ISO 14730:2014

Ophthalmic optics - Contact lens care products - Antimicrobial preservative efficacy testing and guidance on determining discard date

ISO 14730:2014 specifies a procedure to be used in evaluating the antimicrobial preservative activity of all preserved multidose contact lens care products, and provides guidance on methods to be used for determination of discard date as informative annexes.

Optique ophtalmique — Produits d'entretien des lentilles de contact — Essais de l'efficacité de conservation antimicrobienne et lignes directrices pour la détermination de la durée d'utilisation après première ouverture

L'ISO 14730:2014 spécifie la méthode suivie pour évaluer l'activité de conservation antimicrobienne de tous les produits d'entretien des lentilles de contact conservés en emballages multi-doses et fournit des lignes directrices sur les méthodes à utiliser pour la détermination de la durée d'utilisation après première ouverture, en annexes informatives.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 29-Sep-2014
• ICS: 11.040.70 - Ophthalmic equipment
• Technical Committee: ISO/TC 172/SC 7 - Ophthalmic optics and instruments
• Drafting Committee: ISO/TC 172/SC 7/WG 9 - Contact lenses
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Start Date: 10-Sep-2024
• Completion Date: 13-Dec-2025

Relations

• Consolidates: ISO 14469-3:2006 - Road vehicles - Compressed natural gas (CNG) refuelling connector - Part 3: 25 MPa (250 bar) connector
• Effective Date: 06-Jun-2022
• Consolidated By: ISO 16135:2006/Amd 1:2019 - Industrial valves - Ball valves of thermoplastics materials - Amendment 1
• Effective Date: 06-Jun-2022
• Revises: ISO 14730:2000 - Ophthalmic optics - Contact lens care products - Antimicrobial preservative efficacy testing and guidance on determining discard date
• Effective Date: 02-Nov-2013

Overview

ISO 14730:2014 - "Ophthalmic optics - Contact lens care products - Antimicrobial preservative efficacy testing and guidance on determining discard date" defines a standardized test method for evaluating the antimicrobial preservative activity of preserved multidose contact lens care products (CLCP). The standard sets out the test principle (initial microbial challenge and a 14‑day rechallenge), sampling schedule, storage conditions and requirements for neutralization or removal of residual antimicrobials. Informative annexes provide example procedures for determining product discard date (including membrane filtration and extended‑dating approaches).

Key topics and technical requirements

• Scope: Applies to preserved multidose contact lens solutions (up to a 28‑day discard date). Excludes single‑use sterile unit doses and containers with physical contamination barriers (e.g., aerosols).
• Test principle: Inoculate product with specified microorganisms, store at controlled temperature, sample at defined intervals and monitor viable counts to confirm preservative activity and prevention of regrowth.
• Sampling and replication: Three product lots are tested; each lot uses a separate inoculum preparation per challenge organism.
• Challenge organisms: Standard test strains specified (including common bacteria, yeast and mould used in preservative testing).
• Timing and conditions: Sampling includes key time points (including day 7, day 14, and post‑rechallenge at day 21 and day 28); storage at 20 °C to 25 °C and protection from light if product is photosensitive.
• Neutralization and recovery: Validated neutralizing agents or membrane filtration are required to remove or inactivate residual antimicrobials prior to plating; effectiveness of neutralization must be validated.
• Performance criteria and reporting: Performance requirements are provided in the standard (see clause 5.6) and full test reporting requirements are specified.

Practical applications and users

Who uses ISO 14730:2014:

• Contact lens solution manufacturers (R&D and quality control) for product development and batch release.
• Independent microbiology and contract test laboratories performing preservative efficacy testing.
• Regulatory affairs teams preparing safety and labeling documentation (discard/use‑after‑opening dates).
• Clinical safety assessors and post‑market surveillance teams evaluating preservative performance.

Practical use cases:

• Demonstrating that a multidose CLCP maintains antimicrobial activity during intended use.
• Supporting decisions on discard dates (up to 28 days) and using annex procedures to justify extended dating.
• Standardizing preservative efficacy data for regulatory submissions and product labeling.

Related standards

• ISO 14534 - Contact lenses and contact lens care products: fundamental requirements
• ISO 18369‑1 - Contact lenses: vocabulary, classification and labelling recommendations

Keywords: ISO 14730:2014, contact lens care products, preservative efficacy testing, antimicrobial preservative, discard date, multidose contact lens solution, ophthalmic optics.

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 14730
Second edition
2014-10-01
Ophthalmic optics — Contact lens
care products — Antimicrobial
preservative efficacy testing and
guidance on determining discard date
Optique ophtalmique — Produits d’entretien des lentilles de contact
— Essais de l’efficacité de conservation antimicrobienne et lignes
directrices pour la détermination de la durée d’utilisation après
première ouverture
Reference number
©
ISO 2014
© ISO 2014
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E-mail [e-mail]
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Published in Switzerland
ii © ISO 2014 – All rights reserved

Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
5 Test methods . 2
5.1 Materials and reagents . 2
5.2 Test sampling and culture maintenance . 2
5.3 Preparation of microbial challenge (Inoculum) . 3
5.4 Inoculum challenge test procedure . 3
5.5 Controls . 5
5.6 Performance criteria . 5
5.7 Test report . 6
Annex A (informative) Example of a membrane filtration procedure II . 7
Annex B (informative) Discard date procedure I . 9
Annex C (informative) Discard date procedure .12
Annex D (informative) Discard date procedure III .16
Annex E (informative) Discard date procedure IV.19
Annex F (informative) Test organisms from other culture collections .22
Bibliography .23
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
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different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
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Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical Barriers
to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 172, Optics and photonics, Subcommittee
SC 7, Ophthalmic optics and instruments in collaboration with the Technical Committee CEN/TC 170,
Ophthalmic optics.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 14730:2000), of which it constitutes a
minor revision.
iv © ISO 2014 – All rights reserved

Introduction
Contact lens care products (CLCP) are used with contact lenses. These products rinse, clean, disinfect,
store, wet, aid the comfort of, and condition contact lenses. Some products have one function, while
others are multifunctional.
Usually, products manufactured for use with hydrogel lenses may be used with rigid gas-permeable
(RGP) or poly (methyl methacrylate) (PMMA) lenses, but products specifically used for RGP or PMMA
contact lenses are not usually suitable for hydrogel lenses.
Most CLCPs are manufactured as solutions and are commonly packaged and sold in multidose containers.
Dry products are sold as tablets or granules and shall be dissolved in a suitable solvent immediately
prior to use.
If the contact lens care product solution does not have any antimicrobial activity itself, an antimicrobial
preservative can be added to the product to inhibit the growth of microorganisms that might be
introduced from repeated dispensing during use and subsequent storage. All antimicrobial agents
have the potential for toxicity to the user. For maximum protection to the user, the concentration of the
preservative should be such that it provides adequate preservative activity with minimum toxicity.
There are differences between ophthalmic preparations and contact lens care products and some
of these differences are significant in relation to preservative efficacy testing. Typically, ophthalmic
preparations are packaged in small-volume containers and are used for short periods on compromised
eyes. Contact lens care products are distributed in larger volume containers and are used with contact
lenses on a long term basis on healthy eyes. The potential risks for contact lens care products are the
solution/lens interaction causing ocular irritation and the risks of the solution contamination by the
repeated (daily) use of the product.
Thus, when contact lens care products are formulated, the risk of adverse patient reaction due to the
lens and/or solution interaction has to be weighed against the benefits of safety derived from the
maintenance of the antimicrobial activity of the solution.
This International Standard gives the test procedure and performance criteria for preservative efficacy.
It has been adapted from Pharmacopoeias which give a time limitation in their test procedure of 28 d.
The informative annexes give four examples of preservative efficacy test procedures developed by
contact lens care product manufacturers to show preservative efficacy for products whose discard
dates are over 28 d.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 14730:2014(E)
Ophthalmic optics — Contact lens care products —
Antimicrobial preservative efficacy testing and guidance
on determining discard date
1 Scope
This International Standard specifies a procedure to be used in evaluating the antimicrobial preservative
activity of all preserved multidose contact lens care products, and provides guidance on methods for
determination of discard date as informative annexes.
This test is applicable to products for up to a 28-day discard date.
The test is not applicable to sterile products packaged in unit doses for single use or multidose containers
designed with physical barriers to microbial contamination (e.g. aerosol containers).
NOTE 1 Principles of the test can be used to extend discard dating beyond 28 d. See Annexes B, C, D and E.
NOTE 2 Use of multiple or mixed microbial challenges and/or inclusion of contact lenses or other organic
load can influence the apparent antimicrobial activity of a particular product. The evaluation of these variables
together with testing against a larger panel of microorganisms and testing of samples from partially used
containers can be of value in developing a contact lens care product, but are excluded from the scope of this
International Standard.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 14534, Ophthalmic optics — Contact lenses and contact lens care products — Fundamental requirements
ISO 18369-1, Ophthalmic optics — Contact lenses — Part 1: Vocabulary, classification system and
recommendations for labelling specifications
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 18369-1 apply.
4 Principle
4.1 The test consists of challenging the preparation with a specified inoculum of suitable microorganisms
at the commencement of the test and then rechallenging at day 14. The inoculated preparations are stored
at a specified temperature. Samples are withdrawn from the inoculated preparations at specified time
intervals and are cultured for determination of viable organisms. The capability of the product to prevent
re-growth is confirmed by counting of viable organisms over longer time periods.
4.2 The size of the microbial challenge chosen in this test is not intended to be representative of the
likely challenge in practice, but to provide countable numbers from which estimation of the rate and
extent of viability loss can be determined.
4.3 The antimicrobial preservative properties of the product are adequate if, in the conditions of the
test, there is significant reduction of bacteria and no increase in yeasts and moulds in the inoculated
preparation after the times and at the temperatures specified. The performance criteria are given in 5.6.
4.4 Appropriate measures shall be taken to inactivate or remove residual antimicrobial agents during
culturing and counting of survivors. The effectiveness of these measures shall be validated.
5 Test methods
5.1 Materials and reagents
5.1.1 Test organisms
The strains listed in Table 1 shall be used.
NOTE Test organisms from other culture collections that can be used are listed in Annex F.
Table 1 — Test organisms
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
Staphylococcus aureus ATCC 6538
Escherichia coli ATCC 8739
Candida albicans ATCC 10231
Aspergillus brasiliensis ATCC 16404
5.1.2 Culture media and reagents
5.1.2.1 Tryptone Soya Agar (TSA).
5.1.2.2 Sabouraud Dextrose Agar (SDA).
5.1.2.3 Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline, without calcium chloride and magnesium chloride
(DPBS).
Combine 200 mg/l KCl, 200 mg/l KH PO , 8 000 mg/l NaCl, and 2 160 mg/l Na HPO ⋅ 7H O or
2 4 2 4 2
suitable diluent.
5.1.2.4 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, plus 0,05 % volumic mass polysorbate 80 (DPBST) or
suitable diluent.
5.1.2.5 Validated neutralizing agents/media as required, for example, Dey-Engley Neutralizing
Broth (DEB) and Letheen Broth.
5.1.3 Laboratory equipment
The following common laboratory equipment is required: sterile pipettes, swabs, tubes, petri dishes
(90 mm to 100 mm × 20 mm), etc. and suitable instruments for spectrophotometric determination of
cell density, for colony counting and for centrifugation.
5.2 Test sampling and culture maintenance
The product to be tested shall be representative of the product to be marketed. Aliquots should be taken
directly from the final product container immediately prior to testing.
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Three lots of product shall be tested. Each lot of product shall be tested with a separate inoculum
preparation for each challenge organism.
Maintain the test cultures as recommended by the curator of the appropriate culture collection.
Cultures should be no greater than five passes removed from the depository stock (ATCC, NCIB, NCTC,
NCPF or other recognized culture depository; see Annex F). Each pass is a subculture of the previous pass.
5.3 Preparation of microbial challenge (Inoculum)
Culture each test organism on agar slopes under the conditions given in Table 2.
Table 2 — Media and incubation conditions for growth of challenge organisms
Temperature
Organism Medium Incubation time
°C
P. aeruginosa TSA 30 to 35 18 h to 24 h
S. aureus TSA 30 to 35 18 h to 24 h
E. coli TSA 30 to 35 18 h to 24 h
either 20 to 25 42 h to 48 h
C. albicans SDA
or 30 to 35 18 h to 24 h
A. brasiliensis SDA 20 to 25 7 d to 10 d
Use sterile DPBST or suitable diluent to harvest each culture; wash the surface growth, transfer it to a
suitable vessel and vortex. Filter the spore suspensions through sterile glass wool, cheesecloth or gauze
to remove hyphal fragments.
After harvesting, the cultured organisms can be washed using centrifugation. The bacterial suspensions
can be filtered (e.g. 3 µm to 5 µm pore size) to produce a single cell dispersion. Then, adjust all challenge
cell suspensions with DPBST or other suitable diluent to a concentration of between 1,0 × 10 cfu/ml
and 1,0 × 10 cfu/ml. Estimate the approximate cell concentration of each suspension by measuring
the turbidity of the suspension or a dilution of the suspension using a spectrophotometer. The actual
concentration of colony-forming units per millilitre shall be determined for each suspension, e.g. by the
plate-count method, at the time of the test.
If centrifugation is used, each centrifugation should be conducted at 20 °C to 25 °C for no longer than the
equivalent of 10 min at 4 000 g or less.
Use bacterial and yeast cell suspensions on the day of preparation.
NOTE 1 Longer centrifugation times might be required at lower speeds.
NOTE 2 Spore suspensions can be used up to seven days following preparation by storage under refrigeration
(2 °C to 8 °C).
5.4 Inoculum challenge test procedure
5.4.1 Prepare one or more tubes (for each lot tested) containing a minimum of 10 ml of test solution per
challenge organism.
NOTE Sample tubes are used rather than lens cases to allow effective technical execution of the test. Since
incompatibilities can exist between solution ingredients and tube materials, tubes of an appropriate material
which is compatible with the ingredients should be considered.
Inoculate the sample tube of the product to be tested with a suspension of test organisms sufficient
5 6
to provide a final count of between 1,0 × 10 cfu/ml and 1,0 × 10 cfu/ml. Ensure that the volume of
inoculum does not exceed 1 % of the sample volume. Ensure complete dispersion of the inoculum by
adequate mixing.
5.4.2 Store the inoculated product at 20 °C to 25 °C. The temperature shall be monitored using a
calibrated device and the temperature documented.
If the product is sensitive to light, it should be protected during the period of the test.
5.4.3 Take 1,0 ml aliquots of the inoculated product for determination of viable count at 7 d and 14 d.
5.4.4 After taking the 14 d sample, each sample is rechallenged as in 5.4.1 by using an inoculum level of
4 5
1,0 × 10 cfu/ml to 1,0 × 10 cfu/ml.
5.4.5 Take 1,0 ml aliquots of the inoculated product for determination of the viable count at 21 d and 28 d.
5.4.6 Subject each of the 1,0 ml aliquots, removed at the specified time intervals, to a suitable series of
decimal dilutions in validated neutralizing media. Mix the suspension well by vortexing vigorously and
let stand to allow neutralization to be completed. Neutralization conditions shall be based on recovery-
medium control testing (see 5.5.2).
If an antimicrobial agent in the formulation cannot be adequately inactivated or neutralized, eliminate
it using a validated membrane filtration procedure (see Annex A).
5.4.7 Determine the viable count of organisms in appropriate dilutions by preparation of triplicate plates
(unless otherwise justified) of a suitable recovery medium (e.g. TSA for bacteria and SDA for mould and yeast).
If membrane filtration has been employed to remove or neutralize antimicrobial agents, culture the
membranes on these media as appropriate.
If the pour-plate method is utilized, keep the agar for pour plates below 50 °C prior to pouring.
NOTE The agar media used for determination of viable counts can also contain antimicrobial inactivators or
neutralizers, if required.
5.4.8 Incubate bacterial recovery plates at 30 °C to 35 °C. Incubate yeast recovery plates at 20 °C to
25 °C or 30 °C to 35 °C. Incubate mould recovery plates at 20 °C to 25 °C. Incubation times for optimal
recovery of bacteria, yeast, and moulds shall be determined. Minimum incubation times shall be based on
recovery medium control testing (see 5.5.2). Record the number of cfu observed on countable plates.
Plates should be observed periodically during incubation to prevent the occurrence of uncountable
plates due to overgrowth.
5.4.9 Determine the average number of colony-forming units on countable plates. Calculate the
microbial reduction at the specified time points.
NOTE Countable plates refer to 30 cfu to 300 cfu per plate for bacteria and yeast, and 8 cfu to 80 cfu per plate
0 −1
for moulds, except when colonies are observed only for the 10 or 10 dilution plates.
5.4.10 The absence of microorganisms shall be documented, e.g. by recording a “0” or “NR” (no recovery),
when plates for all dilutions of a sample at a single time point have zero colonies.
5.4.11 The concentration of survivors is calculated at each point of time. The concentration of viable
organisms following the 14 d rechallenge is the sum of the rechallenge inoculum concentration and the
14 d survivor concentration.
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5.5 Controls
5.5.1 Inoculum controls
The initial and rechallenge inoculum concentrations are calculated by dispersing an identical aliquot of
the inoculum into the same volume as used in 5.4.1 of a suitable diluent to achieve a final concentration
5 6 4
not less than 1,0 × 10 cfu/ml to 1,0 × 10 cfu/ml for the initial inoculum or 1,0 × 10 cfu/ml to
1,0 × 10 cfu/ml for the rechallenge. The volume of inoculum does not exceed 1 % of the sample volume.
Ensure dispersion of the inoculum by adequate mixing. Evaluate this control sample for cfu/ml at the
beginning of the test in order to demonstrate the suitability of the medium used for growth of the test
organism and provide an estimate of the initial inoculum concentration. Plate the appropriate aliquot
from each tube onto the recovery agar plates in triplicate (unless otherwise justified).
5.5.2 Recovery medium control
Vortex a 1/10 dilution of the preserved product in the validated neutralizing broth (1 ml into 9 ml). Let
it stand to allow neutralization to be completed. Prepare a second control tube with 10 ml of a suitable
diluent (e.g. DPBST). Inoculate the tubes with sufficient inoculum to result in 10 cfu to 100 cfu of challenge
organism per plate. Incubate for an appropriate period of time at ambient temperature. Plate the
appropriate aliquot from each tube onto the recovery agar plates in triplicate (unless otherwise justified).
Incubate bacterial recovery plates at 30 °C to 35 °C. Incubate yeast recovery plates at 20 °C to 25 °C or
30 °C to 35 °C. Incubate mould recovery plates at 20 °C to 25 °C. Determine minimum incubation times
for optimal recovery of bacteria, yeast, and moulds.
Check that the recovery from the neutralizer broth is at least 50 % of the recovery in the second control
tube. Perform this control for each challenge organism.
If a dilution of greater than 1/10 is required for neutralization, then membrane filtration should be used.
Validate the neutralization of the product with each challenge organism initially and as appropriate.
5.6 Performance criteria
5.6.1 General
Products shall be capable of meeting these criteria throughout their labelled shelf life and at the discard date.
Meeting the criteria of 5.6.2 and 5.6.3 shall justify a 28 d period of use after opening (discard date).
NOTE Refer to Annexes B, C, D and E for suggested methods if a discard date longer than 28 d is desired.
5.6.2 Bacteria
The number of each challenge organism recovered per millilitre shall be reduced by a mean value of not
less than 3,0 logs at 14 d. After the rechallenge at 14 d, the concentration of each challenge organism
shall be reduced again by at least a mean value of 3,0 logs by 28 d.
5.6.3 Moulds and yeasts
The number of each challenge organism recovered per millilitre shall remain at, or below, the initial
concentrations (within an experimental error of ±0,5 logs) within 14 d. At 28 d, the concentration of each
challenge organism shall remain at, or below, the concentrations (within an experimental error of ±0,5
logs) of each challenge organism after the rechallenge.
5.7 Test report
The test report shall include
a) the title of this International Standard,
b) the identification of the product, including name of the product, batch number, expiry date,
manufacturer, storage conditions and active substances(s), and its/their concentration(s) (as available),
c) the name(s) of the operator(s),
d) deviations from the protocol,
e) date and time of incubation,
f) storage time for inoculated product, and
g) results obtained, including numbers of organisms recovered at each time point.
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Annex A
(informative)
Example of a membrane filtration procedure II
A.1 Materials and reagents
A.1.1 Culture media and reagents
A.1.1.1 Diluting fluid, with or without neutralizers.
A.1.1.2 Tryptone Soya Agar (TSA).
A.1.1.3 Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline, without calcium chloride and magnesium chloride
(DPBS): 200 mg/l KCl, 200 mg/l KH PO , 8 000 mg/l NaCl, and 2 160 mg/l Na HPO ⋅7H O or suitable diluent.
2 4 2 4 2
A.1.1.4 Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline, plus 0,05 % polysorbate 80 (DPBST) or suitable diluent.
A.1.1.5 Validated neutralizing agents/media, as required, for example, Dey-Engley Neutralizing
Broth (DEB) and Letheen Broth.
A.1.2 Test equipment
Usual laboratory equipment (such as sterile pipettes, petri dishes, containers) together with the following.
A.1.2.1 Sterile membrane filter.
A.1.2.2 Suitable sterile apparatus, for holding the sterile membrane filter and filtrate.
A.1.2.3 Suitable equipment for creating a vacuum or pressure, to cause the liquid phase of the
inoculated test solution to pass through the membrane filter aseptically.
The membrane filter should have a nominal pore size of not greater than 0,45 µm, a diameter of at least
47 mm and should be free of chemicals which could be toxic to microbial cells.
A.2 Test method and results
A.2.1 Moisten the sterile membrane filter (A.1.2.1) in a sterile filter assembly (A.1.2.2) with sterile
DPBST (A.1.1.4), or suitable diluent.
A.2.2 Aseptically transfer a measured volume of the inoculated test solution into sterile DPBST (A.1.1.4)
or diluting fluid.
A.2.3 Transfer the diluted solution to the membrane and filter immediately with the aid of vacuum or
pressure. Dilute the sample applied to the filter with 50 ml to 100 ml of dilution fluid and thoroughly mix
to ensure uniform distribution of the sample over the entire area of the filter.
NOTE This will decrease the probability of multiple colony-forming units being placed on the filter at the
same location.
A.2.4 Wash the membrane filter with several volumes of diluting fluid which may contain additional
neutralizing agents as needed. The actual volume should be determined empirically for each formulation
for each challenge organism.
NOTE Three volumes of diluting fluid (100 ml each) are usually sufficient to remove and/or dilute the
antimicrobial agent.
A.2.5 Incubate the membrane filter with appropriate media to allow growth of colony-forming units on
the surface of the filter.
This can be accomplished by aseptic removal of the membrane filter from the filter assembly unit and
placement of the membrane on the surface of a sterile agar plate which does not have obvious liquid on
the surface; or the membrane can be enclosed in an agar sandwich. Alternatively, a sterile membrane
filter unit can be used which requires addition of sterile media to the sealed filter and incubation of the
membrane in situ. Media should be used which are appropriate for the type of challenge organism and
the specific formulation under test. Time of the incubation should be established.
A.2.6 Determine the average number of colony-forming units on the countable membrane filters (3 cfu
to 100 cfu/47 mm filter for bacteria and yeast and 3 cfu to 10 cfu/47 mm filter for moulds). Calculate and
document the number of colony-forming units per millilitre of inoculated solution.
A.3 Controls
Confirm neutralizer efficacy by transferring an aliquot of the uninoculated test solution into 50 ml to
100 ml of sterile diluting fluid using the same ratio of volume of test solution to volume of diluting fluid.
Apply the entire volume to the membrane and filter using vacuum or pressure. Wash the filter with several
volumes of the diluting fluid using the same volume as used for the test procedure. Transfer 5 cfu to 100 cfu
challenge organisms (one species per filter) into 100 ml of diluting fluid and apply to the membrane.
Incubate the membrane filter in contact with media as described in the test procedure (see A.2.5).
Repeat the procedure using diluting fluid not exposed to the test solution. Compare counts with those
derived by the same method but using a suitable diluent (e.g. DPBST), instead of the test solution. Confirm
the inoculum on a suitable medium in triplicate (unless otherwise justified). Ensure that the recovery in
the neutralizer broth is at least 50 % of the inoculum.
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Annex B
(informative)
Discard date procedure I
B.1 Principle
B.1.1 The test consists of inoculating the test samples with a high level of organism (approximately
10 cfu/ml) on 0 d. The test samples are rechallenged with a low organism inoculum level (approximately
10 cfu/ml) in the test formulation.
B.1.2 Inoculation times are at initial, 2 weeks, 25 %, 50 %, 75 %, and 100 % of the proposed discard date.
B.1.3 Sampling times should include 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks, and 25 %, 50 %, 75 %, and
100 % of the proposed discard date, and 14 d after the proposed discard date.
B.1.4 Test samples should meet the test criteria for ISO Preservative Efficacy of Multidose Preserved
Contact Lens Care Products at 28 d.
B.1.5 Stasis should be shown after rechallenges.
B.2 Test methods
B.2.1 Materials and reagents
B.2.1.1 Test organisms
Test organisms should be as specified in 5.1.1.
B.2.1.2 Test media
Test media should be as specified in 5.1.2.
B.2.1.3 Laboratory equipment
Laboratory equipment should be as specified in 5.1.3.
B.2.1.4 Test samples
Challenge tests are conducted to support discard after opening date, using three lots of contact lens care
solutions representative of the product to be marketed.
Culture maintenance should be as specified in 5.2.
B.2.2 Preparation of microbial challenge (Inoculum)
Test organisms should be cultured and harvested as specified in 5.3.
B.2.3 Inoculum challenge test procedure
B.2.3.1 Prepare a composite sample of greater than 250 ml from individual test samples.
B.2.3.2 Prepare a separate 50 ml quantity of test formulation for each test organism. Place the sample
into a 250 ml flask or specimen container.
B.2.3.3 Prepare 50 ml containers of a suitable diluent for bacteria, yeast, and mould controls.
B.2.3.4 Inoculate formulation samples and controls with 0,5 ml aliquot of the 10 cfu/ml organism
suspension to achieve a final concentration of approximately 10 cfu/ml. Ensure complete dispersion of
the inoculum by adequate mixing.
B.2.3.5 Store the inoculated product at 20 °C to 25 °C. The temperature shall be monitored using a
calibrated device and the temperature documented.
If the contact lens care product is sensitive to light, it should be protected during the period of the test.
B.2.3.6 At 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks, and at 25 %, 50 %, 75 %, and 100 % of the proposed
discard date, and 14 d after the proposed discard date, take 1,0 ml aliquots of the inoculated product for
determination of viable counts.
B.2.3.7 Rechallenge the formulation samples at 2 weeks, 25 %, 50 %, 75 %, and 100 % of the proposed
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 14730
Deuxième édition
2014-10-01
Optique ophtalmique — Produits
d’entretien des lentilles de contact —
Essais de l’efficacité de conservation
antimicrobienne et lignes directrices
pour la détermination de la durée
d’utilisation après première ouverture
Ophthalmic optics — Contact lens care products — Antimicrobial
preservative efficacy testing and guidance on determining discard
date
Numéro de référence
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sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
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Publié en Suisse
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 1
5 Méthodes d’essai . 2
5.1 Matériaux et réactifs . 2
5.2 Échantillons pour essai et maintenance de la culture . . 3
5.3 Préparation de l’ensemencement microbien (inoculum) . 3
5.4 Méthode d’essai d’ensemencement de l’inoculum . 4
5.5 Contrôles . 5
5.6 Critères de performance . 6
5.7 Rapport d’essai . 6
Annexe A (informative) Exemple de méthode II de filtration sur membrane .7
Annexe B (informative) Méthode I pour la durée d’utilisation après première ouverture .9
Annexe C (informative) Méthode pour la durée d’utilisation après première ouverture .13
Annexe D (informative) Méthode III pour la durée d’utilisation après première ouverture .17
Annexe E (informative) Méthode IV pour la durée d’utilisation après première ouverture .21
Annexe F (informative) Organismes d’essai provenant d’autres collections de cultures.25
Bibliographie .26
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/CEI, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration
du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par
l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de
la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de l’OMC concernant
les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos — Informations
supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 172, Optique et photonique, sous-comité
SC 7, Optique et instruments ophtalmiques en collaboration avec le Comité technique CEN/TC 170, Optique
ophtalmique.
Cette seconde édition annule et remplace la première édition (ISO 14730:2000), dont elle constitue une
révision mineure.
iv © ISO 2014 – Tous droits réservés

Introduction
Les produits d’entretien des lentilles de contact (PELC) sont utilisés avec des lentilles de contact. Ces
produits permettent de rincer, de nettoyer, de désinfecter, de stocker, d’humidifier, de conditionner les
lentilles de contact et d’en améliorer le confort. Certains produits ont une seule fonction, d’autres sont
multi-fonctions.
En règle générale, les produits fabriqués en vue d’une utilisation avec des lentilles souples peuvent être
utilisés avec des lentilles rigides perméables aux gaz (RPG) ou avec des lentilles polyméthylméthacrylates
(PMMA), mais les produits utilisés spécifiquement avec les lentilles RPG ou PMMA ne conviennent
généralement pas aux lentilles souples.
La plupart des PELC sont fabriqués sous forme de solutions et sont en général conditionnés et vendus
en emballages multi-doses. Des produits secs sont vendus sous forme de comprimés ou de granulés et
doivent être dissous dans un solvant approprié immédiatement avant utilisation.
Si la solution de produit d’entretien des lentilles de contact n’a pas en elle-même une activité
antimicrobienne, il est possible d’ajouter un conservateur antimicrobien au produit pour inhiber la
prolifération de micro-organismes pouvant être introduits à l’occasion de versements répétés pendant
l’utilisation et le stockage qui suit. Tous les agents antimicrobiens présentent un risque de toxicité
pour l’utilisateur. En vue d’une protection maximale de l’utilisateur, il convient que la concentration du
conservateur soit telle qu’elle offre une activité de conservation adéquate pour une toxicité minimale.
Il existe des différences entre les préparations ophtalmiques et les produits d’entretien des lentilles de
contact. Certaines de ces différences sont significatives par rapport à l’essai de l’efficacité de préservation.
En règle générale, les préparations ophtalmiques sont conditionnées dans des emballages de faible
volume, et sont utilisées pour de courtes périodes sur des yeux présentant des troubles fonctionnels. Les
produits d’entretien des lentilles de contact sont distribués en doses plus grandes et sont utilisés sur des
yeux sains avec des lentilles de contact sur une longue période. Les risques potentiels liés à l’entretien
des lentilles de contact sont l’interaction solution/lentilles qui provoque une irritation oculaire et les
risques de contamination de la solution par l’utilisation répétée (quotidienne) du produit.
Par conséquent, lorsque les produits d’entretien des lentilles de contact sont formulés, le risque d’effet
indésirable sur le patient lié aux lentilles et/ou à l’interaction avec la solution doit être mis en balance
avec les bénéfices en termes de sécurité dus à l’activité antimicrobienne de la solution.
La présente Norme internationale spécifie la méthode d’essai et les critères de performance applicables
à l’efficacité de la conservation. Elle a été adaptée à partir des Pharmacopées qui donnent une limite
de temps de 28 jours dans leur méthode d’essai. Les annexes informatives donnent quatre exemples de
méthodes d’essai de l’efficacité de conservation développées par des fabricants de produits d’entretien
des lentilles de contact afin de présenter l’efficacité de conservation des produits dont les dates
d’utilisation après première ouverture sont supérieures à 28 jours.
NORME INTERNATIONALE ISO 14730:2014(F)
Optique ophtalmique — Produits d’entretien des lentilles
de contact — Essais de l’efficacité de conservation
antimicrobienne et lignes directrices pour la
détermination de la durée d’utilisation après première
ouverture
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie la méthode suivie pour évaluer l’activité de conservation
antimicrobienne de tous les produits d’entretien des lentilles de contact conservés en emballages multi-
doses et fournit des lignes directrices sur les méthodes à utiliser pour la détermination de la durée
d’utilisation après première ouverture, en annexes informatives.
Le présent essai est applicable pour une durée d’utilisation après première ouverture allant
jusqu’à 28 jours.
L’essai ne s’applique pas aux produits stériles emballés en doses unitaires destinées à un usage unique
ni aux emballages multi-doses constituant des barrières physiques à la contamination microbienne
(exemple: emballages aérosol).
NOTE 1 Les principes de l’essai peuvent être utilisés pour étendre la durée d’utilisation au-delà de 28 jours.
Voir Annexes B, C, D et E.
NOTE 2 L’usage d’inoculums multiples ou mixtes et/ou l’inclusion de lentilles de contact ou d’autres charges
organiques peut modifier l’activité antimicrobienne apparente d’un produit particulier. L’évaluation de ces
variables, associée à l’essai sur une large gamme de micro-organismes et l’essai d’échantillons provenant de doses
utilisées partiellement peuvent être intéressants pour développer un produit d’entretien des lentilles de contact,
mais ne font pas partie du domaine d’application de la présente Norme internationale.
2 Références normatives
Les documents ci-après, en totalité ou en partie, sont référencés de manière normative dans le présent
document et sont indispensables pour son application. Pour les références datées, seule l’édition citée
s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y
compris les éventuels amendements).
ISO 14534, Optique ophtalmique — Lentilles de contact et produits d’entretien des lentilles de contact —
Exigences fondamentales
ISO 18369-1, Optique ophtalmique — Lentilles de contact — Partie 1: Vocabulaire, système de classification
et recommandations pour l’étiquetage des spécifications
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l’ISO 18369-1 s’appliquent.
4 Principe
4.1 L’essai consiste à contaminer la préparation avec un inoculum microbien défini et convenable
au début de l’essai, puis à nouveau au 14ème jour. Les préparations inoculées sont conservées à une
température donnée. Des échantillons des préparations inoculées sont prélevés à intervalles donnés,
et sont mis en culture pour déterminer les organismes viables. L’aptitude du produit à empêcher toute
nouvelle prolifération est confirmée par le dénombrement des organismes viables sur des durées
prolongées.
4.2 La dimension de l’ensemencement microbien sélectionné dans le présent essai n’est pas censée être
représentative de l’ensemencement probable en pratique, mais permet plutôt d’obtenir des informations
chiffrées à partir desquelles l’estimation du taux et de l’importance de la perte de viabilité peut être
déterminée.
4.3 Les propriétés de conservation antimicrobienne du produit sont adéquates si, dans les conditions
de l’essai, il existe une réduction significative des bactéries et aucune augmentation des levures et des
moisissures dans la préparation inoculée après le temps indiqué et à la température prescrite. Les critères
de performance figurent en 5.6.
4.4 Il faut prendre des mesures appropriées pour inactiver ou éliminer les agents antimicrobiens
pendant la culture et le dénombrement des micro-organismes survivants. L’efficacité de ces mesures doit
être validée.
5 Méthodes d’essai
5.1 Matériaux et réactifs
5.1.1 Organismes d’essai
Les souches énumérées au Tableau 1 doivent être utilisées.
NOTE Les organismes d’essai provenant d’autres collections de cultures pouvant être utilisés figurent à
l’Annexe F.
Tableau 1 — Organismes d’essai
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
Staphylococcus aureus ATCC 6538
Escherichia coli ATCC 8739
Candida albicans ATCC 10231
Aspergillus brasiliensis ATCC 16404
5.1.2 Milieux de culture et réactifs
5.1.2.1 Gélose de tryptone soja (TSA).
5.1.2.2 Gélose Sabouraud (SDA).
5.1.2.3 Solution saline tamponnée au phosphate Dulbecco, sans chlorure de calcium ni chlorure de
magnésium (DPBS).
Mélanger 200 mg/l de KCl, 200 mg/l de KH PO , 8 000 mg/l de NaCl et 2 160 mg/l de Na HPO ⋅ 7H O
2 4 2 4 2
ou autre diluant approprié.
5.1.2.4 Solution saline tamponnée au phosphate Dulbecco, plus 0,05 % (en masse volumique) de
polysorbate 80 (DPBST) ou autre diluant approprié.
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5.1.2.5 Milieux/agents neutralisants validés, comme spécifié, par exemple bouillon neutralisant
Dey-Engley (DEB) et bouillon Letheen.
5.1.3 Appareillage d’essai
L’équipement normal de laboratoire suivant est nécessaire: pipettes, compresses, tubes, boîtes
de Pétri (90 mm à 100 mm × 20 mm) stériles, etc. et appareils appropriés pour la détermination
spectrophotométrique de la densité des cellules, pour le dénombrement des colonies et pour la
centrifugation.
5.2 Échantillons pour essai et maintenance de la culture
Le produit à soumettre à l’essai doit être représentatif du produit à commercialiser. Il convient de
prélever les parties aliquotes directement dans l’emballage de produit final immédiatement avant l’essai.
Trois lots de produits doivent être soumis à l’essai. Chaque lot de produit doit être soumis à l’essai avec
des contaminants distincts pour chaque organisme à inoculer.
Maintenir les cultures d’essai selon les recommandations du centre de collection dont elles sont issues.
Il convient de ne pas repiquer les cultures plus de 5 fois à partir du stock provenant de la collection
(ATCC, NCIB, NCTC, NCPF ou autres, voir Annexe F). Chaque repiquage est une sous-culture du repiquage
précédent.
5.3 Préparation de l’ensemencement microbien (inoculum)
Chaque organisme d’essai est mis en culture sur de la gélose dans les conditions énoncées au Tableau 2.
Tableau 2 — Milieux et conditions d’incubation pour la prolifération des organismes
d’ensemencement
Température Durée d’incuba-
Organisme Moyene
°C tion
P. aeruginosa TSA 30 à 35 18 h à 24 h
S. aureus TSA 30 à 35 18 h à 24 h
E. coli TSA 30 à 35 18 h à 24 h
20 à 25 42 h à 48 h
C. albicans SDA
ou 30 à 35 18 h à 24 h
A. brasiliensis SDA 20 à 25 7 à 10 jours
Utiliser un DPBST stérile ou un diluant approprié pour collecter chaque culture. Laver le milieu de
culture, le transférer dans un godet adéquat et agiter. Filtrer les suspensions de spores à travers de la
laine de verre stérile, de la mousseline ou de la gaze pour enlever les fragments d’hyphal.
Après la collecte, les organismes mis en culture peuvent être lavés par centrifugation. Les bactéries
en suspension peuvent être filtrées pour produire une unique dispersion de cellules (par exemple
granulométrie des pores de 3 µm à 5 µm). Ajuster ensuite toutes les suspensions de cellules
d’ensemencement avec du DPBST ou un autre diluant approprié à une concentration comprise entre
7 8
1,0 × 10 ufc/ml et 1,0 × 10 ufc/ml. Estimer la concentration approximative en cellules de chaque
suspension en mesurant la turbidité de la suspension ou de la dilution de la suspension à l’aide d’un
spectrophotomètre. La concentration réelle des unités formant colonie par millilitre doit être déterminée
pour chaque suspension, par exemple par la méthode du dénombrement sur plaque, au moment de l’essai.
En utilisant la centrifugation, il convient de réaliser chaque centrifugation entre 20 °C et 25 °C pour une
durée qui ne dépasse pas l’équivalent de 10 min à 4 000 g ou moins.
Utiliser les suspensions de cellules de levures et de bactéries le jour de leur préparation.
NOTE 1 Il se peut que des durées de centrifugation supérieures soient nécessaires à des vitesses inférieures.
NOTE 2 Les suspensions de spores peuvent être utilisées jusqu’à sept jours après la préparation, si elles sont
conservées au réfrigérateur (entre 2 °C et 8 °C).
5.4 Méthode d’essai d’ensemencement de l’inoculum
5.4.1 Préparer un ou plusieurs tubes (pour chaque lot utilisé) contenant un minimum de 10 ml de
solution d’essai par organisme à inoculer.
NOTE Des tubes échantillons sont utilisés de préférence à des boîtes à lentilles pour permettre une exécution
technique efficace de l’essai. Du fait d’incompatibilités qui peuvent exister entre la composition de la solution et
les matériaux des tubes, il convient d’utiliser des tubes dont le matériau est compatible avec la composition de la
solution d’essai.
Inoculer dans le tube à échantillon de produit à soumettre à l’essai une suspension d’organismes d’essai
5 6
suffisante pour obtenir un dénombrement final compris entre 1,0 × 10 ufc/ml et 1,0 × 10 ufc/ml.
S’assurer que le volume de l’inoculum ne dépasse pas 1 % du volume d’échantillon. Mélanger correctement
pour obtenir une dispersion complète de l’inoculum.
5.4.2 Entreposer le produit inoculé entre 20 °C et 25 °C. La température doit être contrôlée à l’aide d’un
dispositif étalonné et consignée dans le rapport d’essai.
Si le produit est sensible à la lumière, il convient de le protéger pendant la durée de l’essai.
5.4.3 Prélever des échantillons de 1,0 ml du produit inoculé pour dénombrer les cellules viables à
7 jours et 14 jours.
5.4.4 Après prélèvement de l’échantillon à 14 jours, chaque échantillon est réensemencé comme en
4 5
5.4.1 en utilisant un inoculum à une concentration comprise entre 1,0 × 10 ufc/ml et 1,0 × 10 ufc/ml.
5.4.5 Prélever des échantillons de 1,0 ml du produit inoculé pour dénombrer les cellules viables à
21 jours et 28 jours.
5.4.6 Soumettre chacune des aliquotes de 1,0 ml prélevées aux intervalles spécifiés à une série
adéquate de dilutions décimales dans un milieu neutralisant validé. Mélanger la suspension en l’agitant
vigoureusement et laisser reposer pour permettre une neutralisation intégrale. Les conditions de la
neutralisation doivent être basées sur l’essai de contrôle du milieu de récupération (voir 5.5.2).
Si un agent antimicrobien de la formulation ne peut pas être inactivé ou neutralisé de manière adéquate,
l’éliminer en utilisant une méthode appropriée de filtration sur membrane (voir Annexe A).
5.4.7 Procéder au dénombrement des organismes viables dans chacune des dilutions en triple (sauf
spécification contraire) en utilisant des boîtes de milieu de récupération approprié (par exemple TSA
pour les bactéries et SDA pour la moisissure et la levure).
Si une filtration sur membrane a été utilisée pour éliminer ou neutraliser les agents antimicrobiens,
cultiver les membranes sur ces milieux, s’il y a lieu.
Si la méthode par inclusion est utilisée, conserver la gélose des boîtes à une température inférieure à
50 °C, avant la distribution.
NOTE Les milieux de gélose utilisés pour le dénombrement des cellules viables peuvent également contenir
des inactivateurs ou des neutralisants antimicrobiens, si nécessaire.
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5.4.8 Incuber les boîtes de récupération de bactéries entre 30 °C et 35 °C. Incuber les boîtes de
récupération de levures entre 20 °C et 25 °C ou entre 30 °C et 35 °C. Incuber les boîtes de récupération de
moisissures entre 20 °C et 25 °C. Il faut déterminer les durées d’incubation permettant la récupération
optimale des bactéries, des levures et des moisissures. Les durées d’incubation minimales doivent se
baser sur l’essai de contrôle du milieu de récupération (voir 5.5.2). Noter le nombre d’ufc observées dans
les boîtes dénombrables.
Il convient d’examiner périodiquement les boîtes pendant l’incubation afin d’empêcher que les boîtes ne
deviennent incomptables en raison d’une surcroissance.
5.4.9 Déterminer le nombre moyen d’unités formant colonie sur des boîtes dénombrables. Calculer la
réduction microbienne à des points temporels spécifiés.
NOTE Ne sont comptables que les boîtes contenant entre 30 et 300 ufc/boîte pour les bactéries et les levures
et entre 8 et 80 ufc/boîte pour les moisissures, sauf si les colonies ne sont observées que sur les boîtes de dilution
0 −1
10 ou 10 .
5.4.10 L’absence de micro-organismes doit être documentée, par exemple en enregistrant « 0 » ou « NR »
(pas de récupération) pour toutes les dilutions d’un échantillon, prélevé à un intervalle de temps donné
unique, qui ont zéro colonie.
5.4.11 La concentration de survivants est calculée à chaque intervalle de temps. La concentration
d’organismes viables après le réensemencement au 14ème jour correspond à la somme de la concentration
de l’inoculum réensemencé et de la concentration de survivants au 14ème jour.
5.5 Contrôles
5.5.1 Contrôles de l’inoculum
La concentration initiale de l’inoculum et celle de l’inoculum réensemencé sont déterminées en diluant
un volume identique d’inoculum dans le même volume d’un diluant approprié que celui utilisé en 5.4.1. Le
5 6
dénombrement des colonies doit montrer que l’inoculum contient entre 1,0 × 10 ufc/ml et 1,0 × 10 ufc/ml
4 5
pour l’inoculum initial, ou entre 1,0 × 10 ufc/ml et 1,0 × 10 ufc/ml pour le réensemencement. Le volume
de l’inoculum n’excède pas 1 % du volume de l’échantillon. Mélanger correctement pour s’assurer de la
dispersion de l’inoculum. Au début de l’essai, évaluer la quantité d’ufc/ml dans cet échantillon témoin
afin de démontrer l’adéquation du milieu utilisé pour la prolifération de l’organisme d’essai et d’obtenir
une estimation de la concentration initiale de l’inoculum. Distribuer la partie aliquote de chaque tube
sur les boîtes de récupération de gélose en triple exemplaire (sauf spécification contraire justifiée).
5.5.2 Contrôle du milieu de récupération
Procéder à une dilution à 1:10 du produit conservé dans le bouillon neutralisant validé (1 ml dans 9 ml)
et agiter. Laisser reposer pour terminer la neutralisation. Préparer un second tube de contrôle avec
10 ml d’un diluant adapté (par exemple le DPBST). Inoculer suffisamment d’inoculum dans les tubes
pour obtenir une concentration d’organisme d’ensemencement comprise entre 10 ufc et 100 ufc par
boîte. Incuber pendant une durée appropriée à température ambiante. Distribuer la partie aliquote de
chaque tube sur les boîtes de récupération de gélose en triple exemplaire (sauf spécification contraire
justifiée).
Incuber les boîtes de récupération bactérienne à une température comprise entre 30 °C et 35 °C. Incuber
les boîtes de récupération de levures à une température comprise entre 20 °C et 25 °C ou entre 30 °C
et 35 °C. Incuber les boîtes de récupération de moisissures entre 20 °C et 25 °C. Déterminer la durée
d’incubation minimale pour obtenir une récupération optimale de bactéries, levures et moisissures.
Vérifier que la récupération dans le bouillon neutralisant est égale ou supérieure à 50 % de la récupération
dans le second tube de contrôle. Procéder à ce contrôle pour chaque organisme d’ensemencement.
Si une dilution supérieure à 1:10 est nécessaire pour la neutralisation, il convient d’utiliser la filtration
sur membrane.
Valider la neutralisation du produit avec chaque organisme d’ensemencement initialement, et lorsque
nécessaire.
5.6 Critères de performance
5.6.1 Généralités
Les produits doivent être capables de satisfaire aux critères tout au long de leur durée de conservation
indiquée sur l’emballage et jusqu’à leur date limite d’utilisation après ouverture.
La satisfaction aux critères indiqués en 5.6.2 et 5.6.3 doit justifier une période d’utilisation de 28 jours
après ouverture (durée d’utilisation après première ouverture).
NOTE Se référer aux Annexes B, C, D et E pour les méthodes suggérées, si une durée d’utilisation supérieure
à 28 jours est souhaitée.
5.6.2 Bactéries
Le nombre de chaque organisme d’ensemencement récupéré par millilitre doit être diminué d’une valeur
moyenne supérieure ou égale à 3,0 logs à 14 jours. Après le réensemencement à 14 jours, la concentration
de chaque organisme d’ensemencement doit être de nouveau réduite d’une valeur moyenne minimum de
3,0 logs à 28 jours.
5.6.3 Moisissures et levures
Le nombre de chaque organisme d’ensemencement récupéré par ml doit rester égal ou inférieur aux
concentrations initiales (avec une tolérance d’erreur expérimentale de ± 0,5 logs) pendant 14 jours. À
28 jours, la concentration de chaque organisme d’ensemencement par ml doit rester égale ou inférieure
aux concentrations (avec une tolérance d’erreur expérimentale de ± 0,5 logs) de chaque organisme
d’ensemencement après le réensemencement.
5.7 Rapport d’essai
Le rapport d’essai doit comporter les éléments suivants:
a) le titre de la présente Norme internationale,
b) l’identification du produit, y compris le nom du produit, le numéro de lot, la date de péremption, le
fabricant, les conditions d’entreposage et la ou les substance(s) active(s) et leur(s) concentration(s)
(si disponibles),
c) le nom du ou des opérateur(s),
d) les écarts par rapport au protocole,
e) la date et la durée d’incubation,
f) la durée de stockage du produit inoculé,
g) les résultats obtenus, incluant le nombre d’organismes récupérés à chaque point.
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Annexe A
(informative)
Exemple de méthode II de filtration sur membrane
A.1 Matériaux et réactifs
A.1.1 Milieux de culture et réactifs
A.1.1.1 Diluant liquide, avec ou sans neutralisants.
A.1.1.2 Gélose de tryptone soja (TSA).
A.1.1.3 Solution saline tamponnée au phosphate Dulbecco, sans chlorure de calcium ni chlorure de
magnésium (DPBS): 200 mg/l de KCl, 200 mg/l de KH PO , 8 000 mg/l de NaCl et 2 160 mg/l de Na HPO
2 4 2 4
⋅ 7H O ou autre diluant approprié.
A.1.1.4 Solution saline tamponnée au phosphate Dulbecco, plus 0,05 % (en masse volumique) de
polysorbate 80 (DPBST) ou autre diluant approprié.
A.1.1.5 Milieux/agents neutralisants validés, comme spécifié, par exemple bouillon neutralisant
Dey-Engley (DEB) et bouillon Letheen.
A.1.2 Appareillage d’essai
Appareillage normal de laboratoire (tel que pipettes stériles, boîtes de Pétri, récipients) ainsi que les
appareils suivants.
A.1.2.1 Filtre à membrane stérile.
A.1.2.2 Appareillage stérile approprié, pour maintenir le filtre à membrane stérile et le filtrat.
A.1.2.3 Appareillage approprié permettant de créer un vide ou une pression, pour faire passer la
phase liquide de la solution d’essai inoculée à travers le filtre à membrane dans des conditions aseptiques.
Il convient que le filtre à membrane ait des pores d’une granulométrie nominale inférieure ou égale à
0,45 µm et un diamètre supérieur ou égal à 47 mm, et qu’il ne contienne aucun produit chimique risquant
d’être toxique pour les cellules microbiennes.
A.2 Méthode d’essai et résultats
A.2.1 Humidifier le filtre à membrane stérile (A.1.2.1) dans un bloc à filtre stérile (A.1.2.2) avec du
DPBST stérile (A.1.1.4) ou un diluant approprié.
A.2.2 Transférer dans des conditions aseptiques le volume mesuré de solution d’essai inoculée dans un
DPBST stérile (A.1.1.4) ou dans un diluant liquide.
A.2.3 Transférer la solution diluée sur la membrane et filtrer immédiatement par effet de vide ou de
pression. Diluer l’échantillon appliqué sur le filtre avec 50 ml à 100 ml de diluant liquide et mélanger
soigneusement pour garantir une distribution uniforme de l’échantillon sur la surface entière du filtre.
NOTE Cette manipulation fera décroître la probabilité que plusieurs unités formant colonie ne se soient
placées au même endroit sur le filtre.
A.2.4 Laver le filtre à membrane en utilisant plusieurs volumes de diluant liquide pouvant contenir des
agents neutralisants supplémentaires si nécessaire. Il convient de déterminer le volume réel de manière
empirique pour chaque formulation et chaque organisme d’ensemencement.
NOTE En règle générale, trois volumes de diluant liquide (de 100 ml chacun) suffisent pour éliminer et/ou
diluer l’agent antimicrobien.
A.2.5 Incuber le filtre à membrane avec des milieux adéquats pour permettre la croissance des unités
formant colonie à la surface du filtre.
Cette opération est possible en retirant dans des conditions aseptiques le filtre à membrane du bloc
filtre et en plaçant la membrane à la surface d’une boîte de gélose stérile ne comportant pas de liquide
en évidence à la surface. La membrane peut également être incluse sous une couche de gélose. Un autre
moyen consiste à utiliser une membrane stérile qui peut nécessiter l’addition de milieux stériles au filtre
hermétique, et l’incubation peut se faire in situ. Il convient d’utiliser des milieux appropriés au type
d’organisme à inoculer et à la formulation spécifique soumise à l’essai. Il convient d’établir la durée
d’incubation.
A.2.6 Déterminer le nombre moyen d’unités formant colonie sur les filtres à membrane dénombrables
(3 ufc à 100 ufc par filtre de 47 mm pour les bactéries et les levures et 3 ufc à 10 ufc par filtre de 47 mm
pour les moisissures). Calculer et documenter le nombre d’unités formant colonie par millilitre de solution
inoculée.
A.3 Contrôles
Confirmer l’efficacité du neutralisant en transférant une aliquote de la solution d’essai non inoculée sur
50 ml à 100 ml de diluant liquide stérile en utilisant le même rapport volumétrique de solution d’essai
par rapport au diluant liquide. Appliquer le volume entier sur la membrane et filtrer par effet de vide
ou de pression. Laver le filtre avec plusieurs volumes de diluant liquide en utilisant le même volume
que dans la méthode d’essai précédente. Transférer entre 5 ufc et 100 ufc d’organismes à inoculer (une
seule espèce par filtre) dans 100 ml de diluant liquide et appliquer sur la membrane. Incuber le filtre à
membrane en contact avec les milieux comme décrit dans la méthode d’essai (voir A.2.5).
Recommencer l’opération en utilisant du diluant liquide non exposé à la solution d’essai. Comparer le
dénombrement avec ceux précédemment obtenus par la même méthode en utilisant un diluant adapté
(par exemple DPBST), au lieu de la solution d’essai. Confirmer l’inoculum sur un milieu adapté en triple
exemplaire (sauf spécification contraire). S’assurer que la récupération dans le bouillon neutralisant est
au moins égale à 50 % de l’inoculum.
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Annexe B
(informative)
Méthode I pour la durée d’utilisation après première ouverture
B.1 Principe
B.1.1 L’essai consiste à inoculer les échantillons pour essai avec des organismes à une concentration
élevée (environ 10 ufc/ml) au jour 0. Les échantillons pour essai sont réensemencés avec des organismes
à une faible concentration dans l’inoculum (environ 10 ufc/ml) dans la formulation de l’essai.
B.1.2 Les dates d’inoculation sont les suivantes: au début, à 2 semaines, à 25 %, à 50 %, à 75 % et à
100 % de la durée d’utilisation après première ouverture proposée.
B.1.3 Il est recommandé d’étudier au moins les durées d’échantillonnage suivantes: 1 semaine,
2 semaines, 3 semaines et 4 semaines, et 25 %, 50 %, 75 % et 100 % de la durée d’utilisation après
première ouverture, ainsi que 14 jours après la durée d’utilisation après première ouverture.
B.1.4 Il convient que les échantillons pour essai satisfassent aux critères d’essai de l’ISO: Efficacité de
préservation des produits d’entretien des lentilles de contact multi-doses à 28 jours.
B.1.5 Il convient que la stase survienne après des réensemencements.
B.2 Méthodes d’essai
B.2.1 Matériaux et réactifs
B.2.1.1 Organismes d’essai
Il convient que les organismes d’essai respectent les conditions spécifiées en 5.1.1.
B.2.1.2 Milieux d’essai
Il convient que les milieux d’essai respectent les conditions spécifiées en 5.1.2.
B.2.1.3 Appareillage d’essai
Il convient que l’appareillage respecte les conditions spécifiées en 5.1.3.
B.2.1.4 Échantillons pour essai
Les essais d’inoculation sont réalisés pour vérifier la durée d’utilisation après première ouverture en
utilisant trois lots de solutions pour lentilles de contact représentatives du produit à commercialiser.
Il convient que la maintenance de la culture respecte les conditions spécifiées en 5.2.
B.2.2 Préparation de l’ensemencement microbien (inoculum)
Il convient que les organismes d’essai soient mis en culture et collectés selon les conditions spécifiées
en 5.3.
B.2.3 Méthode d’essai d’ensemencement de l’inoculum
B.2.3.1 Préparer un échantillon mixte supérieur à 250 ml à partir d’échantillons pour essai.
B.2.3.2 Préparer une quantité distincte de 50 ml de formulation d’essai pour chaque organisme d’essai.
Placer l’échantillon dans un flacon de 250 ml ou dans un récipient pour échantillon.
B.2.3.3 Préparer des récipients de 50 ml de diluant approprié pour les contrôles de bactéries, levures
et moisissures.
B.2.3.4 Inoculer les échantillons de formulation et les contrôles avec une aliquote de 0,5 ml prise dans
8 6
la suspension d’organisme de 10 ufc/ml pour obtenir une concentration finale de 10 ufc/ml environ.
Mélanger correctement pour obtenir une dispersion complète de l’inoculum.
B.2.3.5 Entreposer le produit inoculé entre 20 °C et 25 °C. La température doit être contrôlée à l’aide
d’un dispositif étalonné et consignée dans le rapport d’essai.
Si le produit d’entretien des lentilles de contact est sensible à la lumière, il convient de le protéger
pendant la durée de l’essai.
B.2.3.6 À 1, 2, 3, 4 semaines et 25 %, 50 %, 75 % et 100 % de la durée d’utilisation après première
ouverture proposée, ainsi que 14 jours après la durée d’utilisation après première ouverture proposée,
prélever des aliquotes de 1,0 ml du produit inoculé pour procéder au dénombrement des cellules viables.
B.2.3.7 Réensemencer les échantillons de formulation à 2 semaines, 25 %, 50 %, 75 % et 100 % de la
durée d’utilisation après première ouverture proposée, en utilisant un rapport de 0,05 ml/50 ml d’une
6 3
suspension d’organismes à 10 ufc/ml pour obtenir une concentration finale d’environ 10 ufc/ml.
Recommencer le dénombrement à chaque intervalle avant de réensemencer.
B.2.3.8 Soumettre chacune des aliquotes de 1,0 ml prélevées aux intervalles spécifiés à une série
adéquate de dilutions décimales dans un milieu neutralisant validé. Mélanger la suspension en l’agitant
vigoureusement et laisser reposer pour permettre une neutralisation intégrale.
Si un agent antimicrobien de la formulation ne peut pas être inactivé ou neutralisé de manière adéquate,
l’éliminer en utilisant une méthode appropriée de filtration sur membrane (voir Annexe A).
B.2.3.9 Procéder au dénombrement des organismes viables dans les dilutions appropriées en préparant
des boîtes en triple exemplaire (sauf spécification contraire justifiée) d’un milieu de récupération
approprié (par exemple TSA pour les bactéries et SDA pour les moisissures et les levures).
Si une filtration sur membrane a été utilisée pour éliminer ou neutraliser les agents antimicrobiens,
cultiver les membranes sur ces milieux, s’il y a lieu.
Si la méthode par inclusion est utilisée, conserver la gélose des boîtes à une température inférieure à
50 °C, avant la distribution.
NOTE Les milieux de gélose utilisés pour le dénombrement des cellules viables peuvent également contenir
des inactivateurs ou des neutralisants antimicrobiens, si nécessaire.
B.2.3.10 Incuber les boîtes de récupération bactérienne entre 30 °C et 35 °C. Incuber les boîtes de
récupération de levures entre 20 °C et 25 °C ou entre 30 °C et 35 °C. Incuber les boîtes de récupération
de moisissures entre 20 °C et 25 °C. Il convient de déterminer les durées d’incubation permettant la
récupération optimale des bactéries, des levures et des moisissures. Il convient de baser les durées
d’incubation minimales sur l’essai de contrôle du milieu de récupération (voir B.2.4.2).
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B.2.3.11 Déterminer le nombre moyen d’unités formant colonie sur des boîtes dénombrables. Calculer la
réduction microbienne à des points temporels spécifiés.
NOTE Ne sont comptables que les boîtes contenant entre 30 et 300 ufc/boîte pour les bactéries et les levures
et entre 8 et 80 ufc/boîte pour les moisissures, sauf si les colonies ne sont observées que sur les boîtes de dilution
0 −1
10 ou 10 .
B.2.3.12 Il convient de documenter les cas où les boîtes n’indiquent aucune récupération de micro-
organismes pour toutes les dilutions d’un échantillon à un temps unique.
B.2.3.13 La concentration des survivants est calculée à chaque intervalle.
B.2.4 Contrôles
B.2.4.1 Contrôles de l’inoculum
Des échantillons témoins frais sont utilisés à chaque date d’inoculation en inoculant une solution saline
1)
(pour les bactéries et les levures) ou une solution saline/Tween® 80 (pour les moisissures), selon la
même procédure que pour l’inoculation de l’échantillon. Les nombres théoriques peuvent être obtenus
en calculant la somme cumulée du dernier inoculum, plus le dernier dénombrement de survivants dans
l’échantillon de formulation.
B.2.4.2 Contrôle du milieu de récupération
Procéder à une dilution à 1:10 du produit conservé dans le bouillon neutralisant validé (1 ml dans 9 ml)
et agiter. Laisser reposer pour terminer la neutralisation. Préparer un second tube de contrôle avec
10 ml d’un diluant adapté (par exemple le DPBST). Inoculer suffisamment d’inoculum dans les tubes
pour obtenir une concentration d’organisme d’ensemencement comprise entre 10 ufc et 100 ufc par
boîte. Incuber pendant une durée appropriée à température ambiante. Distribuer la partie aliquote de
chaque tube sur les boîtes de récupération de gélose en triple exemplaire (sauf spécification contraire
justifiée).
Incuber les boîtes de récupération bactérienne à une température comprise entre 30 °C et 35 °C. Incuber
les boîtes de récupération de levures à une température comprise entre 20 °C et 25 °C ou entre 30 °C
et 35 °C. Incuber les boîtes de récupération de moisissures entre 20 °C et 25 °C. Déterminer la durée
d’incubation minimale pour obtenir une récupération optimale de bactéries, levures et moisissures.
Vérifier que la récupération dans le bouillon neutralisant est supérieure ou égale à 50 % de la récupération
dans le second tube de contrôle. Procéder à ce contrôle pour chaque organisme d’ensemencement.
Si une dilution supérieure à 1:10 est nécessaire pour la neutralisation, la filtration sur membrane doit
être utilisée.
Valider la neutralisation du produit au début de l’essai et à intervalles réguliers.
B.2.5 Critères de performance
La durée d’utilisation après première ouverture est validée si le nombre de bactéries survivantes est
diminué de 3 logs avant le jour 14 et si le nombre de bactéries et de champignons n’augmente pas par la
2)
suite.
1)  Tween est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l’intention
des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande
l’emploi du produit désigné.
2)  Le nombre d’organismes récupérés à partir d’un échantillon pour essai n’excède pas la somme des
dénombrements microbiens de l’inoculation plus le dernier dénombrement de survivants à l’intérieur d’une
tolérance de ± 0,5 log (autrement dit, la multiplication des organismes n’a pas eu lieu).
B.2.6 Rapport d’essai
Il convient que le rapport d’essai respecte les conditions spécifiées en 5.7.
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Annexe C
(informative)
Méthode pour la durée d’utilisation après première ouverture
C.1 Principe
C.1.1 L’essai consiste à ensemencer la préparation par un inoculum prescrit composé de micro-
organismes adaptés, à conserver la préparation inoculée à une température donnée, à retirer des
échantillons du récipient à intervalles donnés et à dénombrer les organismes dans les échantillons retirés.
L’aptitude du produit à empêcher toute nouvelle prolifération est confirmée par le dénombrement des
organismes viables sur des durées prolongées.
C.1.2 La dimension de l’ensemencement microbien sélectionné dans le présent essai n’est pas censée
être représentative de l’ensemencement probable en pratique, mais permet plutôt d’obtenir des
informations chiffrées à partir desquelles l’estimation du taux et de l’importance de la perte de viabilité
peut être déterminée.
C.1.3 La préparation doit satisfaire aux exigences requises pour un produit d’entretien des lentilles de
contact conservé de manière adéquat
...