Animal feeding stuffs — Determination of nitrogen content and calculation of crude protein content — Part 2: Block digestion and steam distillation method

ISO 5983-2:2009 specifies a method for the determination of nitrogen content of animal feeding stuffs according to the Kjeldahl method, and a method for the calculation of the crude protein content. It is suitable for use as a semi-micro rapid routine method using block digestion, copper catalyst, and steam distillation into boric acid. The method is applicable to the determination of greater than 0,5 % mass fraction Kjeldahl nitrogen in animal feeding stuffs, pet foods, and their raw materials. The method does not measure oxidized forms of nitrogen nor heterocyclic nitrogen compounds. The method does not distinguish between protein nitrogen and non-protein nitrogen.

Aliments des animaux — Dosage de l'azote et calcul de la teneur en protéines brutes — Partie 2: Méthode de digestion en bloc et distillation à la vapeur

L'ISO 5983‑2:2009 spécifie une méthode de détermination de la teneur en azote des aliments pour animaux suivant la méthode Kjeldahl, ainsi qu'une méthode pour le calcul de la teneur en protéines brutes. Elle peut être utilisée comme semi microméthode de routine rapide utilisant la digestion en bloc, un catalyseur au cuivre et une distillation à la vapeur dans de l'acide borique. La méthode est applicable à la détermination de l'azote Kjeldahl présent à plus de 0,5 % en fraction massique dans les aliments pour animaux, la nourriture pour animaux de compagnie et leurs matières premières. La méthode ne mesure pas les formes oxydées de l'azote ni les composés azotés hétérocycliques. La méthode ne fait pas la différence entre l'azote protéique et l'azote non protéique.

General Information

Status
Published
Publication Date
25-May-2009
Current Stage
9093 - International Standard confirmed
Start Date
19-Sep-2014
Completion Date
07-Dec-2019
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ISO 5983-2:2009 - Animal feeding stuffs -- Determination of nitrogen content and calculation of crude protein content
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ISO 5983-2:2009 - Aliments des animaux -- Dosage de l'azote et calcul de la teneur en protéines brutes
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Standards Content (sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 5983-2
Second edition
2009-06-01
Animal feeding stuffs — Determination of
nitrogen content and calculation of crude
protein content —
Part 2:
Block digestion and steam distillation
method
Aliments des animaux — Dosage de l'azote et calcul de la teneur en
protéines brutes —
Partie 2: Méthode de digestion en bloc et distillation à la vapeur
Reference number
ISO 5983-2:2009(E)
ISO 2009
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 5983-2:2009(E)
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Published in Switzerland
ii © ISO 2009 – All rights reserved
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ISO 5983-2:2009(E)
Contents Page

Foreword............................................................................................................................................................ iv

1 Scope ..................................................................................................................................................... 1

2 Normative references ........................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions........................................................................................................................... 2

4 Principle................................................................................................................................................. 2

5 Reagents................................................................................................................................................ 2

6 Apparatus .............................................................................................................................................. 4

7 Sampling................................................................................................................................................ 4

8 Preparation of test sample................................................................................................................... 5

9 Procedure .............................................................................................................................................. 5

9.1 General................................................................................................................................................... 5

9.2 Test portion ........................................................................................................................................... 5

9.3 Determination........................................................................................................................................ 5

9.4 Blank test............................................................................................................................................... 6

9.5 Recovery tests ...................................................................................................................................... 7

10 Calculation and expression of results................................................................................................ 7

10.1 Calculation............................................................................................................................................. 7

10.2 Calculation of crude protein content.................................................................................................. 8

10.3 Expression of crude protein content results .....................................................................................8

11 Precision................................................................................................................................................ 8

11.1 Interlaboratory tests ............................................................................................................................. 8

11.2 Repeatability.......................................................................................................................................... 9

11.3 Reproducibility...................................................................................................................................... 9

12 Test report ............................................................................................................................................. 9

Annex A (informative) Results of interlaboratory tests................................................................................ 10

Annex B (informative) Results of a profiency test; comparison of the colorimetric and

potentiometric endpoint determination of the titration .................................................................. 14

Bibliography ..................................................................................................................................................... 15

© ISO 2009 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 5983-2:2009(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies

(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO

technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been

established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and

non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the

International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.

International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.

The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards

adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an

International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent

rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.

ISO 5983-2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 10, Animal

feeding stuffs.

This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 5983-2:2005), which has been technically

revised.

ISO 5983 consists of the following parts, under the general title Animal feeding stuffs — Determination of

nitrogen content and calculation of crude protein content:
⎯ Part 1: Kjeldahl method
⎯ Part 2: Block digestion and steam distillation method
iv © ISO 2009 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 5983-2:2009(E)
Animal feeding stuffs — Determination of nitrogen content and
calculation of crude protein content —
Part 2:
Block digestion and steam distillation method

WARNING — The use of this method may involve the use of hazardous materials, operations and

equipment. This part of ISO 5983 does not purport to address all the safety risks associated with its

use. It is the responsibility of the user of this method to establish appropriate health and safety

practices and determine the applicability of local regulatory limitations prior to use.

1 Scope

This part of ISO 5983 specifies a method for the determination of nitrogen content of animal feeding stuffs

according to the Kjeldahl method, and a method for the calculation of the crude protein content.

It is suitable for use as a semi-micro rapid routine method using block digestion, copper catalyst, and steam

distillation into boric acid.

The method is applicable to the determination of greater than 0,5 % mass fraction Kjeldahl nitrogen in animal

feeding stuffs, pet foods, and their raw materials.

The method does not measure oxidized forms of nitrogen nor heterocyclic nitrogen compounds.

The method does not distinguish between protein nitrogen and non-protein nitrogen.

NOTE If it is of importance to determine the content of non-protein nitrogen, an appropriate method can be used.

2 Normative references

The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated

references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referred document

(including any amendments) applies.

ISO 1871, Food and feed products — General guidelines for the determination of nitrogen by the Kjeldahl

method
ISO 6498, Animal feeding stuffs — Guidelines for sample preparation
1) To be published. (Revision of ISO 6498:1998)
© ISO 2009 – All rights reserved 1
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ISO 5983-2:2009(E)
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
nitrogen content

mass fraction of nitrogen determined by the procedure specified in this part of ISO 5983

NOTE The nitrogen content is expressed as a percentage mass fraction or in grams per kilogram.

3.2
crude protein content
nitrogen content (3.1) as a mass fraction multiplied by the factor 6,25

NOTE The crude protein content is expressed as a percentage mass fraction or in grams per kilogram.

4 Principle

The test portion is digested using a block digestion or equivalent apparatus. Concentrated sulfuric acid is used

to convert protein nitrogen to ammonium sulfate at a boiling point elevated by the addition of potassium sulfate.

A copper catalyst is used to enhance the reaction rate. An excess of sodium hydroxide is added to the cooled

digest to liberate ammonia.

The liberated ammonia is distilled, using a manual, semi-automatic or fully automatic steam distillation unit. In

the case of manual or semi-automatic steam distillation, distillation of the ammonia into an excess of boric

acid solution is followed by titration with hydrochloric acid solution to a colorimetric endpoint. Where a fully

automatic system is employed, automatic titration of the ammonia is carried out simultaneously with the

distillation and the endpoint of the titration can also be detected by means of a potentiometric pH system.

The nitrogen content is calculated from the amount of ammonia produced. The crude protein content is

obtained by multiplying the result by the conventional conversion factor of 6,25.

NOTE In principle, sulfuric acid can also be used for the titration.
5 Reagents

During the analysis, unless otherwise stated, use only reagents of recognized analytical grade and distilled or

demineralized water or water of equivalent purity.

5.1 Kjeldahl catalyst tablets, comprising 3,5 g of potassium sulfate and 0,4 g of copper(II) sulfate

pentahydrate per tablet.
These tablets are commercially available.
Other types of tablet may be used provided that:

a) they contain a quantity of potassium sulfate such that 7 g of potassium sulfate and 0,8 g of copper(II)

sulfate pentahydrate can be dispensed using an integral number of whole tablets; and

b) they do not contain salts of toxic metals such as selenium or mercury.

5.2 Sulfuric acid (H SO ), at least 98 % mass fraction, nitrogen-free (ρ ≈ 1,84 g/ml).

2 4 20
5.3 Hydrogen peroxide solution, containing approximately 30 g of H O per 100 ml.
2 2
2 © ISO 2009 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 5983-2:2009(E)

5.4 Antifoaming agent. A silicone preparation is recommended, e.g. with a mass fraction of 30 % aqueous

emulsion.

5.5 Sodium hydroxide (NaOH) solution, approximately 40 % mass fraction, nitrogen-free (< 5 µg of

nitrogen per gram).
5.6 Indicator solutions.

5.6.1 Methyl red solution. Dissolve 100 mg of methyl red (C H N O ) in 100 ml of ethanol or methanol.

15 15 3 2

5.6.2 Bromocresol green solution. Dissolve 100 mg of bromocresol green (C H Br O S) in 100 ml of

21 14 4 5
ethanol or methanol.
5.7 Concentrated boric acid solution, c(H BO ) = 40,0 g/l.
3 3

Dissolve 400 g of boric acid in about 5 l to 6 l of hot water. Mix and add more hot water to a volume of about

9 l. Allow to cool to room temperature. Add 70 ml of the methyl red solution (5.6.1) and 100 ml of the

bromocresol green solution (5.6.2) and mix. Dilute to a final volume of 10 l with water and mix well. Depending

on the water used, the pH of the boric acid solution can differ from batch to batch. Often an adjustment with a

small volume of alkali is necessary to obtain a positive blank (0,05 ml to 0,15 ml of titrant). The colour should

turn green when 100 ml of water are added to 25 ml of the boric acid solution. If still red, titrate with 0,1 mol/l

NaOH until “neutral grey” and calculate the amount of alkali needed for the 10 l batch.

Store the solution, which is red in colour, at room temperature and protect the solution from light and sources

of ammonia fumes during storage.

5.8 Dilute boric acid solution, c(H BO ) = 10,0 g/l (optional trapping solution for titrators that automatically

3 3
begin titration when distillation begins).

Dissolve 100 g of boric acid in about 5 l to 6 l of hot water, mix and add more hot water to a volume of about

9 l. Allow to cool to room temperature. Add 70 ml of the methyl red solution (5.6.1) and 100 ml of the

bromocresol green solution (5.6.2) and mix. Dilute to a final volume of 10 l with water and mix well. Depending

on the water used, the pH of the boric acid solution can differ from batch to batch. Often an adjustment with a

small volume of alkali is necessary to obtain a positive blank (0,05 ml to 0,15 ml of titrant). The colour should

turn green when 100 ml of water are added to 25 ml of the boric acid solution. If still red, titrate with 0,1 mol/l

NaOH until “neutral grey” and calculate the amount of alkali needed for the 10 l batch.

Store the solution, which is light green in colour, at room temperature and protect the solution from light and

sources of ammonia fumes during storage.

NOTE The addition of about 3 ml to 4 ml of 0,1 mol/l NaOH into 1 l of 1 % mass fraction boric acid usually gives good

adjustments.
5.9 Hydrochloric acid standard volumetric solution, c(HCl) = 0,100 0 mol/l.

Other concentrations of HCl or sulfuric acid may be used if this is corrected for in the calculations. The

concentrations should always be expressed to four decimal places.

5.10 Ammonium sulfate [(NH ) SO ], min. 99,5 % mass fraction, with certified purity. Dry ammonium

4 2 4
sulfate at 102 °C ± 2 °C for 4 h and store in a desiccator.

The percentage mass fraction of nitrogen in ammonium sulfate (at 99,5 % mass fraction purity) is 21,09.

5.11 Ammonium iron(II) sulfate [(NH ) Fe(SO )⋅6H O], with certified purity.
4 2 4 2 2

The percentage mass fraction of nitrogen in ammonium iron(II) sulfate (at 100 % mass fraction purity) is 7,145.

© ISO 2009 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 5983-2:2009(E)
5.12 Standard materials.
One of 5.12.1 and 5.12.2 may be used.

In addition to the standard materials listed in 5.12.1 and 5.12.2, suitable reference materials with certified

values for Kjeldahl nitrogen and crude protein should be used whenever possible.
NOTE The moisture content can be checked on a separate portion.

5.12.1 Tryptophan (C H N O ), with melting point 282 °C; nitrogen content 137,2 g/kg. Dry the tryptophan

11 12 2 2
before use.

5.12.2 Acetanilide (C H NO), minimum assay 99 % mass fraction, nitrogen content 103,6 g/kg. Do not dry

8 9
in an oven before use.

5.13 Sucrose (C H O ), with a nitrogen content of not more than 0,002 % mass fraction. Do not dry in an

12 22 11
oven before use.
6 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.

6.1 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 0,1 mg, with a readability of 0,1 mg.

6.2 Digestion block, aluminium alloy block or equivalent block, fitted with an adjustable temperature

control and device for measuring block temperature, capable of being maintained at 420 °C ± 5 °C.

6.3 Digestion tubes, of capacity 250 ml, suitable for use with the digestion block (6.2).

6.4 Exhaust manifold, suitable for use with the digestion tubes (6.3).

6.5 Centrifugal scrubber apparatus, filter pump or aspirator, constructed of acid-resistant material, for use

with mains water supply.
[6]

6.6 Automatic pipettes (dispensers), capable of delivering portions of up to 25 ml, ISO 8655-2

[8]
(ISO 8655-5 ).
6.7 Graduated measuring cylinders, capacity 50 ml.

6.8 Distillation unit, capable of steam distilling, manual or semi-automatic, suitable to accommodate the

digestion tubes (6.3) and the conical flasks (6.9), or capable of steam distillation and autotitration.

6.9 Conical flasks, of capacity 250 ml.
[1]

6.10 Burette, capacity 25 ml or other suitable capacity, with at least a readability of 0,05 ml, ISO 385

class A.
[7]

Alternatively, an automatic burette, ISO 8655-3 , fulfilling the same requirements, may be used.

6.11 Automatic titrator, with a pH meter calibrated in the range pH 4 to pH 7.
7 Sampling

A representative sample should have been sent to the laboratory. It should not have been damaged or

changed during transport or storage.
4 © ISO 2009 – All rights reserved
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 5983-2:2009(E)

Sampling is not part of the method specified in this part of ISO 5983. A recommended sampling method is

[5]
given in ISO 6497 .
8 Preparation of test sample
Prepare the test sample in accordance with ISO 6498.
9 Procedure
9.1 General

Usually, test samples should be analysed in batches according to the procedure specified. For general

requirements on the application of the Kjeldahl method, see ISO 1871.
9.2 Test portion
As the test portion, weigh, to the nearest 0,1 mg:
a) approximately 1,0 g for materials with 3 % to 30 % protein mass fraction;
b) approximately 0,5 g for materials with 30 % to 80 % protein mass fraction;
c) approximately 0,3 g for materials with more than 80 % protein mass fraction.
Do not exceed 1,2 g.

Always perform quality control and standards as well as a reagent blank with each batch.

9.3 Determination
9.3.1 Digestion

Transfer the test portion (9.2) to the digestion tube (6.3) and add two catalyst tablets (5.1) to each tube. Using

a pipetting dispenser (6.6), add 12 ml of sulfuric acid (5,2) to each tube. Use 15 ml for high fat materials

(> 10 % mass fraction fat). It is possible to stop at this point and continue work th

...

NORME ISO
INTERNATIONALE 5983-2
Deuxième édition
2009-06-01
Aliments des animaux — Dosage de
l'azote et calcul de la teneur en protéines
brutes —
Partie 2:
Méthode de digestion en bloc et
distillation à la vapeur
Animal feeding stuffs — Determination of nitrogen content and
calculation of crude protein content —
Part 2: Block digestion and steam distillation method
Numéro de référence
ISO 5983-2:2009(F)
ISO 2009
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 5983-2:2009(F)
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de l'ISO à l'adresse ci-après ou du comité membre de l'ISO dans le pays du demandeur.

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Publié en Suisse
ii © ISO 2009 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 5983-2:2009(F)
Sommaire Page

Avant-propos..................................................................................................................................................... iv

1 Domaine d'application...........................................................................................................................1

2 Références normatives .........................................................................................................................1

3 Termes et définitions.............................................................................................................................2

4 Principe...................................................................................................................................................2

5 Réactifs ...................................................................................................................................................2

6 Appareillage ...........................................................................................................................................4

7 Échantillonnage .....................................................................................................................................5

8 Préparation de l'échantillon pour essai...............................................................................................5

9 Mode opératoire.....................................................................................................................................5

9.1 Généralités .............................................................................................................................................5

9.2 Prise d'essai ...........................................................................................................................................5

9.3 Détermination.........................................................................................................................................5

9.4 Essai à blanc ..........................................................................................................................................7

9.5 Essais de récupération .........................................................................................................................7

10 Calcul et expression des résultats.......................................................................................................8

10.1 Calcul ......................................................................................................................................................8

10.2 Calcul de la teneur en protéines brutes ..............................................................................................8

10.3 Expression des résultats de teneur en protéines brutes ..................................................................9

11 Fidélité ....................................................................................................................................................9

11.1 Essais interlaboratoires ........................................................................................................................9

11.2 Répétabilité.............................................................................................................................................9

11.3 Reproductibilité......................................................................................................................................9

12 Rapport d'essai ....................................................................................................................................10

Annexe A (informative) Résultats des essais interlaboratoires ...................................................................11

Annexe B (informative) Résultats d'un essai d'aptitude; comparaison de la détermination par

virage coloré et de la détermination potentiométrique du point d'arrêt d'un titrage ...................15

Bibliographie .....................................................................................................................................................16

© ISO 2009 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 5983-2:2009(F)
Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de

normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée

aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du

comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non

gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec

la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.

Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,

Partie 2.

La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes

internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur

publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres

votants.

L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne

pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.

L'ISO 5983-2 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 10,

Aliments des animaux.

Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 5983-2:2005), qui a fait l'objet d'une

révision technique.

L'ISO 5983 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Aliments des animaux — Dosage

de l'azote et calcul de la teneur en protéines brutes:
⎯ Partie 1: Méthode Kjeldahl
⎯ Partie 2: Méthode de digestion en bloc et distillation à la vapeur
iv © ISO 2009 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 5983-2:2009(F)
Aliments des animaux — Dosage de l'azote et calcul de la
teneur en protéines brutes —
Partie 2:
Méthode de digestion en bloc et distillation à la vapeur

ATTENTION — La mise en œuvre de cette méthode peut impliquer l'emploi de matériaux, d'opérations

et d'équipements dangereux. La présente partie de l'ISO 5983 n'a pas pour but d'aborder tous les

problèmes de sécurité liés à son utilisation. Il incombe à l'utilisateur d'établir, avant de l'utiliser, des

pratiques d'hygiène et de sécurité appropriées et de déterminer l'applicabilité des restrictions

réglementaires.
1 Domaine d'application

La présente partie de l'ISO 5983 spécifie une méthode de détermination de la teneur en azote des aliments

pour animaux suivant la méthode Kjeldahl, ainsi qu'une méthode pour le calcul de la teneur en protéines

brutes.

Elle peut être utilisée comme semi-microméthode de routine rapide utilisant la digestion en bloc, un catalyseur

au cuivre et une distillation à la vapeur dans de l'acide borique.

La méthode est applicable à la détermination de l'azote Kjeldahl présent à plus de 0,5 % en fraction massique

dans les aliments pour animaux, la nourriture pour animaux de compagnie et leurs matières premières.

La méthode ne mesure pas les formes oxydées de l'azote ni les composés azotés hétérocycliques.

La méthode ne fait pas la différence entre l'azote protéique et l'azote non protéique.

NOTE S'il est nécessaire de déterminer la teneur en azote non protéique, une méthode appropriée peut être utilisée.

2 Références normatives

Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les

références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du

document référencé (y compris tous ses amendements) s'applique.

ISO 1871, Produits alimentaires — Lignes directrices générales pour le dosage de l'azote selon la méthode

de Kjeldahl

ISO 6498, Aliments des animaux — Lignes directrices pour la préparation d'échantillons

1) À publier. (Révision de l’ISO 6498:1998)
© ISO 2009 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 5983-2:2009(F)
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.

3.1
teneur en azote

fraction massique d'azote déterminée par le mode opératoire spécifié dans la présente partie de l'ISO 5983

NOTE La teneur en azote est exprimée sous forme de fraction massique en pourcentage ou en grammes par

kilogramme.
3.2
teneur en protéines brutes

teneur en azote (3.1) exprimée en fraction massique multipliée par le facteur 6,25

NOTE La teneur en protéines brutes est exprimée sous forme de fraction massique en pourcentage ou en grammes

par kilogramme.
4 Principe

La prise d'essai est digérée en utilisant un bloc de digestion ou un appareillage équivalent. L'acide sulfurique

concentré sert à convertir l'azote protéique en sulfate d'ammonium à un point d'ébullition élevé par l'addition

de sulfate de potassium. Un catalyseur au cuivre est employé pour accélérer la réaction. De l'hydroxyde de

sodium est ajouté en excès au digestat refroidi afin de libérer l'ammoniac.

L'ammoniac libéré est distillé au moyen d'une unité de distillation à la vapeur, soit manuelle, soit partiellement

ou entièrement automatisée. Dans le cas d'une distillation à la vapeur manuelle ou semi-automatique, la

distillation de l'ammoniac dans un excès de solution d'acide borique est suivie du titrage avec une solution

d'acide chlorhydrique jusqu'à un point de virage coloré. Lorsqu'un système entièrement automatique est

employé, le titrage automatique de l'ammoniac est effectué simultanément à la distillation et le point d'arrêt du

titrage peut également être détecté à l'aide d'un système potentiométrique de mesure du pH.

La teneur en azote est calculée à partir de la quantité d'ammoniac produite. La teneur en protéines brutes est

obtenue en multipliant le résultat par le facteur de conversion conventionnel de 6,25.

NOTE En principe, de l'acide sulfurique peut aussi être utilisé pour le titrage.
5 Réactifs

Au cours de l'analyse, sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique

reconnue et de l'eau distillée ou déminéralisée ou de pureté équivalente.

5.1 Comprimés de catalyseur Kjeldahl, contenant 3,5 g de sulfate de potassium et 0,4 g de sulfate de

cuivre(II) pentahydraté par comprimé.
Ces comprimés sont disponibles dans le commerce.
D'autres types de comprimés peuvent être utilisés à condition:

a) qu'ils contiennent une quantité de sulfate de potassium telle que 7 g de sulfate de potassium et 0,8 g de

sulfate de cuivre(II) pentahydraté puissent être libérés par un nombre entier de comprimés entiers, et

b) qu'ils ne contiennent pas de sels de métaux toxiques tels que du sélénium ou du mercure.

5.2 Acide sulfurique (H SO ), d'au moins 98 % en fraction massique, sans azote (ρ ≈ 1,84 g/ml).

2 4 20
5.3 Solution de peroxyde d'hydrogène, contenant environ 30 g de H O pour 100 ml.
2 2
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5.4 Agent antimousse. Une préparation à base de silicone est recommandée, par exemple une émulsion

aqueuse à 30 % en fraction massique.

5.5 Hydroxyde de sodium (NaOH) en solution, à environ 40 % en fraction massique, sans azote

(< 5 µg d'azote par gramme).
5.6 Solutions d'indicateurs.

5.6.1 Solution de rouge de méthyle. Dissoudre 100 mg de rouge de méthyle (C H N O ) dans 100 ml

15 15 3 2
d'éthanol ou de méthanol.

5.6.2 Solution de vert de bromocrésol. Dissoudre 100 mg de vert de bromocrésol (C H Br O S) dans

21 14 4 5
100 ml d'éthanol ou de méthanol.
5.7 Solution d'acide borique concentrée, c(H BO ) = 40,0 g/l.
3 3

Dissoudre 400 g d'acide borique dans environ 5 l à 6 l d'eau chaude. Mélanger et ajouter encore de l'eau

chaude jusqu'à un volume d'environ 9 l. Laisser refroidir à la température ambiante. Ajouter 70 ml de solution

de rouge de méthyle (5.6.1) et 100 ml de solution de vert de bromocrésol (5.6.2) puis mélanger. Diluer avec

de l'eau jusqu'à un volume final de 10 l et bien mélanger. En fonction de l'eau utilisée, le pH de la solution

d'acide borique peut différer d'un bidon à l'autre. Souvent, un ajustement avec un petit volume de base est

nécessaire pour obtenir un blanc positif (de 0,05 ml à 0,15 ml de solution titrée). Il convient que la couleur vire

au vert lorsqu'on ajoute 100 ml d'eau à 25 ml de solution d'acide borique. Si la solution reste rouge, titrer avec

NaOH à 0,1 mol/l jusqu'à un «gris neutre» et calculer la quantité de base nécessaire pour le bidon de 10 l.

Entreposer la solution, de couleur rouge, à la température ambiante et à l'abri de la lumière et des sources de

vapeurs d'ammoniac.

5.8 Solution d'acide borique diluée, c(H BO ) = 10,0 g/l (solution de piégeage facultative pour les

3 3

titrateurs qui démarrent automatiquement le titrage au début de la distillation).

Dissoudre 100 g d'acide borique dans environ 5 l à 6 l d'eau chaude, agiter et ajouter encore de l'eau chaude

jusqu'à un volume d'environ 9 l. Laisser refroidir à la température ambiante. Ajouter 70 ml de solution de

rouge de méthyle (5.6.1) et 100 ml de solution de vert de bromocrésol (5.6.2) puis mélanger. Diluer avec de

l'eau jusqu'à un volume final de 10 l et bien mélanger. En fonction de l'eau utilisée, le pH de la solution d'acide

borique peut différer d'un bidon à l'autre. Souvent, un ajustement avec un petit volume de base est nécessaire

pour obtenir un blanc positif (de 0,05 ml à 0,15 ml de solution titrée). Il convient que la couleur vire au vert

lorsqu'on ajoute 100 ml d'eau à 25 ml de la solution d'acide borique. Si la solution reste rouge, titrer avec

NaOH à 0,1 mol/l jusqu'à un «gris neutre» et calculer la quantité de base nécessaire pour le bidon de 10 l.

Entreposer la solution, de couleur vert clair, à la température ambiante et à l'abri de la lumière et des sources

de vapeurs d'ammoniac.

NOTE L'addition d'environ 3 ml à 4 ml de NaOH à 0,1 mol/l dans 1 l d'acide borique à 1 % en fraction massique

donne généralement de bons ajustements.
5.9 Solution étalon volumétrique d'acide chlorhydrique, c(HCl) = 0,100 0 mol/l.

D'autres concentrations d'HCl ou d'acide sulfurique peuvent être utilisées si les calculs en tiennent compte. Il

convient que les concentrations soient toujours exprimées jusqu'à la quatrième décimale.

5.10 Sulfate d'ammonium [(NH ) SO ], min. 99,5 % en fraction massique, de pureté certifiée. Sécher le

4 2 4

sulfate d'ammonium à 102 °C ± 2 °C pendant 4 h et l'entreposer dans un dessiccateur.

La fraction massique d'azote en pourcentage dans le sulfate d'ammonium (pur à 99,5 % en fraction massique)

est de 21,09.
5.11 Sulfate de fer(II) ammoniacal [(NH ) Fe(SO ) , 6H O], de pureté certifiée.
4 2 4 2 2
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La fraction massique d'azote en pourcentage dans le sulfate de fer(II) ammoniacal (pur à 100 % en fraction

massique) est de 7,145.
5.12 Substances étalons.
L'une des substances étalons 5.12.1 ou 5.12.2 peut être utilisée.

Outre les substances étalons répertoriées en 5.12.1 et 5.12.2, il convient d'utiliser aussi souvent que possible

des substances de référence appropriées ayant des valeurs d'azote et de protéines Kjeldahl certifiées.

NOTE La teneur en humidité peut être contrôlée sur un échantillon séparé.

5.12.1 Tryptophane (C H N O ), à point de fusion à 282 °C; teneur en azote de 137,2 g/kg. Sécher le

11 12 2 2
tryptophane avant de l'employer.

5.12.2 Acétanilide (C H NO), de concentration minimale 99 % en fraction massique; teneur en azote de

8 9
103,6 g/kg. Ne pas sécher à l'étuve avant utilisation.

5.13 Saccharose (C H O ), avec une teneur en azote inférieure ou égale à 0,002 % en fraction

12 22 11
massique. Ne pas sécher à l'étuve avant utilisation.
6 Appareillage
Matériel de laboratoire courant et, en particulier, ce qui suit.

6.1 Balance analytique, capable de peser à 0,1 mg près, avec un affichage de 0,1 mg.

6.2 Bloc de digestion, bloc en alliage d'aluminium ou bloc équivalent, muni d'une commande de

température réglable et d'un dispositif de mesurage de la température du bloc, pouvant être maintenu à

420 °C ± 5 °C.

6.3 Tubes de digestion, d'une capacité de 250 ml, utilisables avec le bloc de digestion (6.2).

6.4 Collecteur d'échappement, utilisable avec les tubes de digestion (6.3).

6.5 Laveur centrifugeur, pompe à filtre ou aspirateur, fabriqué avec un matériau résistant aux acides,

utilisable avec l'alimentation en eau du réseau.

6.6 Pipettes automatiques (distributeurs), capables de délivrer des volumes allant jusqu'à 25 ml,

[6] [8]
ISO 8655-2 (ISO 8655-5 ).
6.7 Éprouvettes graduées, d'une capacité de 50 ml.

6.8 Unité de distillation, permettant une distillation à la vapeur, manuelle ou semi-automatique, pouvant

recevoir les tubes de digestion (6.3) et les erlenmeyers (6.9), ou permettant une distillation à la vapeur et un

auto-titrage.
6.9 Erlenmeyers, d'une capacité de 250 ml.

6.10 Burette, d'une capacité de 25 ml ou d'une autre capacité adaptée, permettant au minimum une lecture

[1]
à 0,05 ml, ISO 385 , classe A.
[7]

Une burette automatique, ISO 8655-3 , répondant aux mêmes exigences peut également être utilisée.

6.11 Titrateur automatique, avec un pH-mètre étalonné dans la plage de pH 4 à pH 7.

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7 Échantillonnage

Il convient qu'un échantillon représentatif ait été envoyé au laboratoire. Il convient que ce dernier n'ait pas été

endommagé ou modifié au cours du transport ou du stockage.

L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente partie de l'ISO 5983. Une

[5]
méthode d'échantillonnage recommandée est donnée dans l'ISO 6497 .
8 Préparation de l'échantillon pour essai
Préparer l'échantillon pour essai conformément à l'ISO 6498.
9 Mode opératoire
9.1 Généralités

Généralement, il convient que les échantillons pour essai soient analysés par lots, conformément au mode

opératoire spécifié. Pour les exigences générales d'application de la méthode Kjeldahl, voir l'ISO 1871.

9.2 Prise d'essai
Comme prise d'essai, peser, à 0,1 mg près:

a) environ 1,0 g pour les substances contenant de 3 % à 30 % de protéines en fraction massique;

b) environ 0,5 g pour les substances contenant de 30 % à 80 % de protéines en fraction massique;

c) environ 0,3 g pour les substances contenant plus de 80 % de protéines en fraction massique.

Ne pas dépasser 1,2 g.

Toujours mettre en œuvre un contrôle qualité et des étalons ainsi qu'un blanc de réactif pour chaque lot.

9.3 Détermination
9.3.1 Digestion

Transférer la prise d'essai (9.2) dans le tube de digestion (6.3) et ajouter deux comprimés de catalyseur (5.1)

dans chaque tube. Au moyen d'un distributeur (6.6), ajouter 12 ml d'acide sulfurique (5.2) dans chaque tube.

Utiliser 15 ml pour les substances particulièrement grasses (> 10 % de graisse en fraction massique). Il est

possible de s'arrêter à ce niveau et de reprendre le jour suivant.

Si la formation de mousse est un problème, ajouter doucement 3 ml à 5 ml de peroxyde d'hydrogène (5.3).

Remuer doucement et laisser la réaction s'estomper. Autrement, on peut utiliser quelques gouttes d'agent

antimousse (5.4).

Accrocher les plaques latérales chauffantes au porte-éprouvettes. Fixer le collecteur d'échappement (6.4)

fermement sur les tubes et mettre en marche l'aspirateur d'eau ou le laveur (6.5). Placer le porte-éprouvettes

dans le bloc de digestion préchauffé à 420 °C (6.2).

Après 10 min, diminuer le jet dans la trompe à eau jusqu'à ce que les fumées acides soient juste contenues à

l'intérieur de la hotte d'évacuation. Il convient de maintenir une zone de condensation dans le tube. Après que

le gros des fumées d'oxyde de soufre a été produit au cours des phases de digestion initiales, réduire la

source de dépression afin d'éviter la perte d'acide sulfurique.
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Digérer pendant encore 50 min. Il convient que le temps total de digestion soit d'environ 60 min.

Éteindre le bloc de digestion. Retirer le porte-éprouvettes avec l'échappement toujours en place et laisser

refroidir pendant 10 min à 20 min. Une fois l'émission de vapeurs terminée, retirer le collecteur et arrêter

l'aspirateur. Retirer les plaques latérales.

Laisser refroidir les tubes. Il est recommandé de diluer au préalable manuellement les échantillons avant

distillation. Après avoir mis des gants et une protection oculaire, ajouter précautionneusement quelques

millilitres d'eau dans chaque tube. S'il y a des éclaboussures, cela signifie que les tubes sont encore trop

chauds. Laisser refroidir quelques minutes de plus. Ajouter de l'eau dans chaque tube jusqu'à un volume total

d'environ 80 ml.

Si l'échantillon se solidifie, placer le tube contenant le digestat dilué dans le bloc de digestion et le chauffer

lentement en remuant par moments jusqu'à ce que les sels se dissolvent, ou bien distiller pendant encore

30 s à 60 s.

NOTE 1 Certains instruments ajoutent l'eau automatiquement. La dilution préalable avant de placer le tube dans

l'instrument n'est nécessaire que si des agrégats très durs se forment.

NOTE 2 Certains instruments de distillation commencent par ajouter de la vapeur avant d'ajouter la base, ce qui

entraîne une dissolution des agrégats de sels et une réaction moins violente au cours de l'ajout de base. La cristallisation

pendant la digestion peut provoquer des pertes d'azote.
9.3.2 Distillation
Transférer le tube de digestion (voir 9.3.1) dans l'unité de distillation (6.8).

Lorsque le titrage de la teneur en ammoniac du distillat est effectué manuellement, le mode opératoire indiqué

ci-dessous s'applique. Lorsque l'unité de distillation est totalement automatisée et comprend le titrage de la

concentration en ammoniac du distillat, suivre les instructions du fabricant pour le fonctionnement de l'unité de

distillation.

Placer un erlenmeyer (6.9) contenant 25 ml à 30 ml de solution d'acide borique concentrée (5.7) sous la sortie

du condenseur de sorte que le tube de sortie soit sous la surface de la solution d'acide borique en excès.

Régler l'unité de distillation pour dispenser 50 ml de solution d'hydroxyde de sodium (5.5). Faire fonctionner

l'unité de distillation conformément aux instructions du fabricant et distiller l'ammoniac libéré par l'addition de

la solution d'hydroxyde de sodium. Collecter le distillat dans la solution réceptrice d'acide borique. La quantité

de distillat (temps de distillation à la vapeur) dépend de la quantité d'azote dans l'échantillon. Suivre les

instructions du fabricant.

NOTE Dans une unité de distillation semi-automatique, l'ajout d'hydroxyde de sodium en excès et la distillation à la

vapeur sont effectués automatiquement.
9.3.3 Titrage

9.3.3.1 Titrage colorimétrique. Titrer le contenu de l'erlenmeyer (6.9) à l'aide de la solution étalon

volumétrique d'acide chlorhydrique (5.9) en utilisant une burette (6.10) et lire la quantité de solution titrée

utilisée. Le point de virage est atteint à la première trace de couleur rose dans le contenu. Estimer la valeur

lue sur la burette à 0,05 ml près. Une plaque d'agitateur magnétique éclairée ou un détecteur photométrique

peut aider à la visualisation du point de virage.

Cela peut être fait automatiquement au moyen d'un distillateur à vapeur avec titrage automatique.

9.3.3.2 Titrage potentiométrique. Titrer le contenu de l'erlenmeyer (6.9) à l'aide de la solution étalon

volumétrique d'acide chlorhydrique (5.9) en utilisant un titrateur automatique correctement étalonné pourvu

d'un pH-mètre (6.11). Le point d'arrêt du titrage est atteint à pH 4,6, ce qui représente le point où la pente de

la courbe de titrage est la plus forte (point d'inflexion). Lire la quantité de solution titrée utilisée sur le titrateur

automatique.
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Suivre les instructions du fabricant pour le fonctionnement du distillateur ou du système combiné distillateur et

titrateur en question.

En cas d'utilisation d'un système de titrage automatique, le titrage commence immédiatement après le début

de la distillation et il convient d'employer la solution d'acide borique diluée (5.8).

9.4 Essai à blanc

Effectuer un essai à blanc en suivant le mode opératoire spécifié de 9.1 à 9.3.3 en prenant 2 ml d'eau et

environ 0,7 g de saccharose (5.13) au lieu de la prise d'essai. Enregistrer les valeurs du blanc. Si les valeurs

du blanc changent, identifier la cause de ce changement.

Il convient que la quantité de solution de titrage utilisée pour l'essai à blanc soit toujours supérieure à 0,0 ml. Il

convient que les blancs d'un même laboratoire soient homogènes dans la durée.
9.5 Essais de récupération
9.5.1 Généralités

Les essais de récupération à effectuer régulièrement afin de vérifier la justesse du mode opératoire et de

l'équipement sont spécifiés de 9.5.2 à 9.5.4.
9.5.2 Perte d'azote

Utiliser 0,12 g de sulfate d'ammonium (5.10) et 0,67 g de saccharose (5.13) par erlenmeyer. Ajouter tous les

autres réactifs comme indiqué en 9.3. Digérer et distiller dans les mêmes conditions que pour l'échantillon.

Les récupérations doivent être W 99 % en fraction massique.
9.5.3 Efficacité de la digestion

Utiliser une prise d'essai d'au moins 0,15 g de tryptophane (5.12.1) ou d'acétanilide (5.12.2), pesée à 0,1 mg

près, avec un ajout d'environ 0,7 g de saccharose (5.13). Déterminer la teneur en azote selon le mode

opératoire spécifié de 9.1 à 9.3.3. Il convient que la récupération soit W 99,5 % en fraction massique pour

l'acétanilide et W 98,5 % en fraction massique pour le tryptophane (Référence [9]).

9.5.4 Efficacité de la distillation et du titrage

Peser dans un tube de 0,10 g à 0,15 g de sulfate d'ammonium (5.10), à 0,000 1 g près, ou de 0,3 g à 0,5 g de

sulfate de fer(II) ammoniacal (5.11), à 0,000 1 g près. Ajouter 80 ml d'eau et procéder conformément à 9.3.2

et 9.3.3. La récupération doit être W 99,5 % en fraction massique.
9.5.5 Limites

Une récupération inférieure à la valeur spécifiée ou de plus de 101,0 % en fraction massique dans l'un des

essais de récupération décrits ci-dessus indique des défauts dans les modes opératoires et/ou une

concentration inexacte de la solution étalon volumétrique d'acide chlorhydrique (5.9).

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10 Calcul et expression des résultats
10.1 Calcul
10.1.1 Calcul de la teneur en azote

Calculer la teneur en azote de l'échantillon, w , sous forme de fraction massique, en pourcentage, à l'aide de

l'Équation (1):
1,400 7VV− c
sb s
w = (1)
V est la valeur numérique du volume, en millilitr
...

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