SIST ISO 14189:2014
Water quality - Enumeration of Clostridium perfringens - Method using membrane filtration
Water quality - Enumeration of Clostridium perfringens - Method using membrane filtration
This International Standard specifies a method for the enumeration of vegetative cells and spores of Clostridium perfringens by the membrane filtration method in samples of water intended for human consumption. However, the method can be applied to all types of water samples provided they do not contain particulate or colloidal matter that interferes with filtration.
Qualité de l'eau - Dénombrement de Clostridium perfringens - Méthode de filtration sur membrane
L'ISO 14189:2013 sp�cifie une m�thode pour le d�nombrement des cellules v�g�tatives et des spores de Clostridium perfringens par filtration sur membrane dans des �chantillons d'eau destin�e � la consommation humaine. Cette m�thode peut toutefois s'appliquer � tous les types d'�chantillons d'eau, sous r�serve qu'ils ne contiennent pas de mati�re particulaire ou collo�dale interf�rant avec la filtration.
Kakovost vode - Ugotavljanje števila Clostridium perfringens - Metoda membranske filtracije
General Information
Buy Standard
Standards Content (Sample)
МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 14189
Первое издание
2013-11-01
Качество воды. Подсчет бактерий
Clostridium perfringens. Метод
фильтрации через полупроницаемую
мембрану
Water quality — Enumeration of Clostridium perfringens – Method using
membrane filtration.
Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава
Ссылочный номер
ISO 14189:2013(R)
©
ISO 2013
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 14189:2013(R)
Отказ от ответственности при работе в PDF
Настоящий файл PDF может содержать интегрированные шрифты. В соответствии с условиями лицензирования, принятыми
фирмой Adobe, этот файл можно распечатать или смотреть на экране, но его нельзя изменить, пока не будет получена
лицензия на установку интегрированных шрифтов в компьютере, на котором ведется редактирование. В случае загрузки
настоящего файла заинтересованные стороны принимают на себя ответственность за соблюдение лицензионных условий
фирмы Adobe. Центральный секретариат ISO не несет никакой ответственности в этом отношении.
Adobe - торговый знак Adobe Systems Incorporated.
Подробности, относящиеся к программным продуктам, использованным для создания настоящего файла PDF, можно найти в
рубрике General Info файла; параметры создания PDF оптимизированы для печати. Были приняты во внимание все меры
предосторожности с тем, чтобы обеспечить пригодность настоящего файла для использования комитетами – членами ISO. В
редких случаях возникновения проблемы, связанной со сказанным выше, просим информировать Центральный секретариат
по адресу, приведенному ниже.
ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ
© ISO 2013
Все права сохраняются. Если не задано иначе, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия офиса ISO по адресу, указанному ниже, или членов ISO в стране регистрации
пребывания.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO 2013 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 14189:2013(R)
Содержание Страница
Предисловие .iv
Введение .v
1 Область применения .1
2 Нормативные ссылки .1
3 Термины и определения .1
4 Сущность метода.2
5 Аппаратура и стеклянная посуда .2
6 Питательные среды и реактивы .3
6.1 Основные материалы.3
6.2 Питательные среды.3
7 Отбор проб.3
8 Проведение анализа .3
8.1 Транспортирование и хранение пробы.3
8.2 Предварительная тепловая обработка для отбора спор.4
8.3 Разбавление пробы .4
8.4 Фильтрация.4
8.5 Инкубация и исследование .4
8.6 Подтверждение наличия колоний Clostridium perfringens .5
9 Обработка результатов.5
10 Протокол анализа.5
11 Подтверждение качества .6
Приложение А (нормативное) Состав и приготовление питательных сред и реактивов .7
Приложение В (информативное) Параметры метода .9
Библиография.12
© ISO 2013 – Все права сохраняются iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 14189:2013(R)
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) всемирная федерация национальных органов
по стандартизации (комитеты-члены ISO). Работа по подготовке международных стандартов обычно
ведется через технические комитеты ISO. Каждый комитет-член ISO, проявляющий интерес к
тематике, по которой учрежден технический комитет, имеет право быть представленным в этом
комитете. Международные организации, государственные и негосударственные, имеющие связи с ISO,
также принимают участие в работе. ISO тесно сотрудничает с Международной электротехнической
комиссией (IEC) по всем вопросам стандартизации в области электротехники.
Процедуры, используемые для разработки данного документа, и процедуры, предусмотренные для его
дальнейшего ведения, описаны в Директивах ISO/IEC Directives, Part 1. В частности, следует отметить
различные критерии утверждения, требуемые для различных типов документов ISO. Проект данного
документа был разработан в соответствии с редакционными правилами Директив ISO/IEC Directives,
Part 2. www.iso.org/directives .
Необходимо обратить внимание на возможность того, что ряд элементов данного документа могут
быть предметом патентных прав. Международная организация ISO не должна нести ответственность
за идентификацию таких прав, частично или полностью. Сведения о патентных правах,
идентифицированных при разработке документа, будут указаны во Введении и/или в перечне
полученных ISO объявлениях о патентном праве. www.iso.org/patents .
Любое торговое название, использованное в данном документе, является информацией,
предоставляемой для удобства пользователей, а не свидетельством в пользу того или иного товара
или той или иной компании.
Для пояснения значений конкретных терминов и выражений ISO, относящихся к оценке соответствия, а
также информация о соблюдении Международной организацией ISO принципов ВТО по техническим
барьерам в торговле (TБT), см. следующий унифицированный локатор ресурса (URL): Foreword -
Supplementary information
Технический комитет, несущий ответственность за данный документ, ISO/TC 147, Качество воды,
Подкомитет SC 4, Микробиологические методы.
iv © ISO 2013– Все права сохраняются
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 14189:2013(R)
Введение
Бактерии Clostridium perfringens широко известны как полезный индикатор фекального загрязнения. В
кишечнике животных и человека эти грамм -положительные бактерии образуют споры, стойкие к
нагреванию по сравнению с вегетативными (бесспоровыми) клетками (бактерий). Бактерии
C. perfringens в кишечнике существуют одновременно как споры и как вегетативные клетки; споры
также обнаружены в пробах окружающей среды (экологических пробах). Споры C. Perfringens живут в
воде месяцами, гораздо дольше, чем вегетативные бактерии – фекальный индикатор, и, поэтому, их
присутствие может свидетельствовать о давнем или средней давности фекальном загрязнении.
Мониторинг C. Perfringens показал свою полезность при оценивании качества водных ресурсов и
проверке стадий очистки воды с целью установления эффективности водоочистных сооружений.
Споры невсегда можно инактивировать обычными мерами дезинфекции (например, хлорированием).
© ISO 2013 – Все права сохраняются v
---------------------- Page: 5 ----------------------
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ISO 14189:2013(R)
Качество воды. Подсчет бактерий Clostridium perfringens.
Метод фильтрации через полупроницаемую мембрану
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Пользователи данного международного стандарта должны быть знакомы
с обычной лабораторной практикой. Настоящий стандарт не преследует цели рассмотреть все
вопросы, связанные с безопасностью, если они возникают при его использовании.
Пользователь сам несет ответственность за разработку соответствующих правил техники
безопасности и охраны здоровья, а также за обеспечение соответствия условиям
национальных регламентов.
ВНИМАНИЕ! – Самое главное, чтобы анализ в соответствии с настоящим международным
стандартом выполнялся обученным персоналом.
1 Область применения
Настоящий международный стандарт устанавливает метод подсчета вегетативных клеток и спор
бактерий Clostridium perfringens с помощью фильтрации через полупроницаемую мембрану в пробах
воды, предназначенной для потребления человека. В то же время, этот метод можно применять ко
всем типам проб воды, при условии, что они не содержат твердые частицы или коллоидный материал,
который мешает фильтрации.
2 Нормативные ссылки
Нижеследующие нормативные документы являются обязательными для применения настоящего
документа. В отношении датированных ссылок действительными являются только указанные издания.
В отношении недатированных ссылок применимо последнее издание ссылаемого документа, включая
любые изменения к нему.
ISO 8199, Качество воды. Общее руководство по подсчету микроорганизмов, выращенных методом
посева на питательной среде
ISO/TS 11133-1, Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Правила
приготовления и производства питательных сред. Часть 1.Общие правила по обеспечению
качества приготовления питательных сред в лаборатории
ISO 19458, Качество воды. Отбор проб для микробиологического анализа
ISO/IEC Guide 2:2004, Стандартизация и родственная деятельность. Общий словарь
3 Термины и определения
В данном документе применяются термины и определения, данные в ISO/IEC Guide 2, а также
следующие:
3.1
презумптивные клостридии перфингес
presumptive Clostridium perfringens
бактерии, колонии которых, выращенные на триптоза-сульфитном агаре с циклосерином (TSC –агар)
имеют все оттенки от серого до желто-коричневого и черного цвета, даже если цвет слабовыраженный,
после анаэробной инкубации при температуре (44 ± 1) °C в течение (21 ± 3) ч
© ISO 2013 – Все права сохраняются 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 14189:2013(R)
ПРИМЕЧАНИЕ 1 к статье В отличие от колоний, выращенных непосредственно на агаровой среде, колонии на
мембране не всегда демонстрируют явное почернение, поэтому учитывают и бледные колонии.
3.2
подтвержденные клостридии перфингес
confirmed Clostridium perfringens
бактерии, характеристические колонии которых выращены на триптоза-сульфитном агаре с
циклосерином (TSC –агар) и обладают кислотно-фосфатазным ферментом
4 Сущность метода
Измеренный объем пробы или ее разведения фильтруют через мембрану с размером пор 0,45 мкм,
достаточного для удерживания пор клостридии. Мембрану инкубируют на избирательной/дифференциальной
агаровой (на триптоза-сульфитном агаре с циклосерином) среде в анаэробных условиях при температуре
(44 ± 1) °C в течение (21 ± 3) ч. Колонии C. perfringens обычно от серого до желто-коричневого и черного цвета,
как результат восстановления сульфита до сульфида, который реагирует с солью трехвалентного железа в
питательной среде. Характеристические колонии подсчитывают и проводят подтверждающие тесты.
Результат вычисляют как число колоний на объем пробы. Если требуется только подсчет спор, пробу
сначала подвергают предварительной обработке при температуре (60 ± 2) °C, чтобы инактивировать
вегетативные бактерии.
ПРИМЕЧАНИЕ 1 Питательная среда содержит циклосерин как селективное вещество для подавления роста
бактерий рода Bacillus.
ПРИМЕЧАНИЕ 2 Инкубация при температуре 44 °C увеличивает избирательность теста для C. perfringens.
5 Аппаратура и стеклянная посуда
За исключением стеклянной или пластиковой посуды однократного применения, поставляемых в
стерильной форме, посуду стерилизуют в соответствии с требованиями ISO 8199.
Обычное микробиологическое оборудование и в частности:
5.1 Установка для фильтрации через полупроницаемую мембрану, в соответствии с ISO 8199.
5.2 Стерильные фильтровальные воронки
Используют воронки, которые либо поставляются в стерильной форме, либо стерилизуют их в
соответствии с требованиями ISO 8199. Альтернативно допускается использовать металлические
воронки, которые стерилизуют в пламени перед применением.
ПРИМЕЧАНИЕ Для данного метода недостаточно стерилизовать воронки кипячением.
5.3 Стерильные мембранные фильтры, номинальный размер пор 0,45 мкм.
Качество мембранных фильтров может быть разным в зависимости от марки или даже от партии.
Поэтому рекомендуется регулярно проверять качество.
5.4 Инкубаторы, обеспечивающие поддержание при температурах (36 ± 2) °C и (44 ± 1) °C.
5.5 Водяная баня (необязательно), обеспечивающая поддержание при температуре (60 ± 2) °C и
оснащенная средством для циркуляции воды.
5.6 Автоклав, обеспечивающий поддержание при температуре (121 ± 3) °C.
5.7 Стерильный пинцет
2 © ISO 2013 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 14189:2013(R)
5.8 Анаэростат, или аналогичное оборудование.
5.9 Анаэробная газогенераторная система, для создания атмосферы, состоящей приблизительно
на 90 % из водорода и на 10 % из двуокиси углерода.
6 Питательные среды и реактивы
6.1 Основные материалы
Для единства результатов при приготовлении сред используют компоненты одинакового качества и
химические реактивы признанной аналитической чистоты. Для приготовления сред используют воду,
дистиллированную в стеклянном сосуде, или деионизированную воду равноценной чистоты, как
[1]
установлено для воды класса 3 по ISO 3696 .
Альтернативно используют имеющуюся в продаже обезвоженную полную среду и реактивы,
приготовленные и используемые по инструкциям изготовителя.
Можно пользоваться химическими реактивами других классов, при условии получения таких же
результатов.
6.2 Питательные среды
См. Приложение A.
6.2.1 Триптоза-сульфитный агар с циклосерином (TSC -агар), Ссылки [6][11][12]
См. A.1.
6.2.2 Основа - кровяной агар или колумбийский агар или другой подходящий богатый
питательными веществами агар
См. A.2.
6.2.3 Реактив кислотная фосфатаза
См. A.3.
7 Отбор проб
Осуществляют отбор проб в соответствии с ISO 19458.
8 Проведение анализа
8.1 Транспортирование и хранение пробы
Исследование начинают, как только пробу отобрали, предпочтительно в тот же самый рабочий день.
Пробы следует охлаждать в процессе транспортирования в идеале до температуры (5 ± 3) °C.
Рекомендуется максимальная продолжительность хранения проб, включая транспортирование, для
вегетативных бактерий 12 ч и для спор 24 ч. Продолжительность хранения проб, включая
транспортирование, не должно превышать 18 ч для вегетативных бактерий и 72 ч для спор.
© ISO 2013 – Все права сохраняются 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 14189:2013(R)
8.2 Предварительная тепловая обработка для отбора спор
Если требуется подсчитать только споры, тщательно перемешивают пробу и затем нагревают ее до
(60 ± 2) °C на водяной бане в течение (15 ± 1) мин. Нагретый объем должен быть больше, чем объем,
подлежащий анализу. За температурой необходимо следить, поместить соответствующий термометр в
контрольную склянку такого же размера, как и склянка с пробой, и содержащую такой же объем воды
при той же самой начальной температуре, как подлежащая обработке проба. Время, необходимое для
достижения температуры (60 ± 2) °C, не должно превышать 15 мин и может быть сведено к минимуму
посредством циркуляции воды в водяной бане, максимально увеличивающей теплообмен.
8.3 Разбавление пробы
Испытательный объем пробы или ее разведения – после тепловой обработки, если требуется –
следует выбрать для получения, если возможно, от 10 до 80 колоний на мембрану диаметром от 47 мм
до 50 мм. Испытательные объемы или разведения следует готовить в соответствии с ISO 8199.
8.4 Фильтрация
Для общего описания техники фильтрации через полупроницаемую мембрану см. ISO 8199.
Фильтруют отмеренный объем воды. Этот объем должен соответствовать объему исследуемой воды.
Для воды, предназначенной для потребления человеком, обычно фильтруют объем 100 мл.
Записывают профильтрованный объем.
После фильтрации помещают мембрану лицевой стороной вверх, place the membrane на чашку с TSC-
агаром, следя за тем, чтобы под фильтр не попали пузырьки воздуха.
ПРИМЕЧАНИЕ Альтернативно можно использовать тонкий слой (примерно от 5 мл до 10 мл на чашку
Петри диаметром 90 мм) расплавленного TSC-агара (доведенного до равновесного состояния на
водяной бане температурой (45 ± 1) °C) в качестве укрывающего слоя на мембране. Перед анаэробной
инкубацией дают агару застыть. Эта процедура может способствовать почернению колоний.
Необязательно добавлять циклосерин в TSC-агар для укрывающего мембрану слоя. В то же время,
...
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 14189
First edition
2013-11-01
Water quality — Enumeration of
Clostridium perfringens — Method
using membrane filtration
Qualité de l’eau — Dénombrement de Clostridium perfringens —
Méthode de filtration sur membrane
Reference number
ISO 14189:2013(E)
©
ISO 2013
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 14189:2013(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2013
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form
or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 14189:2013(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Apparatus and glassware . 2
6 Culture media and reagents . 3
6.1 Basic materials . 3
6.2 Culture media . 3
7 Sampling . 3
8 Procedure. 3
8.1 Transport and storage of the sample . 3
8.2 Heat pre-treatment to select spores . 3
8.3 Sample dilution . 3
8.4 Filtration . 4
8.5 Incubation and examination . 4
8.6 Confirmation of Clostridium perfringens . 4
9 Expression of results . 5
10 Test report . 5
11 Quality assurance . 5
Annex A (normative) Composition and preparation of culture media and reagents .7
Annex B (informative) Performance data . 9
Bibliography .12
© ISO 2013 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 14189:2013(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical Barriers
to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4,
Microbiological methods.
iv © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 14189:2013(E)
Introduction
Clostridium perfringens is widely recognized as a valuable indicator for faecal pollution. Within the
intestinal tract of animals and man, these Gram-positive bacteria form spores which are resistant to
heating compared with vegetative cells. C. perfringens in the intestine exists both as spores and vegetative
cells, spores are also found in environmental samples. The spores of C. perfringens survive in water for
months, much longer than vegetative faecal indicator bacteria and consequently their presence may
indicate remote or intermittent faecal pollution. Monitoring of C. perfringens has proven useful for the
assessment of the quality of water resources and to check the stages of water treatment to evaluate the
treatment-works performance. The spores are not always inactivated by routine disinfection procedures
(e.g. chlorination).
© ISO 2013 – All rights reserved v
---------------------- Page: 5 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 14189:2013(E)
Water quality — Enumeration of Clostridium perfringens —
Method using membrane filtration
WARNING — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.
This document does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its
use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and to
ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this document
be carried out by suitably qualified staff.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the enumeration of vegetative cells and spores of
Clostridium perfringens by the membrane filtration method in samples of water intended for human
consumption. However, the method can be applied to all types of water samples provided they do not
contain particulate or colloidal matter that interferes with filtration.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 8199, Water quality — General guidance on the enumeration of micro-organisms by culture
ISO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and production
of culture media — Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in
the laboratory
ISO 19458, Water quality — Sampling for microbiological analysis
ISO/IEC Guide 2:2004, Standardization and related activities — General vocabulary
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO/IEC Guide 2 and the
following apply:
3.1
presumptive Clostridium perfringens
bacteria which produce all shades of black or grey to yellow brown colonies on tryptose-sulfite-cycloserine
agar, even if the colour is faint, after anaerobic incubation at (44 ± 1) °C for (21 ± 3) h
Note 1 to entry: Unlike colonies growing directly on the agar medium, colonies on the membrane do not always
display a distinct blackening, so faint colonies are included in the count.
3.2
confirmed Clostridium perfringens
bacteria that produce characteristic colonies on tryptose-sulfite-cycloserine agar and possess the
enzyme acid phosphatase
© ISO 2013 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 14189:2013(E)
4 Principle
A measured volume of the sample, or a dilution of it, is filtered through a membrane with a pore size of
0,45 µm sufficient to retain spores of clostridia. The membrane is incubated on a selective/differential
agar (tryptose-sulfite-cycloserine agar) anaerobically at (44 ± 1) °C for (21 ± 3) h. C. perfringens usually
produce black or grey to yellow brown colonies as a result of the reduction of sulfite to sulfide which
reacts with a ferric salt in the medium. Characteristic colonies are counted and confirmatory tests are
carried out. The result is calculated as the colony count per sample volume. If a count of spores alone is
required the sample is first pre-treated at (60 ± 2) °C to inactivate vegetative bacteria.
NOTE 1 The medium contains cycloserine as a selective agent to inhibit Bacillus species.
NOTE 2 Incubation at 44 °C increases the selectivity of the test for C. perfringens.
5 Apparatus and glassware
Except for disposable glassware or plastics ware which is delivered sterile, sterilize glassware as
specified in ISO 8199.
Usual microbiological equipment and particularly:
5.1 Membrane filtration apparatus, as specified in ISO 8199.
5.2 Sterile filter funnels
Use funnels either delivered sterile or sterilized as specified in ISO 8199. Alternatively flaming of funnels
made of metal prior to their use is acceptable.
NOTE For this method it is insufficient to disinfect funnels by boiling.
5.3 Sterile membrane filters, nominal pore size 0,45 µm.
The quality of membrane filters may vary from brand to brand or even from batch to batch. It is therefore
advisable to check the quality on a regular basis.
5.4 Incubators, capable of being maintained at (36 ± 2) °C and at (44 ± 1) °C.
5.5 Water bath (optional), capable of being maintained at (60 ± 2) °C equipped with a means of
circulating the water.
5.6 Autoclave, capable of being maintained at (121 ± 3) °C.
5.7 Sterile forceps
5.8 Anaerobic jars, or similar equipment.
5.9 Anaerobic gas generating system, to generate an atmosphere of approximately 90 % hydrogen
and 10 % carbon dioxide.
2 © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 14189:2013(E)
6 Culture media and reagents
6.1 Basic materials
For uniformity of results, in the preparation of media, use constituents of uniform quality and chemicals
of recognized analytical grade. For preparation of the media use glass-distilled water or deionized water
[1]
of equivalent purity, as specified for water grade 3 in ISO 3696 .
Alternatively, use commercially available dehydrated complete medium and reagents prepared and
used according to the manufacturer’s instructions.
Other grades of chemicals may be used provided they can be shown to lead to the same results.
6.2 Culture media
See Annex A.
6.2.1 Tryptose sulfite cycloserine agar (TSC agar), References [6][11][12]
See A.1.
6.2.2 Blood agar or Columbia agar base or another suitable nutrient-rich agar
See A.2.
6.2.3 Acid phosphatase reagent
See A.3.
7 Sampling
Carry out sampling as specified in ISO 19458.
8 Procedure
8.1 Transport and storage of the sample
Start examination as soon as possible after the collection of the sample preferably within the same
working day. Samples should be cooled during transport ideally at (5 ± 3) °C. The recommended maximum
sample storage time including transport is for vegetative bacteria 12 h and for spores 24 h. The sample
storage time including transport shall not exceed 18 h for vegetative bacteria and 72 h for spores.
8.2 Heat pre-treatment to select spores
If it is the intention to count only spores, mix the sample well and then heat it to (60 ± 2) °C in a water bath
for (15 ± 1) min. The volume heated should be greater than the volume to be analysed. The temperature
should be monitored by placing an appropriate thermometer in a reference bottle of the same size as the
sample bottle and containing the same volume of water at the same initial temperature as the sample
being treated. The time taken to reach (60 ± 2) °C shall not exceed 15 min and can be minimized by
ensuring the water in the water bath is circulated to maximize heat exchange.
8.3 Sample dilution
A test volume of sample or dilution of it - after heat treatment if required - should be chosen to yield,
if possible, between 10 and 80 colonies on a membrane 47 mm to 50 mm in diameter. Test volumes or
dilutions should be prepared as described in ISO 8199.
© ISO 2013 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 14189:2013(E)
8.4 Filtration
For a general description of the membrane filtration technique see ISO 8199.
Filter a measured volume of water. The volume should be appropriate to the water being examined. For
water intended for human consumption, it is usual to filter a volume of 100 ml. Record the volume filtered.
After filtration, place the membrane grid face upwards on a TSC agar plate ensuring that no air bubbles
are trapped under the filter.
NOTE Alternatively, a thin layer (about 5 ml to 10 ml related to a petri dish of 90 mm diameter) molten
TSC agar (equilibrated in a water bath at (45 ± 1) °C) as
...
SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 14189:2014
01-marec-2014
Kakovost vode - Ugotavljanje števila Clostridium perfringens - Metoda
membranske filtracije
Water quality - Enumeration of Clostridium perfringens - Method using membrane
filtration
Qualité de l'eau - Dénombrement de Clostridium perfringens - Méthode de filtration sur
membrane
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 14189:2013
ICS:
07.100.20 Mikrobiologija vode Microbiology of water
13.060.70 Preiskava bioloških lastnosti Examination of biological
vode properties of water
SIST ISO 14189:2014 en,fr
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.
---------------------- Page: 1 ----------------------
SIST ISO 14189:2014
---------------------- Page: 2 ----------------------
SIST ISO 14189:2014
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 14189
First edition
2013-11-01
Water quality — Enumeration of
Clostridium perfringens — Method
using membrane filtration
Qualité de l’eau — Dénombrement de Clostridium perfringens —
Méthode de filtration sur membrane
Reference number
ISO 14189:2013(E)
©
ISO 2013
---------------------- Page: 3 ----------------------
SIST ISO 14189:2014
ISO 14189:2013(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2013
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form
or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
SIST ISO 14189:2014
ISO 14189:2013(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Apparatus and glassware . 2
6 Culture media and reagents . 3
6.1 Basic materials . 3
6.2 Culture media . 3
7 Sampling . 3
8 Procedure. 3
8.1 Transport and storage of the sample . 3
8.2 Heat pre-treatment to select spores . 3
8.3 Sample dilution . 3
8.4 Filtration . 4
8.5 Incubation and examination . 4
8.6 Confirmation of Clostridium perfringens . 4
9 Expression of results . 5
10 Test report . 5
11 Quality assurance . 5
Annex A (normative) Composition and preparation of culture media and reagents .7
Annex B (informative) Performance data . 9
Bibliography .12
© ISO 2013 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 5 ----------------------
SIST ISO 14189:2014
ISO 14189:2013(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical Barriers
to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4,
Microbiological methods.
iv © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
SIST ISO 14189:2014
ISO 14189:2013(E)
Introduction
Clostridium perfringens is widely recognized as a valuable indicator for faecal pollution. Within the
intestinal tract of animals and man, these Gram-positive bacteria form spores which are resistant to
heating compared with vegetative cells. C. perfringens in the intestine exists both as spores and vegetative
cells, spores are also found in environmental samples. The spores of C. perfringens survive in water for
months, much longer than vegetative faecal indicator bacteria and consequently their presence may
indicate remote or intermittent faecal pollution. Monitoring of C. perfringens has proven useful for the
assessment of the quality of water resources and to check the stages of water treatment to evaluate the
treatment-works performance. The spores are not always inactivated by routine disinfection procedures
(e.g. chlorination).
© ISO 2013 – All rights reserved v
---------------------- Page: 7 ----------------------
SIST ISO 14189:2014
---------------------- Page: 8 ----------------------
SIST ISO 14189:2014
INTERNATIONAL STANDARD ISO 14189:2013(E)
Water quality — Enumeration of Clostridium perfringens —
Method using membrane filtration
WARNING — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.
This document does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its
use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and to
ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this document
be carried out by suitably qualified staff.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the enumeration of vegetative cells and spores of
Clostridium perfringens by the membrane filtration method in samples of water intended for human
consumption. However, the method can be applied to all types of water samples provided they do not
contain particulate or colloidal matter that interferes with filtration.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 8199, Water quality — General guidance on the enumeration of micro-organisms by culture
ISO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and production
of culture media — Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in
the laboratory
ISO 19458, Water quality — Sampling for microbiological analysis
ISO/IEC Guide 2:2004, Standardization and related activities — General vocabulary
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO/IEC Guide 2 and the
following apply:
3.1
presumptive Clostridium perfringens
bacteria which produce all shades of black or grey to yellow brown colonies on tryptose-sulfite-cycloserine
agar, even if the colour is faint, after anaerobic incubation at (44 ± 1) °C for (21 ± 3) h
Note 1 to entry: Unlike colonies growing directly on the agar medium, colonies on the membrane do not always
display a distinct blackening, so faint colonies are included in the count.
3.2
confirmed Clostridium perfringens
bacteria that produce characteristic colonies on tryptose-sulfite-cycloserine agar and possess the
enzyme acid phosphatase
© ISO 2013 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 9 ----------------------
SIST ISO 14189:2014
ISO 14189:2013(E)
4 Principle
A measured volume of the sample, or a dilution of it, is filtered through a membrane with a pore size of
0,45 µm sufficient to retain spores of clostridia. The membrane is incubated on a selective/differential
agar (tryptose-sulfite-cycloserine agar) anaerobically at (44 ± 1) °C for (21 ± 3) h. C. perfringens usually
produce black or grey to yellow brown colonies as a result of the reduction of sulfite to sulfide which
reacts with a ferric salt in the medium. Characteristic colonies are counted and confirmatory tests are
carried out. The result is calculated as the colony count per sample volume. If a count of spores alone is
required the sample is first pre-treated at (60 ± 2) °C to inactivate vegetative bacteria.
NOTE 1 The medium contains cycloserine as a selective agent to inhibit Bacillus species.
NOTE 2 Incubation at 44 °C increases the selectivity of the test for C. perfringens.
5 Apparatus and glassware
Except for disposable glassware or plastics ware which is delivered sterile, sterilize glassware as
specified in ISO 8199.
Usual microbiological equipment and particularly:
5.1 Membrane filtration apparatus, as specified in ISO 8199.
5.2 Sterile filter funnels
Use funnels either delivered sterile or sterilized as specified in ISO 8199. Alternatively flaming of funnels
made of metal prior to their use is acceptable.
NOTE For this method it is insufficient to disinfect funnels by boiling.
5.3 Sterile membrane filters, nominal pore size 0,45 µm.
The quality of membrane filters may vary from brand to brand or even from batch to batch. It is therefore
advisable to check the quality on a regular basis.
5.4 Incubators, capable of being maintained at (36 ± 2) °C and at (44 ± 1) °C.
5.5 Water bath (optional), capable of being maintained at (60 ± 2) °C equipped with a means of
circulating the water.
5.6 Autoclave, capable of being maintained at (121 ± 3) °C.
5.7 Sterile forceps
5.8 Anaerobic jars, or similar equipment.
5.9 Anaerobic gas generating system, to generate an atmosphere of approximately 90 % hydrogen
and 10 % carbon dioxide.
2 © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 10 ----------------------
SIST ISO 14189:2014
ISO 14189:2013(E)
6 Culture media and reagents
6.1 Basic materials
For uniformity of results, in the preparation of media, use constituents of uniform quality and chemicals
of recognized analytical grade. For preparation of the media use glass-distilled water or deionized water
[1]
of equivalent purity, as specified for water grade 3 in ISO 3696 .
Alternatively, use commercially available dehydrated complete medium and reagents prepared and
used according to the manufacturer’s instructions.
Other grades of chemicals may be used provided they can be shown to lead to the same results.
6.2 Culture media
See Annex A.
6.2.1 Tryptose sulfite cycloserine agar (TSC agar), References [6][11][12]
See A.1.
6.2.2 Blood agar or Columbia agar base or another suitable nutrient-rich agar
See A.2.
6.2.3 Acid phosphatase reagent
See A.3.
7 Sampling
Carry out sampling as specified in ISO 19458.
8 Procedure
8.1 Transport and storage of the sample
Start examination as soon as possible after the collection of the sample preferably within the same
working day. Samples should be cooled during transport ideally at (5 ± 3) °C. The recommended maximum
sample storage time including transport is for vegetative bacteria 12 h and for spores 24 h. The sample
storage time including transport shall not exceed 18 h for vegetative bacteria and 72 h for spores.
8.2 Heat pre-treatment to select spores
If it is the intention to count only spores, mix the sample well and then heat it to (60 ± 2) °C in a water bath
for (15 ± 1) min. The volume heated should be greater than the volume to be analysed. The temperature
should be monitored by placing an appropriate thermometer in a reference bottle of the same size as the
sample bottle and containing the same volume of water at the same initial temperature as the sample
being treated. The time taken to reach (60 ± 2) °C shall not exceed 15 min and can be minimized by
ensuring the water in the water bath is circulated to maximize heat exchange.
8.3 Sample dilution
A test volume of sample or dilution of it - after heat treatment if required - should be chosen to yield,
if possible, between 10 and 80 colonies on a membrane 47 mm to 50 mm in diameter. Test volumes or
dilutions should be prepared as described in ISO 8199.
© ISO 2013 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 11 ----------------------
SIST ISO 14189:2014
ISO 14189:2013(E)
8.4 Filtration
For a general description of the membrane filtration te
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 14189
Première édition
2013-11-01
Qualité de l’eau — Dénombrement de
Clostridium perfringens — Méthode
par filtration sur membrane
Water quality — Enumeration of Clostridium perfringens — Method
using membrane filtration
Numéro de référence
ISO 14189:2013(F)
©
ISO 2013
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 14189:2013(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2013, Publié en Suisse
Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée
sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Ch. de Blandonnet 8 • CP 401
CH-1214 Vernier, Geneva, Switzerland
Tel. +41 22 749 01 11
Fax +41 22 749 09 47
copyright@iso.org
www.iso.org
ii © ISO 2013 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 14189:2013(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Appareillage et verrerie . 2
6 Milieux de culture et réactifs . 3
6.1 Matériaux de base . 3
6.2 Milieux de culture . 3
6.2.1 Gélose Tryptose-Sulfite-Cyclosérine (gélose TSC), Références [6][11][12] . 3
6.2.2 Gélose au sang ou base de gélose Columbia ou autre gélose adaptée riche
en nutriments . 3
6.2.3 Réactif de la phosphatase acide . 3
7 Échantillonnage . 3
8 Mode opératoire. 3
8.1 Transport et stockage de l’échantillon . 3
8.2 Prétraitement thermique pour la sélection des spores . 3
8.3 Dilution de l’échantillon . 4
8.4 Filtration . 4
8.5 Incubation et examen . 4
8.6 Confirmation de Clostridium perfringens . 4
8.6.1 Généralités . 4
8.6.2 Essai à la phosphatase acide . 5
8.6.3 Interprétation . 5
9 Expression des résultats. 5
10 Rapport d’essai . 5
11 Assurance de la qualité . 5
Annexe A (normative) Composition et préparation des milieux de culture et des réactifs .7
Annexe B (informative) Données de performance . 9
Bibliographie .12
© ISO 2013 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 14189:2013(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation
de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de l’Organisation
mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien
suivant: www.iso.org/iso/fr/avant-propos.html
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité
SC 4, Méthodes microbiologiques.
iv © ISO 2013 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 14189:2013(F)
Introduction
Les bactéries Clostridium perfringens sont largement reconnues comme étant un précieux indicateur
de pollution fécale. Dans le tractus intestinal des animaux et de l’homme, ces bactéries Gram positives
forment des spores qui, contrairement aux cellules végétatives, sont résistantes à la chaleur. Dans
les intestins, C. perfringens est présent sous forme de spores et de cellules végétatives, lesquelles se
retrouvent également dans les échantillons environnementaux. Les spores de C. perfringens survivent
dans l’eau pendant des mois, ce qui est nettement plus long que les bactéries végétatives indicatrices
d’une contamination fécale et, par conséquent, la présence de ces spores peut indiquer une pollution
fécale éloignée ou intermittente. La surveillance de C. perfringens s’est avérée utile pour évaluer
la qualité des ressources en eau et contrôler les phases du traitement de l’eau afin d’en évaluer les
performances. Les spores ne sont pas toujours inactivées par les modes opératoires de désinfection de
routine (chloration, par exemple).
© ISO 2013 – Tous droits réservés v
---------------------- Page: 5 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 14189:2013(F)
Qualité de l’eau — Dénombrement de Clostridium
perfringens — Méthode par filtration sur membrane
AVERTISSEMENT — Il convient que les utilisateurs du présent document maîtrisent les pratiques
courantes de laboratoire. Le présent document ne prétend pas couvrir tous les problèmes de
sécurité potentiels associés à son utilisation. Il est de la responsabilité de l’utilisateur d’établir
les pratiques de sécurité et de santé appropriées et d’assurer la conformité aux réglementations
nationales.
IMPORTANT — Il est absolument indispensable que les essais menés conformément au présent
document le soient par du personnel dûment qualifié.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode pour le dénombrement des cellules végétatives
et des spores de Clostridium perfringens par filtration sur membrane dans des échantillons d’eau destinée
à la consommation humaine. Cette méthode peut toutefois s’appliquer à tous les types d’échantillons
d’eau, sous réserve qu’ils ne contiennent pas de matière particulaire ou colloïdale interférant avec la
filtration.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 8199, Qualité de l’eau — Lignes directrices générales pour le dénombrement des micro-organismes sur
milieu de culture
ISO/TS 11133-1, Microbiologie des aliments — Lignes directrices pour la préparation et la production des
milieux de culture — Partie 1: Lignes directrices générales d’assurance qualité pour la préparation des
milieux de culture en laboratoire
ISO 19458, Qualité de l’eau — Échantillonnage pour analyse microbiologique
Guide ISO/IEC 2:2004, Normalisation et activités connexes — Vocabulaire général
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans le Guide Guide ISO/IEC 2
ainsi que les suivants s’appliquent.
3.1
Clostridium perfringens présomptives
bactéries qui produisent toutes les nuances de colonies noires ou grises à jaunes-brunes sur la gélose
Tryptose-Sulfite-Cyclosérine, même si la coloration est légère, après incubation anaérobie à (44 ± 1) °C
pendant (21 ± 3) h
Note 1 à l’article: à l’Article Contrairement aux colonies qui se développent directement sur le milieu gélosé,
les colonies sur la membrane ne présentent pas toujours un noircissement distinct et, de ce fait, les colonies
légèrement colorées sont incluses dans le dénombrement.
© ISO 2013 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 14189:2013(F)
3.2
Clostridium perfringens confirmées
bactéries qui produisent des colonies caractéristiques sur la gélose Tryptose-Sulfite-Cyclosérine et
possèdent l’enzyme phosphatase acide
4 Principe
Un volume mesuré de l’échantillon, ou une dilution de ce dernier, est filtré à travers une membrane
ayant des pores de 0,45 µm, cette dimension étant suffisante pour retenir les spores de clostridia. La
membrane est incubée sur une gélose sélective/différentielle (gélose Tryptose-Sulfite-Cyclosérine)
en anaérobiose à (44 ± 1) °C pendant (21 ± 3) h. Les C. perfringens produisent généralement des
colonies de couleur noire ou grise à jaune-brune suite à la réduction du sulfite en sulfure qui réagit
avec un sel ferrique présent dans le milieu. Les colonies caractéristiques sont dénombrées et des
essais de confirmation réalisés. Le résultat calculé est exprimé en unités formant colonie par volume
d’échantillon. Si seul un dénombrement de spores est requis, l’échantillon est d’abord soumis à un
prétraitement à (60 ± 2) °C afin d’inactiver les bactéries végétatives.
NOTE 1 Le milieu contient de la cyclosérine comme agent sélectif pour inhiber les espèces de Bacillus.
NOTE 2 L’incubation à 44 °C augmente la sélectivité de l’essai pour C. perfringens.
5 Appareillage et verrerie
Hormis la verrerie ou le matériel en plastique à usage unique qui est fourni stérile, stériliser la verrerie
tel que spécifié dans l’ISO 8199.
Utiliser un équipement de microbiologie courant et, en particulier:
5.1 Appareillage de filtration sur membrane, tel que spécifié dans l’ISO 8199.
5.2 Entonnoirs de filtration stériles
Utiliser des entonnoirs stériles à usage unique ou stérilisés conformément à l’ISO 8199. Alternativement,
flamber les entonnoirs métalliques avant de les utiliser.
NOTE Pour cette méthode, une désinfection des entonnoirs par ébullition n’est pas suffisante.
5.3 Membranes filtrantes stériles, ayant des pores de dimension nominale 0,45 µm.
La qualité des membranes filtrantes peut varier d’un fournisseur à l’autre, voire d’un lot à un autre. Il
est donc conseillé de vérifier régulièrement la qualité des membranes.
5.4 Étuves thermostatées, pouvant être maintenues à (36 ± 2) °C et (44 ± 1) °C.
5.5 Bain d’eau (facultatif), pouvant être maintenu à (60 ± 2) °C et équipé d’un système de
circulation d’eau.
5.6 Autoclave, pouvant être maintenu à (121 ± 3) °C.
5.7 Pince stérile
5.8 Jarres anaérobies, ou équipement similaire.
5.9 Système générateur de gaz anaérobie, pour produire une atmosphère contenant
approximativement 90 % d’hydrogène et 10 % de dioxyde de carbone.
2 © ISO 2013 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 14189:2013(F)
6 Milieux de culture et réactifs
6.1 Matériaux de base
Pour l’uniformité des résultats, les constituants utilisés dans la préparation des milieux doivent être
de qualité uniforme et les produits chimiques de qualité analytique reconnue. Pour la préparation des
milieux, utiliser de l’eau distillée dans une verrerie ou de l’eau déionisée de pureté équivalente, tel que
[1]
spécifié dans l’ISO 3696 pour une eau de qualité 3.
Il est également possible d’utiliser un milieu complet déshydraté et des réactifs disponibles dans le
commerce, préparés et utilisés conformément aux instructions du fabricant.
D’autres qualités de produits chimiques peuvent être utilisées, sous réserve de démontrer qu’elles
conduisent aux mêmes résultats.
6.2 Milieux de culture
Voir Annexe A.
6.2.1 Gélose Tryptose-Sulfite-Cyclosérine (gélose TSC), Références [6][11][12]
Voir A.1.
6.2.2 Gélose au sang ou base de gélose Columbia ou autre gélose adaptée riche en nutriments
Voir A.2.
6.2.3 Réactif de la phosphatase acide
Voir A.3.
7 Échantillonnage
Procéder à l’échantillonnage tel que spécifié dans l’ISO 19458.
8 Mode opératoire
8.1 Transport et stockage de l’échantillon
Débuter l’examen dès que possible après le prélèvement de l’échantillon, de préférence le même jour. Il
convient de refroidir les échantillons pendant le transport, idéalement à (5 ± 3) °C. La durée de stockage
maximale recommandée pour l’échantillon, transport inclus, est de 12 h pour les bactéries végétatives
et de 24 h pour les spores. La durée de stockage de l’échantillon, transport inclus, ne doit pas dépasser
18 h pour les bactéries végétatives et 72 h pour les spores.
8.2 Prétraitement thermique pour la sélection des spores
Si seul un dénombrement de spores est souhaité, bien homogénéiser l’échantillon puis le chauffer à
(60 ± 2) °C dans un bain d’eau pendant (15 ± 1) min. Il convient que le volume chauffé soit supérieur
à celui à analyser. Il est recommandé de surveiller la température en plaçant un thermomètre adapté
dans un flacon de référence de taille identique au flacon d’échantillon et contenant le même volume
d’eau à la même température initiale que l’échantillon en cours de traitement. Le temps requis pour
atteindre (60 ± 2) °C ne doit pas dépasser 15 min et peut être réduit en assurant une circulation d’eau
dans le bain afin d’optimiser l’échange thermique.
© ISO 2013 – Tous droits réservés 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 14189:2013(F)
8.3 Dilution de l’échantillon
Il convient de choisir un volume d’essai de l’échantillon ou une dilution de ce dernier - après le traitement
thermique si requis - de manière à obtenir, si possible, entre 10 et 80 colonies sur une membrane
de 47 mm à 50 mm de diamètre. Il est recommandé de préparer les volumes d’essai ou les dilutions
conformément à la description de l’ISO 8199.
8.4 Filtration
Pour obtenir une description générale de la méthode de filtration sur membrane, voir l’ISO 8199.
Filtrer un volume d’eau mesuré. Il convient d’adapter le volume au type d’eau en cours d’analyse. Pour les
eaux destinées à la consommation humaine, un volume de 100 m
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.