ISO 23611-1:2006
(Main)Soil quality — Sampling of soil invertebrates — Part 1: Hand-sorting and formalin extraction of earthworms
Soil quality — Sampling of soil invertebrates — Part 1: Hand-sorting and formalin extraction of earthworms
ISO 23611-1:2006 specifies a method for sampling and handling earthworms from field soils as a prerequisite for using these animals as bioindicators (e.g. to assess the quality of a soil as a habitat for organisms). ISO 23611-1:2006 applies to all terrestrial biotopes in which earthworms occur. It is not applicable for semi-terrestrial soils and it can be difficult to use under extreme climatic or geographical conditions (e.g. in high mountains).
Qualité du sol — Prélèvement des invertébrés du sol — Partie 1: Tri manuel et extraction au formol des vers de terre
L'ISO 23611-1:2006 spécifie une méthode pour le prélèvement et la manipulation de vers de terre sur le terrain, comme prérequis à l'utilisation de ces animaux en tant que bio-indicateurs, par exemple pour évaluer la qualité d'un sol en tant qu'habitat pour des organismes. L'ISO 23611-1:2006 est utilisée pour tous les biotopes terrestres dans lesquels il est possible de trouver des vers de terre. Elle ne s'applique pas aux sols semi-terrestres et il peut être difficile de l'appliquer dans des conditions climatiques ou géographiques extrêmes (en haute montagne par exemple).
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 23611-1
First edition
2006-02-01
Soil quality — Sampling of soil
invertebrates —
Part 1:
Hand-sorting and formalin extraction
of earthworms
Qualité du sol — Prélèvement des invertébrés du sol —
Partie 1: Tri manuel et extraction au formol des vers de terre
Reference number
ISO 23611-1:2006(E)
©
ISO 2006
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ISO 23611-1:2006(E)
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ISO 23611-1:2006(E)
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Terms and definitions. 1
3 Principle. 2
4 Reagents. 2
5 Apparatus . 2
6 Procedure . 3
6.1 Sampling of the earthworms . 3
6.2 Preservation . 5
6.3 Determination of biomass. 5
7 Data assessment. 5
8 Study report. 6
Annex A (informative) Other methods for sampling. 7
Annex B (informative) Species determination in peregrine earthworms . 8
Annex C (informative) The modified TSBF Method . 9
Bibliography . 10
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ISO 23611-1:2006(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 23611-1 was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4, Biological
methods.
ISO 23611 consists of the following parts, under the general title Soil quality — Sampling of soil invertebrates:
⎯ Part 1: Hand-sorting and formalin extraction of earthworms
⎯ Part 2: Sampling and extraction of micro-arthropods (Collembola and Acarina)
⎯ Part 3: Sampling and soil extraction of enchytraeids
⎯ Part 4: Sampling, extraction and identification of free-living stages of terrestrial nematodes
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ISO 23611-1:2006(E)
Introduction
This part of ISO 23611 has been drawn up since there is a growing need for the standardisation of terrestrial
zoological field methods. Such methods, mainly covering the sampling, extraction and handling of soil
invertebrates, are necessary for the following purposes:
[21], [26], [34]
⎯ biological classification of soils including soil quality assessment ;
[9], [12], [28]
⎯ terrestrial bioindication and long-term monitoring ;
⎯ evaluation of the effects of chemicals on soil animals (ISO 11268-3).
Data for these purposes are gained by standardized methods since they can form the basis for far-reaching
decisions (e.g. whether a given site should be remediated or not). In fact, the lack of such standardised
methods is one of the most important reasons why bio-classification and bio-assessment in terrestrial (i.e. soil)
habitats has so far relatively rarely been used in comparison to aquatic sites.
Originally, the methods described here were developed for taxonomical and ecological studies, investigating
the role of earthworms in various soil ecosystems. These animals are without doubt the most important soil
[25], [13], [15]
invertebrates in temperate regions and, to a lesser extent, in tropical soils . Since Darwin (1881),
their influence on soil structure (e.g. aeration, water holding capacity) and soil functions like litter
[8]
decomposition and nutrient cycling is well-known . Due to their often very high biomass they are also
important in many terrestrial food-webs.
Since it is neither possible nor useful to standardize methods for all soil organisms, the most important ones
have been selected.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 23611-1:2006(E)
Soil quality — Sampling of soil invertebrates —
Part 1:
Hand-sorting and formalin extraction of earthworms
1 Scope
This part of ISO 23611 specifies a method for sampling and handling earthworms from field soils as a
prerequisite for using these animals as bioindicators (e.g. to assess the quality of a soil as a habitat for
organisms).
Basic information on the ecology of earthworms and their use as bioindicators in the terrestrial environment
can be found in the references listed in the bibliography.
This part of ISO 23611 applies to all terrestrial biotopes in which earthworms occur. The sampling design of
field studies in general is specified in ISO 10381-1 (see also Reference [38]) and guidance on the
determination of effects of pollutants on earthworms in field situations is given in ISO 11268-3. These details
can vary according to the national requirements or the climatic/regional conditions of the site to be sampled
(see also Annex C).
This part of ISO 23611 is not applicable for semi-terrestrial soils and it can be difficult to use under extreme
climatic or geographical conditions (e.g. in high mountains). Methods for some other soil organism groups,
such as collembolans, are covered in other parts of ISO 23611.
This part of ISO 23611 does not cover the pedological characterization of the site which is highly
recommendable when sampling soil invertebrates. ISO 10390, ISO 10694, ISO 11272, ISO 11274, ISO 11277,
ISO 11461 and ISO 11465 are more suitable for measuring pH, particle size distribution, C/N ratio, organic
carbon content and water-holding capacity.
2 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
2.1
earthworm
megadrile soil-inhabiting earthworms (length of adult individuals: few centimetres to more than 1 m) belonging to
the order Oligochaeta (class Clitellata, phylum Annelida)
EXAMPLE Species of the families Lumbricidae (Holarctic), Glossoscolecidae (Latin America), Eudrilidae (Africa) or
Megascolecidae [Asia, North America (Pacific Coast)].
2.2
peregrine species
earthworms occurring in many regions world-wide today, usually introduced by man
NOTE 1 Well-known examples of peregrine species are several lumbricid species like Aporrectodea caliginosa
(originally coming from Eurasia, but now living also in the Americas and Australia) or the pan-tropical species Pontoscolex
corethrurus (probably coming from Northern Brazil and/or the Guyanas).
NOTE 2 See Reference [15].
© ISO 2006 – All rights reserved 1
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ISO 23611-1:2006(E)
2.3
clitellum
ring or saddle of epidermal thickening only in mature worms which is near the anterior and eventually forms
the cocoon
3 Principle
Earthworms at a certain site are sampled from the soil by using a combination of two different methods:
2
⎯ hand-sorting animals from a certain area (e.g. 0,25 m ) or volume (e.g. 50 cm × 50 cm × 20 cm);
⎯ extraction of worms from the soil by applying formalin.
[5],[20]
Both methods are well-known for a long time . After extraction, the earthworms are fixed and transported
to the laboratory. There they are preserved in a way that they can be stored in a collection indefinitely (e.g. for
taxonomical purposes). In addition, the determination of the biomass of earthworms is described. Finally,
2
abundance and biomass values can be recalculated to area (usually 1 m ) or, more rarely, volume parameters.
NOTE 1 Alternative methods can be useful under special circumstances (e.g. electrical extraction or the use of mustard
as a chemical expellent), but cannot be recommended as a general procedure (see Annex A). In addition, the use of other
[11]; [33]
extraction chemicals than formalin seems to have no advantages concerning extraction efficiency .
NOTE 2 The sampling of earthworms is often included in much broader monitoring programs, trying to cover the whole
[1]
soil fauna or parts of it (e.g. the macrofauna). The design of such programs is not included in this part of ISO 23611 .
NOTE 3 Some hints for the taxonomy of peregrine (occurring in many regions world-wide) earthworms, mainly
belonging to the family Lumbricidae, are given in Annex B.
4 Reagents
4.1 Formalin [formaldehyde solution 4 % (volume fraction)].
4.2 Formalin [formaldehyde solution 37 % (volume fraction)].
4.3 Ethanol, 70 % (volume fraction).
5 Apparatus
Use standard laboratory equipment and the following.
5.1 Plastic vessels, capacities 250 ml and 500 ml, for storing the worms.
5.2 Plastic gloves.
5.3 Forceps.
2 2
5.4 Piece of thick plastic sheeting, 1 m to 2 m .
5.5 Spade or shovel.
5.6 Dissecting microscope, with low magnification (10 to 40 times).
5.7 Balance, able to weigh from 0,01 g to 200 g.
5.8 Water-can, preferably 20 l, with water (20 l per sampling plot).
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ISO 23611-1:2006(E)
5.9 Watering can.
5.10 Pencil, notebook, water resistant marker, labels that go in the vessel.
5.11 Thermometer, e.g. for measuring air temperature.
5.12 Drying cabinet, for soil moisture determination.
6 Procedure
6.1 Sampling of the earthworms
6.1.1 General
Sampling of earthworms is done by a combination of two different methods: hand-sorting and formalin
extraction. Based on several comparative studies, this combination is clearly recommended in the various
reviews on earthworm ecology (e.g. References [7], [8], [15]).
Sampling should be done at times of the year where the animals are not forced by the environmental
conditions (i.e. low soil moisture and/or high temperatures) into diapause (i.e. are not reacting to formalin). In
[15]
temperate regions, such unfavourable sampling times are winter and, in particular, midsummer periods .
Earthworms sampled from the same plot, but sampled under the two different methods, should be stored in
individual plastic vessels. After the end of the sampling process, the excavated and examined soil is returned
to the original sampling plot. In some cases, it is appropriate to use only one of the two methods; e.g. when no
deep-burrowing animals are occurring at a given site, formalin extraction is not necessary. On the other hand,
at sites where giant earthworms are living (parts of South America, South East Asia and Australia), hand-
[22]
sorting is not useful . A very similar method, known as modified TSBF method, is particularly suitable for
tropical regions (see Annex C).
NOTE Usually the earthworms are determined after preservation, but if the species spectrum of a sampling site is
[30]
well known, worms can also be determined alive ; see also Annex B.
In the case collected earthworms are to be used for further analysis or testing, e.g. for biomarker
measurements or for use in bioassays, storage or incubation of the worms in a small portion of soil from the
sampling site is recommended. In the case of formalin extraction, rinsing the worms in tap water is needed
before incubation in soil.
6.1.2 Hand-sorting
Due to the individual size of the worms, a large plot shall be identified. A square of 50 cm × 50 cm is often
sufficient in the Holarctic where most adult earthworms have approximately a length between 1 cm and 20 cm.
However, at places with a low density of earthworms [e.g. soils with low pH (< 4,5) or which are
2
anthropogenically used like crop sites], larger plots (i.e. 1 m ) are recommended (ISO 11268-3). On the other
hand, at sites with a high earthworm density (e.g. many meadows in temperate regions), a smaller plot of
2 [24] 2 [36]
1/8 m is sufficient . Even smaller sample sizes (e.g. 1/16 m ; ) can lead to very low, and thus variable,
individual worm numbers per sample, which in turn leads to an increase in sample numbers (i.e. 16 replicates).
In any case, the soil is removed by means of a spade or shovel (5.5) up to a depth of 20 cm from this plot
(20 cm are suitable for many temperate sites, but the depth also depends on the site properties). The
excavated soil is spread out on a piece of plastic (5.4); this can be done in the field but, especially in periods
of bad weather, the whole procedure can also be performed in the laboratory or greenhouse. Afterwards, the
soil is searched cautiously for earthworms. Big earthworms are collected by hand using plastic hand gloves
(5.2) and small ones by using forceps (5.3). To avoid autotomy and further damage of the worms, the animals
should only be touched at the anterior part of the body. If worms are cut by the spade used to dig out the soil,
both parts are collected in order to measure the correct biomass, whereas only front parts are counted when
determining the number of individuals.
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ISO 23611-1:2006(E)
NOTE 1 With a naked eye, the front end of adult worms can be identified by the position of the clitellum: it is always
located closer to the head than to the tail.
The collected earthworms should immediately be fixed in 70 % ethanol (4.3) using the 250 ml or 500 ml plastic
vessels (5.1) for at least half an hour, but not longer than 24 h. The vessels shall be labelled and observations
(e.g. whether worms have been in a quiescence stage) should be recorded in the notebook (5.10).
An immediate fixation in 4% formalin (volume fraction) (4.1) is possible, but not recommended due to the fact
that the handling of this compound should be minimised as much as possible (in particular under field
conditions).
NOTE 2 In order to avoid morphological changes (e.g. an inversion of the prostomium) due to immediate fixation in
ethanol, the individual worms can be put briefly (about one minute) into warm tap water. The earthworms relax in the water,
and after that they can be transferred to ethanol.
6.1.3 Formalin extraction
During the hand-sorting, the same plot from which the top soil has been removed is used for formalin
extraction. A sufficient amount of water shall be transported (20 l per sampling plot) beforehand to the plots
using large water-cans (5.8). The formalin solution (about 0,5 % volume fraction) is prepared by diluting 25 ml
of 37 % formalin (volume fraction) (4.2) in approximately 5 l water using a watering can (5.9). Diluting 25 ml of
37 % formalin in 5 l water produces a solution of about 0,2 %. The diluted formalin solution is carefully and
evenly applied into the plot from which the top soil has been removed for hand-sorting. This step shall be
repeated until 20 l of formalin-solution are added; the amount of formalin solution can be adapted depending
on the soil properties. During the application, the plot shall be observed in order to collect all earthworms
appearing on the soil surface of the sampling plot. The sampling is finished 30 min after the application of the
last watering can.
Large earthworms should be collected by hand using plastic gloves (5.2) and small earthworms by forceps
(5.3). The repellent formalin produces rapid earthworm emergence of the soil; worms should only be collected
when the largest (preferably whole) portion of the body becomes visible, otherwise damage or retraction back
into the soil occurs. To avoid autotomy and damage of the worms, the animals should only be touched at the
an
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 23611-1
Première édition
2006-02-01
Qualité du sol — Prélèvement
des invertébrés du sol —
Partie 1:
Tri manuel et extraction au formol
des vers de terre
Soil quality — Sampling of soil invertebrates —
Part 1: Hand-sorting and formalin extraction of earthworms
Numéro de référence
ISO 23611-1:2006(F)
©
ISO 2006
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ISO 23611-1:2006(F)
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Publié en Suisse
ii © ISO 2006 – Tous droits réservés
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ISO 23611-1:2006(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Termes et définitions. 1
3 Principe. 2
4 Réactifs . 2
5 Appareillage . 2
6 Mode opératoire . 3
6.1 Prélèvement des échantillons . 3
6.2 Conservation . 5
6.3 Détermination de la biomasse. 5
7 Évaluation des données. 6
8 Rapport d'étude. 6
Annexe A (informative) Autres méthodes de prélèvement . 7
Annexe B (informative) Détermination des espèces de vers de terre pérégrines. 8
Annexe C (informative) La méthode TSBF modifiée. 9
Bibliographie . 10
© ISO 2006 – Tous droits réservés iii
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ISO 23611-1:2006(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 23611-1 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Méthodes biologiques.
L'ISO 23611 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité du sol — Prélèvement
des invertébrés du sol:
⎯ Partie 1: Tri manuel et extraction au formol des vers de terre
⎯ Partie 2: Prélèvement et extraction des micro-arthropodes (Collembola et Acarina)
⎯ Partie 3: Prélèvement et extraction du sol des enchytraeides
⎯ Partie 4: Prélèvement, extraction et identification des nématodes du sol
iv © ISO 2006 – Tous droits réservés
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ISO 23611-1:2006(F)
Introduction
La présente partie de l'ISO 23611 a été rédigée pour répondre à un besoin grandissant en matière de
normalisation des méthodes d'analyse sur le terrain de la zoologie terrestre. De telles méthodes, traitant
principalement du prélèvement, de l'extraction et de la manipulation des invertébrés du sol, sont nécessaires
pour les différentes applications suivantes:
[21], [26], [34]
⎯ la classification biologique des sols, y compris l'évaluation de la qualité des sols ;
[9], [12], [28]
⎯ la bio-indication terrestre et la surveillance à long terme ;
⎯ l'évaluation des effets de substances chimiques vis-à-vis des animaux du sol (ISO 11268-3).
Étant donné qu'elles peuvent être à la base de décisions importantes (par exemple entreprendre ou non la
dépollution d'un site particulier), les données pour ces applications devront être obtenues à l'aide de
méthodes normalisées. En fait, l'absence de telles méthodes normalisées est l'une des principales raisons
pour lesquelles la bioclassification et la bio-évaluation ont été relativement rarement utilisées, jusqu'à présent,
dans des habitats terrestres (comme le sol) par rapport aux sites aquatiques.
À l'origine, les méthodes spécifiées ici ont été développées pour des études taxonomiques ou écologiques,
visant à élucider le rôle des vers de terre dans différents écosystèmes terrestres. Ces animaux sont
indubitablement les invertébrés du sol les plus importants dans les régions tempérées et, à un degré moindre,
[25], [13], [15]
dans les sols tropicaux . Depuis Darwin (1881), leur influence sur la structure du sol (par exemple
l'aération, la capacité de rétention d'eau) et sur les fonctions du sol, comme la décomposition de la litière et le
[8]
cycle des éléments nutritifs, est bien connue . En raison de leur biomasse souvent très élevée, ils jouent
également un rôle majeur dans un grand nombre de réseaux trophiques terrestres.
Étant donné qu'il n'est ni possible ni utile de normaliser des méthodes pour tous les organismes du sol, seuls
les plus importants ont été sélectionnés.
© ISO 2006 – Tous droits réservés v
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NORME INTERNATIONALE ISO 23611-1:2006(F)
Qualité du sol — Prélèvement des invertébrés du sol —
Partie 1:
Tri manuel et extraction au formol des vers de terre
1 Domaine d'application
La présente partie de l'ISO 23611 spécifie une méthode pour le prélèvement et la manipulation de vers de
terre sur le terrain, comme prérequis à l'utilisation de ces animaux en tant que bio-indicateurs (par exemple
pour évaluer la qualité d'un sol en tant qu'habitat pour des organismes).
Il est possible de trouver des informations sur l'écologie des vers de terre et leur utilisation en tant que bio-
indicateurs dans un environnement terrestre dans les références citées dans la bibliographie.
La présente partie de l'ISO 23611 est utilisée pour tous les biotopes terrestres dans lesquels il est possible de
trouver des vers de terre. La conception de l'échantillonnage pour les études sur le terrain est, de manière
générale, déjà spécifiée dans l'ISO 10381-1 (voir aussi Référence [38]) et les lignes directrices pour la
détermination des effets des polluants vis-à-vis des vers de terre sur le terrain sont données dans
l'ISO 11268-3. Ces détails peuvent varier en fonction des exigences nationales ou des conditions
climatiques/régionales du site sur lequel l'échantillon doit être prélevé (voir aussi l'Annexe C).
La présente partie de l'ISO 23611 ne s'applique pas aux sols semi-terrestres et il peut être difficile de
l'appliquer dans des conditions climatiques ou géographiques extrêmes (en haute montagne par exemple).
Les méthodes pour quelques autres groupes d'organismes du sol tels que les Collemboles sont traitées dans
d'autres parties de l'ISO 23611.
La présente partie de l'ISO 23611 ne traite pas de la caractérisation pédologique du site, qui est vivement
recommandée en cas d'échantillonnage des invertébrés du sol. L'ISO 10390, l'ISO 10694, l'ISO 11272,
l'ISO 11274, l'ISO 11277, l'ISO 11461 et l'ISO 11465 s'avèrent plus adéquates pour mesurer le pH, la
distribution granulométrique, le rapport carbone-azote, la teneur en carbone organique et la capacité de
rétention d'eau.
2 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
2.1
vers de terre
vers de terre mégadriles vivant dans le sol (longueur des individus adultes: de quelques cm à plus de 1 m)
appartenant à l'ordre des Oligochaeta (classe Clitellata, phylum Annelida)
EXEMPLE Des espèces des familles des Lumbricidae (Holarctiques), des Glossoscolecidae (Amérique latine), des
Eudrilidae (Afrique) ou des Megascolecidae [Asie, Amérique du Nord (Côte Pacifique)].
2.2
espèces pérégrines
vers de terre qu'il est possible de trouver actuellement dans un grand nombre de régions du monde entier,
généralement introduits par l'homme
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ISO 23611-1:2006(F)
NOTE 1 Des exemples bien connus d'espèces pérégrines sont des espèces de lombricidés telles que Aporrectodea
caliginosa (originaire d'Eurasie, mais vivant actuellement aussi aux Amériques et en Australie) ou l'espèce pantropicale
Pontoscolex corethrurus (probablement originaire du Nord du Brésil et/ou des Guyanes).
NOTE 2 Voir Référence [15].
2.3
clitellum
anneau ou selle d'épaississement épidermique qui se forme près de la partie antérieure des vers, adultes
uniquement, et qui formera éventuellement le cocon
3 Principe
Sur un site donné, les vers de terre sont prélevés dans le sol en combinant deux méthodes différentes:
2
⎯ tri manuel des animaux issus d'une surface donnée (par exemple 0,25 m ) ou d'un volume donné (par
exemple 50 cm × 50 cm × 20 cm);
⎯ extraction des vers du sol par application de formol.
[5], [20]
Les deux méthodes sont bien connues depuis longtemps . Après l'extraction, les vers de terre sont fixés,
puis transportés vers le laboratoire. Là, ils sont conservés de manière à pouvoir être stockés indéfiniment
dans une collection (à des fins taxonomiques par exemple). De plus, la détermination de la biomasse des vers
de terre est décrite. Pour finir, les valeurs d'abondance et de biomasse sont recalculées et rapportées à une
2
surface (généralement 1 m ) ou plus rarement à un volume.
NOTE 1 D'autres méthodes peuvent se révéler utiles dans certaines circonstances (par exemple l'extraction électrique
ou l'utilisation de moutarde comme agent chimique d'expulsion), mais ne peuvent être recommandées en tant que modes
opératoires généralisés (voir l'Annexe A). De plus, l'utilisation d'agents chimiques d'extraction autres que le formol semble
[11], [33]
ne présenter aucun avantage en ce qui concerne l'efficacité de l'extraction .
NOTE 2 Le prélèvement de vers de terre est souvent inclus dans des programmes de surveillance plus vastes visant à
couvrir la totalité ou une partie de la faune du sol (par exemple la macrofaune). La conception de tels programmes n'est
[1]
pas comprise dans la présente partie de l'ISO 23611 .
NOTE 3 Quelques indications sur la taxinomie des vers de terre pérégrins (répartis dans un grand nombre de régions
du monde entier), appartenant principalement à la famille des Lumbricidae, sont fournies dans l'Annexe B.
4 Réactifs
4.1 Formol [solution de formaldéhyde à 4 % (fraction volumique)].
4.2 Formol [solution de formaldéhyde à 37 % (fraction volumique)].
4.3 Éthanol, à 70 % (fraction volumique).
5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et ce qui suit.
5.1 Récipients en plastique, de 250 ml et de 500 ml, pour le stockage des vers de terre.
5.2 Gants en plastique.
5.3 Pinces.
2 2
5.4 Bâche en plastique épais, de 1 m à 2 m .
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5.5 Bêche ou pelle.
5.6 Microscope à dissection, à faible grandissement (de 10 à 40 fois).
5.7 Balance, pouvant peser de 0,01 g à 200 g.
5.8 Bonbonne à eau, de préférence de 20 l de capacité, remplie d'eau (20 l par zone d'échantillonnage).
5.9 Arrosoir.
5.10 Crayon, carnet de notes, marqueur indélébile, étiquettes, qui tiennent dans le récipient.
5.11 Thermomètre, pour des mesures de température de l'air par exemple.
5.12 Enceinte de séchage, pour déterminer l'humidité du sol.
6 Mode opératoire
6.1 Prélèvement des échantillons
6.1.1 Généralités
Le prélèvement des vers de terre est effectué en combinant deux méthodes différentes: le tri manuel et
l'extraction au formol. Sur la base de plusieurs études comparatives, cette combinaison est nettement
recommandée dans différents comptes-rendus traitant de l'écologie des vers de terre (Références [7], [8], [15]
par exemple).
Il convient de réaliser le prélèvement pendant les périodes de l'année où les animaux ne sont pas contraints
par les conditions environnementales (à savoir une faible humidité du sol et/ou des températures élevées) à
un métabolisme réduit (c'est-à-dire qu'ils ne réagissent pas au formol). Dans les régions tempérées, les
périodes défavorables au prélèvement correspondent à l'hiver et surtout au milieu de l'été. Il convient que les
vers de terre issus d'une même zone, mais prélevés selon les deux différentes méthodes, soient stockés dans
des récipients individuels en plastique. À la fin du prélèvement, le sol excavé et examiné est remis dans la
zone de prélèvement d'origine. Dans certains cas, il convient de n'utiliser que l'une des deux méthodes: par
exemple lorsque aucun animal fouisseur profond n'est répertorié pour un site donné, l'extraction au formol
n'est pas nécessaire. Par ailleurs, dans les sites où se trouvent des vers de terre géants (certaines régions
[22]
d'Amérique du Sud, d'Asie du Sud-Est et en Australie), le tri manuel ne présente aucune utilité . Une
méthode très similaire, connue sous le nom de méthode TSBF modifiée, convient tout particulièrement aux
régions tropicales (voir l'Annexe C).
NOTE La détermination des vers de terre intervient généralement après conservation, mais si le spectre des
espèces d'un site d'échantillonnage est bien connu, les vers de terre peuvent aussi être déterminés alors qu'ils sont
[30]
vivants ; voir aussi l'Annexe B.
Si les vers de terre prélevés sont utilisés pour d'autres analyses ou d'autres essais, des mesures de
biomarqueurs ou des essais biologiques, par exemple, le stockage ou l'incubation des vers dans une petite
portion de sol du site de prélèvement est recommandée. En cas d'extraction au formol, il est nécessaire de
rincer les vers à l'eau du robinet avant l'incubation dans le sol.
6.1.2 Tri manuel
En raison de la taille individuelle des vers de terre, il est nécessaire de délimiter une vaste zone. Un carré de
50 cm × 50 cm suffit généralement dans les régions holarctiques où la longueur de la plupart des vers de terre
adultes est comprise entre 1 cm et 20 cm. Cependant, dans les régions à faible densité en vers de terre [par
exemple les sols à faible pH (< 4,5) ou ceux cultivés par l'homme], des zones plus étendues (à savoir de
2
1 m ) sont recommandées (voir l'ISO 11268-3). Par ailleurs, dans les zones à forte densité en vers de terre
2
(par exemple un grand nombre de prairies dans les régions tempérées), une zone plus réduite de 1/8 m
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[24] 2 [36]
suffit . Des tailles d'échantillons encore plus réduites (par exemple 1/16 m ; ) peuvent produire des
nombres très faibles, et donc variables, de vers de terre par échantillon, ce qui entraîne une augmentation du
nombre d'échantillons (c'est-à-dire 16 réplicats).
Dans tous les cas, le sol est prélevé à l'aide d'une bêche ou d'une pelle (5.5) sur une profondeur de 20 cm
pour cette zone (20 cm conviennent pour un grand nombre de sites tempérés, mais la profondeur dépend
aussi des propriétés du site). Le sol excavé est étalé sur une bâche en plastique (5.4); cela peut être effectué
sur le terrain mais, en particulier dans les périodes de mauvais temps, la totalité du procédé peut aussi être
réalisée en laboratoire ou sous serre. Le sol est ensuite examiné avec soin à la recherche de vers de terre.
Les vers de terre de grande taille sont recueillis à la main avec des gants en plastique (5.2) et ceux de petite
taille à l'aide de pinces (5.3). Afin d'éviter l'autotomie et d'endommager les vers davantage, il convient de ne
toucher les animaux que dans leur partie antérieure. Si des vers de terre sont coupés par la bêche utilisée
pour retourner le sol, les deux parties sont ramassées pour une mesure correcte de la biomasse, tandis que
seules les parties antérieures sont comptées lors de la détermination du nombre d'individus.
NOTE 1 Il est possible d'identifier la partie antérieure des vers adultes à l'œil nu par la position du clitellum: celui-ci est
toujours situé plus près de la tête que de la queue.
Il convient de fixer immédiatement les vers de terre collectés dans de l'éthanol à 70 % (4.3) dans des
récipients en plastique (5.1) de 250 ml ou de 500 ml pendant une demi-heure au moins, mais sans dépasser
24 h. Les récipients doivent être étiquetés et il convient de consigner les observations (par exemple si les vers
sont entrés ou non en quiescence) dans le carnet de notes (5.10).
La fixation immédiate dans le formol à 4 % (fraction volumique) (4.1) est possible, mais elle n'est pas
recommandée étant donné qu'il convient de réduire la manipulation de ce composé autant que possible, en
particulier en conditions de terrain.
NOTE 2 Afin d'éviter des modifications morphologiques (par exemple une inversion du prostomium) dues à la fixation
immédiate dans l'éthanol, les vers de terre peuvent être placés brièvement (environ une minute) dans de l'eau chaude du
robinet. Les vers de terre sont laissés au repos dans l'eau et transférés ensuite dans l'éthanol.
6.1.3 Extraction au formol
Pendant le tri manuel, l'extraction au formol est effectuée sur la même zone que celle ayant servi pour le
déblai de l'horizon superficiel. Il est nécessaire de transporter au préalable une quantité suffisante d'eau (20 l
par zone d'échantillonnage) vers les zones à l'aide de grandes bonbonnes à eau (5.8). La solution de formol
(environ 0,5 %, fraction volumique) est préparée en diluant 25 ml de formol à 37 % (fraction volumique) (4.2)
dans environ 5 l d'eau à l'aide d'un arrosoir (5.9). La dilution de 25 ml de formol à 37 % dans 5 l d'eau produit
une solution à environ 0,2 %. La solution de formol diluée est appliquée soigneusement et de manière
homogène sur la zone dont l'horizon superficiel a été prélevé pour le tri manuel. Cette étape doit être
recommencée jusqu'à épuisement de 20 l de solution de formol; il est possible d'adapter la quantité de
solution de formol en fonction des propriétés du sol. Pendant l'application, il est nécessaire d'examiner la zone
afin de recueillir tous les vers de terre apparaissant à la surface de la zone de prélèvement. Le prélèvement
est terminé 30 min après l'application du dernier arrosoir.
Il convient de recueillir les vers de terre de grande taille à la main avec des gants en plastique (5.2) et ceux de
petite taille à l'aide de pinces (5.3). Le formol est répulsif et entraîne l'émergence rapide des vers de terre du
sol; il convient de ne recueillir les vers de terre que lorsque la plus grande partie, voire de préférence la
totalité, du corps est visible, sous peine de l'endommager ou d'entraîner sa rétraction dans le sol. Afin d'éviter
l'autotomie et d'endommager les vers davantage, il convient de ne toucher les animaux que dans leur partie
antérieure, généralement devant le clitellum. Il convient de fixer immédiatement les vers de terre collectés
dans de l'éthanol à 70 % (4.3) dans des récipients en plastique (5.1) de 250 ml ou de 500 ml, pendant 30 min
au moins, mais sans dépasser 24 h. Les récipients doivent être étiquetés et il convient de consigner les
observations dans le carnet de notes (5.10).
2
Il convient d'appliquer le formol sur une surface de 4 m dans les sites où il est possible de rencontrer des
vers de terre géants (Amérique du Sud, Asie du Sud-Est et Australie) et où le tri manuel ne convient pas à
leur collecte. Avant de commencer, il est nécessaire de déblayer les herbes et la litière de la surface du sol.
Le procédé de prélèvement est le même au regard des autres points.
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L'extraction au formol n'est pas nécessaire en l'absence de fouisseurs verticaux (Lumbricus terrestris ou
Aporrectodea longa en particulier) sur un site donné (par exemple si le sol est très acide). La présence de ces
grands vers peut être observée par l'examen des empreintes de surface et de la litière recueillie au niveau
des orifices des galeries (diamètre d'environ 0,5 cm) qu'il est facile de déceler avant le déblai du sol servant
au tri manuel. Par conséquent, il convient de prendre la décision d'utiliser le formol au cas par cas.
NOTE 1 L'utilisation de formol à de faibles concentrations, telle qu'elle est proposée ici, ne présente aucun problème
pour les autres organismes du sol tels que les arthropodes et ne génère aucun effet négatif à long terme sur les
[17]
paramètres microbiens . Le composé est dégradé par voie microbienne dans les jours ou les semaines qui suivent. Il
[7]
peut retarder le développement de certaines espèces végétales dans le même ordre de grandeur .
NOTE 2 Dans le cas de sols fortement argileux, la réalisation de la fosse de prélèvement peut entraîner la fermeture
d'un grand nombre de galeries de vers de terre au fond de la fosse, et empêcher ainsi l'infiltration du formol et/ou
l'émergence des vers de terre fouisseurs profonds. Dans de telles conditions, il est possible de forcer les ouvertures des
galeries ainsi perturbées (par exemple à l'aide d'un couteau) avant l'application du formol.
AVERTISSEMENT — Des précautions adéquates (le port de gants, par exemple) doivent être prises
lors de l'utilisation du formol pour éviter tout risque d'inhalation ou d'exposition cutanée. Selon la
fiche de données de sécurité concernant la solution de formaldéhyde à 37 %, telle qu'elle est éditée
par les fabricants, le composé est un sensibilisant cutané et est considéré comme cancérigène (chez
l'homme: symptômes limités; chez l'animal: éléments probants suffisants). Dans les pays
industrialisés, il est légalement indiqué pour une utilisation scientifique.
6.2 Conservation
Deux méthodes sont possibles:
a) après fixation, il est possible de conserver les animaux dans du formol à 4 % (fraction massique) (4.1)
pendant quatre jours au moins, mais une ou deux semaines de préférence. Les vers de terre peuvent
ensuite être conservés pendant une période illimitée dans de l'éthanol à 70 % (fraction volumique) (4.3);
b) une autre méthode consiste à fixer les vers immédiatement après la collecte dans un mélange d'éthanol
à 70 % (fraction volumique) (4.3) et de formol à 4 % (fraction volumique) (4.1) dans un rapport de 98 % à
2 %. Le liquide de conservation est remplacé par du liquide de conservation frais le jour suivant le
prélèvement au plus tard.
Il convient d'éviter la conservation dans de l'éthanol pur étant donné que la surface des vers de terre devient
parfois très molle et que cela peut effacer des caractéristiques importantes.
Lorsque les tissus des vers de terre doivent être conservés à des fins d'étude d'ordre biochimique ou
[37]
génétique, la conservation dans du formol est recommandée .
6.3 Détermination de la biomasse
La détermination de la biomasse est réalisée sur le matériel conservé. Les animaux sont rincés à l'eau
pendant 5 min, rapidement séchés sur un morceau de papier et leur masse est ensuite déterminée à l'aide
d'une balance adéquate (5.7). Les vers de terre sont ensuite de nouveau conservés dans de l'éthanol à 70 %
(4.3) ou dans un mélange d'éthanol/formol. En raison des modifications de masse survenant pendant la
conservation et du sol contenu dans les intestins, il est possible de corriger les mesurages à l'aide de facteurs
publiés dans la littérature pour déterminer la biomasse des animaux. Selon la littérature (par exemple
Références [7] et [15]), il semble que les vers perdent environ 10 % à 20 % de leur masse au cours de la
fixation. Il s'agit approximativement de la même masse que celle du contenu des intestins. Par conséquent,
aucune compensation n'est nécessaire. Ensuite, il est possible de convertir la masse fraîche mesurée en
[19]
masse sèche en la multipliant par un facteur de 0,15 . Cependant, ce facteur a été déterminé sur la base
[19]
d'habitants de sols minéraux provenant de prairies et, étant spécifique au site, il peut varier
considérablement en fonction de la forme d'utilisation du sol (par exemple, pour les habitants de litière, il est
plus petit que pour les habitants de sols minéraux).
NOTE Si les vers de terre ont été identifiés alors qu'ils étaient vivants, ils peuvent être pesés directement, que ce soit
individuellement ou par groupes, selon les espèces et l'âge.
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7 Évaluation des données
Il est possible d'utiliser les critères d'effet de mesurage suivants pour la bioclassification d'un sol (y compris la
bio-indication ou la biosurveillance (par exemple une contrainte anthropique telle que des produits chimiques
ou des modification d'utilisation du terrain):
⎯ l'abondance (nombre d'individus par unité de surface ou de volume);
⎯ la biomasse (masse fraîche ou sèche de vers de terre par unité de surface ou de volume);
⎯ le nombre d'espèces ou de groupes définis d'un point de vue taxonomique ou écologique;
⎯ la dominance (en pourcentage de la population);
⎯ la structure par âge de la population (par exemple rapport adultes/juvéniles);
⎯ les altérations morphologiques chez les individus.
En premier lieu, le nombre de vers est compté et exprimé sous forme d'individus par prélèvement
(séparément pour les prélèvements par tri manuel et par extraction au formol). En second lieu, les deux
valeurs sont ajoutées afin de déterminer l'abondance totale des vers de terre. Ce nombre est ensuite multiplié
par un facteur afin d'obtenir le nombre de vers par mètre carré [ce facteur est de quatre dans le cas de
2
0,25 m (en général des échantillons de 50 cm × 50 cm)]. Il est possible de déterminer en outre la structure
par âge (les juvéniles se différencient des adultes par la présence d'un clitellum) à l'aide d'un microscope à
dissection (5.6).
8 Rapport d'étude
Le rapport d'étude doit contenir les informations suivantes:
a) une référence à la pré
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.