ISO 21474-2:2022
(Main)In vitro diagnostic medical devices — Multiplex molecular testing for nucleic acids — Part 2: Validation and verification
In vitro diagnostic medical devices — Multiplex molecular testing for nucleic acids — Part 2: Validation and verification
This document gives the general requirements for validation and verification of multiplex molecular tests which simultaneously identify two or more nucleic acid target sequences of interest. This document is applicable to all multiplex methods used for examination using IVD medical devices and laboratory developed tests (LDTs). It provides information for both qualitative and quantitative detection of nucleic acid target sequences. This document is intended as guidance for multiplex examinations that either detect and/or quantify human nucleic acid target sequences or microbial pathogen nucleic acid target sequences from human clinical specimens. This document is applicable to any molecular in vitro diagnostic (IVD) examination performed by medical laboratories. It is also intended to be used by laboratory customers, IVD developers and manufacturers, biobanks, institutions, and commercial organizations performing biomedical research and regulatory authorities. This document is not applicable to metagenomics. NOTE An examination procedure developed for a laboratory’s own use is often referred to as a “laboratory developed test,” “LDT,” or “in-house test”.
Dispositifs médicaux de diagnostic in vitro – Tests moléculaires multiplex pour les acides nucléiques — Partie 2: Validation et vérification
Le présent document donne les exigences générales de validation et de vérification des tests moléculaires multiplex qui identifient simultanément deux séquences cibles d’acide nucléique d’intérêt ou plus. Le présent document est applicable à toutes les méthodes multiplex utilisées pour analyser les dispositifs médicaux DIV et les tests développés en laboratoire (TDL). Il fournit des informations sur la détection qualitative et quantitative des séquences cibles d’acide nucléique. Le présent document est conçu comme une recommandation pour les analyses multiplex qui détectent et/ou quantifient les séquences cibles d’acide nucléique humain ou les séquences cibles d’acide nucléique pathogène microbien dans les échantillons cliniques humains. Il est applicable aux analyses de diagnostic in vitro (DIV) moléculaires effectuées par les laboratoires médicaux. Il est également destiné à être utilisé par des clients de laboratoires, des développeurs et fabricants de l’industrie du DIV, ainsi que par des biobanques, des institutions et des organismes commerciaux spécialisés en recherche biomédicale, de même que des autorités de réglementation. Le présent document n’est pas applicable à la métagénomique. NOTE Un mode opératoire d’analyse développé pour le propre usage d’un laboratoire est souvent appelé «test développé en laboratoire», «TDL» ou «test interne».
General Information
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21474-2
First edition
2022-05
In vitro diagnostic medical devices —
Multiplex molecular testing for nucleic
acids —
Part 2:
Validation and verification
Dispositifs médicaux de diagnostic in vitro – Tests moléculaires
multiplex pour les acides nucléiques —
Partie 2: Validation et vérification
Reference number
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Published in Switzerland
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ISO 21474-2:2022(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 General requirements . 2
4.1 General . 2
4.2 Laboratory requirements . 2
4.3 Reagents requirements . 3
4.4 Apparatus and equipment . 3
4.5 Reference and control materials . 3
4.5.1 General . 3
4.5.2 Endogenous nucleic acid . 4
4.5.3 Nongenomic reference materials (RMs) . 4
4.6 Calibration of the analysis . 4
4.7 Input range . 4
5 Evaluation of performance characteristics. 5
5.1 General . 5
5.2 Analytical specificity . 5
5.2.1 Analytical reactivity . 5
5.2.2 Limit of blank. 6
5.2.3 Cross-reactivity . 6
5.2.4 Exclusivity . 7
5.2.5 Interfering substances and carryover . 7
5.3 Range of reliable signal, reportable range and reference range . 7
5.4 Limit of detection of multiplex molecular test platform (LODP) . 7
5.5 Measurement precision and uncertainty . 8
5.6 Accuracy and method comparison studies . 8
Annex A (informative) Certified reference materials (CRMs) .10
Annex B (informative) Example of human genome reference materials (RMs) .12
Bibliography .15
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ISO 21474-2:2022(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to
the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see
www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 212, Clinical laboratory testing and in
vitro diagnostic test systems.
A list of all parts in the ISO 21474 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
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ISO 21474-2:2022(E)
Introduction
The first generation of in vitro diagnostic (IVD) medical devices for nucleic acid-based molecular
tests focused on detection or quantitation of a single nucleic acid sequence (eg, viral RNA, mRNA, and
genomic DNA) within a clinical specimen. By comparison, a multiplex molecular test simultaneously
measures multiple nucleic acid sequences of interests in a single reaction. The development and clinical
use of multiplex IVD medical devices are rapidly expanding with the technological advances and new
elucidation of clinical significance of the many biomarkers.
The competition among reactions in multiplex molecular tests can impose more stringent requirements
for sample purity, input reagents and platforms to avoid nonspecific reactions and background signal.
In comparison to single target analysis, multiplex molecular tests require an increased number of
controls, more complex performance evaluation/data analysis algorithms and more complex reporting
of results.
Laboratories can develop assays in-house (“home-brew, laboratory-developed, in-house”) or use
commercially available multiplex assays involving a variety of technologies and instrument platforms.
With the increase in the availability and use of multiplex molecular tests, a guideline for the
development, validation, verification, control, data analysis, and implementation of multiplex molecular
tests is increasingly needed. For a multiplex molecular test to reliably achieve its intended use, there
should be control of the process from the acquisition of the sample and preparation of the nucleic acid
for testing to the evaluation of the data and the reporting of the results. Multiplex molecular testing
provides significant challenges to the laboratory with regards to appropriate validation and verification,
acquisition of appropriate control materials, data analysis, and reporting. The complexity of data
analysis and reporting of results is increased relative to singleplex assays. Moreover, the availability
of sufficient and appropriate control and reference materials (RMs) to properly validate and verify
multiplex molecular tests is a major challenge. However, the use of partial or full sequencing techniques
can be useful in qualifying control materials. This document describes the recommendations for
various aspects of validation and verification of the measurement by multiplex molecular tests in order
to ensure reproducible performance of such tests, in developing and implementing multiplex molecular
nucleic acid tests for clinical use.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 21474-2:2022(E)
In vitro diagnostic medical devices — Multiplex molecular
testing for nucleic acids —
Part 2:
Validation and verification
1 Scope
This document gives the general requirements for validation and verification of multiplex molecular
tests which simultaneously identify two or more nucleic acid target sequences of interest. This
document is applicable to all multiplex methods used for examination using IVD medical devices
and laboratory developed tests (LDTs). It provides information for both qualitative and quantitative
detection of nucleic acid target sequences.
This document is intended as guidance for multiplex examinations that either detect and/or quantify
human nucleic acid target sequences or microbial pathogen nucleic acid target sequences from human
clinical specimens.
This document is applicable to any molecular in vitro diagnostic (IVD) examination performed
by medical laboratories. It is also intended to be used by laboratory customers, IVD developers and
manufacturers, biobanks, institutions, and commercial organizations performing biomedical research
and regulatory authorities. This document is not applicable to metagenomics.
NOTE An examination procedure developed for a laboratory’s own use is often referred to as a “laboratory
developed test,” “LDT,” or “in-house test”.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 15189, Medical laboratories — Requirements for quality and competence
ISO 21474-1, In vitro diagnostic medical devices — Multiplex molecular testing for nucleic acids — Part 1:
Terminology and general requirements for nucleic acid quality evaluation
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, terms and definitions given in ISO 21474-1 and the following apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
analytical sensitivity
quotient of the change in a measurement indication and the corresponding change in a value of a
quantity being measured
[1]
[SOURCE: ISO 18113-1:2009, A.3.3, modified —NOTES 1 to 4 were removed .]
1
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ISO 21474-2:2022(E)
3.2
diagnostic sensitivity
ability of an in vitro diagnostic (IVD) examination procedure to identify the presence of a target
marker associated with a specific disease or condition
[1]
[SOURCE: ISO 18113-1:2009, A.3.15, modified —NOTES 1 to 4 were removed .]
4 General requirements
4.1 General
Multiplex molecular tests are IVD medical devices that detect and/or measure multiple nucleic acid
sequences simultaneously, such as multiplex PCR, DNA microarray, and massive parallel sequencing-
based methodologies.
In cases of multiplex molecular tests for nucleic acid, competition among individual reactions may
impose more rigorous requirements for sample purity, sample input, reagents, and platforms to avoid
nonspecific reactions and background signal. In comparison to singleplex analysis, multiplex molecular
tests can have an increased number of controls, more complex performance evaluation/data analysis
algorithms, and more complex reporting of results.
Validation activities are aimed to ensure determination of performance characteristics for intended
use, which is performed in the test development process, by either the manufacturer or laboratory. The
design verification and validation plan, created by manufacturers for an IVD and laboratories for an
LDT, should aim to establish performance specifications such as accuracy, specificity, precision, LOD/
assay range, and cross-reactivity/interfering substance. When planning the development of a test, the
intended use shall be defined, including specimen types to be used. The examination manufacturer
shall specify instructions for examination processses. These shall be followed. Whenever any processes
or methods are changed during the verification process and after the implementation, a laboratory shall
validate the assay with the new performance characteristics. The laboratory shall perform verification
activities to confirm the design input specifications required for patient testing in advance. The
laboratory then performs ongoing quality assurance (QA) of the multiplex molecular tests by document
control of procedures, operator training, routine quality control (QC), proficiency testing, instrument
calibration, and result correlation with clinical findings.
The validity and reliability of multiplex molecular test result can be impacted by all steps of a laboratory
workflow, including primary sample collection, transport, storage, and processing in the preanalytical
phase as well as by the analytical phase itself.
[2]
NOTE The CLSI guideline, MM17-A provides recommendations for various aspects of verification and
validation of multiplex testing.
4.2 Laboratory requirements
The requirement for quality and competence in medical laboratories shall be as described in ISO 15189.
For assays that are not fully integrated in a single disposable or on a single platform (from sample
to result), sample treatment should be carried out in separate working areas/rooms as specified in
[3]
ISO 22174:2005, Clause 6 .
Accidental contamination of DNA and RNA can originate from aerosols containing template, such
as amplicons generated from previously amplified NA (nucleic acid) targets. As a consequence, the
organization of the work area in the laboratory and good practice shall be based on
— the systematic containment of the methodological steps involved in the production of the results,
and
— a “forward flow” principle for sample handling.
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The latter ensures that DNA and RNA in the test material remain physically segregated. Further details
[4]
can be found in ISO 21571 .
4.3 Reagents requirements
All reagents and materials used in the analysis should be identical, or equivalent, to those specified in
the method. Otherwise, all reagents and materials should be of grade relevant for molecular biology,
e.g. DNase and RNase free water.
Those reagents shall be stored and used as recommended by the supplier or according to the laboratory
QA specifications.
The characteristics and quality of reagents (e.g. fluorescent dye(s), buffers) and the amount of an
external measurement standard, or reference material (RM), that is added to the reaction mixture
should be validated/verified.
All critical reagents should be tested for functionality before inclusion in formal performance
evaluations. In multiplex molecular tests, functionality should be evaluated using synthetic controls,
when not feasible to establish it for all the targets using genomic specimens.
Where the examination manufacturer provides instructions for storage and use of a commercial kit
for measurement, these shall be followed. Where the examination manufacturer does not provide such
instructions, they shall be specified and validated by the laboratory and followed.
4.4 Apparatus and equipment
The laboratory should use properly validated (i.e. installation qualified, operationally qualified and
performance qualified) and maintained equipment according to the manufacturers’ instructions and
the requirements given in ISO 15189. In addition to standard laboratory equipment, specific apparatus
for multiplex analysis is described in the corresponding individual standards, e.g. ISO 16578 for
[5]
microarray .
Where available, calibration should be routinely performed and records maintained on equipment
where performance can impact the data produced.
4.5 Reference and control materials
4.5.1 General
Whenever reference materials (RMs) are available, they shall be selected to be fit for their intended use.
When RMs are not available, the alternative approaches shall be planned, developed and documented.
RMs shall be considered for the validation of multiplex molecular testing for nucleic acid. RMs can also
be used for qualitative or quantitative methods, serving many different functions, such as calibration
and assessment of an examination procedure. Especially for genomic analysis using massive parallel
sequencing methods, genomic RMs can vary the sequence data depending on the chosen material (see
Annexes A and B); therefore, RMs for such methods shall be considered for fitting to the intended use.
The laboratory should use QC materials that react to the examining system in a manner as close as
possible to patient sample, as specified in ISO 15189. If these control materials are not available, it is
not possible to test all the probes present in the panel for reagent acceptance or fidelity monitoring. The
laboratory will adapt its arrangements notably by taking into account the clinical context.
Examination results shall be evaluated to confirm that the quality of the sample fits for the intended
use. When the evaluation is performed, the use of RMs (see Annexes A and B) including nongenomic
(see 4.5.3) and genomic (see 4.5.2) RMs shall be considered.
To validate the use of different matrices, overload assays (spiking) are necessary.
3
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Where the manufacturer provides instructions for storage and use of RMs and control materials for
measurement, these shall be followed. Where the examination manufacturer does not provide such
instructions, they shall be specified and validated by the laboratory and followed.
4.5.2 Endogenous nucleic acid
Genomic DNA (gDNA) is the QC material that most closely resembles patient samples, and the most
preferable, although not always the most efficient. The presence or absence of the mutations or variants
in any material (e.g. immortalized human cell lines, purified gDNA, bacterial/microbial cultures, and
bacterial gDNA) should be validated or verified by the laboratory for each new lot obtained before use.
Synthetic recombinant engineered or artificially constructed long DNA, e.g. recombinant artificial
chromosomes, can be used as an alternative control material of gDNA (see 4.5.3). Several transcripts of
housekeeping genes can be used as control materials.
NOTE Housekeeping genes include, e.g. beta-actin, GAPDH and cyclophilin.
4.5.3 Nongenomic reference materials (RMs)
Nongenomic QC materials are synthetic, recombinant, engineered, or artificially constructed, and are
often composed of plasmids, due to their stability and ease of use. Nongenomic QC materials are of
great value and particularly suitable for multiplex assays, since they can be engineered to contain all
sequence variants in gene segments in one sample detected in an assay. Nongenomic controls should
be chosen for QA purposes carefully to be sure that they are suitable for monitoring the desired system
parameters. There are concerns and limitations regarding nongenomic controls. Some test systems
and/or software are not designed to correctly identify multiple alleles contained in a multiplex control.
Nongenomic controls have to be added to the patient material, and therefore cannot behave exactly
as patient-derived material through the entire analysis process. This situation is of particular concern
when there is a reasonable chance of mispriming or false-positive reporting, due to the presence of
pseudogenes or other sequences normally present with high homology to the target of interest.
Nongenomic RMs can be used for not only DNA analysis but also RNA analysis.
NOTE DNA or RNA RMs can be evaluated by establishing metrological traceability from certified RMs such
as NMIJ CRM 6205-a and NMIJ CRM 6204-b.
4.6 Calibration of the analysis
In the quantitative measurement, such as for qPCR-based assays, an appropriate number of calibration
points and replicates covering the range of reliable signal should be applied. The calibration influences
[16]
the measurement uncertainty (MU). More details on calibration of PCR are described in ISO 20395 .
An alternative to genomic DNA or mRNA calibration RMs can be considered for use, provided that it is
demonstrated to perform in an equivalent way to the genomic DNA RM and the genomic DNA extracted
from the sample, or the mRNA RM and the mRNA extracted from the sample.
EXAMPLE As an alternative to genomic DNA or mRNA calibration RMs, a dilution series of a plasmid or
synthetic dsDNA containing the target sequence or a plasmid or synthetic dsDNA and ssRNA can be respectively
used.
4.7 Input range
Input nucleic acid should be titrated to optimize the range of concentrations, in order to ensure the
detection of each target sequence in a given assay, e.g. typical ranges for PCR, arrays, and sequencing.
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5 Evaluation of performance characteristics
5.1 General
The validation protocol should start with an explicit statement of the intended use, which will determine
the types of samples and the performance characteristics that need to be addressed.
The validation protocol should be designed carefully to ensure that all relevant parameters are
addressed as efficiently as possible. Based on design and development planning, the laboratory shall
perform validation of the intended use of the test in comparison to an existing predicate device, if
available. When a predicate device is not available, the laboratory shall validate the intended use by
appropriately designed studies. In accordance with the validation plan, the laboratory shall describe
and document relevant performance characteristics of the test in relation to the disease or other
clinical context assessed by the test. The laboratory shall identify those test characteristics that are
critically associated with the clinical relevance and clinical utility of the test. These characteristics
shall be documented as clinical performance characteristics. For more details regarding the test using
[17]
nucleic acid amplification for microbial pathogens, see ISO 17822 .
Analytical performance evaluations should test the multiplex molecular test system in its final
configuration, and not in separate singleplex experiments.
Considerations specific to the multiplex molecular tests should include, but not be limited to:
— a type and heterogeneity of the specimen;
— LOD that is clinically needed;
— genetic promiscuity and instability of target sequences.
EXAMPLE Examples of genetic promiscuity and instability of target sequences are sequence heterogeneity
both within the disease and across the progression of it, specificity when considering closely related target
of sequence, genetic origin of acquired or inherited when considering with disease inheritance, and genetic
association when considering the disease diagnosis, prognosis or treatment.
NOTE Recommendations on practical guidance for laboratories regarding validation and verification of
[6][7][8]
massive parallel sequencing for genetic diseases are provided in the literature .
In the verification process of a supplier method, major issues to be addressed should include as follows:
— the issue of testing all the probes present in the panel;
— the issue (or even the impossibility) of providing a number of samples that is statistically significant
to conclude on the validity of the tests in particular “positive samples”;
— the issue of comparing the method to an earlier method;
— the complex problem of using internal QCs for all the targets of the panel.
The selection of the analytical performance evaluation tests that are performed should include the
consideration of the design or operating principles of the IVD as well as the intended use or purpose.
For example, limit of quantitation (LoQ) can not be applicable for an IVD that renders a qualitative or
binary result.
5.2 Analytical specificity
5.2.1 Analytical reactivity
Since analytes such as sequence variants or pathogen-specific sequences often respond differently
to reagent variability, all targeted analytes shall be tested, when possible, for accurate results. The
major analytes detected with selected reagent shall be identified. The information of major analytes
should be considered to include in the minimum specifications for the reagents. Those analytes most
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sensitive to reagent parameters shall be identified and used to establish minimum specifications for
the reagents. For the detection analysis of pathogens, weakly positive specimens, e.g. at the established
limit of detection (LOD) concentration, or at a copy number empirically established at the lower end of
the diagnostic range, should be included. It is also possible to use previously negative assayed samples
loaded (spiked) with a defined amount of copies.
Analytical specificity may be established and demonstrated through a variety of tests. The following
are the routine tests that establish analytical specificity and reactivity. Analytical specificity of
an assay is its ability to detect and identify only the intended sequences or biomarkers. Challenging
an assay to detec
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 21474-2
Première édition
2022-05
Dispositifs médicaux de diagnostic in
vitro – Tests moléculaires multiplex
pour les acides nucléiques —
Partie 2:
Validation et vérification
In vitro diagnostic medical devices — Multiplex molecular testing for
nucleic acids —
Part 2: Validation and verification
Numéro de référence
ISO 21474-2:2022(F)
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Web: www.iso.org
Publié en Suisse
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ISO 21474-2:2022(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d'application .1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions . 1
4 Exigences générales . .2
4.1 Généralités . 2
4.2 Exigences de laboratoire. 2
4.3 Exigences relatives aux réactifs . 3
4.4 Appareillage et matériel . 3
4.5 Matériaux de référence et de contrôle . 3
4.5.1 Généralités . 3
4.5.2 Acide nucléique endogène . 4
4.5.3 Matériaux de référence (MR) non génomiques . 4
4.6 Étalonnage de l’analyse . 5
4.7 Gamme de concentrations . 5
5 Évaluation des caractéristiques de performance . 5
5.1 Généralités . 5
5.2 Spécificité analytique . 6
5.2.1 Réactivité analytique . 6
5.2.2 Limite de blanc . 6
5.2.3 Réactivité croisée . 7
5.2.4 Exclusivité . 7
5.2.5 Substances interférentes et contamination . 7
5.3 Étendue de mesure, intervalle de mesure et intervalle de référence . 8
5.4 Limite de détection de la plateforme de tests moléculaires multiplex (LODP) . 8
5.5 Fidélité et incertitude de mesure . 9
5.6 Exactitude et études comparatives des méthodes . 9
Annexe A (informative) Matériaux de référence certifiés (MRC) .11
Annexe B (informative) Exemples de matériaux de référence (MR) génomiques humains .13
Bibliographie .16
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ISO 21474-2:2022(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document
a été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets rédigées par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, de la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute autre information au sujet de
l’adhésion de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les
obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www.iso.org/iso/fr/avant-propos.html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 212, Laboratoires de biologie médicale
et systèmes de diagnostic in vitro.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 21474 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l'adresse www.iso.org/fr/members.html.
iv
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ISO 21474-2:2022(F)
Introduction
La première génération de dispositifs médicaux de diagnostic in vitro (DIV) pour les tests moléculaires
pour les acides nucléiques ciblait la détection ou la quantification d’une seule séquence d’acide nucléique
(par exemple, ARN viral, ARNm et ADN génomique) dans un échantillon clinique. En comparaison,
un test moléculaire multiplex mesure simultanément plusieurs séquences d’acide nucléique d’intérêt
au cours d’une seule réaction. Le développement et l’utilisation clinique de dispositifs médicaux DIV
multiplex se généralisent rapide, grâce aux progrès technologiques et aux nouvelles avancées sur la
signification de nombreux biomarqueurs.
La compétition entre les réactions lors des tests moléculaires multiplex peut imposer des exigences plus
strictes en termes de pureté des échantillons, quantité de réactifs et de plateformes pour éviter toute
réaction non spécifique et tout bruit de fond. Comparés à l’analyse monocible, les tests moléculaires
multiplex nécessitent un nombre élevé de contrôles, des algorithmes d’évaluation des performances/
d’analyse des données plus complexes et un compte-rendu plus élaboré des résultats.
Les laboratoires peuvent développer des dosages en interne (« maison, développés en laboratoire,
en interne ») ou utiliser des dosages multiplex disponibles dans le commerce impliquant diverses
plateformes technologiques et instrumentales. Au vu de l’augmentation de la disponibilité et de
l’utilisation des tests moléculaires multiplex, des lignes directrices relatives au développement, à la
validation, à la vérification, au contrôle, à l’analyse de données et à la mise en œuvre de tests moléculaires
multiplex est plus que jamais nécessaire. Pour que l’utilisation prévue d’un test moléculaire multiplex
soit fiable, il convient de contrôler le processus allant de l’acquisition de l’échantillon et de la préparation
de l’acide nucléique en vue du test jusqu’à l’évaluation des données et au compte-rendu des résultats.
Les laboratoires chargés d’effectuer les tests moléculaires multiplex sont confrontés à d’importantes
problématiques en termes de validation et vérification appropriées, acquisition de matériaux de
contrôle appropriés, analyse de données et compte-rendu. La complexité d’analyse des données et de
compte-rendu des résultats est plus importante que celle des tests monoplex. De plus, la principale
problématique associée à la validation et la vérification adéquates des tests moléculaires multiplex est
la disponibilité des matériaux de contrôle et de référence (MR) suffisants et appropriés. Cependant, il
peut être utile d’employer des techniques de séquençage partiel ou complet pour qualifier les matériaux
de contrôle. Le présent document décrit les recommandations pour différents aspects de la validation
et de la vérification du mesurage par des tests moléculaires multiplex, afin d’assurer une performance
reproductible de ces tests, dans le cadre du développement et de la mise en œuvre de tests moléculaires
multiplex pour les acides nucléiques à usage clinique.
v
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NORME INTERNATIONALE ISO 21474-2:2022(F)
Dispositifs médicaux de diagnostic in vitro – Tests
moléculaires multiplex pour les acides nucléiques —
Partie 2:
Validation et vérification
1 Domaine d'application
Le présent document donne les exigences générales de validation et de vérification des tests
moléculaires multiplex qui identifient simultanément deux séquences cibles d’acide nucléique d’intérêt
ou plus. Le présent document est applicable à toutes les méthodes multiplex utilisées pour analyser les
dispositifs médicaux DIV et les tests développés en laboratoire (TDL). Il fournit des informations sur la
détection qualitative et quantitative des séquences cibles d’acide nucléique.
Le présent document est conçu comme une recommandation pour les analyses multiplex qui détectent
et/ou quantifient les séquences cibles d’acide nucléique humain ou les séquences cibles d’acide nucléique
pathogène microbien dans les échantillons cliniques humains.
Il est applicable aux analyses de diagnostic in vitro (DIV) moléculaires effectuées par les laboratoires
médicaux. Il est également destiné à être utilisé par des clients de laboratoires, des développeurs
et fabricants de l’industrie du DIV, ainsi que par des biobanques, des institutions et des organismes
commerciaux spécialisés en recherche biomédicale, de même que des autorités de réglementation. Le
présent document n’est pas applicable à la métagénomique.
NOTE Un mode opératoire d’analyse développé pour le propre usage d’un laboratoire est souvent appelé
«test développé en laboratoire», «TDL» ou «test interne».
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 15189, Laboratoires de biologie médicale — Exigences concernant la qualité et la compétence
ISO 21474-1, Dispositifs médicaux de diagnostic in vitro — Tests moléculaires multiplex pour les acides
nucléiques — Partie 1: Terminologie et exigences générales pour l’évaluation de la qualité des acides
nucléiques
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l’ISO 21474-1 ainsi que les
suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
1
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ISO 21474-2:2022(F)
3.1
sensibilité analytique
quotient de la variation d’une indication d’un système de mesure par la variation correspondante de la
valeur de la grandeur mesurée
[1]
[SOURCE: ISO 18113-1:2009, A.3.3, modifié — Les NOTES 1 à 4 ont été supprimées .]
3.2
sensibilité diagnostique
aptitude d'une procédure d'analyse de diagnostic in vitro (DIV) à identifier la présence d'un
marqueur cible associé à une maladie particulière ou à un état particulier
[1]
[SOURCE: ISO 18113-1:2009, A.3.15, modifié — Les NOTES 1 à 4 ont été supprimées .]
4 Exigences générales
4.1 Généralités
Les tests moléculaires multiplex sont des dispositifs médicaux DIV qui détectent et/ou mesurent
plusieurs séquences d’acide nucléique simultanément, notamment les méthodes de PCR multiplex,
biopuces ADN et séquençage massif en parallèle.
Dans le cas des tests moléculaires multiplex pour l’acide nucléique, la compétition entre les réactions
individuelles peut imposer des exigences plus strictes en termes de pureté des échantillons, quantité
d’échantillons, réactifs et plateformes pour éviter toute réaction non spécifique et tout bruit de fond.
Comparés à l’analyse monoplex, les tests moléculaires multiplex peuvent avoir un nombre élevé de
contrôles, des algorithmes d’évaluation des performances/d’analyse des données plus complexes et un
compte-rendu plus élaboré des résultats.
Les activités de validation sont destinées à assurer la détermination des caractéristiques de performance
en fonction de l’utilisation prévue, celles-ci sont effectuées pendant le processus de mise au point du
test, soit par le fabricant soit par le laboratoire. Il convient que le plan de vérification et de validation
de conception, créé par les fabricants dans le cas d’un DIV et par les laboratoires dans le cas d’un TDL,
établisse les caractéristiques de performance telles que l’exactitude, la spécificité, la fidélité, la limite
de détection/gamme d’essai et la réactivité croisée/substance interférente. Lors de la planification
de la mise au point d’un test, l’utilisation prévue doit être définie, y compris les types d’échantillons
à utiliser. Le fabricant doit spécifier les instructions relatives aux modes opératoires d’analyse. Ces
instructions doivent être suivies. Dès qu’un mode opératoire ou une méthode est modifié au cours du
processus de vérification et après la mise en œuvre, un laboratoire doit valider l’essai avec les nouvelles
caractéristiques de performance. Préalablement aux tests sur les patients, le laboratoire doit effectuer
une vérification de méthode pour confirmer que les caractéristiques de performance requises pour les
patients peuvent être atteintes. Le laboratoire doit mettre en œuvre un programme d’assurance qualité
(AQ) continue des tests moléculaires multiplex par un contrôle de documents des modes opératoires,
une formation des opérateurs, un contrôle qualité (CQ) de routine, des essais d’aptitude, un étalonnage
des instruments et une corrélation des résultats avec les observations cliniques.
La validité et la fiabilité du résultat du test moléculaire multiplex peuvent être influencées par toutes
les étapes d’un processus de laboratoire, y compris le prélèvement d’échantillons primaires, le stockage
pendant le transport et le traitement lors de la phase préanalytique, ainsi que par la phase analytique
elle-même.
[2]
NOTE La ligne directrice MM17-A du CLSI fournit des recommandations pour plusieurs aspects de la
vérification et de la validation de tests multiplex.
4.2 Exigences de laboratoire
Les exigences relatives à la qualité et aux compétences des laboratoires médicaux doivent être telles
que décrites dans l’ISO 15189.
2
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Pour les essais qui ne sont pas entièrement intégrés dans un dispositif à usage unique ou sur une seule
plateforme (de l’échantillon au résultat), il convient d’effectuer le traitement des échantillons dans des
[3]
locaux/pièces séparés, comme indiqué dans l’ISO 22174:2005, Article 6 .
La contamination accidentelle de l’ADN et de l’ARN peut être due à des aérosols contenant des matrices,
par exemple des amplicons générés par les acides nucléiques cibles préalablement amplifiés. En
conséquence, l’organisation du local au sein du laboratoire et les bonnes pratiques doivent reposer sur:
— le confinement systématique des étapes méthodologiques intervenant dans la production des
résultats; et
— un principe de «marche en avant» pour la manipulation des échantillons.
Ce dernier garantit que l’ADN et l’ARN présents dans le matériau d’essai restent physiquement séparés
[4]
(des amplicons). Des détails supplémentaires peuvent être trouvés dans l’ISO 21571 .
4.3 Exigences relatives aux réactifs
Il convient que tous les réactifs et matériaux utilisés lors de l’analyse soient identiques ou équivalents à
ceux spécifiés dans la méthode. Si ce n’est pas le cas, il convient que tous les réactifs et matériaux aient
une qualité adaptée à la biologie moléculaire, par exemple de l’eau exempte de DNase et de RNase.
Ces réactifs doivent être conservés et utilisés selon les recommandations du fournisseur ou
conformément aux spécifications d'AQ du laboratoire.
Il convient de valider/vérifier les caractéristiques et la qualité des réactifs (par exemple, fluorophore(s),
tampons) ainsi que la quantité d’un étalon externe (ou matériau de référence, MR) ajouté au mélange
réactionnel.
Il convient d’analyser les caractéristiques de tous les réactifs critiques avant de les inclure dans les
évaluations de performance formelles. Dans les tests moléculaires multiplex, il convient d’évaluer les
caractéristiques à l’aide de contrôles synthétiques, lorsqu’il n’est pas possible de l’établir pour toutes les
cibles utilisant des échantillons génomiques.
Si le fabricant fournit des instructions de stockage et d’utilisation d’un kit commercial, elles doivent
être respectées. Si le fabricant ne fournit pas ces instructions, elles doivent être spécifiées et validées
par le laboratoire et respectées.
4.4 Appareillage et matériel
Il convient que le laboratoire utilise un matériel adéquatement validé (c’est-à-dire, qualifié en
termes d'installation, de fonctionnement et de performance) et contrôlé conformément aux
instructions du fabricant et aux exigences énoncées dans l’ISO 15189. Outre le matériel de laboratoire
courant, l’appareillage spécifique pour l’analyse multiplex est décrit dans les normes individuelles
[5]
correspondantes, par exemple l’ISO 16578 pour les biopuces .
Le cas échéant, il convient d’effectuer une calibration de l’équipement et de tenir à jour des rapports sur
l’équipement dès lors que les performances peuvent avoir un impact sur les résultats.
4.5 Matériaux de référence et de contrôle
4.5.1 Généralités
Dès que des matériaux de référence (MR) sont disponibles, ils doivent être choisis en adéquation avec
leur utilisation prévue. Si aucun MR n’est disponible, les autres approches doivent être planifiées,
développées et documentées.
Les MR doivent être privilégiés pour la validation de tests moléculaires multiplex pour l’acide nucléique.
Les MR peuvent également être utilisés pour les méthodes qualitatives ou quantitatives, remplissant
différentes fonctions, telles que l’étalonnage et l’évaluation d’un mode opératoire d’analyse. En
3
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particulier pour l’analyse génomique à l’aide de méthodes de séquençage massif en parallèle, les MR
génomiques peuvent modifier les données de séquence selon le matériau choisi (voir Annexes A et B);
par conséquent, les MR applicables à ces méthodes doivent être choisis en adéquation avec l’utilisation
prévue.
Il convient que le laboratoire utilise des matériaux de CQ qui réagissent au système d’analyse d’une
manière aussi proche que possible que les échantillons des patients, comme spécifié dans l’ISO 15189.
Si ces matériaux de contrôle ne sont pas disponibles, il est impossible de soumettre à essai toutes les
sondes présentes dans le panel pour l’aptitude à l’utilisation du réactif ou le contrôle de la fidélité. Le
laboratoire adaptera considérablement ses dispositions en tenant compte du contexte clinique.
Les résultats d’analyse doivent être évalués pour confirmer que la qualité de l’échantillon est
en adéquation avec l’utilisation prévue. Lorsque l’évaluation est effectuée, l’utilisation de MR
(voir Annexes A et B), y compris des MR non génomiques (voir 4.5.3) et génomiques (voir 4.5.2), doit
être envisagée.
Pour valider l’utilisation de matrices différentes, des essais de charge (dopage) sont nécessaires.
Si le fabricant fournit des instructions de stockage et d’utilisation de MR et de matériaux de contrôle
pour le mesurage, elles doivent être respectées. Si le fabricant ne fournit pas ces instructions, elles
doivent être spécifiées et validées par le laboratoire et respectées.
4.5.2 Acide nucléique endogène
L’ADN génomique est le matériau de CQ qui ressemble le plus aux échantillons des patients, et le plus
préférable, bien qu’il ne soit pas toujours le plus efficace. Il convient que le laboratoire valide ou vérifie
la présence ou l’absence de mutations ou de variants dans un matériau (par exemple, lignées cellulaires
immortalisées, ADN génomique purifié, cultures bactériennes/microbiennes et ADN génomique
bactérien) pour chaque nouveau lot obtenu avant de l’utiliser.
L’ADN recombinant synthétique obtenu par génie génétique ou l’ADN long construit artificiellement,
par exemple les chromosomes artificiels recombinants, peut être utilisé comme matériau de contrôle
alternatif de l’ADN génomique (voir 4.5.3). Plusieurs produits de transcription des gènes de ménage
peuvent être utilisés comme matériaux de contrôle.
NOTE Les gènes de ménage comprennent, par exemple, la bêta-actine, GAPDH et la cyclophiline.
4.5.3 Matériaux de référence (MR) non génomiques
Les matériaux de CQ non génomiques sont des matériaux synthétiques, recombinants, génétiquement
modifiés ou construits artificiellement, et sont souvent composés de plasmides, en raison de leur
stabilité et de leur facilité d’utilisation. Les matériaux de CQ non génomiques sont très utiles et
particulièrement appropriés pour les tests multiplex, car ils peuvent être génétiquement modifiés pour
contenir tous les variants de séquence des segments de gène dans un échantillon détecté lors d’un
essai. Il convient de choisir soigneusement les contrôles non génomiques à des fins d’AQ pour s’assurer
qu’ils sont adaptés à la surveillance des paramètres du système. Des problématiques et des restrictions
pèsent sur les contrôles non génomiques. Certains systèmes de tests et/ou logiciels ne sont pas conçus
pour identifier correctement les multiples allèles contenus dans un contrôle multiplex. Des contrôles
non génomiques doivent être ajoutés à l’échantillon du patient et ne peuvent donc pas se comporter
exactement comme un échantillon du patient tout au long du mode opératoire d’analyse. Cette situation
est particulièrement problématique si des hybridations non spécifiques ou l’existence de faux-positifs
sont probables, en raison de la présence de pseudogènes ou d’autres séquences normalement présents
avec une forte homologie avec la cible étudiée.
Les MR non génomiques peuvent être utilisés non seulement pour l’analyse de l’ADN mais également
pour l’analyse de l’ARN.
NOTE Les MR d’ADN ou d’ARN peuvent être évalués en établissant une traçabilité métrologique à partir de
MR certifiés, par exemple NMIJ CRM 6205-a et NMIJ CRM 6204-b.
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ISO 21474-2:2022(F)
4.6 Étalonnage de l’analyse
Lors du mesurage quantitatif, notamment pour les essais de PCR quantitative, il convient d’appliquer
un nombre approprié de points d’étalonnage et de réplicats couvrant l’étendue de mesure. L’étalonnage
a un impact sur l’incertitude de mesure (IM). Des informations supplémentaires sur l'étalonnage de la
[16]
PCR sont données dans l’ISO 20395 .
L’utilisation de MR d’ADN génomique ou d’ARNm alternatifs pour l’étalonnage peut être envisagée, à
condition de démontrer que leurs propriétés sont équivalentes à celles du MR d’ADN génomique et de
l’ADN génomique extraits de l’échantillon, ou du MR d’ARNm et de l’ARNm extraits de l’échantillon.
EXEMPLE En remplacement des MR d’ADN génomique ou d’ARNm pour l’étalonnage, il est possible d’utiliser
respectivement une série de dilutions d’un ADNdb plasmidique ou synthétique contenant la séquence cible, ou
d’un ADNdb plasmidique ou synthétique et d’un ARNsb.
4.7 Gamme de concentrations
Il convient de titrer l’acide nucléique pour optimiser la gamme de concentrations, afin d’assurer la
détection de chaque séquence cible lors d’un essai donné, par exemple les gammes types pour la PCR,
les biopuces et le séquençage.
5 Évaluation des caractéristiques de performance
5.1 Généralités
Il convient que le protocole de validation commence par une déclaration explicite de l’utilisation prévue,
qui déterminera les types d'échantillons et les caractéristiques de performance à prendre en compte.
Il convient que le protocole de validation soit conçu avec soin pour s’assurer que tous les paramètres
pertinents sont abordés le plus efficacement possible. D’après la planification de la conception et du
développement, le laboratoire doit effectuer la validation de l’utilisation prévue de l’essai en fonction
d’un dispositif prédicat déjà commercialisé, le cas échéant. Lorsqu’un dispositif prédicat n’est pas
disponible, le laboratoire doit valider l’utilisation prévue par des études conçues de manière appropriée.
Conformément au plan de validation, le laboratoire doit décrire et documenter les caractéristiques de
performance pertinentes de l’essai en fonction de la maladie ou de tout autre contexte clinique évalué
par l’essai. L
...
Questions, Comments and Discussion
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