mode opératoire indiqué au paragraphe suivant pour les échantillons
de sol soumis à essai.
Les échantillons de sol soumis à essai doivent tout d’abord être séchés à l’air, puis le sol sec est tamisé à
travers un tamis (6.8) afin d’éliminer tous les fragments grossiers.
NOTE Le séchage à l’air est uniquement requis sur un échantillon de sol distinct en vue de la détermination
ultérieure du volume d’eau à ajouter dans les plaques d’essai.
3
À l’aide d’une spatule fine (6.9), mélanger soigneusement 50 ml d’eau pure et 90 cm du sol dans un
bécher. Après 1 min à 2 min, deux couches se forment: le sol hydraté surmonté d’une couche d’eau.
Abaisser verticalement le cylindre à micromailles (6.6) dans le bécher, jusqu’à la surface du sol hydraté,
puis l’abaisser encore un peu plus afin qu’il commence à se remplir de surnageant.
À l’aide de la micropipette à embouchure large (6.7), aspirer l’eau à l’intérieur du cylindre à micromailles
et la transférer dans une éprouvette graduée.
Replacer le cylindre à micromailles (6.6) dans le bécher, et le presser un peu plus afin de récupérer une
quantité supplémentaire d’eau du sol. Transférer de nouveau l’eau récupérée dans l’éprouvette graduée
et répéter les premières manipulations jusqu’à ce qu’aucune eau ne ressorte plus du sol.
Calculer la quantité d’eau qui a été nécessaire pour obtenir une hydratation complète du sol soumis à
essai. Ce volume (Vsat) correspond au volume d’eau qui a été initialement ajouté au sol (= 50 ml) moins le
volume d’eau de la fraction surnageante (S) qui a été récupéré dans l’éprouvette graduée (Vsat = 50 − S).
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8 Mode opératoire
3
Le mode opératoire décrit ci-dessous est destiné à être utilisé avec 90 cm de sol dans les plaques
d’essai (6.3).
En cas d’évaluation de la relation dose-réponse sur un échantillon solide connu, un essai complet doit
être réalisé avec un certain nombre de mélanges du sol témoin avec l’échantillon (compost, boues ou
déchets, par exemple). Les dilutions doivent être préparées en suivant une suite géométrique avec un
facteur de séparation ne dépassant pas 2,0 (voir l’ISO 11269-1). Selon la gamme de dilutions choisie, le sol
soumis à essai est soigneusement mélangé avec le sol de référence ou le sol standard (soit manuellement
soit en utilisant un batteur à
...
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