ISO 15213-1:2023
(Main)Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Clostridium spp. — Part 1: Enumeration of sulfite-reducing Clostridium spp. by colony-count technique
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Clostridium spp. — Part 1: Enumeration of sulfite-reducing Clostridium spp. by colony-count technique
This document specifies the enumeration of sulfite-reducing Clostridium spp. by the colony-count technique. This document is applicable to: — products intended for human consumption; — products for feeding animals; — environmental samples in the area of food and feed production and handling; — samples from the primary production stage. NOTE This method has been validated in an interlaboratory study for the following food categories: — ready-to-eat, ready-to-reheat meat products; — eggs and egg products (derivates); — processed fruits and vegetables; — infant formula and infant cereals; — multi-component foods or meal components. It has also been validated for the following other categories: — pet food and animal feed; — environmental samples (food or feed production). As this method has been validated for at least five food categories, this method is applicable for a broad range of food. For detailed information on the validation, see Clause 11 and Annex C. Since the method is not commonly used for samples in the primary production stage, this category was not included in the interlaboratory study. Therefore, no performance characteristics were obtained for this category. This horizontal method was originally developed for the examination of all samples belonging to the food chain. Based on the information available at the time of publication of this document, this method is considered to be fully suited to the examination of all samples belonging to the food chain. However, because of the large variety of products in the food chain, it is possible that this horizontal method is not appropriate in every detail for all products. Nevertheless, it is expected that the required modifications are minimized so that they do not result in a significant deviation from this horizontal method. This technique is suitable for, but not limited to, the enumeration of microorganisms in test samples with a minimum of 10 colonies counted on a plate. This corresponds to a level of contamination that is expected to be higher than 10 cfu/ml for liquid samples or higher than 100 cfu/g for solid samples.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de Clostridium spp. — Partie 1: Dénombrement des bactéries Clostridium spp. sulfito-réductrices par la technique de comptage des colonies
Le présent document spécifie le dénombrement des bactéries Clostridium spp. sulfito-réductrices par la technique de comptage des colonies. Le présent document s’applique: — aux produits destinés à la consommation humaine; — aux produits destinés à l’alimentation animale; — aux échantillons environnementaux prélevés dans les secteurs de la production et de la distribution des aliments; et — aux échantillons prélevés au stade de la production primaire. NOTE Cette méthode a été validée dans le cadre d’une étude interlaboratoires pour les catégories d’aliments suivantes: — les produits à base de viande prêts à consommer et prêts à réchauffer; — les œufs et ovoproduits (dérivés); — les fruits et légumes transformés; — les préparations et céréales pour nourrissons; — les aliments composés ou les composants de repas. Elle a également été validée pour les catégories suivantes: — les produits destinés à l’alimentation animale et les aliments pour animaux; — les échantillons environnementaux (production d’aliments ou d’aliments pour animaux). Cette méthode ayant été validée pour au moins cinq catégories d’aliments, elle s’applique à un large éventail d’aliments. Pour des informations détaillées sur la validation, voir l’Article 11 et l’Annexe C. Étant donné que cette méthode n’est pas couramment utilisée pour les échantillons au stade de la production primaire, cette catégorie n’a pas été incluse dans l’étude interlaboratoires. Par conséquent, aucune caractéristique de performance n’a été déterminée pour cette catégorie. Cette méthode horizontale a été initialement développée pour l’examen de tous les échantillons provenant de la chaîne alimentaire. Sur la base des informations disponibles au moment de la publication du présent document, cette méthode est considérée comme parfaitement adaptée à l’examen de tous les échantillons provenant de la chaîne alimentaire. Cependant, en raison de la grande diversité des produits de la chaîne alimentaire, il est possible que cette méthode horizontale ne soit pas appropriée dans ses moindres détails à tous les produits. Néanmoins, il est attendu que les modifications requises soient réduites au minimum afin qu’elles n’entrainent pas de déviation significative de cette méthode horizontale. Cette technique est adaptée, sans toutefois s’y limiter, au dénombrement des micro-organismes dans les échantillons d’essai avec un minimum de 10 colonies dénombrées par boîte. Cela correspond à un niveau de contamination attendu supérieur à 10 UFC/ml pour les échantillons liquides ou supérieur à 100 UFC/g pour les échantillons solides.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 15213-1
First edition
2023-01
Microbiology of the food chain —
Horizontal method for the detection
and enumeration of Clostridium
spp. —
Part 1:
Enumeration of sulfite-reducing
Clostridium spp. by colony-count
technique
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour
la recherche et le dénombrement de Clostridium spp. —
Partie 1: Dénombrement des bactéries Clostridium spp. sulfito-
réductrices par la technique de comptage des colonies
Reference number
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be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on
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Website: www.iso.org
Published in Switzerland
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Contents Page
Foreword .iv
Introduction . vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 2
3 Terms and definitions . 2
4 Principle . 2
4.1 General . 2
4.2 Preparation of dilutions . 3
4.3 Enumeration . 3
4.4 Confirmation . 3
5 Culture media and reagents .3
6 Equipment and consumables .3
7 Sampling . 4
8 Preparation of test sample . 4
9 Procedure .5
9.1 General . 5
9.2 Test portion, initial suspension and dilutions . 5
9.3 Heat treatment to select spores . 5
9.4 Inoculation and incubation. 5
9.5 Enumeration of typical colonies . 6
9.6 Confirmation of sulfite-reducing Clostridium spp. . 6
10 Expression of results . 7
11 Validation of the method . 7
11.1 Interlaboratory study . 7
11.2 Performance characteristics . 7
12 Test report . 8
13 Quality assurance . 8
Annex A (normative) Flow diagram of the procedure . 9
Annex B (normative) Culture media and reagents .11
Annex C (informative) Performance characteristics of the method .14
Annex D (informative) Special protocol for the enumeration of sulfite-reducing
Clostridium spp. in feed .17
Bibliography .21
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ISO 15213-1:2023(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to
the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see
www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 463, Microbiology of the food chain, in accordance with the Agreement on technical
cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This first edition of ISO 15213-1 cancels and replaces ISO 15213:2003, which has been technically
revised.
The main changes are as follows:
— the Scope has been expanded to include samples from the primary production stage;
— the scope of the method has been changed from “sulfite-reducing bacteria” to “sulfite-reducing
Clostridium spp.”: therefore, typical colonies on the iron sulfite agar plates are confirmed;
— the concentration of sulfite in the iron sulfite agar has been reduced from 1,0 g/l to 0,5 g/l;
— the heat treatment of 10 min at 80 °C has been made optional, in the case of high background flora
or for the enumeration of only spores of sulfite-reducing Clostridium spp. present in the sample;
— the option for using tubes for inoculation has been removed;
— the option for incubating the samples at 50 °C for the enumeration of thermophilic sulfite-reducing
bacteria has been removed;
— a description of how the confirmation of typical colonies has to be performed has been added;
— the flow diagram in Annex A giving a short description of the procedure has been revised;
— in Annex C, the performance characteristics have been added;
— Annex D has been added to provide a special protocol for the enumeration of sulfite-reducing
Clostridium spp. in feed.
iv
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ISO 15213-1:2023(E)
A list of all parts in the ISO 15213 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body.
A complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
v
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ISO 15213-1:2023(E)
Introduction
Sulfite-reducing Clostridium spp. are obligate anaerobic, Gram-positive, spore-forming, rod-shaped
bacteria. The most important species which belong to this group are Clostridium (C.) perfringens,
C. bifermentans, C. sporogenes and C. botulinum. Some species can cause foodborne illness. As ubiquitous
bacteria they are predominantly found in nature. The Clostridium species inhabit soils and the intestinal
tract of animals and humans.
Sulfite-reducing Clostridium spp., including C. perfringens, are widely used as microbial indicators of
clostridial contamination in the manufacturing of foods (e.g. meat production). These have the capacity
to produce heat-resistant spores. Outside the dairy industry, the use of sulfite-reducing Clostridium
spp. as a microbial indicator is limited to a relatively small number of foods. Its current application
in non-dairy foods is either an indication of faecal contamination (especially C. perfringens, see also
ISO 15213-2 and ISO/TS 15213-3) and/or as an indicator of sanitation/process control related to
potential growth and survival of anaerobic spore-forming bacteria.
This document describes the horizontal method for the enumeration of sulfite-reducing Clostridium spp.
in food, feed, environmental samples and samples from the primary production stage. The method
for the enumeration of C. perfringens is described in ISO 15213-2. The method for the detection of
C. perfringens is described in ISO/TS 15213-3. These three parts are published as a series of International
Standards because the methods are closely linked to each other. These methods are often conducted in
association with each other in a laboratory, and the media and their performance characteristics can be
similar.
The main technical changes listed in the Foreword, introduced in this document compared with
ISO 15213:2003, are considered as major (see ISO 17468).
These changes have a major impact on the performance characteristics of the method.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 15213-1:2023(E)
Microbiology of the food chain — Horizontal method for
the detection and enumeration of Clostridium spp. —
Part 1:
Enumeration of sulfite-reducing Clostridium spp. by
colony-count technique
WARNING — In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that tests for
the enumeration of sulfite-reducing Clostridium spp. are only undertaken in properly equipped
laboratories, under the control of a skilled microbiologist, and that great care is taken in the
disposal of all incubated materials. Persons using this document should be familiar with normal
laboratory practice. This document does not purport to address all of the safety aspects, if any,
associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and
health practices.
1 Scope
This document specifies the enumeration of sulfite-reducing Clostridium spp. by the colony-count
technique.
This document is applicable to:
— products intended for human consumption;
— products for feeding animals;
— environmental samples in the area of food and feed production and handling;
— samples from the primary production stage.
NOTE This method has been validated in an interlaboratory study for the following food categories:
— ready-to-eat, ready-to-reheat meat products;
— eggs and egg products (derivates);
— processed fruits and vegetables;
— infant formula and infant cereals;
— multi-component foods or meal components.
It has also been validated for the following other categories:
— pet food and animal feed;
— environmental samples (food or feed production).
As this method has been validated for at least five food categories, this method is applicable for a broad range of
food. For detailed information on the validation, see Clause 11 and Annex C. Since the method is not commonly
used for samples in the primary production stage, this category was not included in the interlaboratory study.
Therefore, no performance characteristics were obtained for this category.
This horizontal method was originally developed for the examination of all samples belonging to the
food chain. Based on the information available at the time of publication of this document, this method
is considered to be fully suited to the examination of all samples belonging to the food chain. However,
because of the large variety of products in the food chain, it is possible that this horizontal method is not
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ISO 15213-1:2023(E)
appropriate in every detail for all products. Nevertheless, it is expected that the required modifications
are minimized so that they do not result in a significant deviation from this horizontal method.
This technique is suitable for, but not limited to, the enumeration of microorganisms in test samples
with a minimum of 10 colonies counted on a plate. This corresponds to a level of contamination that is
expected to be higher than 10 cfu/ml for liquid samples or higher than 100 cfu/g for solid samples.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 6887 (all parts), Microbiology of the food chain — Preparation of test samples, initial suspension and
decimal dilutions for microbiological examination
ISO 7218, Microbiology of the food chain — General requirements and guidance for microbiological
examinations
ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and
performance testing of culture media
ISO 19036:2019, Microbiology of the food chain — Estimation of measurement uncertainty for quantitative
determinations
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
sulfite-reducing Clostridium spp.
genus of microorganisms of the family of Clostridiaceae, usually capable of growth in/on iron sulfite
agar (ISA) under anaerobic conditions, forming typical or less typical colonies, and displaying certain
characteristics with biochemical confirmation tests
Note 1 to entry: The biochemical confirmation tests are described in 9.6.
3.2
enumeration of sulfite-reducing Clostridium spp.
determination of the number of colony-forming units (cfu) of sulfite-reducing Clostridium spp. (3.1)
bacteria per gram, per millilitre, per square centimetre or per sampling device when a specified test is
conducted
Note 1 to entry: Specified tests are given in Clause 9.
4 Principle
4.1 General
A specified quantity of the liquid test sample, or of an initial suspension in the case of other products,
is dispensed into an empty Petri dish and mixed well with a specified molten agar culture medium
to form a poured plate. Other plates are prepared under the same conditions using decimal dilutions
of the test sample. After solidification of the agar culture medium, an overlay is used to prevent the
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development of spreading colonies on the surface of the medium. If it is the intention to count only
spores, a heat treatment of 10 min at 80 °C needs to be performed before plating.
When the number of cfu is expected to be at or near the limit of determination, the use of duplicate
plates is preferable. If duplicate plates are used, the minimum for the sum of colonies on both plates
should be 10 colonies. In this case, the level of contamination is expected to be higher than 5 cfu/ml for
liquid samples or higher than 50 cfu/g for solid samples.
A pour-plate technique with overlay is especially suited for the enumeration of products expected to
contain spreading colonies that can obscure colonies of the target microorganisms.
The enumeration of sulfite-reducing Clostridium spp. requires four successive stages as specified in
Annex A.
4.2 Preparation of dilutions
For the preparation of decimal dilutions from the test portion, follow the procedure as specified in the
ISO 6887 series.
4.3 Enumeration
The plates are incubated under anaerobic conditions at 37 °C for 48 h. After incubation, the number
of typical colonies, which show black or grey to yellow-brown staining, are counted. The colour of the
colonies and the surrounding zone changes due to the formation of iron(II)sulfide as a result of the
reaction between sulfide ions and trivalent iron [Fe(III)] present in the medium.
4.4 Confirmation
Typical colonies are picked for confirmation.
NOTE When no confirmation is performed, the results can be reported as “anaerobic sulfite-reducing
bacteria”.
5 Culture media and reagents
Follow current laboratory practices in accordance with ISO 7218. The composition of culture media
and reagents and their preparation are specified in Annex B. For performance testing of culture media,
follow the procedures in accordance with ISO 11133 and Annex B.
6 Equipment and consumables
Disposable equipment is an acceptable alternative to reusable glassware if it has suitable specifications.
The usual microbiological laboratory equipment (see ISO 7218) and, in particular, the following shall be
used.
6.1 Appropriate apparatus for achieving an anaerobic atmosphere, a jar that can be hermetically
sealed or any other appropriate equipment which enables anaerobic atmosphere conditions to
be maintained for the total incubation time of the culture medium. Other systems of equivalent
performance, such as anaerobic cabinets, may be used. Follow the manufacturer’s instructions for
installation and maintenance.
The composition of the atmosphere required can be achieved by means of the addition of a gas mixture
(e.g. from a gas cylinder) after evacuation of air from the jar, by displacement of the atmosphere in
a cabinet or by any other appropriate means (such as commercially available gas packs). In general,
anaerobic incubation requires an atmosphere of less than 1 % volume fraction oxygen, 9 % volume
fraction to 13 % volume fraction carbon dioxide.
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ISO 15213-1:2023(E)
6.2 Apparatus for dry sterilization (oven) or wet sterilization (autoclave).
6.3 Incubator, capable of operating at 37 °C ± 1 °C.
6.4 pH-meter, having an accuracy of calibration of ± 0,1 pH unit at 25 °C.
6.5 Refrigerator, capable of operating at 5 °C ± 3 °C.
6.6 Sterile bottles, flasks or tubes, of appropriate capacity. Bottles, flasks or tubes with non-toxic
metallic or plastic screwcaps may be used.
6.7 Sterile graduated pipettes or automatic pipettes, of nominal capacities of 10 ml and 1 ml.
6.8 Sterile loops, of approximately 1 µl volume, or inoculation needle or wire.
6.9 Sterile Petri dishes, with a diameter of approximately 90 mm and (optional) large size (diameter
approximately 140 mm).
6.10 Thermostatically controlled water bath, capable of operating at 44 °C to 47 °C and 80 °C ± 2 °C.
7 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this document. Follow the specific International
Standard dealing with the product concerned. If there is no specific International Standard dealing
with the sampling of the product concerned, it is recommended that the parties concerned come to an
agreement on this subject.
Recommended sampling techniques are given in the following documents:
— ISO/TS 17728 for food and animal feed;
— ISO 707 for milk and milk products;
— ISO 6887-3 for raw molluscs, tunicates and echinoderms from primary production areas;
— ISO 13307 for primary production stage;
— ISO 17604 for carcasses;
— ISO 18593 for surfaces.
It is important that the laboratory receives a sample that is representative of the product under
consideration. The sample should not have been damaged or changed during transport or storage.
8 Preparation of test sample
Prepare the test sample from the laboratory sample in accordance with the specific International
Standard dealing with the product concerned. Follow the procedures as specified in the ISO 6887 series.
If there is no specific International Standard available, it is recommended that the parties concerned
come to an agreement on this subject.
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9 Procedure
9.1 General
A flow diagram of the procedure is given in Annex A.
9.2 Test portion, initial suspension and dilutions
Follow the procedures in accordance with the ISO 6887 series and the specific International Standard
dealing with the product concerned.
Prepare a single decimal dilution series from the test portion if the product is liquid, or from the initial
suspension in the case of other products.
A special protocol for preparing the initial suspension of feed samples is given in Annex D.
9.3 Heat treatment to select spores
If it is the intention to count only spores, heat the decimal dilution series to 80 °C in a water bath
(6.10) for 10 min ± 1 min. Heat treatment shall be given within 15 min after preparation of the initial
suspension to avoid germination of spores. If the tube is not placed in the water bath within 15 min, it
should be placed immediately in melting ice for a maximum of 2 h.
The temperature during heat treatment should be monitored by placing an appropriate thermometer in
a reference bottle of the same size as the sample bottle and containing the same volume of water at the
same initial temperature as the sample being treated (6.6). The tubes should not be hermetically sealed
during the heat treatment. The time taken to reach 80 °C shall not exceed 5 min and can be minimized
by ensuring the water level to be at least 4 cm above the level of the sample and equipping the water
bath with a circulating-water pump to maximize heat exchange.
Start the time of heating (10 min) when the temperature of the reference sample has reached 80 °C.
After heat treatment, the samples should be cooled immediately until approximately 20 °C.
Heat treatment should also reduce the competitive flora in some matrices containing a high level of
background flora (e.g. liquid whey, feed silage).
9.4 Inoculation and incubation
9.4.1 Take two sterile Petri dishes with a diameter of approximately 90 mm (6.9). Transfer to each
dish, by means of a sterile pipette (6.7), 1 ml of the test sample if liquid, or 1 ml of the initial suspension
−1
(10 dilution) in the case of other products. If plates from more than one dilution are prepared, this
may be reduced to one dish (see ISO 7218).
When, for certain products, it is necessary to estimate low numbers of sulfite-reducing Clostridium spp.,
the limit of enumeration may be lowered by a factor of 10 by examining 10 ml of the initial suspension
in three large (140 mm) Petri dishes (6.9).
9.4.2 Take one other sterile Petri dish (6.9). Use another sterile pipette (6.7) to dispense 1 ml of the
−1 −2
10 dilution (liquid product) or 1 ml of the 10 dilution (other products).
9.4.3 If necessary, repeat the procedure with further dilutions, using a new sterile pipette (6.7) for
each decimal dilution.
9.4.4 If appropriate and possible, select only the critical dilution steps (at least two consecutive
decimal dilutions) for the inoculation of the Petri dishes (6.9) that will give colony counts of between
10 and 150 colonies per plate (on 90 mm Petri dishes) or between 10 and 360 colonies per plate (on
140 mm Petri dishes).
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9.4.5 Pour about 12 ml to 15 ml for 90 mm Petri dishes or 45 ml to 50 ml for 140 mm Petri dishes of
the iron sulfite agar (ISA) medium (Clause B.2), molten and tempered at 44 °C to 47 °C (6.10), into each
Petri dish (6.9).
9.4.6 Carefully mix the inoculum with the medium by rotating the Petri dishes (6.9) and allow the
mixture to solidify by leaving the Petri dishes standing on a cool horizontal surface.
9.4.7 After complete solidification, pour about 5 ml of the ISA medium (Clause B.2) for 90 mm
Petri dishes (6.9) or 10 ml for 140 mm Petri dishes (6.9) as overlay, to prevent the development of
spreading colonies on the surface of the medium. Allow to solidify as specified in 9.4.6.
9.4.8 Invert the plates obtained in 9.4.7 and incubate the plates at 37 °C (6.3) in an anaerobic
atmosphere (6.1).
9.5 Enumeration of typical colonies
9.5.1 After 48 h ± 2 h of incubation, examine the plates (see 9.4.8) for presumptive sulfite-reducing
Clostridium spp.
Typical colonies, which show black or grey to yellow-brown staining on the ISA medium, are counted.
Upon removal of the plates from the anaerobic atmosphere, plates shall be counted within 30 min as
the colour of the colonies can rapidly fade and disappear upon exposure to oxygen. If anaerobic jars are
used, the plates should be checked jar by jar or in small portions if the incubation was performed in an
anaerobic incubator (6.1, 6.3).
NOTE Diffuse, unspecific blackening of the medium can occur. The growth of anaerobic bacteria, which
produce hydrogen (not H S), can also reduce the sulfite present and lead to a general blackening of the medium,
2
which makes enumeration of typical colonies difficult.
9.5.2 Select the plates (see 9.5.1) containing less than 150 presumptive colonies (for 90 mm
Petri d
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 15213-1
Première édition
2023-01
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Méthode horizontale
pour la recherche et le dénombrement
de Clostridium spp. —
Partie 1:
Dénombrement des bactéries
Clostridium spp. sulfito-réductrices
par la technique de comptage des
colonies
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the
detection and enumeration of Clostridium spp. —
Part 1: Enumeration of sulfite-reducing Clostridium spp. by colony-
count technique
Numéro de référence
ISO 15213-1:2023(F)
© ISO 2023
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ISO 15213-1:2023(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2023
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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Web: www.iso.org
Publié en Suisse
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction . vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives .2
3 Termes et définitions . 2
4 Principe. 3
4.1 Généralités . 3
4.2 Préparation des dilutions . 3
4.3 Dénombrement . 3
4.4 Confirmation . 3
5 Milieux de culture et réactifs .3
6 Équipement et consommables . 4
7 Échantillonnage .4
8 Préparation de l’échantillon pour essai . 5
9 Mode opératoire . 5
9.1 Généralités . 5
9.2 Prise d’essai, suspension mère et dilutions . 5
9.3 Traitement thermique pour la sélection des spores . 5
9.4 Ensemencement et incubation . . 6
9.5 Dénombrement des colonies caractéristiques . 6
9.6 Confirmation des bactéries Clostridium spp. sulfito-réductrices . 7
10 Expression des résultats . 7
11 Validation de la méthode . 8
11.1 Étude interlaboratoires . 8
11.2 Caractéristiques de performance . 8
12 Rapport d’essai . 9
13 Assurance qualité . 9
Annexe A (normative) Logigramme du mode opératoire .10
Annexe B (normative) Milieux de culture et réactifs .12
Annexe C (informative) Caractéristiques de performance de la méthode .15
Annexe D (informative) Protocole spécial pour le dénombrement des bactéries
Clostridium spp. sulfito-réductrices dans les aliments pour animaux .18
Bibliographie .22
iii
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ISO 15213-1:2023(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a
été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 9, Microbiologie, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 463, Microbiologie de la chaîne
alimentaire, du Comité européen de normalisation (CEN) conformément à l’Accord de coopération
technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette première édition de l’ISO 15213-1 annule et remplace l’ISO 15213:2003, qui a fait l’objet d’une
révision technique.
Les principales modifications sont les suivantes:
— le domaine d’application a été élargi pour inclure les échantillons prélevés au stade de la production
primaire;
— le domaine d’application de la méthode ne mentionne plus les «bactéries sulfito-réductrices» mais
les «bactéries Clostridium spp. sulfito-réductrices»; les colonies caractéristiques sur les boîtes de
gélose sulfite-fer (ISA) sont donc confirmées;
— la teneur en sulfite dans la gélose sulfite-fer a été réduite de 1,0 g/l à 0,5 g/l;
— le traitement thermique de 10 min à 80 °C a été rendu facultatif, il est appliqué si la flore annexe
est élevée ou pour le dénombrement uniquement des spores de bactéries Clostridium spp. sulfito-
réductrices dans l’échantillon;
— la possibilité d’utiliser des tubes pour l’ensemencement a été supprimée;
— la possibilité d’incuber les échantillons à 50 °C pour le dénombrement des bactéries sulfito-
réductrices thermophiles a été supprimée;
— une description de la méthode de confirmation des colonies caractéristiques a été ajoutée;
iv
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ISO 15213-1:2023(F)
— le logigramme à l’Annexe A qui donne une brève description du mode opératoire a été révisé;
— les caractéristiques de performances ont été ajoutées à l’Annexe C;
— l’Annexe D a été ajoutée pour fournir un protocole spécial pour le dénombrement des bactéries
Clostridium spp. sulfito-réductrices dans les aliments pour animaux.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 15213 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
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ISO 15213-1:2023(F)
Introduction
Les bactéries Clostridium spp. sulfito-réductrices sont des bactéries anaérobies strictes, Gram-positives,
en forme de bâtonnet, produisant des spores. Les espèces les plus connues de ce genre sont les suivantes:
Clostridium (C.) perfringens, C. bifermentans, C. sporogenes et C. botulinum. Certaines espèces peuvent
provoquer des intoxications alimentaires. Comme toutes les bactéries ubiquitaires, elles se trouvent
principalement dans l’environnement. Les espèces Clostridium sont présentes dans le sol et dans le tube
digestif des animaux et des humains.
Les bactéries Clostridium spp. sulfito-réductrices, y compris C. perfringens, sont couramment utilisées
en tant qu’indicateurs microbiens de contamination clostridienne lors de la fabrication d’aliments
(par exemple, la production de viande). Elles peuvent produire des spores thermorésistantes. En dehors
de l’industrie laitière, l’utilisation des bactéries Clostridium spp. sulfito-réductrices en tant qu’indicateur
microbien est limitée à un nombre relativement restreint d’aliments. Son application actuelle à des
aliments non laitiers est soit une indication de contamination fécale (notamment C. perfringens, voir
aussi l’ISO 15213-2 et l’ISO/TS 15213-3) et/ou un indicateur de contrôle d’hygiène/de procédés lié à la
croissance et à la survie potentielles de bactéries sporulées anaérobies.
Le présent document décrit la méthode horizontale pour le dénombrement des bactéries Clostridium spp.
sulfito-réductrices dans les aliments, les aliments pour animaux, les échantillons environnementaux
et les échantillons prélevés au stade de la production primaire. La méthode de dénombrement de
C. perfringens est décrite dans l’ISO 15213-2. La méthode de détection de C. perfringens est décrite dans
l’ISO/TS 15213-3. Ces trois parties sont publiées sous la forme d’une série de Normes internationales,
car les méthodes sont étroitement liées les unes aux autres. Ces méthodes sont souvent utilisées
conjointement dans un laboratoire et les milieux et leurs caractéristiques de performance peuvent être
similaires.
Les principales modifications techniques énumérées dans l’Avant-propos et introduites dans le présent
document par rapport à l’ISO 15213:2003 sont considérées comme des modifications significatives
(voir l’ISO 17468).
Ces modifications ont un impact majeur sur les caractéristiques de performance de la méthode.
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NORME INTERNATIONALE ISO 15213-1:2023(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode
horizontale pour la recherche et le dénombrement de
Clostridium spp. —
Partie 1:
Dénombrement des bactéries Clostridium spp. sulfito-
réductrices par la technique de comptage des colonies
AVERTISSEMENT — Afin de préserver la santé du personnel de laboratoire, il est essentiel que
les essais de dénombrement des bactéries Clostridium spp. sulfito-réductrices ne soient effectués
que dans des laboratoires correctement équipés, sous la surveillance d’un microbiologiste
expérimenté, et qu’un grand soin soit apporté à l’élimination de tous les matériaux incubés.
Il convient que les utilisateurs du présent document connaissent les pratiques de laboratoire
normales. Le présent document ne prétend pas couvrir la totalité des aspects liés à la sécurité
qui pourraient découler de son utilisation. Il incombe à l’utilisateur de mettre en place des
pratiques de santé et de sécurité appropriées.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie le dénombrement des bactéries Clostridium spp. sulfito-réductrices par la
technique de comptage des colonies.
Le présent document s’applique:
— aux produits destinés à la consommation humaine;
— aux produits destinés à l’alimentation animale;
— aux échantillons environnementaux prélevés dans les secteurs de la production et de la distribution
des aliments; et
— aux échantillons prélevés au stade de la production primaire.
NOTE Cette méthode a été validée dans le cadre d’une étude interlaboratoires pour les catégories d’aliments
suivantes:
— les produits à base de viande prêts à consommer et prêts à réchauffer;
— les œufs et ovoproduits (dérivés);
— les fruits et légumes transformés;
— les préparations et céréales pour nourrissons;
— les aliments composés ou les composants de repas.
Elle a également été validée pour les catégories suivantes:
— les produits destinés à l’alimentation animale et les aliments pour animaux;
— les échantillons environnementaux (production d’aliments ou d’aliments pour animaux).
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ISO 15213-1:2023(F)
Cette méthode ayant été validée pour au moins cinq catégories d’aliments, elle s’applique à un large éventail
d’aliments. Pour des informations détaillées sur la validation, voir l’Article 11 et l’Annexe C. Étant donné que cette
méthode n’est pas couramment utilisée pour les échantillons au stade de la production primaire, cette catégorie
n’a pas été incluse dans l’étude interlaboratoires. Par conséquent, aucune caractéristique de performance n’a été
déterminée pour cette catégorie.
Cette méthode horizontale a été initialement développée pour l’examen de tous les échantillons
provenant de la chaîne alimentaire. Sur la base des informations disponibles au moment de la publication
du présent document, cette méthode est considérée comme parfaitement adaptée à l’examen de tous
les échantillons provenant de la chaîne alimentaire. Cependant, en raison de la grande diversité des
produits de la chaîne alimentaire, il est possible que cette méthode horizontale ne soit pas appropriée
dans ses moindres détails à tous les produits. Néanmoins, il est attendu que les modifications requises
soient réduites au minimum afin qu’elles n’entrainent pas de déviation significative de cette méthode
horizontale.
Cette technique est adaptée, sans toutefois s’y limiter, au dénombrement des micro-organismes dans
les échantillons d’essai avec un minimum de 10 colonies dénombrées par boîte. Cela correspond à un
niveau de contamination attendu supérieur à 10 UFC/ml pour les échantillons liquides ou supérieur
à 100 UFC/g pour les échantillons solides.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie de la chaîne alimentaire — Préparation des échantillons, de la
suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Exigences générales et recommandations pour les
examens microbiologiques
ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l'eau — Préparation, production,
stockage et essais de performance des milieux de culture
ISO 19036:2019, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Estimation de l'incertitude de mesure pour les
déterminations quantitatives
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
bactéries Clostridium spp. sulfito-réductrices
genre de micro-organismes de la famille des Clostridiaceae, généralement capables de croître dans/
sur la gélose sulfite-fer (ISA) dans des conditions anaérobies, formant des colonies plus ou moins
caractéristiques et présentant certaines propriétés lors d’essais de confirmation biochimique
Note 1 à l'article: Les essais de confirmation biochimique sont décrits en 9.6.
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ISO 15213-1:2023(F)
3.2
dénombrement des bactéries Clostridium spp. sulfito-réductrices
détermination du nombre d’unités formant colonies (UFC) de bactéries Clostridium spp. sulfito-
réductrices (3.1) par gramme, par millilitre, par centimètre carré ou par dispositif d’échantillonnage,
lors de l’essai spécifié
Note 1 à l'article: Les essais spécifiés sont décrits à l’Article 9.
4 Principe
4.1 Généralités
Une quantité déterminée de l’échantillon d’essai liquide, ou de la suspension mère dans le cas d’autres
produits, est déposée dans une boîte de Petri vide et bien mélangée à un milieu de culture gélosé fondu
spécifié, constituant ainsi une boîte coulée. D’autres boîtes sont préparées dans les mêmes conditions
à partir de dilutions décimales de l’échantillon pour essai. Après solidification du milieu de culture
gélosé, une surcouche est utilisée afin de prévenir le développement des colonies à la surface du milieu.
Si l’objectif est de ne dénombrer que les spores, un traitement thermique de 10 min à 80 °C doit être
effectué avant la mise en culture.
Lorsqu’il est attendu que le nombre d’UFC soit au niveau ou proche de la limite de détection, il est
préférable d’utiliser des boîtes en double exemplaire. En cas d’utilisation de boîtes en double exemplaire,
il convient que la somme des colonies sur les deux boîtes soit au minimum égale à 10. Dans ce cas, il est
attendu que le niveau de contamination soit supérieur à 5 UFC/ml pour les échantillons liquides ou
supérieur à 50 UFC/g pour les échantillons solides.
La technique d’ensemencement en profondeur avec une surcouche est particulièrement appropriée
pour le dénombrement de produits susceptibles de contenir des colonies envahissantes et qui peuvent
masquer les colonies des micro-organismes cibles.
Le dénombrement des bactéries Clostridium spp. sulfito-réductrices exige de suivre quatre étapes
successives comme précisé à l’Annexe A.
4.2 Préparation des dilutions
Pour la préparation des dilutions décimales à partir des prises d’essai, suivre le mode opératoire
spécifié dans la série ISO 6887.
4.3 Dénombrement
Les boîtes sont incubées dans des conditions anaérobies à 37 °C pendant 48 h. Après incubation,
le nombre de colonies caractéristiques, présentant une coloration noire ou grise à jaune-brun, est
calculé. La couleur des colonies et de la zone environnante change en raison de la formation de sulfure
de fer(II) à la suite de la réaction entre les ions sulfure et le fer trivalent [Fe(III)] présents dans le milieu.
4.4 Confirmation
Les colonies caractéristiques sont prélevées pour confirmation.
NOTE Si aucune confirmation n’est effectuée, les résultats peuvent être consignés sous la mention «bactéries
anaérobies sulfito-réductrices».
5 Milieux de culture et réactifs
Suivre les pratiques courantes de laboratoire conformément à l’ISO 7218. La composition des milieux de
culture et des réactifs et leur préparation sont spécifiées à l’Annexe B. Pour les essais de performance
des milieux de culture, suivre les modes opératoires conformément à l’Annexe B et à l’ISO 11133.
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ISO 15213-1:2023(F)
6 Équipement et consommables
Le matériel à usage unique est une alternative acceptable à la verrerie réutilisable, à condition que ses
spécifications soient appropriées. Le matériel courant de laboratoire de microbiologie (voir l’ISO 7218)
et, en particulier, ce qui suit doit être utilisé.
6.1 Appareillage approprié pour créer une anaérobiose, jarre à fermeture étanche ou tout autre
appareillage approprié permettant d’obtenir et de maintenir des conditions d’anaérobiose pendant
toute la durée de l’incubation du milieu de culture. D’autres systèmes de performances équivalentes,
tels que les chambres d’anaérobie, peuvent être utilisés. Suivre les instructions du fabricant pour
l’installation et l’entretien.
La composition de l’atmosphère requise peut être obtenue par addition d’un mélange gazeux (par
exemple d’une bouteille de gaz) après évacuation de l’air de la jarre, par déplacement de l’atmosphère
dans une chambre d’anaérobie ou par tout autre moyen approprié (par exemple les systèmes gazeux
disponibles dans le commerce). En règle générale, l’incubation anaérobie nécessite une atmosphère
contenant moins de 1 % (fraction volumique) d’oxygène, entre 9 % et 13 % (fraction volumique) de
dioxyde de carbone.
6.2 Appareil pour la stérilisation en chaleur sèche (four) ou en chaleur humide (autoclave).
6.3 Étuve, réglable à 37 °C ± 1 °C.
6.4 pH-mètre, ayant une exactitude d’étalonnage de ± 0,1 unité de pH à 25 °C.
6.5 Réfrigérateur, réglable à 5 °C ± 3 °C.
6.6 Flacons, fioles ou tubes stériles d’une capacité appropriée. Des flacons, fioles ou tubes avec
capuchons à vis en métal ou en plastique non toxique peuvent être utilisés.
6.7 Pipettes graduées ou pipettes automatiques stériles, de capacités nominales 10 ml et 1 ml.
6.8 Anses stériles, d’environ 1 µl de volume, ou aiguille ou fil à ensemencer.
6.9 Boîtes de Petri stériles, d’environ 90 mm de diamètre et (facultatif) de grandes dimensions
(environ 140 mm de diamètre).
6.10 Bain-marie à régulation thermostatique, réglable à une température comprise entre 44 °C et
47 °C et à une température de 80 °C ± 2 °C.
7 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document. Suivre la Norme
internationale spécifique du produit concerné. S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique
traitant de l’échantillonnage du produit concerné, il est recommandé que les parties concernées
parviennent à un accord sur ce sujet.
Des techniques d’échantillonnage recommandées sont décrites dans les documents suivants:
— l’ISO/TS 17728 pour les aliments et les aliments pour animaux;
— l’ISO 707 pour le lait et les produits laitiers;
— l’ISO 6887-3 pour les mollusques crus, les tuniciers et les échinodermes de zones de production
primaire;
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ISO 15213-1:2023(F)
— l’ISO 13307 pour le stade de la production primaire;
— l’ISO 17604 pour les carcasses;
— l’ISO 18593 pour les surfaces.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon représentatif du produit étudié. Il convient
que l’échantillon n’ait pas été endommagé ni modifié au cours du transport ou du stockage.
8 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l’échantillon pour essai à partir de l’échantillon de laboratoire, conformément à la Norme
internationale spécifique du produit concerné. Suivre les modes opératoires spécifiés dans la série
ISO 6887. S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique, il est recommandé que les parties
concernées s’accordent sur ce sujet.
9 Mode opératoire
9.1 Généralités
Un logigramme du mode opératoire est présenté à l’Annexe A.
9.2 Prise d’essai, suspension mère et dilutions
Suivre les modes opératoires conformément à la série ISO 6887 et à la Norme internationale spécifique
du produit concerné.
Préparer une seule série de dilutions décimales à partir de la prise d’essai si le produit est liquide et à
partir de la suspension mère dans le cas des autres produits.
Un protocole spécial pour la préparation de la suspension mère des échantillons d’aliments pour
animaux est donné à l’Annexe D.
9.3 Traitement thermique pour la sélection des spores
S’il ne s’agit que de dénombrer les spores, chauffer la série de dilutions décimales à 80 °C au bain-marie
(6.10) pendant 10 min ± 1 min. Le traitement thermique doit être effectué dans les 15 min suivant la
préparation de la suspension mère afin d’éviter toute germination des spores. Si le tube n’est pas placé
dans le bain-marie dans les 15 min, il convient de le placer immédiatement dans un bac à glace pendant
2 h au maximum.
Durant le traitement thermique, il convient de surveiller la température en plaçant un thermomètre
adapté dans un flacon de référence de taille identique au flacon de l’échantillon et contenant le même
volume d’eau à la même température initiale que l’échantillon traité (6.6). Il convient de ne pas fermer
hermétiquement les tubes durant le traitement thermique. Le temps nécessaire pour atteindre 80 °C
ne doit pas dépasser 5 min et peut être réduit au minimum en veillant à ce que le niveau d’eau arrive au
moins 4 cm au-dessus du niveau de l’échantillon et que le bain-marie soit équipé d’une pompe faisant
circuler l’eau pour maximiser l’échange thermique.
Commencer le temps de chauffage (10 min) lorsque la température de l’échantillon de référence atteint
80 °C. Après le traitement thermique, il convient que les échantillons soient refroidis immédiatement
jusqu’à environ 20 °C.
Il convient que le traitement thermique réduise également la flore compétitive dans certaines matrices
contenant un niveau élevé de flore annexe (par exemple, le lactosérum liquide, l’ensilage).
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ISO 15213-1:2023(F)
9.4 Ensemencement et incubation
9.4.1 Prendre deux boîtes de Petri stériles d’environ 90 mm de diamètre (6.9). Au moyen d’une pipette
stérile (6.7), transférer dans chaque boîte 1 ml d’échantillon pour essai si le produit est liquide, ou 1 ml
−1
de la suspension mère
...
Questions, Comments and Discussion
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