ISO 15213-1:2023
(Main)Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Clostridium spp. — Part 1: Enumeration of sulfite-reducing Clostridium spp. by colony-count technique
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Clostridium spp. — Part 1: Enumeration of sulfite-reducing Clostridium spp. by colony-count technique
This document specifies the enumeration of sulfite-reducing Clostridium spp. by the colony-count technique. This document is applicable to: — products intended for human consumption; — products for feeding animals; — environmental samples in the area of food and feed production and handling; — samples from the primary production stage. NOTE This method has been validated in an interlaboratory study for the following food categories: — ready-to-eat, ready-to-reheat meat products; — eggs and egg products (derivates); — processed fruits and vegetables; — infant formula and infant cereals; — multi-component foods or meal components. It has also been validated for the following other categories: — pet food and animal feed; — environmental samples (food or feed production). As this method has been validated for at least five food categories, this method is applicable for a broad range of food. For detailed information on the validation, see Clause 11 and Annex C. Since the method is not commonly used for samples in the primary production stage, this category was not included in the interlaboratory study. Therefore, no performance characteristics were obtained for this category. This horizontal method was originally developed for the examination of all samples belonging to the food chain. Based on the information available at the time of publication of this document, this method is considered to be fully suited to the examination of all samples belonging to the food chain. However, because of the large variety of products in the food chain, it is possible that this horizontal method is not appropriate in every detail for all products. Nevertheless, it is expected that the required modifications are minimized so that they do not result in a significant deviation from this horizontal method. This technique is suitable for, but not limited to, the enumeration of microorganisms in test samples with a minimum of 10 colonies counted on a plate. This corresponds to a level of contamination that is expected to be higher than 10 cfu/ml for liquid samples or higher than 100 cfu/g for solid samples.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de Clostridium spp. — Partie 1: Dénombrement des bactéries Clostridium spp. sulfito-réductrices par la technique de comptage des colonies
Le présent document spécifie le dénombrement des bactéries Clostridium spp. sulfito-réductrices par la technique de comptage des colonies. Le présent document s’applique: — aux produits destinés à la consommation humaine; — aux produits destinés à l’alimentation animale; — aux échantillons environnementaux prélevés dans les secteurs de la production et de la distribution des aliments; et — aux échantillons prélevés au stade de la production primaire. NOTE Cette méthode a été validée dans le cadre d’une étude interlaboratoires pour les catégories d’aliments suivantes: — les produits à base de viande prêts à consommer et prêts à réchauffer; — les œufs et ovoproduits (dérivés); — les fruits et légumes transformés; — les préparations et céréales pour nourrissons; — les aliments composés ou les composants de repas. Elle a également été validée pour les catégories suivantes: — les produits destinés à l’alimentation animale et les aliments pour animaux; — les échantillons environnementaux (production d’aliments ou d’aliments pour animaux). Cette méthode ayant été validée pour au moins cinq catégories d’aliments, elle s’applique à un large éventail d’aliments. Pour des informations détaillées sur la validation, voir l’Article 11 et l’Annexe C. Étant donné que cette méthode n’est pas couramment utilisée pour les échantillons au stade de la production primaire, cette catégorie n’a pas été incluse dans l’étude interlaboratoires. Par conséquent, aucune caractéristique de performance n’a été déterminée pour cette catégorie. Cette méthode horizontale a été initialement développée pour l’examen de tous les échantillons provenant de la chaîne alimentaire. Sur la base des informations disponibles au moment de la publication du présent document, cette méthode est considérée comme parfaitement adaptée à l’examen de tous les échantillons provenant de la chaîne alimentaire. Cependant, en raison de la grande diversité des produits de la chaîne alimentaire, il est possible que cette méthode horizontale ne soit pas appropriée dans ses moindres détails à tous les produits. Néanmoins, il est attendu que les modifications requises soient réduites au minimum afin qu’elles n’entrainent pas de déviation significative de cette méthode horizontale. Cette technique est adaptée, sans toutefois s’y limiter, au dénombrement des micro-organismes dans les échantillons d’essai avec un minimum de 10 colonies dénombrées par boîte. Cela correspond à un niveau de contamination attendu supérieur à 10 UFC/ml pour les échantillons liquides ou supérieur à 100 UFC/g pour les échantillons solides.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 15213-1
First edition
2023-01
Microbiology of the food chain —
Horizontal method for the detection
and enumeration of Clostridium
spp. —
Part 1:
Enumeration of sulfite-reducing
Clostridium spp. by colony-count
technique
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour
la recherche et le dénombrement de Clostridium spp. —
Partie 1: Dénombrement des bactéries Clostridium spp. sulfito-
réductrices par la technique de comptage des colonies
Reference number
© ISO 2023
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Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .iv
Introduction . vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 2
3 Terms and definitions . 2
4 Principle . 2
4.1 General . 2
4.2 Preparation of dilutions . 3
4.3 Enumeration . 3
4.4 Confirmation . 3
5 Culture media and reagents .3
6 Equipment and consumables .3
7 Sampling . 4
8 Preparation of test sample . 4
9 Procedure .5
9.1 General . 5
9.2 Test portion, initial suspension and dilutions . 5
9.3 Heat treatment to select spores . 5
9.4 Inoculation and incubation. 5
9.5 Enumeration of typical colonies . 6
9.6 Confirmation of sulfite-reducing Clostridium spp. . 6
10 Expression of results . 7
11 Validation of the method . 7
11.1 Interlaboratory study . 7
11.2 Performance characteristics . 7
12 Test report . 8
13 Quality assurance . 8
Annex A (normative) Flow diagram of the procedure . 9
Annex B (normative) Culture media and reagents .11
Annex C (informative) Performance characteristics of the method .14
Annex D (informative) Special protocol for the enumeration of sulfite-reducing
Clostridium spp. in feed .17
Bibliography .21
iii
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to
the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see
www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 463, Microbiology of the food chain, in accordance with the Agreement on technical
cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This first edition of ISO 15213-1 cancels and replaces ISO 15213:2003, which has been technically
revised.
The main changes are as follows:
— the Scope has been expanded to include samples from the primary production stage;
— the scope of the method has been changed from “sulfite-reducing bacteria” to “sulfite-reducing
Clostridium spp.”: therefore, typical colonies on the iron sulfite agar plates are confirmed;
— the concentration of sulfite in the iron sulfite agar has been reduced from 1,0 g/l to 0,5 g/l;
— the heat treatment of 10 min at 80 °C has been made optional, in the case of high background flora
or for the enumeration of only spores of sulfite-reducing Clostridium spp. present in the sample;
— the option for using tubes for inoculation has been removed;
— the option for incubating the samples at 50 °C for the enumeration of thermophilic sulfite-reducing
bacteria has been removed;
— a description of how the confirmation of typical colonies has to be performed has been added;
— the flow diagram in Annex A giving a short description of the procedure has been revised;
— in Annex C, the performance characteristics have been added;
— Annex D has been added to provide a special protocol for the enumeration of sulfite-reducing
Clostridium spp. in feed.
iv
A list of all parts in the ISO 15213 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body.
A complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
v
Introduction
Sulfite-reducing Clostridium spp. are obligate anaerobic, Gram-positive, spore-forming, rod-shaped
bacteria. The most important species which belong to this group are Clostridium (C.) perfringens,
C. bifermentans, C. sporogenes and C. botulinum. Some species can cause foodborne illness. As ubiquitous
bacteria they are predominantly found in nature. The Clostridium species inhabit soils and the intestinal
tract of animals and humans.
Sulfite-reducing Clostridium spp., including C. perfringens, are widely used as microbial indicators of
clostridial contamination in the manufacturing of foods (e.g. meat production). These have the capacity
to produce heat-resistant spores. Outside the dairy industry, the use of sulfite-reducing Clostridium
spp. as a microbial indicator is limited to a relatively small number of foods. Its current application
in non-dairy foods is either an indication of faecal contamination (especially C. perfringens, see also
ISO 15213-2 and ISO/TS 15213-3) and/or as an indicator of sanitation/process control related to
potential growth and survival of anaerobic spore-forming bacteria.
This document describes the horizontal method for the enumeration of sulfite-reducing Clostridium spp.
in food, feed, environmental samples and samples from the primary production stage. The method
for the enumeration of C. perfringens is described in ISO 15213-2. The method for the detection of
C. perfringens is described in ISO/TS 15213-3. These three parts are published as a series of International
Standards because the methods are closely linked to each other. These methods are often conducted in
association with each other in a laboratory, and the media and their performance characteristics can be
similar.
The main technical changes listed in the Foreword, introduced in this document compared with
ISO 15213:2003, are considered as major (see ISO 17468).
These changes have a major impact on the performance characteristics of the method.
vi
INTERNATIONAL STANDARD ISO 15213-1:2023(E)
Microbiology of the food chain — Horizontal method for
the detection and enumeration of Clostridium spp. —
Part 1:
Enumeration of sulfite-reducing Clostridium spp. by
colony-count technique
WARNING — In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that tests for
the enumeration of sulfite-reducing Clostridium spp. are only undertaken in properly equipped
laboratories, under the control of a skilled microbiologist, and that great care is taken in the
disposal of all incubated materials. Persons using this document should be familiar with normal
laboratory practice. This document does not purport to address all of the safety aspects, if any,
associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and
health practice
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 15213-1
Première édition
2023-01
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Méthode horizontale
pour la recherche et le dénombrement
de Clostridium spp. —
Partie 1:
Dénombrement des bactéries
Clostridium spp. sulfito-réductrices
par la technique de comptage des
colonies
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the
detection and enumeration of Clostridium spp. —
Part 1: Enumeration of sulfite-reducing Clostridium spp. by colony-
count technique
Numéro de référence
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CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction . vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives .2
3 Termes et définitions . 2
4 Principe. 3
4.1 Généralités . 3
4.2 Préparation des dilutions . 3
4.3 Dénombrement . 3
4.4 Confirmation . 3
5 Milieux de culture et réactifs .3
6 Équipement et consommables . 4
7 Échantillonnage .4
8 Préparation de l’échantillon pour essai . 5
9 Mode opératoire . 5
9.1 Généralités . 5
9.2 Prise d’essai, suspension mère et dilutions . 5
9.3 Traitement thermique pour la sélection des spores . 5
9.4 Ensemencement et incubation . . 6
9.5 Dénombrement des colonies caractéristiques . 6
9.6 Confirmation des bactéries Clostridium spp. sulfito-réductrices . 7
10 Expression des résultats . 7
11 Validation de la méthode . 8
11.1 Étude interlaboratoires . 8
11.2 Caractéristiques de performance . 8
12 Rapport d’essai . 9
13 Assurance qualité . 9
Annexe A (normative) Logigramme du mode opératoire .10
Annexe B (normative) Milieux de culture et réactifs .12
Annexe C (informative) Caractéristiques de performance de la méthode .15
Annexe D (informative) Protocole spécial pour le dénombrement des bactéries
Clostridium spp. sulfito-réductrices dans les aliments pour animaux .18
Bibliographie .22
iii
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a
été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 9, Microbiologie, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 463, Microbiologie de la chaîne
alimentaire, du Comité européen de normalisation (CEN) conformément à l’Accord de coopération
technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette première édition de l’ISO 15213-1 annule et remplace l’ISO 15213:2003, qui a fait l’objet d’une
révision technique.
Les principales modifications sont les suivantes:
— le domaine d’application a été élargi pour inclure les échantillons prélevés au stade de la production
primaire;
— le domaine d’application de la méthode ne mentionne plus les «bactéries sulfito-réductrices» mais
les «bactéries Clostridium spp. sulfito-réductrices»; les colonies caractéristiques sur les boîtes de
gélose sulfite-fer (ISA) sont donc confirmées;
— la teneur en sulfite dans la gélose sulfite-fer a été réduite de 1,0 g/l à 0,5 g/l;
— le traitement thermique de 10 min à 80 °C a été rendu facultatif, il est appliqué si la flore annexe
est élevée ou pour le dénombrement uniquement des spores de bactéries Clostridium spp. sulfito-
réductrices dans l’échantillon;
— la possibilité d’utiliser des tubes pour l’ensemencement a été supprimée;
— la possibilité d’incuber les échantillons à 50 °C pour le dénombrement des bactéries sulfito-
réductrices thermophiles a été supprimée;
— une description de la méthode de confirmation des colonies caractéristiques a été ajoutée;
iv
— le logigramme à l’Annexe A qui donne une brève description du mode opératoire a été révisé;
— les caractéristiques de performances ont été ajoutées à l’Annexe C;
— l’Annexe D a été ajoutée pour fournir un protocole spécial pour le dénombrement des bactéries
Clostridium spp. sulfito-réductrices dans les aliments pour animaux.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 15213 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
v
Introduction
Les bactéries Clostridium spp. sulfito-réductrices sont des bactéries anaérobies strictes, Gram-positives,
en forme de bâtonnet, produisant des spores. Les espèces les plus connues de ce genre sont les suivantes:
Clostridium (C.) perfringens, C. bifermentans, C. sporogenes et C. botulinum. Certaines espèces peuvent
provoquer des intoxications alimentaires. Comme toutes les bactéries ubiquitaires, elles se trouvent
principalement dans l’environnement. Les espèces Clostridium sont présentes dans le sol et dans le tube
digestif des animaux et des humains.
Les bactéries Clostridium spp. sulfito-réductrices, y compris C. perfringens, sont couramment utilisées
en tant qu’indicateurs microbiens de contamination clostridienne lors de la fabrication d’aliments
(par exemple, la production de viande). Elles peuvent produire des spores thermorésistantes. En dehors
de l’industrie laitière, l’utilisation des bactéries Clostridium spp. sulfito-réductrices en tant qu’indicateur
microbien est limitée à un nombre relativement restreint d’aliments. Son application actuelle à des
aliments non laitiers est soit une indication de contamination fécale (notamment C. perfringens, voir
aussi l’ISO 15213-2 et l’ISO/TS 15213-3) et/ou un indicateur de contrôle d’hygiène/de procédés lié à la
croissance et à la survie potentielles de bactéries sporulées anaérobies.
Le présent document décrit la méthode horizontale pour le dénombrement des bactéries Clostridium spp.
sulfito-réductrices dans les aliments, les aliments pour animaux, les échantillons environnementaux
et les échantillons prélevés au stade de la production primaire. La méthode de dénombrement de
C. perfringens est décrite dans l’ISO 15213-2. La méthode de détection de C. perfringens est décrite dans
l’ISO/TS 15213-3. Ces trois parties sont publiées sous la forme d’une série de Normes internationales,
car les méthodes sont étroitement liées les unes aux autres. Ces méthodes sont souvent utilisées
conjointement dans un laboratoire et les milieux et leurs caractéristiques de performance peuvent être
similaires.
Les principales modifications techniques énumérées dans l’Avant-propos et introduites dans le présent
document par rapport à l’ISO 15213:2003 sont considérées comme des modifications significatives
(voir l’ISO 17468).
Ces modifications ont un impact majeur sur les caractéristiques de performance de la méthode.
vi
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.