ISO 18184:2014

Textiles - Determination of antiviral activity of textile products

ISO 18184:2014 specifies testing methods for the determination of the antiviral activity of the textile products. The textile products include woven and knitted fabrics, fibres, yarns, braids, etc.

Textiles — Détermination de l'activité virucide de produits textiles

L'ISO 18184:2014 spécifie des méthodes d'essai permettant d'évaluer l'activité virucide des produits textiles. Les produits textiles incluent les tissus, les tricots, les fibres, les fils, les tresses, etc.

General Information

• Status: Withdrawn
• Publication Date: 18-Aug-2014
• Withdrawal Date: 18-Aug-2014
• ICS: 59.080.01 - Textiles in general
• Technical Committee: ISO/TC 38 - Textiles
• Drafting Committee: ISO/TC 38/WG 23 - Biological properties of textiles
• Current Stage: 9599 - Withdrawal of International Standard
• Start Date: 05-Jun-2019
• Completion Date: 13-Dec-2025

Relations

• Revised: ISO 18184:2019 - Textiles - Determination of antiviral activity of textile products
• Effective Date: 28-May-2016

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 18184
First edition
2014-09-01
Textiles — Determination of antiviral
activity of textile products
Textiles — Détermination de l’activité virucide de produits textiles
Reference number
©
ISO 2014
© ISO 2014
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Published in Switzerland
ii © ISO 2014 – All rights reserved

Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Virus and host cell . 3
6 Warning . 3
7 Apparatus . 3
8 Sterilization of apparatus . 6
9 Reagent and medium . 6
10 Preparation .11
10.1 Restoration of host cell from cryopreservation .11
10.2 Subculture of host cell .11
10.3 Cell culture for the infectious virus titre assay .12
10.4 Preparation for test virus .12
10.5 Preparation for test specimen .15
10.6 Control test .16
11 Test procedure .16
11.1 Preparation of specimen.16
11.2 Inoculation of virus to the specimens .16
11.3 Contacting time.17
11.4 Wash-out of virus immediately after inoculation .17
11.5 Wash-out of virus after contacting time.17
12 Preparation of the series of the dilution for the virus suspension .17
13 Infective titre measurement .18
13.1 Plaque assay .18
13.2 TCID method .18
14 Calculation of infectivity titre .18
14.1 Plaque assay .18
14.2 TCID method .18
14.3 Test result .20
15 Test report .21
Annex A (normative) Virus strains and host cells .22
Annex B (normative) Infectivity titre test: Plaque assay .23
Annex C (normative) Infectivity titre test: TCID method .26
Annex D (normative) Composition of Media .27
Annex E (informative) Additional virus: Polio virus .30
Annex F (informative) Testing method using SPF embryonated hen’s eggs .31
Annex G (informative) Antiviral efficacy .36
Annex H (informative) Round robin test result (1) .37
Annex I (informative) Round robin test result (2) .39
Bibliography .42
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of any
patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or on
the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical Barriers
to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 38, Textiles.
iv © ISO 2014 – All rights reserved

Introduction
Recently, along with the global improvement in the level of living, consumers are showing the trend to
seek healthcare or health protective products. Also, an increase in the people’s interest for protection
against epidemic diseases has been noted, as the overcrowded commuting train car where the commuters
experience every day, the hospitals, nursing homes, etc.
Being supported by the processing technology of textile products to provide a high performance which
has been highly developed recently, the health protective and hygiene relating products have been
advancing into the market.
Because those products are relatively new products and included the technical aspects out of textile
technology, the testing methods have been developed by the individual producers to evaluate the product
performance. That has resulted in inexistence of a unified test method, hindering for both consumers
and producers a true explanation or understanding of those high functional products.
The antiviral product is one of those products and includes the technical fields of the textile technology
and the biotechnology.
The demand to establish the international standard has been growing in the consumers, retailers,
producers, etc. as the stakeholders in the market.
Antiviral textile products are textiles capable of reducing the number of infective virus particles that
contact the surface of the textile. This standard provides a quantitative test method to assess the
antiviral performance of such products.
The data obtained in objective manner by this standard give the common knowledge to all the stake
holders such as consumers, producers, retailers, etc. to understand the correct performance of the
antiviral textile products.
There are two methods to quqntify the number of infective virus, as infective virus titre in this standard,
which are the plaque method and the TCID method. The method used can be selected by the experience
and the convenience of each testing house. Any appropriate cellular system can be used and that the
testing conditions when used should be reported.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 18184:2014(E)
Textiles — Determination of antiviral activity of textile
products
1 Scope
This International Standard specifies testing methods for the determination of the antiviral activity of
the textile products. The textile products include woven and knitted fabrics, fibres, yarns, braids, etc.
Viruses used in this International Standard are as follows:
— one of enveloped viruses, an influenza virus, which is an infective virus in humans that causes
respiratory tract infection;
— one of non-enveloped viruses, a feline calicivirus, which is one of surrogates of noroviruses which
are important enteric pathogens.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 105-F02, Textiles — Tests for colour fastness — Part F02: Specification for cotton and viscose adjacent
fabrics
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
ISO 6330, Textiles — Domestic washing and drying procedures for textile testing
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
virus
has no cell and consists of the gene material enclosed by the shell of the protein, it can replicate in the
specific host cells
3.2
virus activity
ability to replicate in the specific host cells
3.3
antiviral property
property to give the morphological change or structural damage to the surface protein of virus
Note 1 to entry: As the result, the damaged virus loses the fitting to the receptor of host cell and reduces the virus
activity. Depending on the type of molecules the property can also be an alteration of nucleic acids. In addition to
enveloped viruses there is an alteration of envelope as well.
Note 2 to entry: It is not necessarily to imply that the change of antigenic response or the change of constituent
element is the reduction of virus infectivity.
3.4
antiviral chemicals
inorganic or organic chemicals able to reduce virus activity
Note 1 to entry: The organic antiviral chemicals give the change to the surface protein of virus by the chemical
adsorption. The inorganic metallic antiviral substances destroy or change the morphology of the virus by the
extraction of hydrogen atom in the virus protein by OH radicals which are generated by the radical reaction.
3.5
reference cloth
cloth used to verify the stability of the test virus on a textile fabric
Note 1 to entry: The 100 % cotton cloth described in ISO 105-F02 should be used without any chemical treatments
such as the fluorescent bleach, etc.
Note 2 to entry: The fabrics before the antivirus treatment may be used as a reference cloth with the same
condition described in 3.5.
3.6
control test of specimen
test to confirm that a specimen does not affect the host cell
Note 1 to entry: This test is performed as same as actual test, but without virus.
3.7
cytopathic effect (CPE) caused by virus
effect appears as morphological change or destruction of the host cells as a result of the virus
multiplication
3.8
infectivity titre of virus
number of infectious viral particles present per unit volume in a cell lysate or in a solution
3.9
plaque
lysis formed area in a cell monolayer under semisolid medium due to infection by and multiplication of
a single infectious virus
3.10
plaque forming units
PFU
unit expressed as the concentration of the infectious virus per unit volume (ml)
3.11
plaque assay
assay to determine the infectivity titre of virus from PFU by using the series of dilution
3.12
TCID method
50 % infectious dose of a wash-out virus suspension or the dilution of the virus suspension that induces
a CPE in 50 % of cell culture units
Note 1 to entry: See 3.7.
4 Principle
The viruses are inoculated to a specimen. After specific contacting time, the remaining infectious virus
is counted and the reduction rate is calculated by the comparison between the antiviral product test
specimen and the reference specimen by common logarithm. There are two methods to quantify the
infectious virus titre. One method is the plaque assay (3.11) and the other is the TCID method (3.12)
2 © ISO 2014 – All rights reserved

as explained. The selection of the method depends on the convenience and experience of the testing
organization.
5 Virus and host cell
Viruses used in this standard are an Influenza virus and a feline calicivirus which is described in
Annex A. Moreover, the host cells are described corresponding to the viruses in Annex A. One or both
viruses are chosen for the test depended on the end use of the textile products.
6 Warning
This standard calls for use of the infectious viruses or substances/procedures that may be injurious to
the health/environment if appropriate conditions are not observed. It refers only to technical suitability
and does not absolve the user from legal obligations relating to health and safety/environment at any
stage.
The warning is extended as the following. The virus in the standard shall be the one of biotechnology
safety level class II classified by the directives of WHO as stated. The user of this standard shall have
enough knowledge and experience of the biotechnology. Moreover, users shall comply strictly to the
safety standard of the manufacturers and the domestic regulation.
7 Apparatus
7.1 High pressure steam sterilizer: Autoclave, capable of operating at a temperature of (121 ± 2) °C
and a pressure of (103 ± 5) kPa.
7.2 Dry heat sterilizer: ovens, capable of operating at a temperature of (180 ± 2) °C and (160 ± 2) °C.
7.3 Measuring flask, with capacity of 1 l.
7.4 Scale, with the available range of 100 g ± 0,1 g to 0,01 g ± 0,000 1 g.
7.5 Glass pipette, with capacities of 50 ml ± 0,5 ml, 25 ml ± 0,25 ml, 10 ml ± 0,1 ml and 5 ml ± 0,05 ml.
7.6 Plastic pipette, with capacities of 50 ml ± 0,5 ml, 25 ml ± 0,25 ml, 10 ml ± 0,1 ml and 5 ml ± 0,05 ml.
7.7 Pipetter, capable of mounting the glass or plastic pipettes or chips.
7.8 Micropipette, having the most suitable volume for each use, with a tip made of glass or plastic, and
with a tolerance of 0,5 % or less.
7.9 Water bath, capable of maintaining at a temperature of (37 ± 2) °C, (50 ± 2) °C or (56 ± 2) °C.
7.10 Vortex-type mixer, used for microbial testing.
7.11 Freezer, capable of operating at a temperature of – (80 ± 2) °C or – (20 ± 2) °C.
7.12 Liquid nitrogen bath, for the preservation approximately at −196 °C.
7.13 Membrane filter, with a pore size of 0,22 μm.
7.14 Refrigerator, capable of operating at a temperature between (2 ± 2) °C and (8 ± 2) °C.
7.15 pH meter, with a glass electrode detector.
7.16 Inverted microscope, capable of being used for cultured cells observation.
7.17 Tweezers, capable of being sterilized.
7.18 Centrifuge, capable of being operated at a temperature of (4 ± 2)°C, and relative centrifugal force
of approximately 1 000 g.
7.19 Biological safety cabinet, class II.
7.20 Vial container, with a capacity of 30 ml and closed with the screw cap. The gasket is made of
perfluoroethylene or silicone and the cap is made of polypropylene.
7.21 96 wells microplate with the gamma radiation sterilization, for TCID method.
Figure 1 — 96 wells microplate for TCID method
7.22 6 wells plastic plate with the gamma radiation sterilization, for plaque assay.
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Figure 2 — 6 wells plastic plate for plaque assay
7.23 Flasks, for cell culture use with the gamma radiation sterilization finish, with an adherent type, a
cell culture area of 75 cm and with the vent cap, and the tight closed cap. The vent cap can be exchanged
abacterial air through 0,2 μm filter.
Figure 3 — flask for cell culture use
7.24 CO incubator, capable of maintaining an atmosphere with 5 % CO , at a temperature of (34 ± 2) °C
2 2
and (37 ± 2) °C.
7.25 Incubator, capable of maintaining at a temperature of (25 ± 2) °C, (34 ± 2) °C or (37 ± 2) °C.
7.26 Centrifuge tube.
7.27 Culture container.
7.28 Test tube.
7.29 Beaker.
8 Sterilization of apparatus
Sterilize all apparatus which come in contact with the cells, the chemicals, or test specimen. The
sterilization method shall be used by high pressure steam or dry heat method.
— High pressure steam sterilization: by an autoclave (7.1) at a temperature of 121 °C and a pressure of
103 kPa for 15 min.
— Dry-heat sterilization: by a dry heat sterilizer (7.2) at a temperature of 180 °C for 30 min or 160 °C
for 2 h.
9 Reagent and medium
All reagents shall have the quality suitable for virological needs, ie free of toxic substances for testing
microorganisms. Some of the media are available in the market.
9.1 Water, which must be of grade 3 according to ISO 3696.
9.2 Eagle’s minimum essential medium (EMEM), is available in the market. The composition is
described in Annex D. If there are any components missing from the composition, add them according to
the composition table.
9.3 7,5 % sodium bicarbonate solution.
9.3.1 Sterilize sodium bicarbonate 75 g in autoclave in a culture container with a cap closed tightly.
9.3.2 Grade 3 water is also sterilized by autoclave.
9.3.3 Dissolve sodium bicarbonate in the sterized water of 1 000 ml well.
9.4 Formalin solution.
9.4.1 Use for cell fixation.
9.4.2 Prepare 37 % formaldehyde solution of 100 ml,
9.4.3 Add grade 3 water of 900 ml to 9.4.2.
9.5 Methylene blue solution, use for the cells dyeing.
9.5.1 Prepare a measuring flask (7.3) of 1 l, then, put the following materials in the flask:
— Grade 3 water, 1 000 ml;
— Methylene blue, 0,375 g;
— 1 N sodium hydroxide solutions 62,5 μl.
9.5.2 Dissolve and mix well.
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9.6 Inactivated Fetal bovine serum: FBS.
9.6.1 Put the freezed cryopreserved Fetal bovine serum in a package in the water bath (7.9) at a
temperature of 37 °C and keep it until defrosting.
9.6.2 Then, put it in the water bath at a temperature of 56 °C and keep it for 30 min to inactivate.
9.6.3 Divide it into several tubes. Put them in the freezer (7.11) at a temperature lower than – 20 °C.
9.6.4 Just before use, put it in the water bath at a temperature of 37 °C and keep it until defrosting.
9.7 Growth medium, used for cell culture.
9.7.1 Prepare a measuring flask (7.3) of 1 l, and put the following materials into the flask:
— Grade 3 water, 800 ml;
— Kanamycin sulfate, 60 mg;
— Eagle’s minimum essential medium, 9,53 g, or RPMI 1640 medium, 10,4 g.
9.7.2 Dissolve and mix well and make up whole solution to 1 000 ml by grade 3 water.
NOTE RPMI stands for Roswell Park Memorial Institute.
9.7.3 Sterilize the mixed solution of 9.7.2 by using 0,22 μm filter (7.13).
9.7.4 Add 15 ml of 7,5 % sodium bicarbonate solution (9.3) and 100 ml of the inactivated Fetal bovine
serum (9.6) in the solution of 9.7.3.
NOTE When L-glutamine is not included in the EMEM purchased in the market, add it according to the
composition of Annex C before use.
9.8 Maintenance medium, used for cell culture.
9.8.1 Prepare a measuring flask (7.3) of 1 l, then, put the following materials in the flask:
— Grade 3 water, 800 ml;
— Kanamycin sulfate, 60 mg;
— Eagle’s minimum essential medium, 9,53 g.
9.8.2 Dissolve them well, then, make up the whole amount to 1 000 ml by adding grade 3 water.
9.8.3 Sterilize the mixed solution 9.8.2 by using the filter (7.13) with a pore size of 0,22 μm.
9.8.4 Add 15 ml of 7,5 % sodium bicorbonate solution (9.3) in the solution 9.8.3.
NOTE When L-glutamine is not included in the EMEM purchased in the market, mix it according to the
composition of Annex C before use.
9.9 Double consentration of the maintenance medium 9.8.
9.9.1 Prepare a measuring flask (7.3) of 1 l, then, put the following materials in the flask:
— Grade 3 water, 800 ml;
— Kanamycin sulfate, 120 mg;
— Eagle’s minimum essential medium, 19,06 g.
9.9.2 Dissolve them well, then, make up the whole amount to 1 000 ml by adding grade 3 water.
9.9.3 Sterilize the mixed solution 9.9.2 by using the filter (7.13) with a pore size of 0,22 μm.
9.10 0,01 mol/l phosphate buffered saline PBS (-).
9.10.1 Prepare a measuring flask (7.3) of 1 l, then, put the following materials in the flask:
— Sodium chloride, 8 g;
— Potassium chloride, 0,2 g;
— Phosphoric acid hydrogen 2 sodium 12 hydrate, 2,9 g;
— Phosphoric acid 2 hydrogen potassium, 0,2 g.
9.10.2 Add grade 3 water by making up whole amount to 1 000 ml and dissolve well, then,
9.10.3 Sterilize the solution 9.10.2 by using autoclave (7.1) at a temperature of 121 °C and a pressure of
103 kPa for 15 min.
9.11 Trypsin derived from beef pancreas and PBS (-) solution.
9.11.1 Prepare a beaker, then, put the following materials in the beaker:
— 0,01 mol/l phosphate buffered saline PBS (-) (9.10), 100 ml;
— Trypsin derived from beef pancreas, 1,0 g.
9.11.2 Dissolve and mix well by using mixer for 2 h.
9.11.3 Then, sterilize the solution 9.11.2 by using the filter (7.13) with a pore size of 0,22 μm.
The divided solution tubes that are not used immediately are preserved in the freezer at a temperature
of lower than −80 °C.
9.11.4 Prepare a test tube and put the following solutions in the test tube:
— 0,01 mol/l phosphate buffered saline PBS (-) (9.10), 9 ml;
— Trypsin derived from beef pancreas and PBS (-) mixed solution 9.11.3, 1ml.
9.11.5 Dissolve and mix them well.
9.11.6 Divide the solution in test tubes and preserve in the freezer at a temperature of lower than −20 °C.
9.11.7 Just before using, put it in the water bath (7.9) at a temperature of 37 °C and keep it until defrosting.
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9.12 Trypsin EDTA solution.
9.12.1 Prepare a measuring flask (7.3) of 1 l, then, put the following materials in the measuring flask:
— 0,01 mol/l phosphate buffered saline PBS (-) (9.10), 1 000 ml;
— Trypsin, 2,5 g;
— Kanamycin sulfate, 0,1 g;
— Streptomycin sulfate, 0,1 g;
— Amphotericin B, 2 mg;
— EDTA, 0,014 mol.
9.12.2 Dissolve and mix well.
9.12.3 Then, sterilize the solution 9.12.2 by using the filter (7.13) with a pore size of 0,22 μm.
9.12.4 Divide the solution in test tubes and preserve in the freezer at a temperature of lower than - 20 °C.
9.12.5 Just before using, put it in the water bath (7.9) at a temperature of 37 °C and keep it until defrosting.
NOTE Trypsin EDTA solution is available in market. The products with the different components from 9.12.1,
could be used after proper validation.
9.13 DEAE-dextran solution.
9.13.1 Prepare a measuring flask (7.3) of 1 l, then, put the following materials in the measuring flask:
— Grade 3 water, 1 000 ml;
— DEAE-dextran, 20 g.
9.13.2 Dissolve and mix well.
9.13.3 Sterilize the solution 9.13.2 by using the filter (7.13) with a pore size of 0,22 μm.
9.14 Agar medium, used for the plaque assay. This is prepared with A liquid and B liquid as follows and
mixed well just before using.
9.14.1 A liquid.
9.14.1.1 Prepare a measuring flask (7.3) of 1 l, then, put the following materials in the measuring flask:
— Double concentration of maintenance medium (9.9), 1 000 ml;
— DEAE-dextran solution (9.13), 10 ml;
— 7,5 % sodium bicorbonate solution (9.3), 40 ml.
Mix well.
9.14.1.2 Only for the influenza virus test and for the plaque assay, add 3,0 ml of the Trypsin from beef
pancreas and PBS (-) solution (9.11).
9.14.1.3 Put the solution 9.14.1.1 or 9.14.1.2 in the water bath (7.9) at a temperature of 37 °C and keep
it until using.
9.14.2 B liquid.
9.14.2.1 Prepare a measuring flask (7.3) of 1 l, then, put the following materials in the measuring flask:
— Grade 3 water, 1 000 ml;
— Cell culture agar, 15 g.
Mix well.
9.14.2.2 Sterilize mixed solution 9.14.2.1 by using autoclave (7.1) at a temperature of 121 °C and a
pressure of 103 kPa for 15 min.
9.14.2.3 Put the solution 9.14.2.2 in the water bath (7.9) at a temperature of 50 °C, and keep it until
using.
9.15 SCDLP medium, used for washing-out and for suppression of agent activity of the treated textile
product.
9.15.1 Prepare a measuring flask (7.3) of 1 l, then, put the following materials in the measuring flask:
— Grade 3 water, 1 000 ml;
— Peptone made of casein, 17,0 g;
— Peptone made of soybean, 3,0 g;
— Sodium chloride, 5,0 g;
— Phosphoric acid hydrogen 2 potassium, 2,5 g;
— Glucose, 2,5 g;
— Lecithin, 1,0 g.
Mix together and dissolve well, then, add,
— Nonionic surfactant, 7,0 g.
Dissolve and mix well.
9.15.2 Adjust the solution 9.15.1 to pH 7,0 ± 0,2 by the sodium hydroxide solution or the hydrochloric
acid solution in the water bath (7.9) at a temperature of 25 °C.
9.15.3 Sterilize the mixed solution 9.15.2 by using autoclave (7.1) at a temperature of 121 °C and a
pressure of 103 kPa for 15 min.
9.16 Maintenance medium, used for cell culture and for TCID method.
9.16.1 Prepare a measuring flask (7.3) of 1 l, then, put the following materials in the measuring flask:
— Maintenance medium (9.8), 1 000 ml;
— Trypsin from beef pancreas and PBS(-) solution (9.11), 3,0 ml.
Dissolve them well.
10 © ISO 2014 – All rights reserved

10 Preparation
10.1 Restoration of host cell from cryopreservation
Because the host cell is cryopreserved, to defrost and then to culture are required. The procedure is as
follows:
10.1.1 Put the cryopreserved host cell in the water bath (7.9) at a temperature of 37 °C and keep it for
rapid defrosting.
10.1.2 Prepare a new flask for cell culture (7.23) with a vent cap lid and add 20 ml of growth medium
(9.8) in the flask.
10.1.3 Put whole ampule of defrosted host cell 10.1.1 in the flask 10.1.2.
10.1.4 Put the flask 10.1.3 in the CO incubator (7.24) at a temperature of 37 °C and keep it for (24 ± 2)
h to culture the host cell.
10.1.5 Then, observe the flask 10.1.4 by microscope if the cells are attached on the bottom of the flask.
If the growth is confirmed, then, go to next step. If not, continue to keep in the incubator.
10.1.6 Drain the remained growth medium in the flask of 10.1.5.
10.1.7 Add 20 ml of the new growth medium (9.8) to the flask of 10.1.6.
10.1.8 Put the flask 10.1.7 in the CO incubator (7.24) at a temperature of 37 °C for (48 ± 2) h. Then,
10.1.9 Observe the flask of 10.1.8 by a microscope and confirm if the cells is cultured as a confluent
growth on the bottom of the flask. If the growth of cells is not enough, continue the step 10.1.7 until the
sufficient growth is confirmed.
10.1.10 Then, proceed the serial subcultivation by taking the following steps of 10.2.
10.2 Subculture of host cell
The host cell shall be grown by subculture. The procedure of subculture is as the following:
10.2.1 Drain an extra growth medium of the flask 10.1.9 after confirmation of a confluent growth of cells.
10.2.2 Add 5 ml of 0,01 mol/l phosphate buffered saline PBS (-) (9.11) and wash the surface of the grown
cells on the bottom of the flask by the solution.
Repeat 3 times of this washing procedure.
10.2.3 Add 1 ml of Trypsin EDTA solution (9.13) in the flask of 10.2.2 and spread the solution over whole
surface, then drain an extra Trypsin EDTA solution.
10.2.4 Put the flask of 10.2.3 in the CO incubator (7.24) at a temperature of 37 °C for 10 min ± 1 min to
keep warm. Then,
10.2.5 Observe visually the flask of 10.2.4 if the grown cells are starting to come off, if confirmed, tap the
side of the flask and disperse the cells.
10.2.6 Add 5 ml of the growth medium (9.8) in the flask of 10.2.5 and pipetting the medium to make mild
mix well to avoid the damage to the cells.
10.2.7 Prepare a new flask for cell culture (7.23) with a tight close cap and add 20 ml of the growth
medium (9.8).
10.2.8 Add 1 ml of the cell suspension of 10.2.6 by the pipette to 10.2.7.
10.2.9 Close the cap of the flask of 10.2.8 and put the flask in the CO incubator (7.24) at a temperature
of 37 °C for 5 days to culture.
10.3 Cell culture for the infectious virus titre assay
The cell culture in 6 wells plate or 96 wells microplate is required for the test of the plaque assay or
TCID method.
10.3.1 Put 20 ml of growth medium (9.8) in the culture medium container (7.27) and add 1ml of the
subcultured cell suspension of 10.2.6.
10.3.2 Put 3 ml of the cell suspension of 10.3.1 in each hole of the 6 wells plastic plate (7.22) for the
plaque assay test.
10.3.3 Put 0,1 ml of the cell suspension of 10.3.1 in each well of the 96 wells microplate (7.21) for TCID
method.
10.3.4 Put the plate of 10.3.2 and the microplate of 10.3.3 in the CO incubator (7.24) at a temperature
of 37 °C and keep it for 3 days to 5 days to culture.
10.3.5 Observe the condition of the cells by the inversed microscopy if the multiplied cells are confluent.
10.4 Preparation for test virus
10.4.1 General
The viruses are cryopreserved in the freezer, so the operation to defrost and to grow them for test is
required.
10.4.2 Influenza virus
10.4.2.1 Put the cryopreserved base virus in the water bath (7.9) at a temperature of 37 °C and keep it
for rapid defrosting.
10.4.2.2 Drain the growth medium from the flask of 10.2.9 with the cultured cells in the monolayer.
10.4.2.3 Add 5 ml of the maintenance medium (9.8) in the flask of 10.4.2.2. Wash the surface of the
cultured cells and drain the maintenance medium. Repeat the washing procedure 2 times.
10.4.2.4 Prepare a new test tube.
10.4.2.5 Put the defrosted base influenza virus in the test tube of 10.4.2.4, dilute with the maintenance
3 4
medium (9.8) and adjust the concentration of virus to 10 PFU to 10 PFU or TCID / ml.
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10.4.2.6 Inoculate 1 ml of the adjusted base influenza virus of 10.4.2.5 on the surface of cell in the flask
of 10.4.2.3 and spread to the whole surface.
10.4.2.7 Put the flask of 10.4.2.6 in the CO incubator (7.24) at a temperature of 34 °C and keep it for 1 h
to absorb the virus into the cells.
10.4.2.8 Put 20 ml of the maintenance medium (9.8) in the flask (10.4.2.7) and add 30 μl of Trypsin
derived from beef pancreas and PBS (-) solution (9.11).
10.4.2.9 Put the flask in the CO incubator (7.24) at a temperature of 34 °C for 1 to 3 days to multiply the
influenza virus.
10.4.2.10 Observe the cytopathic effect by a microscope and judge the multiplication of influenza
virus. If the multiplication of influenza virus is confirmed, then,
10.4.2.11 Put the multiplied virus suspension in the centrifugal tube (7.22).
10.4.2.12 Centrifuge the multiplied virus suspension of 10.4.2.11 by using a centrifuge at a
temperature of 4 °C and 1 000 g for 15 min.
10.4.2.13 Take the supernatant suspension from the centrifugal tube after the centrifugation. This is
to be the influenza virus suspension. Divide the suspension into test tubes appropriately and cryopreseave
at −80 °C in the freezer (7.11).
10.4.2.14 Check the concentration of the virus if it is more than 10 PFU or TCID /ml by plaque
titre assay or TCID method. If the concentration is less than 10 PFU or TCID /ml, prepare it from
50 50
beginning.
10.4.2.15 Just before use, put the cryopreserved virus suspension of 10.4.2.14 in the water bath
(7.9) at a temperature of 37 °C and keep it for rapid defrosting.
10.4.2.16 This is to be the virus suspension for the test. If not use immediately, preserve in the
refrigerator at a temperature of 4 °C.
10.4.3 Feline calicivirus
10.4.3.1 Put the cryopreserved base virus in the water bath (7.9) at a temperature of 37 °C and keep it
for rapid defrosting.
10.4.3.2 Drain the growth medium from the flask of 10.2.9 with the cultured cells in the monolayer.
10.4.3.3 Add 5 ml of the maintenance medium (9.8) in the flask of 10.4.3.2. Wash the surface of the
cultured cells and drain the maintenance medium. Repeat the washing procedure 2 times.
10.4.3.4 Prepare a new test tube.
10.4.3.5 Put the defrosted base viruses in the test tube of 10.4.3.4, dilute by the maintenance medium
5 6
(9.8) and adjust the concentration of virus to 10 PFU to 10 PFU or TCID /ml.
10.4.3.6 Inoculate 1 ml of the adjusted base viruses of 10.4.3.5 on the surface of the cultured cells in the
flask of 10.4.3.2 and spread to the whole surface.
10.4.3.7 Put the flask of 10.4.3.6 in the CO incubator (7.24) at a temperature of 37 °C and keep it for 1 h
to absorb the virus into the cells.
10.4.3.8 Add 20 ml of the maintenance medium (9.8) in the flask of 10.4.3.7.
10.4.3.9 Put the flask of 10.4.3.8 in the CO incubator (7.24) at a temperature of 37 °C and keep it for 1
to 3 days to multiply the viruses.
10.4.3.10 Observe the cytopathic effect by a microscope and judge the multiplication of the feline
calicivirus. If the multiplication of the virus is confirmed.
10.4.3.11 Put the multiplied virus suspension in the centrifugal tube.
10.4.3.12 Centrifuge the multiplied virus suspension of 10.4.3.11 by using the centrifuge (7.18) at a
temperature of 4 °C and 1 000 g for 15 min.
10.4.3.13 Take the supernatant fluid from the centrifugal tube after the centrifugation. This is to be
the virus suspension. Divide the suspension into test tubes appropriately and cryopreserve at −80 °C in
the freezer (7.11).
10.4.3.14 Check the concentration of the virus if it is more than 10 PFU or TCID /ml for Feline
calicivirus by the plaque assay or TCID method.
If the concentration is less than 10 PFU or TCID /ml, prepare it from beginning.
10.4.3.15 Just before use, put the cryopreserved virus suspension of 10.4.3.14 in the water bath
(7.9) at a temperature of 37 °C and keep it for rapid defrosting. This is to be a virus suspension for the test.
If not use immediately, preserve in the refrigerator at a temperature of 4 °C.
10.4.4 Infectivity titre of the test viruses
The infectivity titre of the test virus shall be determined by the following procedure:
10.4.4.1 Preparation for series of the dilution for the virus suspension
10.4.4.1.1 Put 1,8 ml of the maintenance medium (9.8) in a new test tubes, keep it in the water bath with
ice.
10.4.4.1.2 Add 0,2 ml of the virus suspension for the test of 10.4.2.16 and 10.4.3.15 in the test tubes of
10.4.4.1.1, and shake the test tubes well by Vortex mixture (7.8).
−1 6
NOTE The dilution of 1/10 (10 ) is prepared. The concentration of the virus suspension is 2 × 10 x
−1 5
10 = 2 × 10 PFU / ml or TCID /ml.
10.4.4.1.3 Put 1,8 ml of the maintenance medium (9.8) in new test tubes, keep in the water bath with ice.
10.4.4.1.4 Add 0,2 ml of the suspension of 10.4.4.1.2 to the test tubes of 10.4.4.1.3 and shake them well.
−2 5
NOTE The dilution of 1/100 (10 ) is prepared. The concentration of the virus suspension is 2 × 10 x
−1 4
10 = 2 × 10 PFU / ml or TCID / ml.
10.4.4.1.5 Repeat this procedure to prepare the series of the dilution for the virus suspension.
NOTE 1 In case of TCID method, the series of the dilution for the virus suspension is required to prepare for
the observation from the infectious wells for all of 8 wells to 0 wells.
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NOTE 2 In case of the infective virus titre of 10 TCID /ml for the test, the virus suspension of 0,2 ml is diluted
by the wash-out virus suspension of 10 ml. Then the base wash-out virus suspension becomes 2 × 10 TCID /ml.
−7
So, in case of TCID /ml, the series of the dilution for the virus suspension may be required to prepare by 10 .
10.4.4.1 Infectivity titre measurement
10.4.4.1.1 Plaque assay
Determine the infectivity titre according to Annex B.
10.4.4.1.2 TCID method
Determine TCID according to Annex C.
10.5 Preparation for test specimen
10.5.1 Control fabric
The cotton 100 % woven fabric specified by ISO 105-F02 or the untreated test sample fabric is available.
Before testing, wash the reference fabric 10 times, for 10 min. at 60 °C without detergent, fluorescent
bleaching agent or any other chemicals.
10.5.2 Preparation of test specimens
10.5.2.1 Obtain test specimens with mass of 0,40 g ± 0,05 g and cut pieces with approximately 20 mm by
20 mm a piece and make up the mass with the several pieces. In case of yarns, prepare the yarns in bundle
and then cut approximately 20 mm with the same mass of 0,40 g ± 0,05 g
10.5.2.2 Obtain 9 specimens for the reference cloth and 6 specimens for the antiviral test sample.
NOTE 3 reference fabric specimens and 3 antiviral test specimens are used for the control test of the effect
of test specimen without virus. 3 reference specimens of the reference cloth are used for the infectivity titre
measurement immediately after inoculation of virus. The remained 3 reference specimens and 3 antiviral
specimens are used for the main test of this standard.
10.5.3 Sterilization of specimens
10.5.3.1 Put specimens in the vial containers one by one and put all vial containers in a metal wire basket
and cover them by aluminium foil. Put caps of vial containers in the basket with wrapping of aluminium
foil separately from containers.
10.5.3.2 Put the basket of 10.5.3.1 in the autoclave (7.1) at 121 °C and 103 kPa to sterilize for 15 min.
10.5.3.3 After sterilization, remove the foil and take out all vial containers with the specimens and put
them in a safety cabinet (7.16) and keep for 60 min for cooling down, then after checking of no dew
condensation in the vial containers, put the caps on all vial containers and close them.
NOTE If the high-pressure steam sterilization cannot be recommended because of the property of the
antiviral agents or the characteristic of textile products, the other appropriate sterilization method could be
chosen.
10.6 Control test
10.6.1 General
The purpose of the control test is to confirm the efficiency for suppression of agent activity of test
specimen. Th
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 18184
Première édition
2014-09-01
Textiles — Détermination de l’activité
virucide de produits textiles
Textiles — Determination of antiviral activity of textile products
Numéro de référence
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ISO 2014
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Tel. + 41 22 749 01 11
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E-mail [e-mail]
Web www.iso.org
Publié en Suisse
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Virus et cellule hôte . 3
6 Avertissement . 3
7 Appareillage . 3
8 Stérilisation de l’appareillage . 6
9 Réactif et milieu de culture . 6
10 Préparation .11
10.1 Restauration de la cellule hôte cryoconservée .11
10.2 Sous-culture de cellules hôtes .11
10.3 Culture cellulaire pour détermination du titre infectieux d’une suspension virale .12
10.4 Préparation du virus à soumettre à essai .12
10.5 Préparation des éprouvettes .15
10.6 Essais témoin .16
11 Mode opératoire d’essai.17
11.1 Préparation des éprouvettes .17
11.2 Inoculation du virus dans les éprouvettes .17
11.3 Durée de contact .17
11.4 Élimination du virus immédiatement après inoculation .17
11.5 Élimination du virus après la durée de contact .17
12 Préparation pour dilutions en série de la suspension virale .17
13 Mesurage du titre infectieux .18
13.1 Méthode des plages de lyse .18
13.2 Méthode TCID .
50 18
14 Calcul du titre infectieux .18
14.1 Méthode des plages de lyse .18
14.2 Méthode TCID .
50 19
14.3 Résultat de l’essai .20
15 Rapport d’essai .21
Annexe A (normative) Souches virales et cellules hôtes .22
Annexe B (normative) Détermination du titre infectieux: méthode des plages de lyse .23
Annexe C (normative) Détermination du titre infectieux: méthode TCID .26
Annexe D (normative) Composition des milieux .27
Annexe E (informative) Autre virus: virus de la poliomyélite .30
Annexe F (informative) Méthode d’essai utilisant des œufs de poule fécondés SPF .31
Annexe G (informative) Efficacité virucide .36
Annexe H (informative) Résultats des essais interlaboratoires (1) .37
Annexe I (informative) Résultats des essais interlaboratoires (2) .39
Bibliographie .42
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/CEI, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration
du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par
l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de
la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de l’OMC concernant
les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos — Informations
supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 38, Textiles.
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Introduction
Au cours de ces dernières années, le niveau de vie de la population mondiale a connu une nette amélioration
et les consommateurs tendent aujourd’hui à rechercher des produits de soin ou de protection de la
santé. Cette tendance s’accompagne d’un regain d’intérêt de la population pour la protection contre
des maladies épidémiques, tel que les banlieusards qui empruntent quotidiennement des moyens de
transport bondés, les hôpitaux, les maisons médicalisées, etc.
Grâce à la récente accélération du développement de techniques ultra performantes pour le traitement
des produits textiles, les produits d’hygiène et de protection de la santé occupent une place de plus en
plus importante sur le marché.
Ces produits relativement nouveaux ont bénéficié des avancées techniques réalisées dans le domaine
des technologies textiles et les fabricants ont individuellement développé des méthodes d’essai afin
d’évaluer les performances des produits. Cependant, aucune méthode d’essai unifiée n’a été élaborée et
les consommateurs et les fabricants ne disposent à ce jour d’aucune information claire sur ces produits
hautement fonctionnels.
Les produits à propriétés virucides figurent parmi ces produits et intègrent les domaines techniques des
technologies textiles et des biotechnologies.
Dans ce contexte, la nécessité d’élaborer une Norme internationale s’impose aux consommateurs,
distributeurs, fabricants ou autres intervenants, ainsi qu’aux différents acteurs du marché.
Les produits textiles à propriétés virucides sont des textiles capables de réduire le nombre de virus
infectieux entrant en contact avec leur surface. La présente norme établit une méthode d’essai
quantitative permettant d’évaluer les performances virucides de ces produits.
Les données objectives obtenues grâce à la présente norme permettent à tous les acteurs (consommateurs,
fabricants, distributeurs, etc.) de déterminer de manière correcte la performance des produits textiles
antiviraux.
Deux méthodes permettent de quantifier le nombre de virus infectieux (titre infectieux dans la présente
norme): la méthode directe des plages de lyse et la méthode TCID . La méthode utilisée peut être choisie
en fonction de l’expertise et des capacités techniques de chaque centre d’essai. Tout système cellulaire
approprié peut être utilisé et les conditions d’essai en cas d’utilisation doivent être consignées.
NORME INTERNATIONALE ISO 18184:2014(F)
Textiles — Détermination de l’activité virucide de produits
textiles
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie des méthodes d’essai permettant d’évaluer l’activité virucide
des produits textiles. Les produits textiles incluent les tissus, les tricots, les fibres, les fils, les tresses,
etc.
Les virus utilisés dans la présente Norme internationale sont:
— l’un des virus enveloppés, un virus de la grippe, qui est un virus infectieux chez l’homme qui
provoque une infection des voies respiratoires;
— l’un des virus non enveloppés, un calicivirus félin, qui est l’un des substituts de norovirus qui sont
importants pathogènes entériques.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 105-F02, Textiles — Essais de solidité des teintures — Partie F02: Spécifications pour les tissus témoins
en coton et en viscose
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai
ISO 6330, Textiles — Méthodes de lavage et de séchage domestiques en vue des essais des textiles
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
virus
micro-organisme acellulaire dont le matériel génétique est contenu dans une enveloppe protéique. Il
peut se répliquer dans des cellules hôtes spécifiques
3.2
activité virale
capacité d’un virus à se répliquer dans des cellules hôtes spécifiques
3.3
propriété virucide
propriété permettant une modification morphologique ou entraînant une altération structurelle de la
surface protéique du virus
Note 1 à l’article: Le virus endommagé perd son affinité pour le récepteur de la cellule hôte et son activité virale
est ainsi diminuée En plus d’une altération des virus enveloppés, celle de l’enveloppe existe aussi.
Note 2 à l’article: La modification de la réponse antigénique ou la modification d’un élément constitutif n’implique
pas nécessairement une réduction de la virulence d’un virus.
3.4
substances chimiques virucides
substances chimiques inorganiques ou organiques capables de réduire l’activité virale
Note 1 à l’article: Les substances chimiques virucides organiques modifient la surface protéique du virus par
adsorption chimique. Les substances virucides métalliques inorganiques détruisent ou modifient la morphologie
du virus par arrachement d’un atome d’hydrogène de la protéine virale, grâce à des radicaux OH générés par
réaction radicalaire.
3.5
étoffe de référence
étoffe utilisée pour vérifier la stabilité du virus soumis à essai sur une étoffe textile
Note 1 à l’article: Le tissu 100 % coton décrit dans l’ISO 105-F02, sans aucun traitement chimique, tel qu’un
blanchiment optique, etc., pourrait être utilisé.
Note 2 à l’article: Les étoffes avant traitement virucide peuvent servir d’étoffes de référence dans les mêmes
conditions que celles décrites au 3.5.
3.6
essai témoin d’une éprouvette
essai destiné à vérifier qu’une éprouvette n’a aucune influence sur la cellule hôte
Note 1 à l’article: Cet essai est effectué dans les mêmes conditions que l’essai réel, mais sans le virus
3.7
effet cytopathogène (ECP) du virus
effet qui se manifeste sous la forme d’une altération morphologique ou d’une destruction des cellules
hôtes provoquée par la multiplication des virus
3.8
titre infectieux du virus
nombre de particules virales infectieuses présentes par unité de volume dans un lysat cellulaire ou dans
une solution
3.9
plage de lyse
zone formée dans une monocouche cellulaire en milieu semi-solide à la suite d’un processus de lyse
induit par l’infection et la multiplication d’un seul virus
3.10
unité formatrice de plages (UFP)
unité exprimée en concentration de virus infectieux par unité de volume (ml)
3.11
méthode des plages de lyse
méthode destinée à déterminer le titre infectieux du virus à partir du nombre d’UFP en utilisant des
dilutions successives
3.12
méthode TCID
dose infectieuse à 50 % d’une suspension virale de rinçage ou d’une dilution de suspension virale qui
induit un ECP dans 50 % des cultures cellulaires
Note 1 à l’article: voir 3.7.
4 Principe
Les virus sont inoculés dans une éprouvette. Une fois le temps de contact écoulé, la quantité restante du
virus infectieux est déterminée et le taux de réduction est calculé par comparaison entre l’éprouvette
d’essai du produit virucide et l’éprouvette de référence, par logarithme décimal. Deux méthodes
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permettent de quantifier le titre infectieux d’un virus. La première est la méthode des plages de
lyse (3.11) et la seconde la méthode TCID (3.12). La méthode est choisie en fonction de l’expertise et
des capacités du centre d’essai.
5 Virus et cellule hôte
Les virus utilisés dans la présente norme sont un virus Influenza et un calicivirus félin qui sont décrits
dans l’Annexe A. Les cellules hôtes respectivement associées sont également décrites dans cette annexe.
Le choix de l’un de ces virus, ou des deux, qui seront utilisés lors de l’essai, dépend de l’utilisation finale
des produits textiles.
6 Avertissement
La présente norme nécessite l’utilisation de virus infectieux ou de substances et/ou modes opératoires
qui peuvent être préjudiciables à la santé et à l’environnement si les conditions appropriées ne sont pas
respectées. Elle se réfère uniquement à l’aptitude technique et ne dispense nullement l’utilisateur de
satisfaire, à tout moment, aux obligations légales en matière de santé, de sécurité et d’environnement.
L’avertissement est également applicable aux éléments suivants. Le virus utilisé dans le cadre de la
présente norme doit être un virus de niveau de sécurité biotechnologique de classe II, désigné comme
tel par les directives de l’OMS. L’utilisateur de la présente norme doit disposer de connaissances et d’une
expertise suffisantes en matière de biotechnologies. Par ailleurs, les utilisateurs doivent rigoureusement
se conformer à la norme de sécurité des fabricants et à la réglementation locale applicable.
7 Appareillage
7.1 Stérilisateur sous vapeur à haute pression: autoclave, réglable à une température de (121 ± 2) °C
et une pression de (103 ± 5) kPa.
7.2 Stérilisateur à chaleur sèche: étuves, réglables aux températures de (180 ± 2) °C et (160 ± 2)°C.
7.3 Fiole jaugée, d’une capacité de 1 l.
7.4 Balance, offrant une plage de mesure de 100 g ± 0,1 g à 0,01 g ± 0,0001 g.
7.5 Pipette en verre, de capacités: 50 ml ± 0,5 ml, 25 ml ± 0,25 ml, 10 ml ± 0,1 ml et 5 ml ± 0,05 ml.
7.6 Pipette en plastique, de capacités: 50 ml ± 0,5 ml, 25 ml ± 0,25 ml, 10 ml ± 0,1 ml et 5 ml ± 0,05 ml.
7.7 Pipeteur, capable de recevoir les pipettes en verre ou en plastique, ou les embouts pour pipette.
7.8 Micropipette, de volume parfaitement adapté à chaque utilisation, à extrémité en verre ou en
plastique, avec une tolérance inférieure ou égale à 0,5 %.
7.9 Bain d’eau, pour maintenir une température de (37 ± 2) °C, (50 ± 2) °C ou (56 ± 2) °C.
7.10 Mélangeur (type vortex), utilisé pour les essais microbiens.
7.11 Congélateur, réglable à une température de – (80 ± 2) °C ou – (20 ± 2) °C.
7.12 Bain d’azote liquide, pour la conservation à – 196 °C environ.
7.13 Filtre à membrane, avec un diamètre de pore de 0,22 μm.
7.14 Réfrigérateur, réglable à une température comprise entre (2 ± 2) °C et (8 ± 2) °C.
7.15 pH-mètre, équipé d’une électrode en verre.
7.16 Microscope inversé, pour l’observation des cultures cellulaires.
7.17 Pinces, stérilisables.
7.18 Centrifugeuse, réglable à une température de (4 ± 2) °C et générant une force centrifuge relative
de 1 000 g environ.
7.19 Hotte de sécurité biologique, de classe II.
7.20 Flacon, d’une capacité de 30 ml et fermé par un bouchon à vis. Le joint est en tétrafluoroéthylène
ou silicone, et le bouchon en polypropylène.
7.21 Microplaque à 96 puits pour stérilisation par rayonnement gamma, pour la méthode TCID .
Figure 1 — Microplaque à 96 puits à utiliser pour la méthode TCID
7.22 Plaque en plastique à 6 puits pour stérilisation par rayonnement gamma, pour la méthode
des plages de lyse
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Figure 2 — Plaque en plastique à 6 puits à utiliser pour la méthode des plages de lyse
7.23 Fioles, pour la culture cellulaire, stérilisées aux rayonnements gamma, traitées pour faciliter
l’adhérence cellulaire, avec une zone de culture cellulaire de 75 cm , un bouchon d’aération et un bouchon
étanche. Le bouchon d’aération peut laisser passer de l’air sans bactéries via un filtre à pores de 0,2 μm.
Figure 3 — Fiole pour culture cellulaire
7.24 Incubateur à CO , pour maintenir une atmosphère contenant 5 % de CO à une température de
2 2
(34 ± 2) °C et de (37 ± 2) °C.
7.25 Incubateur, pour maintenir une température de (25 ± 2) °C, (34 ± 2) °C ou (37 ± 2) °C.
7.26 Tube à centrifuger.
7.27 Boîte de culture cellulaire.
7.28 Tube à essai.
7.29 Bécher.
8 Stérilisation de l’appareillage
Stériliser tous les équipements entrant en contact avec les cellules, les substances chimiques ou les
éprouvettes. La stérilisation doit être effectuée à la vapeur d’eau ou par chaleur sèche.
— Stérilisation à la vapeur d’eau (7.1): par autoclave à une température de 121 °C et une pression
de 103 kPa pendant 15 min.
— Stérilisation par chaleur sèche (7.2): par stérilisateur à chaleur sèche à une température de 180 °C
pendant 30 min ou à 160 °C pendant 2 h.
9 Réactif et milieu de culture
Tous les réactifs doivent être d’une qualité adaptée aux besoins virologiques, c’est-à-dire sans substance
toxique pour les essais microbiens. Certains milieux de culture sont disponibles dans le commerce.
9.1 Eau, de qualité 3 conformément à l’ISO 3696.
9.2 Milieu minimum essentiel d’Eagle (EMEM), disponible dans le commerce. La composition de ce
milieu est décrite à l’Annexe D. Si des composants du milieu sont manquants, les ajouter conformément
au tableau présentant la composition.
9.3 Solution de bicarbonate de sodium à 7,5 %.
9.3.1 Stériliser à l’autoclave 75 g de bicarbonate de sodium dans une boîte de culture fermée par un
bouchon étanche.
9.3.2 Stériliser également de l’eau de qualité 3 par autoclave.
9.3.3 Bien dissoudre le bicarbonate de sodium dans 1 000 ml d’eau stérilisée.
9.4 Solution de formaldéhyde.
9.4.1 À utiliser pour la fixation cellulaire.
9.4.2 Préparer une solution de 100 ml de formaldéhyde à 37 %.
9.4.3 Ajouter 900 ml d’eau de qualité 3 à 9.4.2.
9.5 Solution de bleu de méthylène.
À utiliser pour la coloration cellulaire.
9.5.1 Préparer une fiole jaugée (7.3) de 1 l, puis y ajouter les substances suivantes:
— Eau de qualité 3, 1 000 ml
— Bleu de méthylène, 0,375 g
— Solution d’hydroxyde de sodium 1 N, 62,5 μl
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9.5.2 Dissoudre et bien mélanger.
9.6 Sérum bovin fœtal inactivé (SBF).
9.6.1 Plonger le sérum bovin fœtal congelé cryoconservé, encore dans son emballage, dans un bain
d’eau (7.9) maintenu à 37 °C, jusqu’à décongélation.
9.6.2 Le placer ensuite dans le bain-marie à une température de 56 °C et l’y maintenir pendant 30 min
afin de l’inactiver.
9.6.3 Placer ensuite le sérum dans plusieurs tubes. Placer les tubes dans le congélateur (7.11) à une
température inférieure à –20 °C.
9.6.4 Juste avant utilisation, placer le sérum dans un bain d’eau à 37 °C et l’y maintenir jusqu’à
décongélation.
9.7 Milieu de croissance.
Utilisé pour les cultures cellulaires.
9.7.1 Préparer une fiole jaugée (7.3) de 1 l, puis y ajouter les substances suivantes.
— Eau de qualité 3, 800 ml
— Sulfate de kanamycine, 60 mg
— Milieu minimum essentiel d’Eagle, 9,53 g, ou milieu RPMI 1640, 10,4 g
9.7.2 Dissoudre et bien mélanger, puis compléter le volume total de la solution à 1 000 ml avec de l’eau
de qualité 3.
NOTE L’acronyme RPMI signifie “Roswell Park Memorial Institute”.
9.7.3 Stériliser la solution mélangée de 9.7.2 à l’aide d’un filtre à pores de 0,22 μm (7.13).
9.7.4 Ajouter ensuite 15 ml de solution de bicarbonate de sodium à 7,5 % (9.3) et 100 ml de sérum
bovin fœtal inactivé (9.6) dans la solution de 9.7.3.
NOTE Lorsque la L-glutamine n’est pas incluse dans l’EMEM acheté dans le commerce, l’ajouter avant
utilisation conformément à la composition indiquée dans l’Annexe C.
9.8 Milieu de conservation.
Utilisé pour les cultures cellulaires.
9.8.1 Préparer une fiole jaugée (7.3) de 1 l, puis y ajouter les substances suivantes.
— Eau de qualité 3, 800 ml
— Sulfate de kanamycine, 60 mg
— Milieu minimum essentiel d’Eagle, 9,53 g, ou milieu RPMI 1640, 10,4 g
9.8.2 Bien dissoudre les différents composants, puis compléter le volume total de la solution à 1 000 ml
avec de l’eau de qualité 3.
9.8.3 Stériliser la solution mélangée de 9.8.2 en utilisant le filtre (7.13) à pores de 0,22 μm.
9.8.4 Ajouter 15 ml de la solution de bicarbonate de sodium à 7,5 % (9.3) à la solution de 9.8.3.
NOTE Lorsque la L-glutamine n’est pas incluse dans l’EMEM acheté dans le commerce, l’ajouter avant
utilisation conformément à la composition indiquée dans l’Annexe C.
9.9 Double concentration du milieu de conservation (9.8).
9.9.1 Préparer une fiole jaugée (7.3) de 1 l, puis y ajouter les substances suivantes.
— Eau de qualité 3, 800 ml
— Sulfate de kanamycine, 120 mg
— Milieu minimum essentiel d’Eagle, 19,06 g.
9.9.2 Bien dissoudre les différents composants, puis compléter le volume total de la solution à 1 000 ml
avec de l’eau de qualité 3.
9.9.3 Stériliser la solution mélangée de 9.9.2 en utilisant le filtre (7.13) à pores de 0,22 μm.
9.10 Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 0,01 mol/l.
9.10.1 Préparer une fiole jaugée (7.3) de 1 l, puis y ajouter les substances suivantes.
— Chlorure de sodium, 8 g
— Chlorure de potassium, 0,2 g
— Phosphate d’hydrogène disodique dodécahydraté, 2,9 g
— Phosphate dipotassique d’hydrogène, 0,2 g
9.10.2 Ajouter de l’eau de qualité 3, compléter le volume total à 1 000 ml et bien dissoudre.
9.10.3 Stériliser ensuite la solution de 9.10.2 à l’aide de l’autoclave (7.1) à une température de 121 °C et
une pression de 103 kPa pendant 15 min.
9.11 Trypsine pancréatique bovine et solution PBS.
9.11.1 Préparer un bécher, puis y placer les substances suivantes.
— Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 0,01 mol/l (9.10), 100 ml;
— Trypsine pancréatique bovine, 1,0 g.
9.11.2 Dissoudre et bien homogénéiser en utilisant un mélangeur pendant 2 h.
9.11.3 Stériliser ensuite la solution de 9.11.2 en utilisant le filtre (7.13) à pores de 0,22 μm.
Les tubes entre lesquels la solution a été divisée et qui ne sont pas utilisés immédiatement sont conservés
dans le congélateur à une température inférieure à −80 °C.
9.11.4 Préparer un tube à essai et y ajouter les solutions suivantes.
— Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 0,01 mol/l (9.10), 9 ml;
— Solution mélangée contenant de la trypsine pancréatique bovine et la solution PBS (9.11.3), 1 ml.
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9.11.5 Dissoudre et bien les mélanger.
9.11.6 Placer la solution dans plusieurs tubes à essai et conserver ces tubes dans le congélateur à une
température inférieure à −20 °C.
9.11.7 Juste avant utilisation, placer les tubes dans un bain d’eau (7.9) à 37 °C et les y maintenir jusqu’à
décongélation.
9.12 Solution de trypsine/EDTA.
9.12.1 Préparer une fiole jaugée (7.3) de 1 l, puis y ajouter les substances suivantes:
— Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 0,01 mol/l (9.10), 1 000 ml;
— Trypsine, 2,5 g;
— Sulfate de kanamycine, 0,1 g;
— Sulfate de streptomycine, 0,1 g;
— Amphotéricine B, 2 mg;
— EDTA, 0,014 mol.
9.12.2 Dissoudre et bien mélanger.
9.12.3 Stériliser ensuite la solution de 9.12.2 en utilisant le filtre (7.13) à pores de 0,22 μm.
9.12.4 Placer la solution dans plusieurs tubes à essai; conserver ces tubes dans le congélateur à une
température inférieure à –20 °C.
9.12.5 Juste avant utilisation, placer les tubes dans un bain d’eau (7.9) à 37 °C et les y maintenir jusqu’à
décongélation.
NOTE La solution de trypsine/EDTA est disponible dans le commerce. Les produits contenant les différents
composants de 9.12.1 peuvent être utilisés après un processus de validation adapté.
9.13 Solution de DEAE/dextrane.
9.13.1 Préparer une fiole jaugée (7.3) de 1 l, puis y ajouter les substances suivantes.
— Eau de qualité 3, 1 000 ml;
— DEAE/dextrane, 20 g.
9.13.2 Dissoudre et bien mélanger.
9.13.3 Stériliser ensuite la solution de 9.13.2 en utilisant le filtre (7.13) à pores de 0,22 μm.
9.14 Milieu gélosé.
Utilisé pour la méthode des plages de lyse. Préparer ce milieu avec les liquides A et B, conformément aux
instructions ci-après. Bien mélanger avant utilisation.
9.14.1 Liquide A.
9.14.1.1 Préparer une fiole jaugée (7.3) de 1 l, puis y ajouter les substances suivantes:
— Double concentration du milieu de conservation (9.9), 1 000 ml;
— Solution de DEAE/dextrane (9.13), 10 ml;
— Solution de bicarbonate de sodium à 7,5 % (9.3), 40 ml.
Bien mélanger.
9.14.1.2 Uniquement dans le cadre des essais utilisant le virus influenza et pour la méthode des plages
de lyse, ajouter 3,0 ml de la solution de trypsine pancréatique bovine et de PBS (-) (9.11).
9.14.1.3 Placer la solution de 9.14.1.1 ou 9.14.1.2 dans un bain d’eau (7.9) à 37 °C et l’y maintenir jusqu’à
utilisation.
9.14.2 Liquide B.
9.14.2.1 Préparer une fiole jaugée (7.3) de 1 l, puis y ajouter les substances suivantes:
— Eau de qualité 3, 1 000 ml;
— Milieu gélosé pour culture cellulaire, 15 g.
Bien mélanger.
9.14.2.2 Stériliser ensuite la solution mélangée de 9.14.2.1 en utilisant un autoclave (7.1) à une
température de 121 °C et une pression de 103 kPa pendant 15 min.
9.14.2.3 Placer ensuite la solution de 9.14.2.2 dans un bain d’eau (7.9) à une température de 50 °C et l’y
maintenir jusqu’à utilisation.
9.15 Milieu SCDLP, utilisé pour le rinçage et la suppression de l’activité de l’agent du produit textile
traité.
9.15.1 Préparer une fiole jaugée (7.3) de 1 l, puis y ajouter les substances suivantes:
— Eau de qualité 3, 1 000 ml;
— Peptone de caséine, 17,0 g;
— Peptone de soja, 3,0 g;
— Chlorure de sodium, 5,0 g;
— Phosphate dipotassique d’hydrogène, 2,5 g;
— Glucose, 2,5 g;
— Lécithine, 1,0 g.
Mélanger et bien dissoudre, puis ajouter
— Tensioactif non ionique, 7,0 g.
Dissoudre et bien mélanger.
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9.15.2 Ajuster ensuite le pH de la solution de 9.15.1 à 7,0 ± 0,2 en ajoutant la solution d’hydroxyde de
sodium ou d’acide chlorhydrique dans le bain d’eau (7.9) à 25 °C.
9.15.3 Stériliser la solution mélangée de 9.15.2 en utilisant un autoclave (7.1) à une température
de 121 °C et une pression de 103 kPa pendant 15 min.
9.16 Milieu de conservation, utilisé pour les cultures cellulaires et pour la méthode TCID .
9.16.1 Préparer une fiole jaugée (7.3) de 1 l, puis y ajouter les substances suivantes:
— Milieu de conservation (9.9), 1 000 ml;
— Trypsine pancréatique bovine et solution PBS (9.11), 1,5 ml.
Bien dissoudre.
10 Préparation
10.1 Restauration de la cellule hôte cryoconservée
La cellule hôte cryoconservée doit être décongelée et mise en culture. Le mode opératoire est le suivant:
10.1.1 Placer la cellule hôte cryoconservée dans un bain d’eau (7.9) à 37 °C et l’y maintenir pour une
décongélation rapide.
10.1.2 Préparer une nouvelle fiole pour culture cellulaire (7.23) coiffée d’un bouchon d’aération. Ajouter
20 ml de milieu de croissance (9.8) dans la fiole.
10.1.3 Placer une ampoule complète de cellules hôtes décongelées de 10.1.1 dans la fiole de 10.1.2.
10.1.4 Placer la fiole de 10.1.3 dans l’incubateur à CO (7.24) à 37 °C. L’y conserver pendant (24 ± 2) h
pour la mise en culture des cellules hôtes.
10.1.5 Examiner ensuite la fiole de 10.1.4 au microscope afin de déterminer si les cellules sont fixées au
fond de la fiole.
Si la croissance cellulaire est confirmée, passer à l’étape suivante. Si elle ne l’est pas, maintenir la fiole
dans l’incubateur.
10.1.6 Retirer le milieu de croissance restant de la fiole de 10.1.5.
10.1.7 Ajouter 20 ml de milieu de croissance frais (9.8) dans la fiole de 10.1.6.
10.1.8 Placer la fiole de 10.1.7 dans l’incubateur à CO (7.24) à 37 °C pendant (48 ± 2) h.
10.1.9 Observer ensuite la fiole de 10.1.8 au microscope et vérifier que les cellules mises en culture
confluent en nappe au fond de la fiole. Si la croissance des cellules est insuffisante, passer à l’étape 10.1.7
jusqu’à confirmation d’une croissance suffisante.
10.1.10 Effectuer ensuite une sous-culture en série en exécutant les étapes de 10.2.
10.2 Sous-culture de cellules hôtes
La croissance des cellules hôtes doit s’effectuer en sous-culture. Le mode opératoire est le suivant:
10.2.1 Retirer l’excès de milieu de croissance de la fiole 10.1.9 après confirmation de la croissance
confluente des cellules.
10.2.2 Ajouter 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 0,01 mol/l (9.11) et rincer la
surface de la culture cellulaire au fond de la fiole en utilisant cette solution.
Renouveler 3 fois le rinçage.
10.2.3 Ajouter 1 ml de solution de trypsine/EDTA (9.13) dans la fiole de 10.2.2 et répartir la solution sur
toute la surface, puis retirer le volume de solution de trypsine/EDTA en excès.
10.2.4 Placer la fiole de 10.2.3 dans l’incubateur à CO (7.24) à 37 °C pendant 10 min ± 1 min afin de la
maintenir à température.
10.2.5 Observer ensuite la fiole 10.2.4 à l’œil nu afin de déterminer si les cellules en culture se détachent.
Si le détachement est confirmé, tapoter le côté de la fiole et disperser les cellules.
10.2.6 Ajouter 5 ml du milieu de croissance (9.8) dans la fiole de 10.2.5 et pipeter le milieu pour permettre
un mélange en douceur et éviter d’endommager les cellules.
10.2.7 Préparer une nouvelle fiole pour culture cellulaire (7.23) coiffée d’un bouchon étanche et ajouter
20 ml de milieu de croissance (9.8).
10.2.8 À l’aide d’une pipette, ajouter 1 ml de suspension cellulaire 10.2.6 au milieu 10.2.7.
10.2.9 Fermer le bouchon de la fiole de 10.2.8 et placer cette dernière dans l’incubateur à CO (7.24) à
une température de 37 °C pour 5 jours de mise en culture.
10.3 Culture cellulaire pour détermination du titre infectieux d’une suspension virale
Réaliser la culture cellulaire dans une plaque à 6 puits pour la méthode des plages de lyse ou dans une
microplaque à 96 puits pour la méthode TCID
10.3.1 Placer 20 ml de milieu de croissance (9.8) dans la boîte de culture (7.27) et ajouter 1 ml de la
suspension cellulaire en sous-culture de 10.2.6.
10.3.2 Pour la méthode des plages de lyse, placer 3 ml de la suspension cellulaire de 10.3.1 dans chaque
puits de la plaque en plastique à 6 puits (7.22).
10.3.3 Pour la méthode TCID , placer 0,1 ml de la suspension cellulaire de 10.3.1 dans chaque puits de
la microplaque à 96 puits (7.21).
10.3.4 Placer la plaque de 10.3.2 et la microplaque de 10.3.3 dans l’incubateur à CO (7.24) à une
température de 37 °C. Les laisser dans l’incubateur pendant 3 à 5 jours pour la mise en culture.
10.3.5 Vérifier au microscope inversé la multiplication et la confluence des cellules.
10.4 Préparation du virus à soumettre à essai
10.4.1 Généralités
Les virus étant cryoconservés dans le congélateur, il faut donc les décongeler et les mettre en culture
pour l’essai.
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10.4.2 Virus Influenza
10.4.2.1 Placer la base virale cryoconservée dans un bain d’eau (7.9) à 37 °C et l’y conserver pour une
décongélation rapide.
10.4.2.2 Retirer le milieu de croissance de la fiole de 10.2.9 contenant la monocouche de cellules en
culture.
10.4.2.3 Ajouter 5 ml du milieu de conservation (9.8) dans la fiole de 10.4.2.2. Rincer la surface des
cellules en culture et retirer le milieu de conservation. Renouveler 2 fois le rinçage.
10.4.2.4 Préparer un nouveau tube à essai.
10.4.2.5 Placer le virus Influenza décongelé dans le tube à essai de 10.4.2.4, diluer en utilisant le milieu
3 4
de conservation (9.8) et ajuster la concentration du virus de 10 à 10 UFP ou TCID /ml.
10.4.2.6 Inoculer 1 ml du virus Influenza ajusté de 10.4.2.5 à la surface cellulaire dans la fiole de 10.4.2.3
et étaler sur toute la surface.
10.4.2.7 Placer la fiole de 10.4.2.6 dans l’incubateur à CO (7.24) à une température de 34 °C. Conserver
la fiole dans l’incubateur pendant 1 h pour permettre l’absorption du virus dans les cellules.
10.4.2.8 Placer 20 ml du milieu de conservation (9.8) dans la fiole (10.4.2.7) et ajouter 30 μl de trypsine
pancréatique bovine et de solution PBS (9.11).
10.4.2.9 Placer la fiole dans l’incubateur à CO (7.24) à une température de 34 °C pendant 2 à 3 jours,
pour permettre la multiplication du virus Influenza.
10.4.2.10 Observer l’effet cytopathique au microscope et évaluer la multiplication du virus Influenza.
10.4.2.11 Si la multiplication du virus Influenza est confirmée, placer la suspension virale dans un
tube à centrifuger (7.22).
10.4.2.12 Centrifuger la suspension virale de 10.4.2.11 en utilisant la centrifugeuse à une température
de 4 °C, à raison de 1 000 g pendant 15 min.
10.4.2.13 Après centrifugation, ôter le surnageant du tube à centrifuger. Il s’agit de la suspension du
virus Influenza. Diviser la suspension entre différents tubes à essai de manière adéquate. Cryoconserver
les tubes à −80 °C dans le congélateur (7.11).
10.4.2.14 Vérifier que la concentration du virus est supérieure à 10 UFP ou TCID /ml par
la méthode des plages de lyse ou la méthode TCID . Si la concentration est inférieure à 10 UFP ou
TCID /ml, re-préparer la suspension depuis le début.
10.4.2.15 Juste avant utilisation, placer la suspension virale cryoconservée de 10.4.2.14 dans un
bain d’eau (7.9) à une température de 37 °C et l’y maintenir pour une décongélation rapide.
10.4.2.16 Ce mélange constituera la suspension virale de l’essai. Si les tubes ne sont pas utilisés
immédiatement, les conserver dans le réfrigérateur à une température de 4 °C.
10.4.3 Calicivirus félin
10.4.3.1 Placer la base virale cryoconservée dans un bain d’eau (7.9) à 37 °C et l’y conserver pour une
décongélation rapide.
10.4.3.2 Retirer le milieu de croissance de la fiole de 10.2.9 contenant la monocouche de cellules en
culture.
10.4.3.3 Ajouter 5 ml de milieu d’entretien (9.8) dans la fiole 10.4.3.2. Rincer la surface des cellules en
culture et drainer le milieu d’entretien. Répétez la procédure de rinçage 2 fois.
10.4.3.4 Préparer un nouveau tube à essai.
10.4.3.5 Placer la base virale décongelée dans le tube à essai de 10.4.3.4, diluer en utilisant le milieu de
5 6
conservation (9.8) et ajuster la concentration des virus de 10 à 10 UFP ou TCID /ml.
10.4.3.6 Inoculer 1 ml des virus de la base ajustée de 10.4.3.5 à la surface des cellules en culture dans la
fiole de 10.4.3.2 et étaler sur toute la surface.
10.4.3.7 Placer la fiole de 10.4.3.6 dans l’incubateur à CO (7.24) à une température de 37 °C. Conserver
la fiole dans l’incubateur pendant 1 h pour permettre l’absorption du virus dans les cellules.
10.4.3.8 Ajouter 20 ml du milieu de conservation (9.8) dans la fiole de 10.4.3.7.
10.4.3.9 Placer ensuite la fiole de 10.4.3.8 dans l’incubateur à CO (7.24) à une température de 37 °C et
l’y conserver pendant 1 à 3 jours pour permettre la multiplication des virus.
10.4.3.10 Observer l’effet cytopathique au microscope et évaluer la multiplication du calicivirus
félin. Si la multiplication du virus est confirmée,
10.4.3.11 Placer la suspension virale dans le tube à centrifuger.
10.4.3.12 Centrifuger la suspension virale de 10.4.3.11 en utilisant la centrifugeuse (7.18) à une
température de 4 °C, à raison de 1 000 g pendant 15 min.
10.4.3.13 Après centrifugation, récupérer le surnageant du tube à centrifuger. Il s’agit de la suspension
du virus. Diviser la suspension entre différents tubes à essai de manière adéquate. Cryoconserver les
tubes à −80 °C dans le congélateur (7.11).
10.4.3.14 Vérifier que la concentration du virus est supérieure à 10 UFP ou TCID /ml de calicivirus
félin par la méthode des plages de lyse ou la méthode TCID .
Si la concentration est inférieure à 10 UFP ou TCID /ml, re-préparer la suspension depuis le début.
10.4.3.15 Juste avant utilisation, placer la suspension virale cryoconservée de 10.4.3.14 dans un
bain d’eau (7.9) à une température de 37 °C et l’y maintenir pour une décongélation rapide.
Il s’agit de la suspension virale de l’essai. Si les tubes ne sont pas utilisés immédiatement, les conserver
dans le réfrigérateur à une température de 4 °C.
10.4.4 Titre infectieux des virus soumis à essai
Le titre infectieux des virus soumis à essai doit être déterminé par le mode opératoire suivant.
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10.4.4.1 Préparation pour dilutions en série de la suspension virale
10.4.4.1.1 Placer 1,8 ml du milieu de conservation (9.8) dans de nouveaux tubes à essai. Les conserver
dans un bain d’eau avec de la glace.
10.4.4.1.2 Dans les tubes à essai de 10.4.4.1.1, ajouter 0,2 ml de la suspension virale utilisée pour les
essais de 10.4.2.16 et 10.4.3.15. Bien agiter les tubes à l’aide d’un mélangeur type-vortex (7.8).
−1 6
NOTE La dilution à 1/10 (10 ) est préparée. La concentration de la suspension virale est: 2 × 10 x
−1 5
10 = 2 × 10 PFU / ml ou TCID /ml.
10.4.4.1.3 Placer 1,8 ml du milieu de conservation (9.8
...