ISO 9439:1999

Water quality — Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium — Carbon dioxide evolution test

Qualité de l'eau — Évaluation de la biodégradabilité aérobie ultime en milieu aqueux des composés organiques — Essai de dégagement de dioxyde de carbone

La présente Norme internationale prescrit une méthode pour l'évaluation, par dosage du dioxyde de carbone (CO2) en milieu aqueux, de la biodégradabilité aérobie ultime des composés organiques présents à une concentration donnée sous l'action de micro-organismes aérobies.La méthode de la présente Norme internationale s'applique à des composés organiquesa) solubles dans l'eau dans les conditions de l'essai, auquel cas l'élimination du COD peut être déterminée à titre d'information complémentaire (voir l'annexe D);b) peu solubles dans l'eau dans les conditions de l'essai, auquel cas il peut être nécessaire de prendre des mesures particulières afin d'assurer une bonne dispersion du composé (voir par exemple l'ISO 10634);c) non volatils ou ayant une pression de vapeur négligeable dans les conditions de l'essai - NOTE: En ce qui concerne les substances volatiles, utiliser par exemple l'ISO 9408 ou l'ISO 14593.d) n'ayant pas d'effet inhibiteur sur les micro-organismes soumis à l'essai, à la concentration choisie pour l'essai -NOTE: L'existence d'un effet inhibiteur peut être mis en évidence suivant la méthode prescrite en 8.3, ou par toute autre méthode de détermination de l'effet inhibiteur d'une substance sur des bactéries (voir par exemple l'ISO 8192).

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 03-Mar-1999
• ICS: 13.060.70 - Examination of biological properties of water
• Technical Committee: ISO/TC 147/SC 5 - Biological methods
• Drafting Committee: ISO/TC 147/SC 5 - Biological methods
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Start Date: 09-Mar-2026
• Completion Date: 14-Mar-2026

Relations

• Revises: ISO 9439:1990 - Water quality — Evaluation in an aqueous medium of the "ultimate" aerobic biodegradability of organic compounds — Method by analysis of released carbon dioxide
• Effective Date: 15-Apr-2008
• Revises: ISO 9439:1990/Cor 1:1992 - Water quality — Evaluation in an aqueous medium of the "ultimate" aerobic biodegradability of organic compounds — Method by analysis of released carbon dioxide — Technical Corrigendum 1
• Effective Date: 15-Apr-2008

Overview - ISO 9439:1999 (Carbon dioxide evolution test)

ISO 9439:1999 specifies a laboratory method to evaluate the ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous media by measuring microbially produced carbon dioxide (CO2). The standard is intended for compounds that are water‑soluble (or can be dispersed), non‑volatile (or negligible vapor pressure) and not inhibitory to test microorganisms. The test measures CO2 evolved over an incubation period (typically up to 28 days) and expresses biodegradation as a percentage of the theoretical CO2 (ThCO2) yield.

Key topics and technical requirements

• Test principle: static aqueous system containing inorganic medium, test compound as sole carbon source (10–40 mg/L organic carbon), and a mixed environmental inoculum; aeration with CO2‑free air and trapping/analysis of evolved CO2.
• Inoculum: activated sludge or environmental samples (wastewater, surface water); preconditioning or pre‑exposure options are described. Inoculum quantity and quality must ensure sufficient biodegradative activity and meet validity criteria.
• Environmental conditions: incubation in the dark or diffused light at 20–25 °C (±2 °C). Agitation and controlled aeration are required.
• Apparatus and analysis: test vessels with CO2‑impermeable tubing, CO2‑free air supply (example flowrates provided), external CO2 traps and analytical methods (CO2 or DIC analyzers or titrimetric determination after absorption). DOC measurement is optional (Annex D).
• Quality and validity: use of reference compounds (e.g., aniline, sodium benzoate), inhibition checks, calculation against ThCO2, and reporting requirements are defined. Safety warning: activated sludge may contain pathogens-handle with appropriate precautions.

Practical applications and users

ISO 9439 is used to:

• Determine ultimate biodegradability for regulatory dossiers, environmental risk assessments and product stewardship.
• Support chemical manufacturers, environmental testing laboratories and consultants in characterizing persistence of organic substances in aquatic environments.
• Compare biodegradation performance of novel compounds, intermediates or formulations under aerobic conditions. Primary users include environmental laboratories, wastewater treatment operators, regulatory bodies, ecotoxicologists and R&D teams in chemical and pharmaceutical industries.

Related standards

• ISO 14593, ISO 15462 - alternative CO2‑based or biodegradation methods
• ISO 10634 - guidance for poorly water‑soluble compounds
• ISO 9408 - methods for volatile substances
• ISO 8192, ISO 9887, ISO 9888, ISO 11923 - related biodegradation, inhibition and analytical procedures

Keywords: ISO 9439:1999, carbon dioxide evolution test, aerobic biodegradability, water quality, DOC, ThCO2, activated sludge, CO2 measurement.

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 9439
Second edition
1999-03-01
Water quality — Evaluation of ultimate
aerobic biodegradability of organic
compounds in aqueous medium — Carbon
dioxide evolution test
Qualité de l'eau — Évaluation de la biodégradabilité aérobie ultime en
milieu aqueux des composés organiques — Essai de dégagement de
dioxyde de carbone
A
Reference number
Contents
1 Scope .1
2 Definitions .1
3 Principle.3
4 Test environment.3
5 Reagents.3
6 Apparatus .4
7 Procedure .5
8 Calculation.7
9 Validity of results.8
10 Test report .9
Annex A (informative) Principle of a test system for measuring carbon dioxide (example) .10
Annex B (informative) Examples of the determination of released carbon dioxide.11
Annex C (informative) Example of a biodegradation curve .13
Annex D (informative) Combined determination of carbon dioxide and DOC .14
Bibliography.17
©  ISO 1999
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means, electronic
or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
Case postale 56 • CH-1211 Genève 20 • Switzerland
Internet [e-mail]
Printed in Switzerland
ii
© ISO
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
International Standard ISO 9439 has been prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality,
Subcommittee SC 5, Biological methods.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 9439:1990), which has been technically revised.
Annexes A to D of this International Standard are for information only.
iii
© ISO
Introduction
The conditions described in this International Standard do not always correspond to the optimal conditions for
allowing the maximum degree of biodegradation to occur. With this test system, the microbially derived carbon
dioxide (CO ) is measured in the traps through which gas exhausted from the test vessels is passed. Some of the
CO remains in the medium in the vessels as dissolved inorganic carbon (DIC), the concentration of which may
increase as biodegradation proceeds. As the organic carbon approaches complete removal, the concentration of
DIC gradually falls and tends to reach zero by the end of incubation. It is thus necessary to acidify the medium at
the end of the test to measure the biogenically formed CO completely. The measurement of CO in the external
2 2
traps may differ from the true production of CO and the kinetic rate may also be lower than a rate based on DOC
removal measurement. The consequence may be that the biodegradation curves based on the trapped CO may
not fully represent the true microbial kinetic rate. For alternative biodegradation methods, see ISO 15462 and in
particular ISO 14593, which is based on CO production as well but does not have this defect.
iv
INTERNATIONAL STANDARD  © ISO ISO 9439:1999(E)
Water quality — Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of
organic compounds in aqueous medium — Carbon dioxide
evolution test
WARNING — Activated sludge and sewage may contain potentially pathogenic organisms. Appropriate
precautions should be taken when handling them. Toxic test compounds and those whose properties are
unknown should be handled with care.
1 Scope
This International Standard specifies a method, by determination of carbon dioxide (CO ), for the evaluation in an
aqueous medium of the ultimate biodegradability of organic compounds at a given concentration by aerobic
microorganisms.
The method applies to organic compounds which are:
a) water-soluble under the conditions of the test, in which case removal of DOC may be determined as additional
information (see annex D);
b) poorly water-soluble under the conditions of the test, in which case special measures may be necessary to
achieve good dispersion of the compound (see, for example, ISO 10634);
c) non-volatile or which have a negligible vapour pressure under the conditions of the test;
NOTE For volatile substances use for example ISO 9408 or ISO 14593.
d) not inhibitory to the test microorganisms at the concentration chosen for the test.
NOTE The presence of inhibitory effects can be determined as specified in 8.3, or by using any other method for
determining the inhibitory effect of a compound on bacteria (see, for example, ISO 8192).
2 Terms and definitions
For the purposes of this International Standard, the following terms and definitions apply.
2.1
ultimate aerobic biodegradation
breakdown of a chemical compound or organic matter by microorganisms in the presence of oxygen to carbon
dioxide, water and mineral salts of any other elements present (mineralization) and the production of new biomass
2.2
primary biodegradation
structural change (transformation) of a chemical compound by microorganisms resulting in the loss of a specific
property
2.3
activated sludge
biomass produced in the aerobic treatment of wastewater by the growth of bacteria and other microorganisms in the
presence of dissolved oxygen
© ISO
2.4
concentration of suspended solids
 amount of solids obtained by filtration or centrifugation of a known volume of activated sludge
o
and drying at about 105 C to constant mass
2.5
dissolved organic carbon
DOC
that part of the organic carbon in a water sample which cannot be removed by specified phase separation
-2
NOTE For example, by centrifugation at 40 000 m { s for 15 min or by membrane filtration using membranes with pores
of diameter 0,2 μm to 0,45 μm.
2.6
total inorganic carbon
TIC
all that inorganic carbon in the water deriving from carbon dioxide and carbonate
2.7
dissolved inorganic carbon
DIC
that part of the inorganic carbon in water which cannot be removed by specified phase separation
-2
NOTE For example, by centrifugation at 40 000 m { s for 15 min or by membrane filtration using membranes with pores
of diameter 0,2 μm to 0,45 μm.
2.8
theoretical amount of formed carbon dioxide
ThCO
theoretical maximum amount of carbon dioxide formed after oxidizing a chemical compound completely
NOTE It is calculated from the molecular formula and expressed in this case as milligrams carbon dioxide per milligram (or
gram) test compound.
2.9
lag phase
time from the start of a test until adaptation and/or selection of the degrading microorganisms are achieved and the
biodegradation degree of a chemical compound or organic matter has increased to about 10 % of the maximum
level of biodegradation
NOTE It is normally recorded in days.
2.10
maximum level of biodegradation
maximum biodegradation degree of a chemical compound or organic matter in a test, above which no further
biodegradation takes place during the test
NOTE It is normally recorded in percent.
2.11
biodegradation phase
time from the end of the lag phase of a test until about 90 % of the maximum level of biodegradation has been
reached
NOTE It is normally recorded in days.
2.12
plateau phase
time from the end of the biodegradation phase until the end of the test
NOTE It is normally recorded in days.
© ISO
2.13
pre-exposure
pre-incubation of an inoculum in the presence of the test chemical compound or organic matter, with the aim of
enhancing the ability of this inoculum to biodegrade the test material by adaptation and/or selection of the
microorganisms
2.14
preconditioning
pre-incubation of an inoculum under the conditions of the subsequent test in the absence of the test chemical
compound or organic matter, with the aim of improving the performance of the test by acclimatization of the
microorganisms to the test conditions
3 Principle
The biodegradability of organic compounds by aerobic microorganisms is determined using a static aqueous test
system. The test mixture contains an inorganic medium, the organic compound as the nominal sole source of
carbon and energy at a concentration of 10 mg/l to 40 mg/l organic carbon and a mixed inoculum obtained from a
wastewater treatment plant or from another source in the environment. The mixture is agitated in test vessels and
aerated with CO -free air normally up to 28 d (for example see annex A). The CO formed during the microbial
2 2
degradation is trapped in external vessels, determined by an appropriate analytical method (for examples see
annex B), compared with the theoretical amount (ThCO ) and expressed as a percentage.
For sufficiently water-soluble compounds, removal of DOC may optionally be measured to obtain additional
information on the ultimate biodegradability. This can be done in the method given, but a convenient procedure is
described in annex D which allows the use of higher concentrations of the test compound and the inoculum, thus
improving the biodegradation potential of the test. If a substance-specific analytical method is available, information
on the primary degradability may also be obtained.
4 Test environment
o o
Incubation shall take place in the dark or in diffused light, at a temperature within the range 20 C to 25 C which
o
shall not vary by more than ± 2 C during the test.
5 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade.
5.1  Water, distilled or deionized, containing less than 1 mg/l DOC.
5.2  Test medium.
5.2.1  Composition
a) Solution a)
Dissolve
anhydrous potassium dihydrogenphosphate (KH PO ) 8,5 g
2 4
anhydrous dipotassium hydrogenphosphate (K HPO ) 21,75 g
2 4
disodium hydrogenphosphate dihydrate (Na HPO ·2H O) 33,4 g
2 4 2
ammonium chloride (NH Cl) 0,5 g
in water (5.1), quantity necessary to make up to 1 000 ml
© ISO
In order to check this buffer solution it is recommended to measure the pH, which should be about 7,4. If this is
not the case, prepare a new solution.
b) Solution b)
Dissolve 22,5 g magnesium sulfate heptahydrate (MgSO ·7H O) in water (5.1), quantity necessary to make up
4 2
to 1 000 ml.
c) Solution c)
Dissolve 36,4 g calcium chloride dihydrate (CaCl ·2H O) in water (5.1), quantity necessary to make up to
2 2
1 000 ml.
d) Solution d)
Dissolve 0,25 g iron(III) chloride hexahydrate (FeCl ·6H O) in water (5.1), quantity necessary to make up to
3 2
1 000 ml. To avoid precipitation, prepare this solution freshly before use or add a drop of concentrated
hydrochloric acid (HCl).
5.2.2  Preparation of the test medium
For 1 000 ml of test medium add to about 800 ml of water (5.1):
 10 ml of solution a);
 1 ml of each of the solutions b) to d).
Make up to 1 000 ml with water (6.1).
6 Apparatus
Ensure that all glassware is thoroughly cleaned and free from both organic and toxic matter.
6.1  Test vessels. Glass vessels (e.g. Erlenmeyer vessels or bottles) allowing gas purging and shaking or stirring,
including tubing impermeable to CO . Located in a constant-temperature room or in a thermostatically controlled
environment (e.g. water bath).
6.2  CO -free air production system, capable of supplying each test vessel at a flowrate between about
50 ml/min and 100 ml/min for 3 l of medium, held constant (see example of assembly with the test vessels in
annex A).
6.3  Analytical equipment for determining CO .
Any suitable apparatus or technique with sufficient accuracy, e.g. CO - or DIC analyzer or device for titrimetric
determination after complete absorption in an alkaline solution (see examples in annex B).
6.4  Analytical equipment for measuring dissolved organic carbon (DOC) (optional).
6.5  Centrifuge or device for filtration, with membrane filters (nominal aperture diameter of 0,2 μm to 0,45 μm
pore size) which adsorb or release organic carbon to a minimum degree.
6.6  pH meter.
© ISO
7 Procedure
7.1 Preparation of the test solutions
7.1.1 Test compound
Prepare a stock solution of a sufficiently water-soluble test compound in water (5.1) or the test medium (5.2) and
add a suitable amount of this to obtain an organic carbon concentration in the final test medium of between 10 mg/l
and 40 mg/l. Depending on the properties of the test compound (e.g. toxicity) and the purpose of the test, other
concentrations may be used. Add compounds of low water solubility directly into the test vessels. Determine the
added amount exactly.
NOTE For more details on handling poorly water-soluble compounds, see ISO 10634.
7.1.2 Reference compound
Use as reference compound an organic compound of known biodegradability, such as aniline or sodium benzoate.
Prepare a stock solution of the reference compound in the test medium (5.2) in the same way as with a water-
soluble test compound (7.1.1), in order to obtain a final organic carbon concentration of 20 mg/l or a concentration
equivalent to that of the test compound.
7.1.3 Solution to check inhibition
If required (when e.g. no information on the toxicity of test compound is available), prepare a solution containing, in
the test medium (5.2), both the test compound (7.1.1) and the reference compound (7.1.2) preferably at
concentrations of organic carbon of 20 mg/l for each.
7.2 Preparation of the inoculum
7.2.1 General
Prepare the inoculum using activated sludge (7.2.2) or the sources described in 7.2.3 and 7.2.4 or a mixture of
these sources to obtain a microbial population that offers sufficient biodegradative activity. Check the activity of the
inoculum by means of the reference compound (7.1.2 and clause 9). The CO production of the blank should fulfil the
validity criteria (see clause 9). To reduce the influence of the blank, it may be helpful to precondition the inoculum, e.g.
by washing with medium (5.2.2) and aerating it, from 1 d to 7 d, before use. Use a suitable volume for inoculation (see
note 2 below).
NOTE 1 Normally the inoculum should not be pre-exposed to the test compound to allow a general prediction of the
degradation behaviour in the environment. In certain circumstances, depending on the purpose of the test, pre-exposed inocula
may be used, provided that this is clearly stated in the test report (e. g. percent biodegradation = x %, using pre-exposed
inocula) and the method of pre-exposure is detailed in the test report. Pre-exposed inocula can be obtained from laboratory
biodegradation tests conducted under a variety of conditions (e.g. Zahn-Wellens test ISO 9888 and SCAS test ISO 9887) or
from samples collected from locations where relevant environmental conditions exist (e.g. treatment plants dealing with similar
compounds or contaminated areas).
NOTE 2 Based on experience, suitable volume means:
 sufficient to give a population which offers enough biodegradation activity;
 degrades the reference compound by the stipulated percentage (see clause 9);
3 6
 gives between 10 to 10 colony-forming units per millilitre in the final mixture;
 gives not greater than the equivalent of 30 mg/l suspended solids of activated sludge in the final mixture;
 the quantity of dissolved organic carbon provided by the inoculum should be less than 10 % of the initial concentration of
organic carbon introduced by the test compound;
 generally 1 ml to 10 ml of inoculum are sufficient for 1 000 ml of test solution.
© ISO
7.2.2 Inoculum from an activated sludge plant
Take a sample of activated sludge collected from the aeration tank of a full-scale or a laboratory wastewater
treatment plant dealing with predominantly domestic sewage. Mix well and determine the concentration of
suspended solids of the activated sludge (use e.g. ISO 11923). If necessary remove coarse particles by filtration
through a sieve and concentrate the sludge by settling, so that the volume of sludge added to the test assay is
minimal. Keep the sample under aerobic conditions and use preferably on the day of collection. Use a suitable
volume to obtain 30 mg/l of suspended solids in the final mixture.
7.2.3 Inoculum from wastewater
Take a sample from the influent or from the effluent of a full-scale or a laboratory wastewater treatment plant
dealing with predominantly domestic sewage. If necessary, remove gross particulate matter by coarse filtration and
concentrate the sample, e.g. by centrifugation. Mix well, keep the sample under aerobic conditions and use
preferably on the day of collection. Before use, let the sample settle for 1 h and take a suitable volume of the
supernatant for inoculation.
7.2.4 Inoculum from a surface water
Take a sample of an appropriate surface water. If necessary, concentrate the sample by filtration using a coarse
paper filter or centrifugation. Keep the sample under aerobic conditions and use preferably on the day of collection.
Use a suitable volume as inoculum.
7.3 Test procedure
Provide a sufficient number of vessels (6.1) in order to have
 at least two test vessels (denoted F ) for the test compound (7.1.1);
T
 at least two blank vessels (denoted F ) containing test medium and inoculum;
B
 at least one vessel, for checking the procedure (denoted F ) containing the reference compound (7.1.2);
C
 if needed, one vessel for checking a possible inhibitory effect of the test compound (denoted F ) containing
I
solution 7.1.3;
 if needed, one vessel for checking a possible abiotic elimination (denoted F ) containing the test compound
S
(7.1.1) but no inoculum, sterilized by autoclaving or by addition of a suitable inorganic toxic compound to
prevent microbial activity. Use, for example, 1 ml/l of a solution containing 10 g/l of mercury(II) chloride (HgCl ).
Add the same amount of the toxic substance two weeks after the test was begun.
Add appropriate amounts of the test medium (5.2), and the inoculum (7.2) to the vessels as indicated in Table 1 to
obtain a final test volume of e.g. 3 l. Other final test volumes are possible; adapt in such a case all relevant
parameters and the calculation of test results. Connect the vessels to the CO -free air production system (see
annex A). Incubate at the desired test temperature (see clause 4) and aerate the vessels for 24 h to purge CO from
the system. Agitate throughout the test with a magnetic stirrer. If excessive foaming is observed, replace the air sparge
by headspace aeration while stirring. After the pre-aeration period, connect the air exit of each vessel to the CO
trapping or measuring system.
Add the test sample (7.1.1) and the reference compound (7.1.2) at the desired concentrations to the respective
vessels in accordance with Table 1 and start the test by bubbling CO -free air through the vessels with 3 l medium
at a rate of about 50 ml/min to 100 ml/min.
Measure the amount of CO released from each vessel at timed intervals, depending on the rate of evolution of
CO , using an appropriate and sufficiently accurate method (see annex B). If a nearly constant level of CO
2 2
formation is attained (plateau phase) and no further biodegradation is expected, the test is considered to be
completed. Usually the maximum test period should not exceed 28 d. Extend the test by one to two weeks, if
degradation has obviously started but has not reached a plateau.
© ISO
Table 1 — Final distribution of test and reference compounds in the test vessels
Test Test Reference
Vessel Inoculum
medium compound compound
(5.2) (7.1.1) (7.1.2) (7.2)
F Test compound + + 2 +
T
+ + 2 +
F Test compound
T
F Blank + 2 2 +
B
+ 2 2 +
F Blank
B
F Inoculum check + 2 ++
C
F Inhibition control (optional) + + + +
I
F Abiotic elimination c
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 9439
Deuxième édition
1999-03-01
Qualité de l'eau — Évaluation de la
biodégradabilité aérobie ultime en milieu
aqueux des composés organiques — Essai
de dégagement de dioxyde de carbone
Water quality — Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic
compounds in aqueous medium — Carbon dioxide evolution test
A Numéro de référence
Sommaire
1 Domaine d'application.1
2 Termes et définitions.1
3 Principe.3
4 Environnement d'essai.3
5 Réactifs.3
6 Appareillage .4
7 Mode opératoire.5
8 Calculs .7
9 Validité des résultats.8
10 Rapport d'essai .9
Annexe A (informative) Principe d'un système d’essai de mesurage du dioxyde de carbone (exemple) .10
Annexe B (informative) Exemples de dosage du dioxyde de carbone libéré.11
Annexe C (informative) Exemple de courbe de biodégradation.13
Annexe D (informative) Dosage combiné du CO et du COD.14
Bibliographie.17
©  ISO 1999
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque
forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit de l'éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 • CH-1211 Genève 20 • Suisse
Internet [e-mail]
Imprimé en Suisse
ii
© ISO
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 3.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
La Norme internationale ISO 9439 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-
comité SC 5, Méthodes biologiques.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 9439:1990), dont elle constitue une révision
technique.
Les annexes A à D de la présente Norme internationale sont données uniquement à titre d'information.
iii
© ISO
Introduction
Les conditions décrites dans la présente Norme internationale ne correspondent pas toujours aux conditions
optimales permettant d'obtenir un degré maximal de biodégradation. Dans le cadre de ce système d'essai, le
dioxyde de carbone (CO ) émis par les micro-organismes est dosé à l'intérieur des pièges traversés par l'air
provenant des récipients d'essai. Une partie du CO reste dans le milieu des récipients sous forme de carbone
inorganique dissous (CID), dont la concentration peut augmenter pendant le processus de biodégradation. Lorsque
le carbone organique est pratiquement éliminé, la concentration en CID baisse graduellement et tend à se
rapprocher de zéro vers la fin de l'incubation. Il est donc nécessaire de procéder à l'acidification du milieu en fin
d'essai afin de mesurer la totalité du CO biologiquement formé. Le mesurage du CO dans les pièges extérieurs
2 2
peut varier par rapport à la véritable production de CO et le taux cinétique peut lui aussi être inférieur au taux
calculé à partir du mesurage de l'élimination du carbone organique dissous. Il peut en résulter que les courbes de
biodégradation, dont les valeurs reposent sur la quantité de CO piégé, ne représentent pas complètement le
véritable taux cinétique microbien. Pour des variantes de méthodes d'évaluation de la biodégradation, consulter
l'ISO 15462 et plus particulièrement l'ISO 14593, qui repose également sur la production de CO mais qui n'a
cependant pas ce défaut.
iv
NORME INTERNATIONALE  © ISO ISO 9439:1999(F)
Qualité de l'eau — Évaluation de la biodégradabilité aérobie ultime
en milieu aqueux des composés organiques — Essai de
dégagement de dioxyde de carbone
AVERTISSEMENT — Les boues activées et eaux d’égouts peuvent contenir des organismes
potentiellement pathogènes. Il convient donc de prendre des précautions appropriées lors de leur
manipulation. Il convient de manipuler avec précaution les composés pour analyse toxiques, de même que
ceux dont les propriétés sont inconnues.
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale prescrit une méthode pour l'évaluation, par dosage du dioxyde de carbone (CO )
en milieu aqueux, de la biodégradabilité aérobie ultime des composés organiques présents à une concentration
donnée sous l'action de micro-organismes aérobies.
La méthode de la présente Norme internationale s'applique à des composés organiques
a) solubles dans l'eau dans les conditions de l'essai, auquel cas l'élimination du COD peut être déterminée à titre
d'information complémentaire (voir l'annexe D);
b) peu solubles dans l'eau dans les conditions de l'essai, auquel cas il peut être nécessaire de prendre des
mesures particulières afin d'assurer une bonne dispersion du composé (voir par exemple l'ISO 10634);
c) non volatils ou ayant une pression de vapeur négligeable dans les conditions de l'essai
NOTE En ce qui concerne les substances volatiles, utiliser par exemple l'ISO 9408 ou l'ISO 14593.
d) n'ayant pas d'effet inhibiteur sur les micro-organismes soumis à l'essai, à la concentration choisie pour l'essai.
NOTE L'existence d'un effet inhibiteur peut être mis en évidence suivant la méthode prescrite en 8.3, ou par toute autre
méthode de détermination de l'effet inhibiteur d'une substance sur des bactéries (voir par exemple l'ISO 8192).
2 Termes et définitions
Pour les besoins de la présente Norme internationale, les termes et définitions suivants s'appliquent.
2.1
biodégradation aérobie ultime
décomposition d'un composé chimique ou d'une matière organique par des micro-organismes, en présence
d'oxygène, en dioxyde de carbone, eau et sels minéraux de tout autre élément présent (minéralisation) et
production de nouvelle biomasse
2.2
biodégradation primaire
modification structurelle (transformation) d'un composé chimique par des micro-organismes, entraînant la perte
d'une propriété spécifique
2.3
boue activée
biomasse produite par la croissance de bactéries ou d'autres micro-organismes en présence d'oxygène dissous,
lors du traitement aérobie des eaux usées
© ISO
2.4
concentration en matières en suspension
quantité de matière solide obtenue par filtration ou centrifugation d'un volume connu de
boue activée et séchage à environ 105 °C jusqu'à masse constante
2.5
carbone organique dissous
COD
fraction du carbone organique présent dans l'eau qui ne peut être éliminée par la méthode de séparation des
phases spécifiée
-2
NOTE Par exemple par centrifugation à 40 000 m·s pendant 15 min ou par filtration sur membrane dont le diamètre des
pores est de 0,2 mm à 0,45 mm.
2.6
carbone inorganique total
CIT
totalité du carbone inorganique présent dans l'eau provenant du dioxyde de carbone et des carbonates
2.7
carbone inorganique dissous
CID
fraction du carbone inorganique présent dans l'eau qui ne peut être éliminée par la méthode de séparation des
phases spécifiée
-2
NOTE Par exemple par centrifugation à 40 000 m·s pendant 15 min ou par filtration sur membrane dont le diamètre des
pores est de 0,2 mm à 0,45 mm.
2.8
quantité théorique de dioxyde de carbone formé
CO Th
quantité théorique maximale de dioxyde de carbone formé après l'oxydation complète d'un composé chimique
NOTE Elle est calculée à partir de la formule moléculaire et est exprimée dans ce cas en milligrammes de dioxyde de
carbone par milligramme (ou par gramme) du composé à analyser.
2.9
phase de latence
délai s'écoulant entre le début d'un essai et le moment où l'adaptation et/ou la sélection des micro-organismes
dégradants est achevée, et où le degré de biodégradation d'un composé chimique ou d'une matière organique
représente environ 10 % du niveau maximal de biodégradation
NOTE Elle est généralement exprimée en jours.
2.10
niveau maximal de biodégradation
taux maximal de biodégradation d'un composé chimique ou d'une matière organique au cours d'un essai, au-delà
duquel aucune biodégradation ne survient plus pendant l'essai
NOTE Il est généralement exprimé en pourcentage.
2.11
phase de biodégradation
durée entre la fin de la phase de latence d'un essai et le moment où environ 90 % du niveau maximal de
biodégradation a été atteint
NOTE Elle est généralement exprimée en jours.
2.12
phase de plateau
durée entre la fin de la phase de biodégradation et la fin de l'essai
NOTE Elle est généralement exprimée en jours.
© ISO
2.13
préexposition
pré-incubation d'un inoculum en présence du composé chimique ou de la matière organique à analyser, destinée à
accroître l'aptitude de l'inoculum à dégrader le matériau d'essai par adaptation et/ou par sélection des micro-
organismes
2.14
préconditionnement
pré-incubation d'un inoculum dans les conditions de l'essai, en l'absence du composé chimique ou de la matière
organique à analyser, destinée à améliorer l'efficacité de l'essai par acclimatation des micro-organismes aux
conditions d'essai
3 Principe
La biodégradabilité des composés organiques par des micro-organismes aérobies est déterminée à l'aide d'un
système d'essai aqueux statique. Le mélange soumis à l'essai contient un milieu inorganique, le composé
organique constituant la seule source nominale de carbone et d'énergie à une concentration de 10 mg/l à 40 mg/l
en carbone organique, ainsi qu'un inoculum mixte provenant d'une usine de traitement des eaux résiduaires ou
d'une autre source de l'environnement. Le mélange est agité dans des récipients d'essai puis exposé à un flux d'air
exempt de CO généralement jusqu'à 28 jours (voir un exemple en annexe A). Le CO formé pendant la
2 2
dégradation microbienne est piégé dans des récipients externes et déterminé par une méthode d'analyse
appropriée (voir des exemples en annexe B), puis comparé à la quantité théorique (CO Th) et exprimé en
pourcentage.
Dans le cas de composés suffisamment solubles dans l'eau, il est possible, de façon facultative, de mesurer
l'élimination du COD afin d'obtenir des informations complémentaires sur la biodégradabilité ultime. Ceci peut être
fait par la présente méthode, mais l'annexe D décrit un mode opératoire facile qui permet d'utiliser le composé à
analyser et l'inoculum à des concentrations plus élevées, ce qui améliore le potentiel de biodégradation de l'essai.
S'il existe une méthode d'analyse spécifique à la substance, il est également possible d'obtenir des informations
concernant la dégradabilité primaire.
4 Environnement d'essai
L'incubation doit avoir lieu à l'abri de la lumière ou sous lumière diffuse, à une température comprise entre 20 °C et
25 °C, maintenue constante à – 2 °C près tout au long de l'essai.
5 Réactifs
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
5.1  Eau distillée ou déionisée, contenant moins de 1 mg/l de COD.
5.2  Milieu d'essai.
5.2.1  Composition
a) Solution a)
Dissoudre:
Dihydrogénophosphate de potassium anhydre (KH PO ) 8,50 g
2 4
Monohydrogénophosphate de dipotassium anhydre (K HPO ) 21,75 g
2 4
Monohydrogénophosphate de disodium dihydraté (Na HPO ,2H O) 33,40 g
2 4 2
Chlorure d'ammonium (NH Cl) 0,50 g
dans de l'eau (5.1), quantité suffisante pour 1 000 ml
© ISO
Il est recommandé de mesurer le pH pour vérifier cette solution tampon. Il convient que le pH soit d'environ 7,4.
Si ce n'est pas le cas, préparer une nouvelle solution.
b) Solution b)
Dissoudre 22,50 g de sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO ,7H O) dans de l'eau (5.1), en quantité
4 2
suffisante pour 1 000 ml.
c) Solution c)
Dissoudre 36,40 g de chlorure de calcium dihydraté (CaCl ,2H O) dans de l'eau (5.1), en quantité suffisante
2 2
pour 1 000 ml.
d) Solution d)
Dissoudre 0,25 g de chlorure de fer(III) hexahydraté (FeCl ,6H O) dans de l'eau (5.1), en quantité suffisante
3 2
pour 1 000 ml. Afin d'éviter toute précipitation, préparer cette solution extemporanément ou ajouter une goutte
d'acide chlorhydrique concentré (HCl).
5.2.2  Préparation du milieu d'essai
Pour 1 000 ml de milieu d'essai, ajouter à environ 800 ml d'eau (5.1):
� 10 ml de solution a);
� 1 ml de chacune des solutions b) à d).
Compléter à 1 000 ml avec de l'eau (5.1).
6 Appareillage
S’assurer que la verrerie de laboratoire a été soigneusement nettoyée et, plus particulièrement, qu'elle est exempte
de substances organiques et de substances toxiques.
6.1  Récipients d'essai, en verre (par exemple erlenmeyers ou flacons), permettant la purge des gaz et l'utilisation
d'un agitateur, comprenant des tubes non perméables au CO , entreposés dans une pièce à température constante
ou dans un environnement contrôlé par thermostat (par exemple un bain-marie).
6.2  Système de production d'air exempt de CO , pouvant alimenter chacun des récipients d'essai à un débit
constant compris entre 50 ml/min et 100 ml/min pour 3 l de milieu (voir en annexe A un exemple de montage des
récipients d'essai).
6.3  Dispositif d'analyse de la teneur en dioxyde de carbone: tout appareillage ou technique approprié(e)
présentant une précision suffisante, comme par exemple un analyseur de CO ou de CID, ou un dispositif de
dosage titrimétrique après absorption totale dans une solution alcaline (voir des exemples en annexe B).
6.4  Appareil d'analyse de la concentration en carbone organique dissous (COD) (facultatif).
6.5  Centrifugeuse ou dispositif de filtration, muni de membranes filtrantes (diamètre nominal d'ouverture des
pores compris entre 0,20 mm et 0,45 mm), dans lesquelles l'adsorption ou le relargage du carbone organique est
réduit au minimum.
6.6  pH-mètre.
© ISO
7 Mode opératoire
7.1 Préparation des solutions d'essai
7.1.1 Composé à analyser
Préparer une solution mère d'un composé à analyser dont la solubilité dans l'eau est suffisante, dans de l'eau (5.1)
ou dans le milieu d'essai (5.2), et ajouter une quantité adéquate de cette solution afin d'obtenir une concentration en
carbone organique dans le milieu d'essai final comprise entre 10 mg/l et 40 mg/l. Suivant les propriétés du composé
à analyser (par exemple sa toxicité) et suivant les besoins de l'essai, il est possible d'utiliser d'autres
concentrations. Ajouter directement dans les récipients d'essai les composés ayant une faible solubilité dans l'eau.
Déterminer avec exactitude la quantité ajoutée.
NOTE Pour plus de détails concernant la manipulation des composés peu solubles dans l'eau, voir l'ISO 10634.
7.1.2 Composé de référence
Utiliser comme composé de référence un composé organique de biodégradabilité connue, tel que l'aniline ou le
benzoate de sodium. Préparer une solution mère du composé de référence dans le milieu d'essai (5.2) en
procédant comme pour le composé à analyser soluble dans l'eau (7.1.1), de façon à obtenir une concentration
finale en carbone organique de 20 mg/l ou une concentration équivalente à celle du composé à analyser.
7.1.3 Solution témoin de l'inhibition
Si nécessaire (par exemple lorsqu'aucune information n'est disponible sur la toxicité du composé à analyser),
préparer une solution contenant, dans le milieu d'essai (5.2), à la fois le composé à analyser (7.1.1) et le composé
de référence (7.1.2), de préférence à des concentrations en carbone organique égales à 20 mg/l pour chaque
composé.
7.2 Préparation de l'inoculum
7.2.1 Généralités
Préparer l'inoculum à partir de boues activées (voir 7.2.2) ou des sources décrites en 7.2.3 et 7.2.4, ou à partir d'un
mélange de ces sources, afin d'obtenir une population microbienne offrant une activité de biodégradation suffisante.
Vérifier cette activité au moyen du composé de référence (7.1.2 et voir l'article 9). Il convient que la production de
CO dans la solution à blanc satisfasse aux critères de validité (voir l'article 9). Il peut s'avérer utile, pour réduire
l'influence du blanc, de préconditionner l'inoculum, par exemple en le lavant avec le milieu d'essai (5.2.2) et en
l'aérant, pendant 1 jour à 7 jours, avant utilisation. Utiliser un volume convenable pour l'inoculation (voir la note 2 ci-
après).
NOTE 1 Généralement, il convient de ne pas préexposer l'inoculum au composé à analyser dans le but de permettre une
prévision générale du comportement de dégradation au sein de l'environnement. Dans certaines circonstances, selon l'objectif
de l'essai, il est possible d'utiliser des inocula préexposés, à condition de clairement le mentionner dans le rapport d'essai (par
exemple pourcentage de biodégradation = %, avec inocula préexposés) et à condition que la méthode de préexposition soit
x
détaillée dans le rapport d'essai. Des inocula préexposés peuvent être obtenus à partir d'essais de biodégradation en
laboratoire effectués dans diverses conditions (par exemple essai de Zahn-Wellens selon l'ISO 9888 et essai SCAS selon
l'ISO 9887) ou à partir d'échantillons prélevés en des lieux où sont réunies les conditions d'environnement appropriées (par
exemple usines assurant le traitement de composés identiques ou zones contaminées).
NOTE 2 Sur la base de l'expérience, un volume convenable signifie:
 qu'il est suffisant pour permettre d'obtenir une population offrant une activité de biodégradation suffisante;
 qu'il assure la dégradation du composé de référence au pourcentage stipulé (voir l'article 9);
3 6
 qu'il fournit entre 10 et 10 unités formant colonies par millilitre dans le mélange final;
 que la concentration des matières en suspension est au plus équivalente à 30 mg/l de boue activée dans le mélange final;
qu’il convient que la quantité de carbone organique dissous apportée par l'inoculum soit inférieure à 10 % de la

concentration initiale en carbone organique introduite par le composé à analyser;
 qu'en général 1 ml à 10 ml d'inoculum suffisent pour une solution d'essai de 1 000 ml.
© ISO
7.2.2 Inoculum provenant d'une usine de traitement des boues activées
Prélever un échantillon de boue activée dans le bassin d'aération d'une station de traitement des eaux usées ou
d'un laboratoire, traitant principalement des eaux usées domestiques. Bien mélanger et déterminer la concentration
des particules solides en suspension dans la boue activée (utiliser par exemple l'ISO 11923). Éliminer si nécessaire
les grosses particules par filtration sur un tamis et concentrer la boue par décantation, afin que le volume de boue
ajouté à la quantité analysée soit minimal. Conserver l'échantillon dans des conditions aérobies et l'utiliser de
préférence le jour du prélèvement. Utiliser un volume convenable pour obtenir 30 mg/l de matières solides en
suspension dans le mélange final.
7.2.3 Inoculum provenant d'eaux usées
Prélever un échantillon dans l'affluent ou dans l'effluent d'une usine de traitement des eaux usées ou d'un
laboratoire traitant principalement des eaux usées domestiques. Éliminer si nécessaire les grosses particules en
procédant à une filtration grossière et concentrer l'échantillon, par exemple par centrifugation. Bien mélanger,
conserver l'échantillon dans des conditions aérobies et l'utiliser de préférence le jour du prélèvement. Avant
utilisation, laisser décanter l'échantillon pendant 1 h et prélever dans le surnageant un volume convenable pour
l'inoculation.
7.2.4 Inoculum provenant d'une eau de surface
Prélever un échantillon dans une eau de surface appropriée. Si nécessaire, concentrer l'échantillon par filtration sur
un papier filtre grossier ou par centrifugation. Conserver l'échantillon dans des conditions aérobies et l'utiliser de
préférence le jour du prélèvement. Utiliser un volume convenable comme inoculum.
7.3 Mode opératoire d'essai
Prévoir un nombre suffisant de récipients d'essai (6.1) pour avoir:
 au moins deux récipients d'essai (nommés F ) destinés au composé à analyser (7.1.1);
T
 au moins deux récipients pour essai à blanc (nommés F ) contenant le milieu d'essai et l'inoculum;
B
 au moins un récipient destiné à vérifier le mode opératoire (nommé F ) contenant le composé de référence
C
(7.1.2);
 le cas échéant, un récipient destiné à mettre en évidence un éventuel effet inhibiteur du composé à analyser
(nommé F ) contenant la solution 7.1.3;
I
 le cas échéant, un récipient destiné à mettre en évidence une éventuelle élimination abiotique (nommé F ),
S
contenant le composé à analyser (7.1.1) mais sans inoculum, stérilisé à l'autoclave ou par ajout d'un composé
inorganique toxique approprié afin d'empêcher toute activité microbienne. Utiliser, par exemple, 1 ml/l d'une
solution contenant 10 g/l de chlorure de mercure(II) (HgCl ). Ajouter la même quantité de substance toxique
deux semaines après le début de l'essai.
Ajouter dans chaque récipient les quantités appropriées de milieu d'essai (5.2) et d'inoculum (7.2), comme indiqué
dans le tableau 1, de manière à obtenir un volume d'essai final par exemple égal à 3 l. Il est possible d’utiliser des
volumes d'essai finaux différents: adapter dans ce cas tous les paramètres pertinents et le calcul des résultats
d'essai. Relier les récipients au système de production d'air exempt de CO (voir l'annexe A). Incuber à la
température d'essai désirée (voir l'article 4) et aérer les récipients pendant 24 h afin de purger le système du CO
qu'il contient. Agiter, durant tout l'essai, à l'aide d'un agitateur magnétique. Si une émulsion excessive est observée,
remplacer la projection d'air par une aération de l'espace de tête, tout en agitant. À la suite de la période d'aération
préalable, relier la sortie d'air de chacun des récipients au système de piégeage ou de mesurage du CO .
Ajouter le composé à analyser (7.1.1) et le composé de référence (7.1.2) dans les concentrations désirées, dans
les récipients respectifs, conformément au tableau 1 et commencer l'essai en insufflant de l'air exempt de CO dans
les récipients avec 3 l de milieu, à un débit de 50 ml/min à 100 ml/min.
© ISO
Tableau 1 — Répartition finale du composé à analyser et du composé de référence
dans les récipients d’essai
Composé à Composé de
Milieu d'essai Inoculum
Récipient analyser référence
(5.2) (7.2)
(7.1.1) (7.1.2)
F Composé à analyser + + - +
T
F Composé à analyser + + - +
T
F Témoin à blanc + - - +
B
F Témoin à blanc + - - +
B
F Témoin de l'inoculum + - + +
C
F  Témoin d'inhibition (facultatif) + + + +
I
F Témoin de l’élimination
S
++ - -
abiotique (facultatif)
Mesurer la quantité de CO libérée dans chacun des récipients, à intervalles réguliers selon la vitesse de
dégagement du CO , en appliquant une méthode appropriée et suffisamment précise (voir l'annexe B). Si un niveau
presque constant de formation de CO est atteint (phase de plateau) et qu'aucune biodégradation supplémentaire
n'est attendue, l'essai est considéré comme terminé. Il convient habituellement que la durée de l'essai n'excède pas
28 jours. Augmenter la durée de l'essai d'une à deux semaines si la dégradation a de toute évidence commencé
mais qu'elle n'a pas atteint la phase de plateau.
Au dernier jour de l'essai, mesurer le pH, acidifier toutes les récipients avec 1 ml à 10 ml d'acide chlorhydrique
concentré afin de décomposer les carbonates et les bicarbonates, et pour purger le dioxyde de carbone. Po
...