Microbiology of the food chain — Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus using real-time RT-PCR — Part 2: Method for detection

This document specifies a method for detection of hepatitis A virus (HAV) and norovirus genogroups I (GI) and II (GII), from test samples of foodstuffs [(soft fruit, leaf, stem and bulb vegetables, bottled water, bivalve molluscan shellfish (BMS)] or surfaces using real-time RT-PCR. This method is not validated for detection of the target viruses in other foodstuffs (including multi-component foodstuffs), or any other matrices, nor for the detection of other viruses in foodstuffs, surfaces or other matrices.

Microbiologie de la chaine alimentaire — Méthode horizontale pour la recherche des virus de l'hépatite A et norovirus par la technique RT-PCR en temps réel — Partie 2: Méthode de détection

Le présent document spécifie une méthode de détection du virus de l'hépatite A (VHA) et des norovirus des génogroupes I (GI) et II (GII) dans des échantillons pour essai d'aliments (baies, légumes feuilles, tiges et bulbes, eau embouteillée, mollusques bivalves) ou sur des surfaces par RT-PCR en temps réel. Cette méthode n'est pas validée pour la détection des virus cibles dans d'autres aliments (y compris les aliments à plusieurs composants) ou d'autres matrices, ni pour la détection d'autres virus dans les aliments, sur les surfaces ou dans d'autres matrices.

General Information

Status
Published
Publication Date
22-Jul-2019
Technical Committee
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
23-Jul-2019
Completion Date
23-Jul-2019
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ISO 15216-2:2019 - Microbiology of the food chain -- Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus using real-time RT-PCR
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ISO 15216-2:2019 - Microbiologie de la chaine alimentaire -- Méthode horizontale pour la recherche des virus de l'hépatite A et norovirus par la technique RT-PCR en temps réel
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Standards Content (sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 15216-2
First edition
2019-07
Microbiology of the food chain —
Horizontal method for determination
of hepatitis A virus and norovirus
using real-time RT-PCR —
Part 2:
Method for detection
Microbiologie dans la chaine alimentaire — Méthode horizontale
pour la recherche des virus de l'hépatite A et norovirus par la
technique RT-PCR en temps réel —
Partie 2: Méthode de détection
Reference number
ISO 15216-2:2019(E)
ISO 2019
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ISO 15216-2:2019(E)
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Published in Switzerland
ii © ISO 2019 – All rights reserved
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ISO 15216-2:2019(E)
Contents Page

Foreword ..........................................................................................................................................................................................................................................v

Introduction ................................................................................................................................................................................................................................vi

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 3

4.1 Virus extraction ...................................................................................................................................................................................... 3

4.2 RNA extraction ........................................................................................................................................................................................ 3

4.3 Real-time RT-PCR .................................................................................................................................................................................. 3

4.4 Control materials .................................................................................................................................................................................. 4

4.4.1 Process control virus .................................................................................................................................................... 4

4.4.2 EC RNA control .................................................................................................................................................................. 4

4.5 Test results.................................................................................................................................................................................................. 4

5 Reagents ........................................................................................................................................................................................................................ 4

5.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 4

5.2 Reagents used as supplied ............................................................................................................................................................ 4

5.3 Reagents requiring preparation ............................................................................................................................................... 6

6 Equipment and consumables .................................................................................................................................................................. 7

7 Sampling ........................................................................................................................................................................................................................ 8

8 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 8

8.1 General laboratory requirements ........................................................................................................................................... 8

8.2 Virus extraction ...................................................................................................................................................................................... 8

8.2.1 General...................................................................................................................................................................................... 8

8.2.2 Process control virus material ............................................................................................................................. 9

8.2.3 Negative process control ........................................................................................................................................... 9

8.2.4 Surfaces .................................................................................................................................................................................... 9

8.2.5 Soft fruit and leaf, stem and bulb vegetables........................................................................................... 9

8.2.6 Bottled water ...................................................................................................................................................................10

8.2.7 Bivalve molluscan shellfish (BMS) .................................................................................................................10

8.3 RNA extraction .....................................................................................................................................................................................11

8.4 Real-time RT-PCR ...............................................................................................................................................................................11

8.4.1 General requirements ...............................................................................................................................................11

8.4.2 Real-time RT-PCR analysis ....................................................................................................................................12

9 Interpretation of results ............................................................................................................................................................................14

9.1 General ........................................................................................................................................................................................................14

9.2 Construction of process control virus RNA standard curve..........................................................................14

9.3 Control for RT-PCR inhibition..................................................................................................................................................14

9.4 Calculation of extraction efficiency ....................................................................................................................................15

10 Expression of results .....................................................................................................................................................................................15

11 Performance characteristics of the method ..........................................................................................................................16

11.1 Validation study...................................................................................................................................................................................16

11.2 Sensitivity .................................................................................................................................................................................................16

11.3 Specificity .................................................................................................................................................................................................16

11.4 LOD ..........................................................................................................................................................................................................16

12 Test report ................................................................................................................................................................................................................16

Annex A (normative) Diagram of procedure .............................................................................................................................................17

Annex B (normative) Composition and preparation of reagents and buffers ........................................................18

Annex C (informative) Real-time RT-PCR mastermixes and cycling parameters ................................................21

© ISO 2019 – All rights reserved iii
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ISO 15216-2:2019(E)

Annex D (informative) Real-time RT-PCR primers and hydrolysis probes for the detection of

HAV, norovirus GI and GII and mengo virus (process control) ..........................................................................22

Annex E (informative) Growth of mengo virus strain MC for use as a process control ..............................25

Annex F (informative) RNA extraction using the BioMerieux NucliSens system .............................................26

Annex G (informative) Generation of external control RNA (EC RNA) stocks .........................................................28

Annex H (informative) Typical optical plate layout ...........................................................................................................................31

Annex I (informative) Method validation studies and performance characteristics ......................................32

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................40

iv © ISO 2019 – All rights reserved
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ISO 15216-2:2019(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso

.org/iso/foreword .html.

This document was prepared by the European Committee for Standardization (CEN) Technical

Committee CEN/TC 275, Food analysis — Horizontal methods, in collaboration with ISO Technical

Committee TC 34, Food products, Subcommittee SC 9, Microbiology, in accordance with the agreement

on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).

This first edition cancels and replaces ISO/TS 15216-2:2013, which has been technically revised with

the following changes:

— a requirement to use a suitable buffer for the dilution of control materials has been added;

— the method for generating process control virus RNA for the standard curve has been changed;

— breakpoints with a defined temperature and time parameters in the extraction methods have

been added;

— the terminology has been changed from amplification efficiency to RT-PCR inhibition;

— extra real-time RT-PCR reactions for sample RNA and negative controls have been added;

— method characteristics and the results of method validation studies have been added.

A list of all parts in the ISO 15216 series can be found on the ISO website.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
© ISO 2019 – All rights reserved v
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ISO 15216-2:2019(E)
Introduction

Hepatitis A virus (HAV) and norovirus are important agents of food-borne human viral illness. No

routine methods exist for culture of norovirus, and HAV culture methods are not appropriate for routine

application to food matrices. Detection is therefore reliant on molecular methods using the reverse-

transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). As many food matrices contain substances that

are inhibitory to RT-PCR, it is necessary to use an extraction method that produces highly clean RNA

preparations that are fit for purpose. For surfaces, viruses are removed by swabbing. For soft fruit and

leaf, stem and bulb vegetables, virus extraction is by elution with agitation followed by precipitation

with PEG/NaCl. For bottled water, adsorption and elution using positively charged membranes followed

by concentration by ultrafiltration is used. For bivalve molluscan shellfish (BMS), viruses are extracted

from the tissues of the digestive glands using treatment with a proteinase K solution. For all matrices

that are not covered by this document, it is necessary to validate this method. All matrices share a

common RNA extraction method based on virus capsid disruption with chaotropic reagents followed

by adsorption of RNA to silica particles. Real-time RT-PCR monitors amplification throughout the real-

time RT-PCR cycle by measuring the excitation of fluorescently labelled molecules. In real-time RT-PCR

with hydrolysis probes, the fluorescent label is attached to a sequence-specific nucleotide probe that

also enables simultaneous confirmation of target template. These modifications increase the sensitivity

and specificity of the real-time RT-PCR method, and obviate the need for additional amplification

product confirmation steps post real-time RT-PCR. Due to the complexity of the method, it is necessary

to include a comprehensive suite of controls. The method described in this document enables detection

of virus RNA in the test sample. A schematic diagram of the testing procedure is shown in Annex A.

The main changes, listed in the Foreword, introduced in this document compared to ISO/TS 15216-2:2013,

are considered as minor (see ISO 17468).
vi © ISO 2019 – All rights reserved
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 15216-2:2019(E)
Microbiology of the food chain — Horizontal method for
determination of hepatitis A virus and norovirus using
real-time RT-PCR —
Part 2:
Method for detection
1 Scope

This document specifies a method for detection of hepatitis A virus (HAV) and norovirus genogroups

I (GI) and II (GII), from test samples of foodstuffs [(soft fruit, leaf, stem and bulb vegetables, bottled

water, bivalve molluscan shellfish (BMS)] or surfaces using real-time RT-PCR.

This method is not validated for detection of the target viruses in other foodstuffs (including multi-

component foodstuffs), or any other matrices, nor for the detection of other viruses in foodstuffs,

surfaces or other matrices.
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 20838, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the

detection of food-borne pathogens — Requirements for amplification and detection for qualitative methods

ISO 22119, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Real-time polymerase chain reaction (PCR) for

the detection of food-borne pathogens — General requirements and definitions

ISO 22174, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the

detection of food-borne pathogens — General requirements and definitions
3 Terms and definitions

For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 20838, ISO 22119, ISO 22174

and the following apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https:/ /www. iso. org/obp
— IEC Electropedia: available at http:/ /www.e lectropedia. org/
3.1
foodstuff
substance used or prepared for use as food

Note 1 to entry: For the purposes of this document, this definition includes bottled water.

3.2
surface
surface of food, food preparation surface or food contact surface
© ISO 2019 – All rights reserved 1
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ISO 15216-2:2019(E)
3.3
soft fruit
small edible stoneless fruit
EXAMPLE Strawberries, raspberries, currants.
3.4
leaf, stem and bulb vegetables
leaves, stems and bulbs of plants, eaten as a vegetable
EXAMPLE Lettuce, green onions.
3.5
hepatitis A virus
HAV
member of the Picornaviridae family responsible for infectious hepatitis

Note 1 to entry: Genetically, HAV can be subdivided into six genotypes on the basis of the VP1/2A region

(genotypes 1, 2 and 3 have been found in humans, while genotypes 4, 5, and 6 are of simian origin). There is only

one serotype.

Note 2 to entry: Transmission occurs via the faecal-oral route by person-to-person contact, through the

consumption of contaminated foodstuffs (3.1), contact with contaminated water or surfaces (3.2), or contact with

contaminated fomites. HAV is classified as a group 2 biological agent by the European Union and as a risk group 2

human aetiological agent by the United States National Institutes of Health.
3.6
norovirus

member of the Caliciviridae family responsible for sporadic cases and outbreaks of acute gastroenteritis

Note 1 to entry: Genetically, norovirus can be subdivided into seven separate genogroups. Three of these

genogroups, GI, GII and GIV have been implicated in human gastrointestinal disease. GI and GII are responsible

for the vast majority of clinical cases.

Note 2 to entry: Transmission occurs via the faecal-oral route by person-to-person contact, through the

consumption of contaminated foodstuffs (3.1), through contact with contaminated water or surfaces (3.2), or

contact with contaminated fomites. GI and GII noroviruses are classified as group 2 biological agents by the

European Union and as risk group 2 human aetiological agents by the United States National Institutes of Health.

3.7
detection of HAV

detection of HAV (3.5) RNA in a predetermined mass or volume of foodstuff (3.1), or on the area of a

surface (3.2)
3.8
detection of norovirus

detection of norovirus (3.6) RNA in a predetermined mass or volume of foodstuff (3.1), or on the area of

a surface (3.2)
3.9
process control virus

virus added to the sample portion at the earliest opportunity prior to virus extraction to control for

extraction efficiency
3.10
process control virus RNA

RNA extracted from the process control virus (3.9) in order to produce standard curve data for the

estimation of extraction efficiency
3.11
negative RNA extraction control

control free of target RNA carried through all steps of the RNA extraction and detection procedure to

monitor any contamination events
2 © ISO 2019 – All rights reserved
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ISO 15216-2:2019(E)
3.12
negative process control

target pathogen-free sample of the food matrix, or target pathogen-free non-matrix sample, that is run

through all stages of the analytical process
3.13
hydrolysis probe

fluorescent probe coupled with a fluorescent reporter molecule and a quencher molecule, which are

sterically separated by the 5′-3′-exonuclease activity of the enzyme during the amplification process

3.14
negative real-time RT-PCR control

aliquot of highly pure water used in a real-time RT-PCR reaction to assess contamination in the real-

time RT-PCR reagents
3.15
external control RNA
EC RNA

reference RNA that can be used to assess inhibition of amplification for the real-time RT-PCR assay of

relevance by being added in a defined amount to an aliquot of sample RNA in a separate reaction

EXAMPLE RNA synthesized by in vitro transcription from a plasmid carrying a copy of the target gene.

3.16
C value

quantification cycle, which is the cycle at which the target is quantified in a given real-time RT-PCR

reaction

Note 1 to entry: This corresponds to the cycle at which reaction fluorescence rises above a threshold level.

4 Principle
4.1 Virus extraction

The foodstuffs and surfaces covered by this document are often highly complex matrices and the target

viruses can be present at low concentrations. It is therefore necessary to carry out matrix-specific virus

extraction and/or concentration in order to provide a substrate for subsequent common parts of the

process. The choice of method depends upon the matrix.
4.2 RNA extraction

It is necessary to extract RNA using a method that yields RNA preparations of suitable purity to reduce

the effect of RT-PCR inhibitors. In this document, the chaotropic agent guanidine thiocyanate is used to

disrupt the viral capsid. RNA is then adsorbed to silica to assist purification through several washing

stages. Purified viral RNA is released from the silica into a buffer prior to real-time RT-PCR.

4.3 Real-time RT-PCR

This document uses one-step real-time RT-PCR using hydrolysis probes. In one-step real-time RT-PCR,

reverse transcription and PCR amplification are carried out consecutively in the same tube.

Real-time RT-PCR using hydrolysis probes utilizes a short DNA probe with a fluorescent label and a

fluorescence quencher attached at the 5’ and 3’ ends, respectively. The assay chemistry ensures that as

the quantity of amplified product increases, the probe is hydrolysed and the fluorescent signal from the

label increases proportionately.

Due to the low levels of virus template often present in foodstuffs or surfaces and the strain diversity in

the target viruses, the selection of fit-for-purpose one step real-time RT-PCR reagents and PCR primers

and hydrolysis probes for the target viruses is important. Guidelines for their selection are given in

© ISO 2019 – All rights reserved 3
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ISO 15216-2:2019(E)

5.2.19 and 5.2.20. Illustrative details of reagents, primers, and probes (used in the development of this

document) are provided in Annexes C and D.
4.4 Control materials
4.4.1 Process control virus

Losses of target virus can occur at several stages during sample virus extraction and RNA extraction.

To account for these losses, samples are spiked at the earliest opportunity prior to virus extraction

with a defined amount of a process control virus. The level of recovery of the process control virus shall

be determined for each sample.

The virus selected for use as a process control shall be a culturable non-enveloped positive-sense

ssRNA virus of a similar size to the target viruses to provide a good morphological and physicochemical

model. The process control virus shall exhibit similar persistence in the environment to the targets.

The virus shall be sufficiently distinct genetically from the target viruses that real-time RT-PCR assays

for the target and process control viruses do not cross-react, and shall not normally be expected to

occur naturally in the foodstuffs or surfaces under test.

An example of the preparation of process control virus (used in the development of this document) is

provided in Annex E.
4.4.2 EC RNA control

Many food matrices contain substances inhibitory to RT-PCR, and there is also a possibility of carryover

of further inhibitory substances from upstream processing. In order to evaluate RT-PCR inhibition in

individual samples, EC RNA (an RNA species carrying the target sequence of interest, 5.3.11) is added

to an aliquot of sample RNA and tested using the real-time RT-PCR method. Comparison of the results

of this with the results of EC RNA in the absence of sample RNA enables determination of the level of

RT-PCR inhibition in each sample under test. In addition, in this method, the EC RNA control acts as a

positive control for real-time RT-PCR for the target viruses.

Alternative approaches for the assessment of RT-PCR inhibition are permitted, provided that the

alternative approach can be demonstrated to provide equivalent performance to the use of EC RNA

control as described in this document.
4.5 Test results

For surfaces, this method provides a result expressed either as “virus genome detected” or “virus

genome not detected” followed by “in x cm ”, where x is the approximate surface area swabbed. Where

it is not possible to record the surface area swabbed, results are expressed either as “virus genome

detected” or “virus genome not detected”. For other sample types, results are expressed as “virus

genome detected” or “virus genome not detected” followed by “in x ml” or “in x g”, where x is the amount

of sample tested.
5 Reagents
5.1 General
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified.
For current laboratory practice, see ISO 7218.
5.2 Reagents used as supplied
5.2.1 Molecular biology grade water.
4 © ISO 2019 – All rights reserved
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ISO 15216-2:2019(E)
5.2.2 Polyethylene glycol (PEG), mean relative molecular mass 8 000.
5.2.3 Sodium chloride (NaCl).
5.2.4 Potassium chloride (KCl).
5.2.5 Disodium hydrogenphosphate (Na HPO ).
2 4
5.2.6 Potassium dihydrogenphosphate (KH PO ).
2 4
5.2.7 Tris base.
5.2.8 Glycine.
5.2.9 Beef extract powder.
5.2.10 Proteinase K.
5.2.11 Pectinase from Aspergillus niger or A. aculeatus.
5.2.12 Chloroform.
5.2.13 n-Butanol.
5.2.14 Sodium hydroxide (NaOH) (≥ 10 mol/l).
5.2.15 Hydrochloric acid (HCl) (≥ 5 mol/l).
5.2.16 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium dihydrate.

5.2.17 Silica, lysis, wash and elution buffers for extraction of viral RNA. Reagents shall enable

processing of 500 μl of sample extract, using lysis with a chaotropic buffer containing guanidine

[4]

thiocyanate and using silica as the RNA-binding matrix. Following treatment of silica-bound RNA with

wash buffer(s) to remove impurities, RNA shall be eluted in 100 μl elution buffer.

The RNA preparation shall be of a quality and concentration suitable for the intended purpose. See

Annex F for illustrative details of RNA extraction reagents (used in the development of the method

described in this document).

5.2.18 Reagents for one step real-time RT-PCR. Reagents shall allow processing of 5 μl RNA in 25 μl

total
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 15216-2
Première édition
2019-07
Microbiologie dans la chaine
alimentaire — Méthode horizontale
pour la recherche des virus de
l'hépatite A et norovirus par la
technique RT-PCR en temps réel —
Partie 2:
Méthode de détection
Microbiology of the food chain — Horizontal method for determination
of hepatitis A virus and norovirus using real-time RT-PCR —
Part 2: Method for detection
Numéro de référence
ISO 15216-2:2019(F)
ISO 2019
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 15216-2:2019(F)
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y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut

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Publié en Suisse
ii © ISO 2019 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 15216-2:2019(F)
Sommaire Page

Avant-propos ................................................................................................................................................................................................................................v

Introduction ................................................................................................................................................................................................................................vi

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 3

4.1 Extraction de virus .............................................................................................................................................................................. 3

4.2 Extraction d’ARN .................................................................................................................................................................................... 3

4.3 RT-PCR en temps réel ........................................................................................................................................................................ 3

4.4 Témoins ......................................................................................................................................................................................................... 4

4.4.1 Virus témoin de processus ...................................................................................................................................... 4

4.4.2 Témoin ARN CE ................................................................................................................................................................. 4

4.5 Résultats des essais ............................................................................................................................................................................. 4

5 Réactifs ........................................................................................................................................................................................................................... 5

5.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 5

5.2 Réactifs utilisés dans l’état ............................................................................................................................................................ 5

5.3 Réactifs nécessitant une préparation .................................................................................................................................. 6

6 Équipement et consommables ............................................................................................................................................................... 7

7 Échantillonnage ..................................................................................................................................................................................................... 9

8 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 9

8.1 Exigences générales de laboratoire ....................................................................................................................................... 9

8.2 Extraction de virus .............................................................................................................................................................................. 9

8.2.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 9

8.2.2 Virus témoin de processus ...................................................................................................................................... 9

8.2.3 Témoin négatif de processus ................................................................................................................................. 9

8.2.4 Surfaces .................................................................................................................................................................................... 9

8.2.5 Baies et légumes feuilles, tiges et bulbes .................................................................................................10

8.2.6 Eau embouteillée ..........................................................................................................................................................11

8.2.7 Mollusques bivalves (MBV) .................................................................................................................................11

8.3 Extraction d’ARN .................................................................................................................................................................................12

8.4 RT-PCR en temps réel .....................................................................................................................................................................12

8.4.1 Exigences générales ...................................................................................................................................................12

8.4.2 Analyse de RT-PCR en temps réel ...................................................................................................................13

9 Interprétation des résultats ..................................................................................................................................................................15

9.1 Généralités ...............................................................................................................................................................................................15

9.2 Élaboration des courbes étalon d’ARN du virus témoin de processus .................................................15

9.3 Contrôle de l’inhibition de la RT-PCR ...............................................................................................................................15

9.4 Calcul du rendement d’extraction .......................................................................................................................................16

10 Expression des résultats............................................................................................................................................................................16

11 Caractéristiques de performance de la méthode ............................................................................................................17

11.1 Étude de validation...........................................................................................................................................................................17

11.2 Sensibilité .................................................................................................................................................................................................17

11.3 Spécificité ..................................................................................................................................................................................................17

11.4 LDD ..............................................................................................................................................................................................................

50 17

12 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................17

Annexe A (normative) Diagramme de mode opératoire...............................................................................................................19

Annexe B (normative) Composition et préparation des réactifs et des tampons ...............................................20

Annexe C (informative) Mélanges réactionnels de RT-PCR en temps réel et paramètres de cycles 23

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ISO 15216-2:2019(F)

Annexe D (informative) Amorces et sondes d’hydrolyse de la RT-PCR en temps réel pour la

détection du VHA, du norovirus GI et GII et du mengovirus (témoin de processus) ..................24

Annexe E (informative) Multiplication de la souche du mengovirus MC utilisé comme

témoin de processus ......................................................................................................................................................................................27

Annexe F (informative) Extraction d’ARN avec le système NucliSens de chez BioMérieux ...................28

Annexe G (informative) Solutions mères d’ARN contrôle externe (ARN CE) ............................................................30

Annexe H (informative) Disposition de plaque optique type ..................................................................................................33

Annexe I (informative) Études de validation de la méthode et caractéristiques de performances .35

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................47

iv © ISO 2019 – Tous droits réservés
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ISO 15216-2:2019(F)
Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.

L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents

critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/directives).

L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion

de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/avant -propos.

Le présent document a été élaboré par le comité technique du Comité européen de normalisation (CEN)

CEN/TC 275, Analyse des produits alimentaires — Méthodes horizontales, en collaboration avec le comité

technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie, conformément à l’accord de

coopération technique établi entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).

Cette première édition annule et remplace ISO/TS 15216-2:2013, qui a fait l’objet d’une révision

technique avec les changements suivants:

— une exigence concernant l’utilisation d’un tampon adapté pour la dilution des témoins a été ajoutée;

— la méthode de préparation de l’ARN du virus témoin de processus pour la courbe étalon a été

modifiée;

— des points d’arrêt avec des paramètres définis de température et de temps dans les méthodes

d’extraction ont été ajoutés;

— le terme «efficacité d’amplification» a été remplacé par «inhibition de la RT-PCR»;

— des réactions supplémentaires de RT-PCR en temps réel pour l’ARN de l’échantillon et les témoins

négatifs ont été ajoutées;

— les caractéristiques de la méthode et les résultats des études de validation de la méthode ont été

ajoutés.

Une liste de toutes les parties de la série ISO 15216 se trouve sur le site web de l’ISO.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
© ISO 2019 – Tous droits réservés v
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ISO 15216-2:2019(F)
Introduction

Le virus de l’hépatite A (VHA) et les norovirus sont des agents importants de maladies virales d’origine

alimentaire, chez l’humain. Aucune méthode de routine n’existe pour la culture des norovirus, et les

méthodes de culture du VHA ne sont pas adaptées à l’application en routine aux matrices alimentaires.

La détection dépend ainsi des méthodes moléculaires qui utilisent une transcription inverse suivie

d’une réaction de polymérisation en chaîne (RT-PCR). Étant donné que de nombreuses matrices

alimentaires contiennent des substances inhibitrices de la technique RT-PCR, il est nécessaire d’utiliser

une méthode d’extraction produisant des préparations d’ARN extrêmement pures et adaptées à

l’usage. En ce qui concerne les surfaces, les virus sont prélevés par écouvillonnage. L’extraction de

virus dans les baies et les légumes feuilles, tiges et bulbes s’effectue par élution sous agitation suivie

d’une précipitation au PEG/NaCl. Pour l’eau embouteillée, une adsorption et une élution utilisant

des membranes chargées positivement, suivies d’une étape de concentration par ultrafiltration sont

utilisées. Les virus contaminant les mollusques bivalves (MBV) sont extraits des tissus digestifs par

traitement avec une solution de protéinase K. Pour toutes les matrices qui ne sont pas couvertes par le

présent document, il est nécessaire de valider cette méthode. La méthode d’extraction d’ARN, commune

à toutes les matrices, est basée sur la lyse de la capside du virus par des réactifs chaotropiques, suivie

d’une adsorption de l’ARN sur des particules de silice. La technique de RT-PCR en temps réel permet

de suivre l’amplification tout au long des cycles de RT-PCR en temps réel en mesurant l’excitation de

molécules marquées par fluorescence. Lors d’une RT-PCR en temps réel utilisant une sonde d’hydrolyse,

le marqueur fluorescent est fixé à une sonde nucléotidique spécifique d’une séquence, ce qui permet

une confirmation simultanée de la présence de la séquence cible. Ces modifications augmentent la

sensibilité et la spécificité de la méthode de RT-PCR en temps réel, et rendent alors inutiles les étapes

de confirmation post RT-PCR du produit amplifié. En raison de la complexité de la méthode, il est

nécessaire d’inclure une série exhaustive de témoins. La méthode décrite dans le présent document

permet la détection des ARN viraux dans l’échantillon pour essai. L’Annexe A présente un diagramme

de mode opératoire.

Les principales modifications énumérées dans l’Avant-propos, introduites dans le présent document

par rapport à l’ISO/TS 15216-2:2013, sont considérées comme mineures (voir l’ISO 17468).

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NORME INTERNATIONALE ISO 15216-2:2019(F)
Microbiologie dans la chaine alimentaire — Méthode
horizontale pour la recherche des virus de l'hépatite A et
norovirus par la technique RT-PCR en temps réel —
Partie 2:
Méthode de détection
1 Domaine d’application

Le présent document spécifie une méthode de détection du virus de l’hépatite A (VHA) et des norovirus

des génogroupes I (GI) et II (GII) dans des échantillons pour essai d’aliments (baies, légumes feuilles,

tiges et bulbes, eau embouteillée, mollusques bivalves) ou sur des surfaces par RT-PCR en temps réel.

Cette méthode n’est pas validée pour la détection des virus cibles dans d’autres aliments (y compris

les aliments à plusieurs composants) ou d’autres matrices, ni pour la détection d’autres virus dans les

aliments, sur les surfaces ou dans d’autres matrices.
2 Références normatives

Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur

contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.

Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les

éventuels amendements).

ISO 20838, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection des

micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences relatives à l'amplification et à la détection

pour les méthodes qualitatives

ISO 22119, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) en temps réel pour la

détection des micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions

ISO 22174, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la recherche de

micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions

3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions de l’ISO 20838, l’ISO 22119, l’ISO 22174

ainsi que les suivants, s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp;

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/.
3.1
aliment
substance utilisée ou préparée pour être utilisée comme aliment

Note 1 à l'article: Pour les besoins du présent document, cette définition inclut l’eau embouteillée.

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ISO 15216-2:2019(F)
3.2
surface

surface des aliments, surface de préparation des aliments ou surface en contact avec les aliments

3.3
baies
petit fruit comestible sans noyau
EXEMPLE Fraises, framboises, groseilles.
3.4
légumes feuilles, tiges et bulbes
feuilles, tiges et bulbes de végétaux consommés en tant que légumes
EXEMPLE Laitue, oignons verts.
3.5
virus de l’hépatite A
VHA
membre de la famille des Picornaviridae responsable d’hépatite infectieuse

Note 1 à l'article: Génétiquement, le VHA peut être subdivisé en six génotypes sur la base de la région VP1/2A

(des génotypes 1, 2 et 3 ont été trouvés chez les humains alors que les génotypes 4, 5 et 6 sont d’origine simienne).

Il n’existe qu’un sérotype.

Note 2 à l'article: La transmission se fait par voie féco-orale de personne à personne, par la consommation

d’aliments (3.1) contaminés, par contact avec de l’eau ou des surfaces (3.2) contaminées, ou par contact avec des

matières contaminées. Le VHA est classé comme étant un agent biologique de groupe 2 par l’Union européenne et

un agent pathogène du groupe de risque 2 selon les United States National Institutes of Health.

3.6
norovirus

membre de la famille des Caliciviridae responsable de cas sporadiques et d’épidémies de

gastroentérites aiguës

Note 1 à l'article: Génétiquement, les norovirus peuvent être subdivisés en sept génogroupes distincts. Trois de

ces génogroupes, GI, GII et GIV, ont été impliqués dans des troubles gastro-intestinaux chez l’homme. GI et GII

sont responsables de la grande majorité des cas cliniques.

Note 2 à l'article: La transmission se fait par voie féco-orale de personne à personne, par la consommation d’aliments

(3.1) contaminés, par contact avec de l’eau ou des surfaces (3.2) contaminées, ou par contact avec des matières

contaminées. Les norovirus GI et GII sont classés comme étant des agents biologiques de groupe 2 par l’Union

européenne et des agents pathogènes du groupe de risque 2 selon les United States National Institutes of Health.

3.7
détection du VHA

détection de l’ARN du VHA (3.5) dans une masse ou un volume d’aliments (3.1) ou sur une superficie de

surface (3.2) prédéterminés
3.8
détection des norovirus

détection de l’ARN du norovirus (3.6) dans une masse ou un volume d’aliments (3.1) ou sur une superficie

de surface (3.2) prédéterminés
3.9
virus témoin de processus

virus ajouté à la prise d’échantillon, avant de commencer l’extraction du virus, afin de contrôler le

rendement d’extraction
3.10
ARN du virus témoin

ARN extrait du virus témoin de processus (3.9) permettant d’établir une courbe étalon en vue de

l’estimation du rendement d’extraction
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ISO 15216-2:2019(F)
3.11
témoin négatif d’extraction d’ARN

témoin sans ARN cible soumis à toutes les étapes du mode opératoire d’extraction d’ARN et de détection

permettant de s’assurer de l’absence de contamination
3.12
témoin négatif de processus

échantillon de la matrice alimentaire sans agent pathogène cible, ou échantillon n’appartenant pas à la

matrice sans agent pathogène cible, soumis à toutes les étapes du processus analytique

3.13
sonde d’hydrolyse

sonde fluorescente couplée à une molécule fluorescente et une molécule quencher, qui sont séparées de

façon stérique par l’activité d’exonucléasique 5‘-3‘ de l’enzyme pendant le processus d’amplification

3.14
témoin négatif de RT-PCR en temps réel

aliquot d’eau très pure utilisée dans une RT-PCR en temps réel permettant de s’assurer de la non-

contamination des réactifs de RT-PCR en temps réel
3.15
ARN contrôle externe
ARN CE

ARN de référence pouvant être utilisé pour évaluer l’inhibition de l’amplification d’une réaction de

RT-PCR en temps réel appropriée, qui est ajouté à un aliquot d’ARN de l’échantillon selon une quantité

donnée dans une réaction distincte

EXEMPLE ARN synthétisé par transcription in vitro à partir d’un plasmide portant une copie du gène cible.

3.16
valeur C

cycle de quantification, correspondant au moment réactionnel où la cible est quantifiée pour une

réaction donnée de RT-PCR en temps réel

Note 1 à l'article: Cela correspond au cycle auquel la réaction de fluorescence dépasse un niveau seuil.

4 Principe
4.1 Extraction de virus

Les aliments et les surfaces couverts par le présent document sont souvent des matrices hautement

complexes et les virus cibles peuvent être présents à de faibles concentrations. Il est donc nécessaire

d’effectuer une extraction et/ou une concentration du virus propre à la matrice afin de produire un

substrat pour les parties communes ultérieures du processus. Le choix de la méthode dépend de la

matrice.
4.2 Extraction d’ARN

Il est nécessaire d’extraire l’ARN en utilisant une méthode qui permet d’obtenir des préparations d’ARN

de pureté appropriée afin de réduire les effets des inhibiteurs de RT-PCR. Dans le présent document,

le thiocyanate de guanidinium, réactif chaotropique, est utilisé pour la lyse de la capside virale. L’ARN

est ensuite adsorbé sur de la silice afin de faciliter la purification à travers plusieurs étapes de lavage.

L’ARN viral purifié est libéré de la silice dans un tampon avant la RT-PCR en temps réel.

4.3 RT-PCR en temps réel

Le présent document utilise la RT-PCR en temps réel en une étape avec des sondes d’hydrolyse. Dans la

technique de RT-PCR en temps réel en une étape, la transcription inverse et l’amplification par PCR sont

effectuées consécutivement dans le même tube.
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ISO 15216-2:2019(F)

La RT-PCR en temps réel utilisant des sondes d’hydrolyse comprend une sonde d’ADN courte marquée

par une molécule fluorescente et un quencher fluorescent respectivement aux extrémités 5’ et 3’. La

chimie de cette réaction garantit qu’au cours du processus d’amplification de la cible, la sonde est

hydrolysée et le signal fluorescent libéré par la sonde augmente proportionnellement.

En raison des faibles concentrations de virus cible dans les aliments ou sur les surfaces et de la diversité

des souches dans les virus cibles, il est important de sélectionner de façon adéquate des réactifs pour

RT-PCR en temps réel en une étape, des amorces PCR et des sondes d’hydrolyse adaptés aux virus cibles.

Pour cela, des lignes directrices sont données en 5.2.19 et 5.2.20. Des exemples détaillés de réactifs,

d’amorces et de sondes (utilisés lors de l’élaboration du présent document) sont fournis dans les

Annexes C et D.
4.4 Témoins
4.4.1 Virus témoin de processus

Des pertes de virus cible peuvent se produire à différentes étapes lors de l’extraction de virus dans

l’échantillon et de l’extraction de l’ARN. Afin de contrôler ces pertes, les échantillons sont contaminés

artificiellement dès que cela est possible avant de commencer l’extraction du virus avec une quantité

définie de virus témoin de processus. Le niveau de récupération du virus témoin de processus doit être

déterminé pour chaque échantillon.

Le virus sélectionné en tant que témoin de processus doit être un virus cultivable, non enveloppé, à

ARNsb (simple brin) de polarité positive, de taille similaire aux virus cibles afin de fournir un modèle

morphologique et physico-chimique correct. Le virus témoin de processus doit montrer une persistance

dans l’environnement semblable aux virus cibles. Le virus doit être suffisamment différent sur le plan

génétique par rapport aux virus cibles afin de ne pas avoir de réactions RT-PCR en temps réel croisées

entre virus cibles et virus témoins, et sa présence dans les aliments ou sur les surfaces à l’état naturel

ne doit normalement pas être possible.

Un exemple de préparation du virus témoin de processus (utilisé lors de l’élaboration du présent

document) est fourni à l’Annexe E.
4.4.2 Témoin ARN CE

Des substances inhibitrices de la RT-PCR sont contenues dans de nombreuses matrices alimentaires,

mais peuvent également provenir d’une contamination due à un traitement effectué en amont. Afin

d’évaluer l’éventuelle inhibition de la RT-PCR dans un échantillon individuel, un ARN CE (une séquence

d’ARN comportant la séquence cible d’intérêt, 5.3.11) est ajouté à un aliquot d’ARN de l’échantillon et

soumis à essai en utilisant la méthode RT-PCR en temps réel. Une comparaison des résultats de cet essai

avec les résultats d’un ARN CE amplifié en l’absence d’ARN de l’échantillon permet la détermination du

niveau d’inhibition de la RT-PCR pour chaque échantillon soumis à essai. De plus, dans cette méthode, le

témoin ARN CE agit comme un témoin positif de la RT-PCR en temps réel pour les virus cibles.

Il est permis d’appliquer des approches différentes pour l’évaluation de l’inhibition

...

Questions, Comments and Discussion

Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.