ISO 15952:2006
(Main)Soil quality — Effects of pollutants on juvenile land snails (Helicidae) — Determination of the effects on growth by soil contamination
Soil quality — Effects of pollutants on juvenile land snails (Helicidae) — Determination of the effects on growth by soil contamination
ISO 15952:2005 specifies a semi-static method for the determination of the effects of contaminants on growth and survival of young snails, usually Helix aspersa aspersa Müller. The animals are exposed via the cutaneous and digestive route using a test substrate (artificial or natural soil according to the objective of the study) to which defined amounts of the following are added: substances or preparations; and soils (contaminated or of unknown quality) or waste materials. A static method is also described. ISO 15952:2005 does not apply to volatile substances, i.e. substances for which the Henry constant, H, or the air/water partition coefficient is over 1, or for which the vapour pressure is over 0,013 3 Pa at 25 °C. This test takes into account possible changes in the test substance, preparation, soil or waste material because the test mixture is prepared and renewed every 7 days during the 28-day test period.
Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des escargots juvéniles (Helicidae) — Détermination des effets sur la croissance par contamination du sol
L'ISO 15952:2005 s'applique à une méthode semi-statique pour la détermination des effets de contaminants sur la croissance et la survie d'escargots juvéniles, généralement Helix aspersa aspersa Müller. Les animaux sont exposés par les voies cutanée et digestive à un substrat d'essai (sol artificiel ou naturel selon l'objectif de l'étude) auquel sont ajoutées des quantités définies de substances ou de préparations, de sols (contaminés ou de qualité inconnue) ou de déchets. Une méthode statique est aussi décrite. L'ISO 15952:2005 ne s'applique pas aux substances volatiles, c'est-à-dire aux substances dont la constante de Henry, H, ou le coefficient de partage air/eau est supérieur à 1, ou pour lesquelles la pression de vapeur est supérieure à 0,013 3 Pa à 25 °C. Cet essai prend en considération le changement éventuel de la substance d'essai, de la préparation, du sol ou des déchets, étant donné que le mélange d'essai est préparé et renouvelé tous les 7 jours pendant la période d'essai de 28 jours.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 15952
First edition
2006-02-15
Soil quality — Effects of pollutants on
juvenile land snails (Helicidae) —
Determination of the effects on growth by
soil contamination
Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des escargots juvéniles
(Helicidae) — Détermination des effets sur la croissance par
contamination du sol
Reference number
ISO 15952:2006(E)
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ISO 15952:2006(E)
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 2
4 Principle. 3
5 Test environment. 3
6 Reagents. 3
7 Apparatus . 5
8 Storage and preparation of the samples. 6
8.1 Soil to be tested . 6
8.2 Waste material. 6
9 Procedure . 6
9.1 Preparation of the test. 6
9.2 Distribution of the test mixture . 8
9.3 Introduction of the feed. 8
9.4 Introduction of the biological reagent . 8
9.5 Handling during the tests . 8
10 Reference substance. 10
11 Calculations and expression of results. 10
11.1 Calculations. 10
11.2 Expression of results . 12
12 Validity of test for Helix aspersa aspersa . 13
13 Test report . 13
Annex A (normative) Static method . 15
Annex B (informative) Breeding technique for snails . 16
Annex C (informative) Example of composition of snail feed . 21
Annex D (informative) Example of table of data. 22
Annex E (informative) Example of results with Helix aspersa aspersa . 23
Annex F (informative) Determination of the effects on growth by food contamination . 26
Annex G (informative) Test performance with other snail species. 30
Bibliography . 31
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ISO 15952:2006(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 15952 was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4, Biological
methods.
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ISO 15952:2006(E)
Introduction
Because of the limited amount of data available concerning toxicity of contaminants on soil organisms, the
problems of assessing the ecotoxicity of soils and waste are cause for serious concern at both national and
international levels. Currently available tests use soil-fauna organisms restricted to annelid (earthworms and
Enchytraeidae) and arthropod phyla (insects: Collembola and Coleoptera). Among the latter, two standards
[5]
assess acute toxicity [earthworms (ISO 11268-1) and coleoptera larvae ] and three other standards assess
[2] [1] [3]
sublethal effects of soil contaminants on reproduction (earthworms , Collembola , Enchytraeidae ). In
the biological cycles of organisms, it appears that growth is, like reproduction, a fundamental ecophysiological
[33]
parameter to be taken into consideration for the sustainability of species and ecosystems .
[15]
Snails are pertinent ecological indicators for assessing the quality of soils , as they are characteristic of the
soil surface layer (saprophagous and phytophagous) of which a large part of the biological cycle takes place in
[6], [17], [26]
the soil (egg-laying, hatching, initial stages of development, hibernation, etc.) . During the other
phases of their cycle, they eat soil and are in contact with the soil via their moist pedal sole (foot) covered with
mucus and participate in the permanent exchanges with the soil (water, mineral salts, excrement and finally
[6], [17], [28]
shell and organic matter when they die) . In addition, they constitute an important link between
plants, fauna and soil microorganisms. They correspond fully to the criteria for a good biological indicator:
[8, 10 to 14, 16, 17, 19, 21,
easy to sample and identify, they are widely distributed; they accumulate contaminants
26, 27, 35 to 43] [6], [9], [29]
; their ecological and physiological characteristics are well-known ; and they are now
[19], [23, [29]
easy to breed under controlled conditions . Their susceptibility to common contaminants of their
[10 to 15, 18 to 27, 32, 33, 36 to 42]
environment has been demonstrated .
This International Standard describes a method for determining the effects on survival and growth of young
snails of substances, preparations, soils or waste materials added to an artificial or a natural soil. The
described method is thus applicable to test contaminated soils or to compare different uncontaminated soils.
The recommended species is Helix aspersa aspersa Müller (also commonly called: common garden snail,
brown garden snail, garden snail, land snail, “Petit-Gris”). Among land snails (stylommatophoran pulmonate
gastropod molluscs of the Helicidae family), Helix aspersa aspersa Müller is the most ubiquitous. This
palearctic species can be acclimated to regions with different types of climate: Mediterranean, oceanic
temperate, midcontinental temperate and even tropical. Helix aspersa aspersa Müller is of European origin
[9]
and has been introduced into all parts of the world. They are now on all continents except Antarctica .
Indeed, in their natural environment, snails integrate the contaminants by contact (with various substrates
such as soil, soil leachates, plant litter), by ingestion (of plants and soil), as well as through the respiratory
[6], [26]
tract . So, for specific testing purposes (evaluation of the toxicity of a pesticide, for example), another
test design, which is focussed on exposure via food uptake, is optionally available (Annex F and
Reference [4]).
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 15952:2006(E)
Soil quality — Effects of pollutants on juvenile land snails
(Helicidae) — Determination of the effects on growth by soil
contamination
1 Scope
This International Standard specifies a semi-static method for the determination of the effects of contaminants
on growth and survival of young snails, usually Helix aspersa aspersa Müller. The animals are exposed via
the cutaneous and digestive route using a test substrate (artificial or natural soil according to the objective of
the study) to which defined amounts of the following are added:
⎯ substances or preparations;
⎯ soils (contaminated or of unknown quality) or waste materials.
A static method may be implemented in addition to the semi-static method (optional). This method is
described in Annex A.
This method does not apply to volatile substances, i.e. substances for which the Henry constant, H, or the
air/water partition coefficient is over 1, or for which the vapour pressure is over 0,013 3 Pa at 25 °C.
This test takes into account the possible change in the test substance, preparation, soil or waste material
because the test mixture is prepared and renewed every 7 days during the 28-day test period.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 10381-6, Soil quality — Sampling — Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for
the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory
ISO 10390, Soil quality — Determination of pH
ISO 10694, Soil quality — Determination of organic and total carbon after dry combustion (elementary
analysis)
ISO 11268-1, Soil quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) — Part 1: Determination of
acute toxicity using artificial soil substrate
ISO 11269-2, Soil quality — Determination of the effects of pollutants on soil flora — Part 2: Effects of
chemicals on the emergence and growth of higher plants
ISO 11274, Soil quality — Determination of the water-retention characteristic — Laboratory methods
ISO 11465, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis — Gravimetric
method
EN 14735, Characterization of waste — Preparation of waste samples for ecotoxicity tests
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ISO 15952:2006(E)
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
test substrate
artificial soil or natural soil used as control and dilution substrate
3.2
matrix
soil or waste material under test
3.3
test mixture
mixture of the test substance, preparation or matrix with the test substrate
3.4
growth
increase in the biomass, i.e. in the total fresh mass (body and shell) of the organisms and increase in the
maximum shell diameter, between the start and completion of the test
NOTE It is expressed in the form of a growth coefficient.
3.5
effect concentration
EC
x
concentration at which a specific effect is detected; x is the percentage (10, 25, 50) of this effect, e.g. growth
inhibition
EXAMPLE EC means the concentration estimated to reduce growth at the end of the test to 50 % compared to the
50
control.
3.6
median lethal concentration
LC
50
concentration of the substance, of the test preparation initially present, or the concentration of the matrix
causing the death of 50 % of the snails submitted to testing
3.7
lowest observed effect concentration
LOEC
lowest tested concentration at which the test substance is observed to have a statistically significant effect
(p < 0,05) when compared with the control
NOTE All test concentrations above the LOEC have a harmful effect equal to or greater than those observed at the
LOEC. When these two conditions cannot be satisfied, a full explanation should be given for how the LOEC (and hence
the NOEC) has been selected.
3.8
no observed effect concentration
NOEC
test concentration immediately below the LOEC, which, when compared with the control, has no statistically
significant effect (p > 0,05) within a given exposure time
NOTE 1 The NOEC is the concentration just below the LOEC.
NOTE 2 For 3.5, 3.6, 3.7 and 3.8, results are given:
⎯ in dry mass of test substance or preparation per dry mass of the test substrate;
⎯ in mass percentage of the tested matrix in the test mixture (expressed in dry mass).
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ISO 15952:2006(E)
4 Principle
Juvenile land snails (usually Helix aspersa aspersa Müller) are exposed during a period of 28 days to a test
mixture containing the test substance, preparation or matrix at different concentrations. The test mixture is
freshly prepared and renewed every 7 days.
According to the objectives, the test mixture may be prepared with artificial soil (6.3.2) or with a suitable
natural soil (6.3.3).
The snails are fed during the test with uncontaminated food.
The effects on growth (fresh mass and shell diameter) and on survival are measured after 28 days of
exposure (optionally, effects could be measured every 7 days during 28 days).
The results obtained during testing are compared with those of a control to determine the NOEC or LOEC and
to allow the estimation of the concentration which reduces the growth of the snails by 50 % within 28 days with
respect to the fresh mass [EC (28 days)] and to the shell diameter [EC (28 days)] or other values
50,m 50,d
of EC .
x
If the concentrations selected result in lethal effects, the results obtained during testing are compared with
those of a control and used for estimating the concentration which causes the death of 50 % of the snails
[LC (28 days)].
50
For particular applications, various parameters (EC , NOEC, LOEC, LC ) can be assessed (optional) after
x 50
exposure periods lower than 28 days (7 days, 14 days or 21 days).
The test is conducted in two stages:
⎯ a preliminary test intended to indicate both the non-observed effect concentration, NOEC, and the
complete growth inhibition. The resulting dose-response relationship is important for the proper design of
the definitive test;
⎯ a definitive test specifying the concentrations which cause between 10 % and 90 % of growth inhibition. It
is not necessary to perform a final test where the preliminary test has not revealed any inhibitory effects
at the maximum concentration tested.
5 Test environment
The test shall be carried out at a temperature of (20 ± 2) °C under a day-night photoperiod of 18 h to 6 h. The
illumination intensity (artificial light of daylight type), without any natural light in the test containers shall be
50 lux to 100 lux.
6 Reagents
6.1 Water, of purity at least deionized
6.2 Biological material
Test organisms shall be juvenile snails. The recommended species is Helix aspersa aspersa Müller which
shall be 3 to 5 weeks old, having a mean fresh mass of (1 ± 0,3) g and a shell diameter of (15,5 ± 1) mm.
NOTE The use of some other genus and/or species of Helicidae is possible (see examples and conditions in
Annex G).
The snails shall be selected from synchronous breeding in order to form a population as homogeneous as
possible with respect to size, mass and age. The breeding techniques for snails are described in Annex B.
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ISO 15952:2006(E)
After a nursery period (3 to 5 weeks, see Annex B), the young snails shall be used after at least 1 week of
aestivation and no more than 5 months. The aestivation is carried out in round wooden boxes (approximately
12 cm in diameter by 4 cm in height), with the snails under dry conditions, at a temperature of 17 °C to 20 °C.
Two to three days before starting the test, snails shall be woken by spraying water (6.1) into the boxes used
for aestivation. The proportion of snails not woken shall be less than 10 %. As soon as they have resumed
activity (snails not stuck to the walls of the box and which are beginning to move about), the snails shall be
transferred to a box (7.1) that has been moistened with water (6.1). The bottom of this box either can be
covered with absorbent paper that has also been moistened, or can contain some test substrate (6.3)
moistened to 50 % to 60 % of its water-holding capacity. Between waking and the start of the test (2 to 3 days),
the snails shall be fed (6.4).
6.3 Test substrate
6.3.1 General
According to the objectives of the study, either an artificial soil (6.3.2) or a suitable natural soil (6.3.3) is used
as test substrate.
NOTE Artificial soil may be used as a control and dilution substrate to assess the effect of a substance or of a
preparation, or to compare different soils or waste, or to assess the effects of a contaminated soil.
Natural soil (field soil) may be used as a control and dilution substrate in order to assess, for example, the effect of the
incorporation of wastewater treatment plant sludge into the field soil or to test the effect of a contaminated soil (in this case
an uncontaminated soil comparable to the soil sample to be tested ought to be used).
6.3.2 Artificial soil
The artificial soil shall have the following composition (as defined by ISO 11268-1).
Table 1 — Composition of artificial soil
Composition Percentage expressed in dry mass
Sphagnum peat air-dried and finely ground (2 ± 1) mm without
10 %
any visible plant remains.
Kaolinite clay, preferably containing not less than 30 % kaolinite. 20 %
Air-dried industrial quartz sand (predominantly fine sand with Approximately 69 % (depending on the amount of
more than 50 % by mass of particle size 0,05 mm to 0,2 mm). CaCO needed).
3
Calcium carbonate (CaCO , pulverised, analytical grade) to bring Approximately 0,3 % to 1,0 %
3
the pH of the wetted artificial soil to 6,0 ± 0,5.
The artificial soil shall be prepared, at least two days prior to starting the test, by mixing the dry constituents
listed above thoroughly in a large-scale laboratory mixer. The amount of calcium carbonate required might
vary, depending on the properties of the individual batch (mainly the peat) and should be determined by
measuring subsamples immediately before the test.
The mixed artificial soil shall be stored at room temperature for at least two days to equilibrate acidity. To
determine pH and the maximum water-holding capacity, the dry artificial soil shall be pre moistened one or
two days before starting the test by adding deionized water to obtain half of the required final water content of
50 % to 60 % of the maximum water-holding capacity.
The pH value shall be measured according to ISO 10390. If the measured pH is not within the required range,
a sufficient amount of CaCO shall be added or a new batch of artificial soil shall be prepared. The maximum
3
water-holding capacity of the artificial soil shall be determined according to ISO 11274 or to Annex A of
ISO 11269-2.
4 © ISO 2006 – All rights reserved
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ISO 15952:2006(E)
6.3.3 Natural soil
Determine the following parameters on the selected natural soil which shall be sieved through a 4-mm square
mesh sieve to remove large fragments:
⎯ pH, according to ISO 10390;
⎯ water-holding capacity, according to ISO 11274 or Annex A of ISO 11269-2;
⎯ water content, according to ISO 11465;
⎯ content of organic matter, according to ISO 10694.
It is also recommended to determine the cation exchange capacity, according to ISO 11260.
6.4 Feed
The feed shall be provided in the form of flour at its natural moisture content (5 % to 10 %).
In order to obtain sufficient growth, it is recommended to carry out the tests with a flour-based feed comprising
1)
cereals, forage, mineral salts and vitamins which properly covers the needs of the snails . An example of
feed composition is given in Annex C.
7 Apparatus
Use ordinary laboratory apparatus and the following.
7.1 Test containers
2)
Disposable mouse boxes made of transparent polystyrene or any other container having a volume of
approximately 1,6 l [advised approximate dimensions: 24 cm (length) × 10,5 cm (width) × 8 cm (height)].
7.2 Containers for food
Petri dishes, approximately 5,5 cm in diameter and approximately 1 cm in height or any other containers of
equivalent dimensions.
7.3 Calliper rule, having a precision of 0,1 mm
7.4 Balances
One analytical balance having a precision of at least 1 mg. Two other balances, one having a precision of
0,1 g, another having a precision of 1 g.
1) The snail feed “Helixal” manufactured and distributed by Établissements Chays Frères, 6, rue du Collège, BP 21,
25800 Valdahon, France, or the INRA formulation snail feed manufactured and distributed by Établissements Berton
SARL, Lieu-dit Berton / Départementale 23, 85510 Le Boupère, France, or the snail feed manufactured and distributed by
UCAAB, rue de l'Église, BP 19, 02400 Château-Thierry Cedex, France, are examples of suitable products available on the
market. This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement
by ISO of these products.
2) The disposable transparent polystyrene mouse boxes referenced E1DBBAC001 distributed by Charles River
Laboratories France, BP 0109, 69592 L'Arbresle Cedex, France, are examples of suitable products available on the
market. This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement
by ISO of these products.
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ISO 15952:2006(E)
8 Storage and preparation of the samples
8.1 Soil to be tested
The soil samples received at the laboratory shall be stored in accordance with ISO 10381-6.
The soil sample submitted for testing shall be sieved through a 4-mm square mesh sieve to remove coarse
fragments.
For each soil, the same characteristics than for natural soil (6.3.3) that can be used as control or dilution
substrate, shall be determined.
8.2 Waste material
The samples of waste material received at the laboratory shall be stored according to EN 14735 [less than
2 months at (4 ± 3) °C].
For conducting the tests, the grading of the waste shall be less than 4 mm. Where this condition is not fulfilled,
the particle size of the waste material shall be reduced so that all of the particles pass through a 4-mm square
mesh sieve.
9 Procedure
9.1 Preparation of the test
9.1.1 Selection of the concentrations to be tested
9.1.1.1 Preliminary test
This test is performed within a wide range of concentrations.
⎯ Four concentrations of the substance or preparation and one control (e.g. 0 mg/kg; 50 mg/kg; 100 mg/kg;
500 mg/kg and 1 000 mg/kg of test substrate) with five snails per concentration and per container. The
preliminary test may be conducted without replication.
⎯ Four percentages of the matrix under examination and one control (e.g. 0 %; 12,5 %; 25 %; 50 %; 100 %)
with five snails per percentage and per container. The preliminary test may be conducted without
replication.
9.1.1.2 Final test
Select a range of at least five concentrations of the test substance, preparation or matrix according to a
geometric progression, so as to cover and extend beyond the range of those concentrations or percentages
which in the preliminary test did not have any effect on the growth or which inhibited it completely. The ratio of
this geometric progression shall preferably not exceed 2.
If the ratio exceeds 2, it is necessary to have available two concentrations for which the provoked effect is
between 10 % and 90 %.
For the definitive test, three replicates are carried out per concentration.
6 © ISO 2006 – All rights reserved
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ISO 15952:2006(E)
9.1.2 Preparation of the test mixtures
9.1.2.1 General
The test mixture (3.3) is made up of test substrate and of test substance, preparation or matrix. Prepare
enough test mixture in order to cover the bottom of the test container with a layer of the test mixture of at least
1 cm.
If the test substance is used in the raw state (without dehydration prior to use), take into account its moisture
rate so as to express the concentrations in milligrams of substance or of preparation per kilogram of dry test
substrate and, for the matrixes, in mass percentage of matrix (expressed in dry mass) in the test mixture
(expressed in dry mass).
9.1.2.2 Water-soluble or emulsifiable substances and preparations
For each examined concentration, dissolve the appropriate quantity of test substance or preparation required
for obtaining the desired concentration in the same water (6.1) used for moistening the test substrate. Spray
the solution over the dry or raw test substrate (6.3), then mix carefully.
The final test mixture shall have a moisture content corresponding to 50 % to 60 % of its total water-holding
capacity (determined according to ISO 11274 or according to Annex A of ISO 11269-2).
Measure the pH for each test concentration according to ISO 10390.
Proceed likewise for the control treatment apart from the addition of test substance or preparation.
Continue the test as specified in 9.2.
9.1.2.3 Water-insoluble substances and preparations, but soluble in organic solvents
Dissolve the quantity of test substance or preparation required for obtaining the desired concentration into a
volatile solvent (e.g. methanol or acetone). Spray the obtained solution over the dry or
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 15952
Première édition
2006-02-15
Qualité du sol — Effets des polluants
vis-à-vis des escargots juvéniles
(Helicidae) — Détermination des effets
sur la croissance par contamination du
sol
Soil quality — Effects of pollutants on juvenile land snails (Helicidae) —
Determination of the effects on growth by soil contamination
Numéro de référence
ISO 15952:2006(F)
©
ISO 2006
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ISO 15952:2006(F)
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ISO 15952:2006(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions. 2
4 Principe. 3
5 Environnement de l'essai. 3
6 Réactifs . 4
7 Appareillage . 6
8 Stockage et préparation des échantillons. 6
8.1 Sol à étudier . 6
8.2 Déchets . 6
9 Mode opératoire . 7
9.1 Préparation de l'essai. 7
9.2 Répartition du mélange d'essai. 8
9.3 Introduction de la nourriture . 9
9.4 Introduction du réactif biologique . 9
9.5 Manipulations pendant les essais. 9
10 Substance de référence . 10
11 Calculs et expression des résultats. 11
11.1 Calculs . 11
11.2 Expression des résultats . 12
12 Validité de l'essai pour Helix aspersa aspersa . 14
13 Rapport d'essai . 14
Annexe A (normative) Méthode statique . 16
Annexe B (informative) Technique d'élevage des escargots . 17
Annexe C (informative) Exemple de composition de la nourriture pour escargots. 22
Annexe D (informative) Exemple de tableau de données . 23
Annexe E (informative) Exemple de résultats avec Helix aspersa aspersa . 24
Annexe F (informative) Détermination des effets sur la croissance par contamination
de la nourriture. 27
Annexe G (informative) Réalisation de l'essai avec d'autres espèces d'escargots . 31
Bibliographie . 32
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Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 15952 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4, Méthodes
biologiques.
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Introduction
En raison du nombre limité de données disponibles sur la toxicité des contaminants sur les organismes vivant
dans le sol, les problèmes d'évaluation de l'écotoxicité des sols et des déchets sont très préoccupants tant au
niveau national qu'au niveau international. Les essais actuellement disponibles utilisent les organismes de la
faune du sol limités aux embranchements annélides (vers de terre et Enchytraeidae) et des arthropodes
(insectes: Collemboles et Coléoptères). Parmi ces derniers, deux normes évaluent la toxicité aiguë [vers de
[5]
terre (ISO 11268-1) et larves de coléoptères ] et trois autres normes évaluent les effets sublétaux des
[2] [1] [3]
contaminants du sol sur la reproduction (vers de terre , Collemboles ), Enchytraeidae ). Dans les cycles
biologiques des organismes, il semble que la croissance est, tout comme la reproduction, un paramètre
écophysiologique fondamental à prendre en considération pour la viabilité des espèces et des
[33]
écosystèmes .
[15]
Les escargots sont des indicateurs écologiques pertinents pour l'évaluation de la qualité des sols , étant
donné qu'ils sont caractéristiques de la couche superficielle du sol (saprophages et phytophages) et qu'une
grande partie de leur cycle biologique a lieu dans le sol (ponte, éclosion, premiers stades du développement,
[6], [17], [26]
hibernation, etc.) . Pendant les autres phases de leur cycle, ils ingèrent du sol et sont en contact
avec celui-ci par l'intermédiaire de leur sole pédieuse humide (pied), recouverte de mucus, et participent aux
échanges permanents avec le sol (eau, sels minéraux, excréments, puis finalement la coquille et la matière
[6], [17], [28]
organique quand ils meurent) . De plus, ils représentent un lien important entre les plantes, la faune
et les micro-organismes du sol. Ils répondent entièrement aux critères d'un bon indicateur biologique: faciles à
[8, 10 à 14, 16, 17, 19,
collecter et à identifier, ils présentent une large répartition, ils accumulent les contaminants
21, 26, 27, 35 à 43] [6], [9], [29]
, leurs caractéristiques écologiques et physiologiques sont bien connues et ils sont,
[19], [23], [29]
à présent, faciles à élever dans des conditions contrôlées . Leur sensibilité aux contaminants
[10 à 15, 18 à 27, 32, 33, 36 à 42]
courants dans leur environnement a été démontrée .
Le présent document décrit une méthode pour déterminer les effets sur la survie et la croissance des
escargots juvéniles de substances, de préparations, de sols ou de déchets ajoutés à un sol artificiel ou naturel.
La méthode décrite est donc applicable aux essais de sols contaminés ou à la comparaison de différents sols
non contaminés. L'espèce recommandée est Helix aspersa aspersa Müller (aussi communément appelée:
escargot petit-gris, escargot de jardin, Petit-Gris). Parmi les escargots terrestres (mollusques gastéropodes
pulmonés stylommatophores de la famille Helicidae), Helix aspersa aspersa Müller est le plus répandu. Cette
espèce paléarctique peut s'acclimater à des régions présentant des climats de types différents: méditerranéen,
océanique tempéré, continental tempéré, voire tropical. Helix aspersa aspersa Müller est d'origine
européenne et a été introduit dans le monde entier. On en trouve à présent sur tous les continents hormis
[9]
l'Antarctique .
Dans leur environnement naturel, les escargots assimilent les contaminants par contact (avec des substrats
variés tels que le sol, les lixiviats du sol et la litière végétale), par ingestion (de plantes et de sol), de même
[6], [26]
que par les voies respiratoires . Ainsi, pour des objectifs particuliers (évaluation de la toxicité d'un
pesticide, par exemple), une autre méthode d'exposition basée sur l'exposition par ingestion d'aliments est
disponible en option (Annexe F et Référence [4]).
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NORME INTERNATIONALE ISO 15952:2006(F)
Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des escargots
juvéniles (Helicidae) — Détermination des effets sur la
croissance par contamination du sol
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale s'applique à une méthode semi-statique pour la détermination des effets de
contaminants sur la croissance et la survie d'escargots juvéniles, généralement Helix aspersa aspersa Müller.
Les animaux sont exposés par les voies cutanée et digestive à un substrat d'essai (sol artificiel ou naturel
selon l'objectif de l'étude) auquel sont ajoutées des quantités définies
⎯ de substances ou de préparations;
⎯ de sols (contaminés ou de qualité inconnue) ou de déchets.
Il est admis de mettre en œuvre une méthode statique en sus de la méthode semi-statique (facultatif). Cette
méthode est décrite dans l'Annexe A.
Cette méthode ne s'applique pas aux substances volatiles, c'est-à-dire aux substances dont la constante de
Henry, H, ou le coefficient de partage air/eau est supérieur à 1, ou pour lesquelles la pression de vapeur est
supérieure à 0,013 3 Pa à 25 °C.
Cet essai prend en considération le changement éventuel de la substance d'essai, de la préparation, du sol
ou des déchets, étant donné que le mélange d'essai est préparé et renouvelé tous les 7 jours pendant la
période d'essai de 28 jours.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 10381-6, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 6: Lignes directrices pour la collecte, la manipulation
et la conservation de sols destinés à une étude en laboratoire des processus microbiens aérobies
ISO 10390, Qualité du sol — Détermination du pH
ISO 10694, Qualité du sol — Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche
(analyse élémentaire)
ISO 11268-1, Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre (Eisenia fetida) — Partie 1:
Détermination de la toxicité aiguë en utilisant des substrats de sol artificiel
ISO 11269-2, Qualité du sol — Détermination des effets des polluants sur la flore du sol — Partie 2: Effets
des substances chimiques sur l'émergence et la croissance des végétaux supérieurs
ISO 11274, Qualité du sol — Détermination de la caractéristique de la rétention en eau — Méthodes de
laboratoire
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ISO 11465, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau — Méthode
gravimétrique
EN 14735, Caractérisation des déchets — Préparation des échantillons de déchets en vue d'essais
écotoxicologiques
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
substrat d'essai
sol artificiel ou sol naturel utilisé comme témoin et comme substrat de dilution
3.2
matrice
sol ou déchet soumis à l'essai
3.3
mélange d'essai
mélange de la substance d'essai, de la préparation ou de la matrice avec le substrat d'essai
3.4
croissance
augmentation de la biomasse, c'est-à-dire de la masse fraîche totale (corps et coquille) des organismes et
augmentation du diamètre maximal de la coquille, entre le début et la fin de l'essai
NOTE Elle s'exprime sous forme d'un coefficient de croissance.
3.5
concentration efficace
CE
x
concentration à laquelle est décelé un effet spécifique; x est le pourcentage (10, 25, 50) de cet effet, par
exemple inhibition de la croissance
NOTE Par exemple, CE est la concentration estimée conduire à une réduction de la croissance, à la fin de l'essai,
50
de 50 % par rapport au témoin.
3.6
CL
50
concentration létale médiane, c'est-à-dire la concentration de la substance d'essai ou de la préparation
présente à l'origine ou la concentration de la matrice entraînant la mort de 50 % des escargots soumis à
l'essai
3.7
concentration minimale avec effet observé
CMEO
concentration la plus basse soumise à l'essai, à laquelle il est observé que la substance d'essai a un effet
statistiquement significatif (p < 0,05) par rapport au témoin
NOTE Toutes les concentrations d'essai supérieures à la CMEO ont un effet nocif supérieur ou égal à ceux observés
à la CMEO. Lorsqu'il n'est pas possible de satisfaire ces deux conditions, il convient d'expliquer dans le détail comment a
été sélectionnée la CMEO (et par conséquent la CSEO).
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3.8
concentration sans effet observable
CSEO
concentration de l'essai immédiatement inférieure à la CMEO, qui, lorsqu'elle est comparée à celle du témoin,
ne produit aucun effet statistiquement significatif (p > 0,05) pendant un temps d'exposition donné
NOTE 1 La CSEO est la concentration immédiatement inférieure à la CMEO.
NOTE 2 Dans le cas de 3.5,de 3.6, de 3.7 et de 3.8, les résultats sont exprimés:
⎯ en masse sèche de la substance d'essai ou de la préparation par masse sèche du substrat d'essai;
⎯ en pourcentage de la masse de la matrice étudiée dans le mélange d'essai (exprimé en masse sèche).
4 Principe
Des escargots terrestres juvéniles (généralement Helix aspersa aspersa Müller) sont exposés pendant une
période de 28 jours à un mélange d'essai contenant la substance d'essai, la préparation ou la matrice à
différentes concentrations. Le mélange d'essai est fraîchement préparé et renouvelé tous les 7 jours.
En fonction des objectifs, le mélange d'essai peut être préparé avec du sol artificiel (6.3.2) ou un sol naturel
adapté (6.3.3).
Pendant l'essai, les escargots sont nourris avec un aliment non contaminé.
Les effets sur la croissance (masse fraîche et diamètre de la coquille) et sur la survie sont mesurés après
28 jours d'exposition (en option, les effets peuvent être mesurés tous les 7 jours pendant 28 jours).
Les résultats obtenus au cours de l'essai sont comparés avec ceux d'un témoin afin de déterminer la CSEO
ou la CMEO et ils permettent d'estimer la concentration qui réduit la croissance des escargots de 50 % en
l'espace de 28 jours par rapport à la masse fraîche [CE (28 jours)] et au diamètre de la coquille
50,m
[CE (28 jours)] ou à d'autres valeurs de CE .
50,d x
Si les concentrations sélectionnées provoquent des effets létaux, les résultats obtenus au cours de l'essai
sont comparés à ceux d'un témoin et sont utilisés pour estimer la concentration qui entraîne la mort de 50 %
des escargots [CL (28 jours)].
50
Dans certaines applications, il est possible d'évaluer (facultatif) certains paramètres (CE , CSEO, CMEO,
x
CL ) après des périodes d'exposition inférieures à 28 jours (7 jours, 14 jours ou 21 jours).
50
L'essai comprend deux étapes:
⎯ un essai préliminaire dont le but est de déterminer aussi bien la concentration sans effet observable
(CSEO) et l'inhibition totale de la croissance. La relation dose/effet obtenue est importante pour la
conception correcte de l'essai définitif;
⎯ un essai définitif spécifiant les concentrations entraînant une inhibition de 10 % à 90 % de la croissance.
Il n'est pas nécessaire d'effectuer un essai définitif lorsque l'essai préliminaire n'a pas révélé d'effets
inhibiteurs à la concentration maximale étudiée.
5 Environnement de l'essai
L'essai doit être réalisé à une température de (20 ± 2) °C avec une photopériode jour-nuit de 18 h à 6 h.
L'intensité lumineuse (lumière artificielle de type lumière du jour), sans lumière naturelle dans les récipients
d'essai, doit être de 50 lux à 100 lux.
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6 Réactifs
6.1 Eau, de pureté au minimum déionisée
6.2 Matériel biologique
Les organismes d'essai doivent être des escargots juvéniles. L'espèce recommandée est Helix aspersa
aspersa Müller, dont les individus doivent être âgés de 3 à 5 semaines et présenter une masse fraîche
moyenne de (1 ± 0,3) g et un diamètre de coquille de (15,5 ± 1) mm.
NOTE Il est possible d'utiliser un autre genre et/ou une autre espèce d'Helicidae (voir les exemples et les conditions
dans l'Annexe G).
Les escargots doivent être sélectionnés à partir d'un élevage synchrone afin d'obtenir une population la plus
homogène possible au regard de la taille, de la masse et de l'âge. Les techniques d'élevage des escargots
sont décrites dans l'Annexe B. Après une période de nursery (de 3 à 5 semaines, voir l'Annexe B), les
escargots juvéniles doivent être utilisés après une période d'estivation d'au moins 1 semaine et de 5 mois au
plus. L'estivation a lieu dans des boîtes rondes en bois (diamètre de 12 cm et hauteur de 4 cm environ), les
escargots étant soumis à des conditions sèches à une température de 17 °C à 20 °C.
De deux à trois jours avant de commencer l'essai, les escargots doivent être réveillés par une pulvérisation
d'eau (6.1) dans les boîtes ayant servi à l'estivation. La proportion d'escargots non réveillés doit être inférieure
à 10 %. Dès que les escargots reprennent leur activité (ils se décollent des parois de la boîte et commencent
à se déplacer), ils doivent être transférés vers une boîte (7.1) ayant été préalablement humidifiée avec de
l'eau (6.1). Le fond de cette boîte peut être soit recouvert de papier absorbant ayant aussi été humidifié, soit
contenir du substrat d'essai (6.3) humidifié de 50 % à 60 % de sa capacité de rétention d'eau. Il est
nécessaire de nourrir les escargots (6.4) entre le moment du réveil et le début de l'essai (de 2 à 3 jours).
6.3 Substrat d'essai
6.3.1 Généralités
En fonction des objectifs de l'étude, le substrat d'essai peut être préparé avec du sol artificiel (6.3.2) ou un sol
naturel adapté (6.3.3).
NOTE Il est admis d'utiliser un sol artificiel en tant que témoin et substrat de dilution pour évaluer l'effet d'une
substance ou d'une préparation, pour comparer différents sols ou déchets ou pour évaluer les effets d'un sol contaminé.
Il est admis d'utiliser un sol naturel (sol d'un champ) en tant que témoin et substrat de dilution pour évaluer, par exemple,
l'effet de l'incorporation de boues de stations d'épuration d'eaux usées dans le sol d'un champ ou pour étudier l'effet d'un
sol contaminé (dans ce cas, il est recommandé d'utiliser un sol non contaminé, comparable à l'échantillon de sol à étudier).
6.3.2 Sol artificiel
Le sol artificiel doit présenter la composition suivante (telle que définie par l'ISO 11268-1).
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Tableau 1 — Composition du sol artificiel
Pourcentage exprimé en masse
Composition
sèche
Tourbe de sphaigne séchée à l'air et finement moulue (2 ± 1) mm, dépourvue de
10 %
résidus végétaux visibles.
Argile à kaolinite, contenant de préférence au moins 30 % de kaolinite. 20 %
Sable quartzeux industriel séché à l'air (prédominance de sable fin avec plus de
Environ 69 % (en fonction de la
50 % de la masse présentant une granulométrie comprise entre 0,05 mm et
quantité nécessaire de CaCO ).
3
0,2 mm).
Carbonate de calcium (CaCO , pulvérisé, de qualité analytique) pour ramener le
3
Environ 0,3 % à 1,0 %.
pH du sol artificiel humide à 6,0 ± 0,5.
Le sol artificiel doit être préparé au moins deux jours avant le début de l'essai, en mélangeant parfaitement les
constituants secs, indiqués ci-dessus, dans un mélangeur de laboratoire de grande dimension. La quantité de
carbonate de calcium requise peut varier en fonction des propriétés de chaque lot (en particulier de la tourbe)
et il convient de la déterminer en mesurant des sous-échantillons immédiatement avant l'essai.
Il convient de stocker le sol artificiel mélangé à température ambiante pendant deux jours au moins, afin d'en
équilibrer l'acidité. Pour déterminer le pH et la capacité de rétention d'eau maximale, le sol artificiel sec doit
être préhumidifié un ou deux jours avant le début de l'essai, en ajoutant de l'eau déionisée, afin d'obtenir la
moitié de la teneur en eau finale requise de 50 % à 60 % de la capacité de rétention d'eau maximale.
La valeur du pH doit être mesurée selon l'ISO 10390. Si la valeur du pH ne se trouve pas dans la plage
requise, il est nécessaire d'ajouter une quantité suffisante de CaCO ou de préparer un nouveau lot de sol
3
artificiel. La capacité de rétention d'eau maximale du sol artificiel doit être déterminée selon l'ISO 11274 ou
l'Annexe A de l'ISO 11269-2.
6.3.3 Sol naturel
2
Déterminer les paramètres suivants pour le sol naturel sélectionné qui doit être passé au tamis de 4 mm afin
d'en extraire les fragments de grosse taille:
⎯ pH, selon l'ISO 10390;
⎯ capacité de rétention d'eau selon l'ISO 11274 ou l'Annexe A de l'ISO 11269-2;
⎯ teneur en eau selon l'ISO 11465;
⎯ teneur en matière organique selon l'ISO 10694.
Il est aussi recommandé de déterminer la capacité d'échange cationique selon l'ISO 11260.
6.4 Nourriture
La nourriture doit être fournie sous forme de farine avec son taux d'humidité naturel (de 5 % à 10 %).
Afin que la croissance soit suffisante, il est recommandé d'effectuer les essais avec un aliment sous forme de
farine comprenant des céréales, du fourrage, des sels minéraux et des vitamines couvrant convenablement
1)
les besoins des escargots . Un exemple de composition de la nourriture est donné dans l'Annexe C.
1) La nourriture pour escargots «Helixal» fabriquée et distribuée par les Établissements Chays Frères, 6, rue du Collège,
BP 21, 25800 Valdahon, France, ou la préparation de nourriture pour escargots de l’INRA fabriquée et distribuée par les
Établissements Berton SARL, Lieu-dit Berton / Départementale 23, 85510 Le Boupère, France, ou la nourriture pour
escargots fabriquée et distribuée par UCAAB, rue de l'Église, BP 19, 02400 Château-Thierry Cedex, France, sont des
exemples de produits adaptés disponibles sur le marché. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs de la
présente Norme internationale et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif des produits
ainsi désignés.
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7 Appareillage
Le matériel de laboratoire habituel et ce qui suit.
7.1 Récipients d'essai
2)
Boîtes à souris jetables en polystyrène transparent ou tout autre récipient dont le volume est égal à 1,6 l
environ [dimensions approximatives recommandées: 24 cm (longueur) × 10,5 cm (largeur) × 8 cm (hauteur)].
7.2 Récipients pour la nourriture
Boîtes de Petri de 5,5 cm de diamètre environ et de 1 cm de hauteur environ ou tout autre récipient de
dimensions équivalentes.
7.3 Pied à coulisse, d'une précision de 0,1 mm
7.4 Balances
Une balance analytique d'une précision de 1 mg au moins. Deux autres balances, l'une avec une précision de
0,1 g, l'autre avec une précision de 1 g.
8 Stockage et préparation des échantillons
8.1 Sol à étudier
Les échantillons de sol reçus au laboratoire doivent être stockés selon l'ISO 10381-6.
2
L'échantillon de sol soumis à l'essai doit être passé au tamis de 4 mm afin d'en extraire les fragments de
grande taille.
Il est nécessaire de déterminer, pour chaque sol, les mêmes caractéristiques que pour le sol naturel (6.3.3)
qui peut être utilisé comme témoin ou comme substrat de dilution.
8.2 Déchets
Les échantillons de déchets reçus au laboratoire doivent être stockés selon l'EN 14735 [moins de 2 mois à
(4 ± 3) °C].
Pour les essais, la granulométrie des déchets doit être inférieure à 4 mm. Si tel n'est pas le cas, il est
nécessaire de réduire la granulométrie des déchets de telle manière que toutes les particules traversent un
2
tamis de 4 mm .
2) Les boîtes à souris jetables en polystyrène transparent portant la référence E1DBBAC001 distribuées par Charles
River Laboratories France, BP 0109, 69592 L'Arbresle Cedex, France, sont des exemples de produits adaptés disponibles
sur le marché. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie
nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif des produits ainsi désignés.
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9 Mode opératoire
9.1 Préparation de l'essai
9.1.1 Sélection des concentrations à étudier
9.1.1.1 Essai préliminaire
Cet essai est réalisé avec une vaste plage de concentrations.
⎯ Quatre concentrations de la substance ou de la préparation et un témoin (par exemple 0 mg/kg;
50 mg/kg; 100 mg/kg; 500 mg/kg et 1 000 mg/kg de substrat d'essai) avec cinq escargots par
concentration et par récipient. L'essai préliminaire peut être effectué sans répétition.
⎯ Quatr
...
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