ISO 11267:1999
(Main)Soil quality — Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida) by soil pollutants
Soil quality — Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida) by soil pollutants
Qualité du sol — Inhibition de la reproduction de Collembola (Folsomia candida) par des polluants du sol
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11267
First edition
1999-04-01
Soil quality — Inhibition of reproduction of
Collembola (Folsomia candida) by soil
pollutants
Qualité du sol — Inhibition de la reproduction de Collembola (Folsomia
candida) par des polluants du sol
A
Reference number
ISO 11267:1999(E)
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ISO 11267:1999(E)
Contents
1 Scope .1
2 Normative references .1
3 Terms and definitions .1
4 Principle.2
5 Reagents.2
6 Apparatus .3
7 Procedure .3
8 Calculation and expression of results.5
9 Validity of the test.6
10 Test report .7
Annex A (informative) Techniques for rearing and breeding of Collembola.8
Annex B (informative) Techniques for counting juvenile springtails .11
Annex C (informative) Determination of water-holding capacity of artificial soil.12
Annex D (informative) Guidance on adjustment of pH of artificial soil .13
Annex E (informative) Determination of effects of contaminated soil on Collembola reproduction.14
Bibliography.16
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or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from the publisher.
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Printed in Switzerland
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ISO 11267:1999(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
International Standard ISO 11267 was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee
SC 4, Biological methods.
Annexes A to E of this International Standard are for information only.
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Introduction
This International Standard describes a method for testing the effects of chemicals on the reproduction of
Collembola in artificial soil. It can be adapted for use for testing or comparing soils to assess, for example, the
effects of remediation treatments, and for assessing sublethal effects and no-effect levels for pesticides or other
added chemicals.
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INTERNATIONAL STANDARD © ISO ISO 11267:1999(E)
Soil quality — Inhibition of reproduction of Collembola
Folsomia candida
( ) by soil pollutants
1 Scope
This International Standard describes a method for determining the effects of substances on the reproduction of
Folsomia candida by dermal and alimentary uptake in a defined artificial soil substrate.
The method is not applicable to volatile substances, i.e. substances for which H (Henry's constant) or the air/water
partition coefficient is greater than 1, or for which the vapour pressure exceeds 0,013 3 Pa at 25 °C.
NOTE 1 The stability of the test substance cannot be assured over the test period. No allowance is made in the test method
described for possible degradation of the test substance over the course of the experiment.
NOTE 2 Recommendations for adapting the method for comparing or monitoring soil quality are given in annex E.
2 Normative references
The following normative documents contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this International Standard. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, any of these
publications do not apply. However, parties to agreements based on this International Standard are encouraged to
investigate the possibility of applying the most recent editions of the normative documents indicated below. For
undated references, the latest edition of the normative document referred to applies. Members of ISO and IEC
maintain registers of currently valid International Standards.
ISO 10390:1994, Soil quality — Determination of pH.
ISO 11268-1:1993, Soil quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) — Part 1: Determination of
acute toxicity using artificial soil substrate.
ISO 11274, Soil quality — Determination of the water retention characteristic — Laboratory methods.
3 Terms and definitions
For the purposes of this International Standard, the following terms and definitions apply.
3.1
LOEC
lowest observed effect concentration
lowest concentration of the test substance which is observed to have a significant effect when compared with the
control
NOTE All test concentrations above the LOEC have a harmful effect equal to, or greater than that observed at the LOEC.
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3.2
NOEC
no observed effect concentration
highest tested concentration of a test substance at which no lethal or other effect (such as mass alteration) is
observed
3.3
EC10
concentration estimated to reduce the reproduction rate at the end of the test by 10 % compared to the control
NOTE All effect concentrations are expressed as mass of test substance per dry mass of the test substrate (5.2.1).
3.4
EC50
concentration estimated to reduce the reproduction rate at the end of the test by 50 % compared to the control
NOTE All effect concentrations are expressed as mass of test substance per dry mass of the test substrate (5.2).
3.5
reproduction
increase in the mean numbers of offspring in each test vessel after 28 days incubation under the specified test
conditions
4 Principle
The effects of different concentrations of test substance on the reproduction of 10- to 12-day old springtails
(Folsomia candida) in a defined artificial substrate are determined. The springtails are incubated until offspring (F )
1
emerge from eggs laid by mature adults, and the number of offspring are determined. Normally offspring emerge
after 28 days in control experiments.
5 Reagents
5.1 Biological material.
In this test, 10- to 12-day old juvenile springtails of the species Folsomia candida (Willem) are used (see A.1. for
details on synchronization of breeding).
5.2 Test substrate, consisting of the wet basic soil substrate (defined artificial soil in accordance with
ISO 11268-1) the test substance and deionized water.
5.2.1 Soil substrate.
Component Dry mass fraction
Sphagnum peat, air-dried, finely ground and with no 10 %
visible plant remains
Kaolinite clay (air-dry) containing not less than 30 % 20 %
kaolinite
Industrial quartz sand (air dried, and predominantly fine 70 %
sand with more than 50 % of particle size 0,05 mm to
0,2 mm)
Add sufficient (usually 0,5 % to 1 %) calcium carbonate (CaCO ), pulverized and of recognized analytical grade, to
3
bring the pH (as measured in 1 mol/l KCl solution) to 6,0 ± 0,5 at the start of the test. The pH shall be determined in
accordance with ISO 10390.
NOTE 1 The amount of calcium carbonate required will depend on the components of the soil substrate and should be
determined by measurements on subsamples (see annex D) immediately before the test.
2
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The dry constituents are blended in the correct proportions and mixed thoroughly in a large-scale laboratory mixer
or a household mixer. A portion of the deionized water required is added while mixing is continued. This is the basic
soil substrate. The overall water content of the test and control substrates respectively should be adjusted to give
the substrate a crumbly structure to enable springtails to penetrate substrate cavities. This is normally at a water
content of 40 % to 60 % of the total water-holding capacity determined in accordance with ISO 11274, or with the
method given in annex C. Water content and pH are determined before the start of the test and at the end of the
test for the control and for each concentration tested.
NOTE 2 Allowance should be made for any water or quartz sand used for introducing the test substance into the soil.
5.2.2 Control substrate, consisting of the basic substrate and deionized water. If the preparation of the test
requires the use of an auxiliary agent, then an additional control will be necessary.
5.3 Reference substance.
To ensure the quality of the test system, tests should be performed regularly (once or twice a year) with a reference
substance.
The agricultural chemicals Betanal plus (a.i. 160 g/l Phenmedipham) and E 605 forte (a.i. 507,5 g/l Parathion) have
been tested in a ring test, and are recommended as reference substances.
WARNING — When handling these chemicals, appropriate precautions should be taken to avoid ingestion
or skin contact.
NOTE Betanal plus: Effects on reproduction (α = 0,05) were observed at concentrations of between 100 mg and 200 mg of the
product per kilogram dry mass of the substrate.
E 605 forte: Effects on mortality and reproduction were observed at concentrations of between 0,18 mg and 0,32 mg product
and between 0,1 mg and 0,18 mg product per kilogram dry mass of the substrate respectively.
6 Apparatus
Standard laboratory equipment, and:
6.1 Glass containers (able to be closed tightly) of about 100 ml capacity and with a diameter of about 5 cm.
6.2 Apparatus capable of measuring pH and water content of the substrate.
6.3 Exhaustor for transfer of springtails (see A.2).
6.4 Enclosure, capable of being controlled to a temperature of 20 °C ± 2 °C.
6.5 Light source, capable of delivering a constant light intensity of 400 lx to 800 lx at the substrate surface at a
controlled light:dark cycle of between 12 h:12 h and 16 h: 8 h.
7 Procedure
7.1 Preparation of the test
7.1.1 Test concentrations
a) NOEC approach:
4
At least five concentrations in a geometric series at a factor not exceeding 2 (e.g. 10 ∼ 1,8) should be selected
to give an estimation of the LOEC/NOEC of the reproduction rate.
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b) ECx approach:
For the ECx approach, a higher number of concentrations should be used (e.g. 12), and each tested with two
replicates. The spacing of concentrations may be variable (i.e. smaller at low concentrations, and larger at high
concentrations).
The concentrations of the test substance shall be expressed as mass of substance per dry mass of soil substrate
(mg/kg) (see 5.2).
If no other relevant toxicity data are available, the concentrations selected to provide the LOEC/NOEC or EC10 will
be based on the results of a preliminary test (see 7.2).
7.1.2 Introduction of the test substance
7.1.2.1 Water-soluble substances
Immediately before starting the test, dissolve the quantity of test substance in the water required for the replicates of
one concentration (or that portion of it necessary to wet the soil substrate in order to meet the requirements of
5.2.1), and mix it thoroughly with the basic soil substrate before introducing it into the test containers.
Continue as described in 7.1.3.
7.1.2.2 Substances insoluble in water but soluble in organic solvents
Dissolve the quantity of test substance required to obtain the desired concentration in a volatile solvent (such as
acetone or hexane) and mix it with a portion of the quartz sand required. After having evaporated the solvent by
placing the container in a fume hood, add the remainder of the basic substrate (allowing for the amount of sand
used to prepare the test substance) and the water, and mix thoroughly before introducing it into the test containers.
Continue as described in 7.1.3.
NOTE Ultrasonic dispersion, organic solvents, emulsifiers or dispersants may be used to disperse substances with low
aqueous solubility. When such auxiliary substances are used, all test concentrations and an additional control should contain
the same minimum amount of auxiliary substance.
WARNING — Appropriate precautions should be taken when dealing with solvent vapour to avoid danger
from inhalation or explosion, and to avoid damage to extraction equipment, pumps etc.
7.1.2.3 Substances insoluble in water or organic solvents
For a substance insoluble in a volatile solvent, prepare a mixture of 10 g of finely ground industrial quartz sand (see
5.2) and the quantity of the test substance required to obtain the desired concentration. Add the remainder of the
basic substrate (allowing for the amount of sand used to prepare the test substance) and the water, and mix it
thoroughly before introducing it into the test containers.
Continue as described in 7.1.3.
7.1.3 Introduction of the test organisms
Ten juvenile springtails (10 to 12 days old) are placed in each test container.
Springtails are tapped or sucked from the breeding containers to transfer them to the test containers. This can
easily be done using an exhaustor as described in clause A.2. Before they are transferred to the test containers,
organisms are counted and checked for damage both to reduce control mortality and to avoid systematic trial errors.
7.1.4 Control container
Prepare control containers in the same way as test containers, but without addition of the test substance. If the
preparation of the test requires the use of auxiliary substances (see 7.1.2.2), use additional control containers. Treat
these containers in the same way as those without the test substance.
4
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7.2 Preliminary test (optional)
If it is necessary to determine the range of concentrations to be used in the final test, perform a preliminary acute
test to determine mortality, using four concentrations of the test substance and a control (e.g. 0 mg/kg, 1 mg/kg,
10 mg/kg, 100 mg/kg and 1 000 mg/kg). Use 10 specimens of 10- to 12-day old springtails per concentration and
per container. Prepare the test containers as indicated in 7.1.2. Place the test containers in the test enclosure (6.4)
with the light source (6.5).
At the beginning of the test, add about 2 mg of granulated dry yeast to each test container, and cover the containers
tightly (e.g. using plastic, glass discs or parafilm). Open the test containers briefly twice a week to allow aeration.
After 14 days, count the live springtails in each container, and determine the percentage mortality for each test
substance concentration. Also observe surviving springtails and record any symptoms. Due to the rapid degradation
of dead springtails, missing springtails are assumed to have died during the test period.
NOTE To obtain additional information for the determination of the concentration range for the final test, the test period can
be extended to four weeks to allow qualitative determination of effects at concentrations at which effects on reproduction could
be expected.
7.3 Final test
The concentrations selected for use in the test will be based on the results of the preliminary test, or on other
toxicity data. Substances do not need to be tested at concentrations higher than 1 000 mg/kg dry mass of test
substrate.
After mixing the test substance (see 7.1.2) into the test substrate for one concentration, each test container
(replicate) is filled with 30 g wet mass of the test substrate. To ensure easy migration of springtails, the substrate in
the test container should not be compressed.
For each concentration and control five replicates are prepared. If the ECx approach is applied prepare at least two
replicates for the selected concentrations and five for the control. To facilitate checking of the pH and humidity of the
test substrate, use of additional containers for each concentration and for the control is recommended.
At the beginning of the test and after a period of 14 days, add about 2 mg of granulated dry yeast to each test
container, and cover the containers tightly (e.g. using plastic, glass discs or parafilm). Open the test containers
briefly twice a week to allow aeration.
Determine the water content and the pH (in the presence of 1 mol/l KCl) of the artificial soil at the beginning and end
of the test. When acidic or basic substances are tested, do not adjust the pH.
After two weeks, check the water content by reweighing the additional test containers, and compensate for water
loss if it exceeds 2 % of the initial water content.
7.4 Determination of surviving springtails
Determine the number of springtails present four weeks after introducing the
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 11267
Première édition
1999-04-01
Qualité du sol — Inhibition de la
reproduction de Collembola (Folsomia
candida) par des polluants du sol
Soil quality — Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida)
by soil pollutants
A
Numéro de référence
ISO 11267:1999(F)
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ISO 11267:1999(F)
Contents
1 Domaine d'application.1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions.1
4 Principe.2
5 Réactifs.2
6 Appareillage .3
7 Mode opératoire.4
8 Calcul et expression des résultats.6
9 Validité de l'essai .7
10 Rapport d'essai .7
Annexe A (informative) Techniques de culture et d'élevage des collemboles .8
Annexe B (informative) Techniques de dénombrement des collemboles juvéniles .11
Annexe C (informative) Détermination de la capacité de rétention d'eau du sol artificiel.12
Annexe D (informative) Orientations sur l'ajustement du pH du sol artificiel.13
Annexe E (informative) Détermination des effets du sol contaminé sur la reproduction des collemboles.14
Bibliographie.16
© ISO 1999
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque
forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit de l'éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 • CH-1211 Genève 20 • Suisse
Internet iso@iso.ch
Imprimé en Suisse
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Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 3.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
La Norme internationale ISO 11267 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité
SC 4, Méthodes biologiques.
Les annexes A à E de la présente Norme internationale sont données uniquement à titre d'information.
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Introduction
La présente Norme internationale décrit une méthode de détermination des effets des produits chimiques sur la
reproduction des collemboles dans un sol artificiel. Elle peut être adaptée pour la détermination et la comparaison
des sols, dans le but, par exemple, d'évaluer les effets de traitements curatifs, les effets sublétaux et les niveaux
sans effet des pesticides ou de tout autre produit chimique ajouté sur les sols.
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NORME INTERNATIONALE © ISO ISO 11267:1999(F)
Qualité du sol — Inhibition de la reproduction de
Collembola Folsomia candida
( ) par des polluants du sol
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale décrit une méthode de détermination des effets de substances sur la reproduction
des Folsomia candida par absorption cutanée et alimentaire dans un substrat de sol artificiel défini.
Cette méthode n'est pas applicable aux substances volatiles, c'est-à-dire les substances pour lesquelles H (la
constante de Henry) ou le coefficient de partage air/eau est supérieur à 1, ou bien les substances pour lesquelles la
pression de la vapeur est supérieure à 0,013 3 Pa à 25 °C.
NOTE 1 La stabilité de la substance d'essai ne peut être garantie sur toute la période d'essai. La méthode d'essai décrite ne
tient pas compte de la dégradation éventuelle de la substance d'essai.
NOTE 2 Les recommandations concernant l'adaptation de cette méthode à la comparaison ou à la surveillance de la qualité
des sols sont données à l'annexe E.
2 Références normatives
Les documents normatifs suivants contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui y est faite,
constituent des dispositions valables pour la présente Norme internationale. Pour les références datées, les
amendements ultérieurs ou les révisions de ces publications ne s'appliquent pas. Toutefois, les parties prenantes
aux accords fondés sur la présente Norme internationale sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer les
éditions les plus récentes des documents normatifs indiqués ci-après. Pour les références non datées, la dernière
édition du document normatif en référence s'applique. Les membres de l'ISO et de la CEI possèdent le registre des
Normes internationales en vigueur.
ISO 10390:1994, Qualité du sol — Détermination du pH.
ISO 11268-1:1993, Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre (Eisenia fetida) — Partie 1:
Détermination de la toxicité aiguë en utilisant des substrats de sol artificiel.
ISO 11274, Qualité du sol — Détermination de la caractéristique de la rétention en eau — Méthodes de laboratoire.
3 Termes et définitions
Pour les besoins de la présente Norme internationale, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
LOEC
concentration la plus faible ayant un effet observé
concentration d'essai la plus faible de la substance d'essai pour laquelle un effet significatif a été observé par
comparaison avec le témoin
NOTE Toutes les concentrations d'essai supérieures à la LOEC ont un effet nuisible égal ou supérieur à celui observé
à la LOEC.
1
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3.2
NOEC
concentration sans effet observé
concentration d'essai la plus élevée d'une substance d'essai, à laquelle aucun effet létal ou autre (tel qu'une
variation pondérale) n'est observé
3.3
CE10
concentration estimée réduisant de 10 % le taux de reproduction, à la fin de l'essai, par rapport au témoin
NOTE Toutes les concentrations d'essai sont exprimées en masse de la substance d'essai par masse sèche de substrat
d'essai (voir 5.2).
3.4
CE50
concentration estimée réduisant de 50 % le taux de reproduction, à la fin de l'essai, par rapport au témoin
NOTE Toutes les concentrations d'essai sont exprimées en masse de la substance d'essai par masse sèche de substrat
d'essai (voir 5.2).
3.5
reproduction
augmentation du nombre moyen de larves dans chaque récipient d'essai, après 28 jours d'incubation dans les
conditions d'essai spécifiées
4 Principe
Les effets des substances d'essai sont déterminés, à différentes concentrations, sur la reproduction des
collemboles (Folsomia candida) âgés de 10 jours à 12 jours dans un substrat de sol artificiel. Les collemboles sont
laissés en incubation jusqu'à ce que les larves (F ) éclosent des œufs pondus par des adultes parvenus à maturité.
1
Le nombre de larves est ensuite déterminé. Dans les essais témoins, les larves éclosent généralement après 28
jours.
5 Réactifs
5.1 Réactif biologique.
Pour cet essai, on utilise des collemboles juvéniles âgés de 10 jours à 12 jours de l'espèce Folsomia candida
(Willem) (voir l'article A.1 pour les détails relatifs à la synchronisation de l'élevage).
5.2 Substrat d'essai, composé d'un substrat de sol humide (sol artificiel défini conformément à l'ISO 11268-1), de
la substance d'essai et d'eau déionisée.
5.2.1 Substrat de sol.
Constituants En pourcentage
de la masse sèche
Tourbe de sphaigne, séchée à l'air ambiant,
finement moulue, exempte de tout résidu de
plante visible 10 %
Argile kaolinique (séchée à l'air), contenant au
moins 30 % de kaolinite 20 %
Sable de quartz industriel (séché à l'air, composé
principalement de sable fin, dont plus de 50 % de
la masse des grains présentent une granulométrie
de 0,05 mm à 0,2 mm) 70 %
2
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Ajouter une quantité suffisante (en général 0,5 % à 1 %) de carbonate de calcium (CaCO ), pulvérisé et de qualité
3
analytique reconnue, pour amener le pH (mesuré dans une solution de KCl à 1 mol/l) à 6,0 ± 0,5 au début de
l'essai. Le pH doit être déterminé conformément à l'ISO 10390.
NOTE 1 La quantité de carbonate de calcium nécessaire dépend des constituants du substrat de sol et il convient de la
déterminer par des mesurages effectués sur des sous-échantillons (voir annexe D) immédiatement avant l'essai.
Mélanger les matières sèches dans les bonnes proportions, puis bien agiter dans un mélangeur de laboratoire ou
ménager de grande taille. Une partie de l'eau déionisée nécessaire est ajoutée au cours du mélange. Ceci permet
d'obtenir le substrat de sol de base. Il convient que la teneur totale en eau du substrat d'essai et du substrat témoin,
respectivement, soit ajustée de manière à conférer au substrat une structure friable permettant aux collemboles de
pénétrer dans les cavités du substrat. La teneur en eau adéquate se situe normalement entre 40 % et 60 % de la
capacité totale de rétention d'eau déterminée conformément à l'ISO 11274, ou à l'aide de la méthode donnée à
l'annexe C. La teneur en eau et le pH sont déterminés avant le début de l'essai, et à la fin de l'essai pour le témoin
et pour chaque concentration soumise à essai.
NOTE 2 Il convient de tenir compte de l'ajout ultérieur d'eau ou de sable de quartz pour faire pénétrer la substance d'essai
dans le sol.
5.2.2 Substrat témoins, composé du substrat de base et d'eau déionisée. Dans le cas où la préparation de l'essai
nécessite l'utilisation d'un composé auxiliaire, un témoin supplémentaire est nécessaire.
5.3 Substance de référence.
Afin de garantir la qualité du système d'essai, il convient de réaliser les essais régulièrement (une ou deux fois par
an) avec une substance de référence.
Les produits chimiques agricoles Betanal plus (matière active: 160 g/l de Phenmedipham) et E 605 forte (matière
active: 507,5 g/l de Parathion) ont été soumis à un essai circulaire et sont recommandés comme substances de
référence.
AVERTISSEMENT — Il convient de prendre les précautions nécessaires pour éviter l'ingestion ou le contact
avec la peau de ces produits chimiques lors de leur manutention.
NOTE Betanal Plus: Des effets sur la reproduction (α = 0,05) ont été observés à des concentrations comprises entre
100 mg et 200 mg de produit par kilogramme de masse sèche du substrat.
E 605 forte: Des effets sur la mortalité et la reproduction ont été observés à des concentrations comprises entre 0,18 mg et
0,32 mg et entre 0,1 mg et 0,18 mg de produit par kilogramme de masse sèche du substrat, respectivement.
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Récipients en verre (pouvant être fermés hermétiquement), d'une capacité d'environ 100 ml et d'un diamètre
d'environ 5 cm.
6.2 Appareil pouvant mesurer le pH et la teneur en eau du substrat.
6.3 Extracteur pour le transfert des collemboles (voir l'article A.2).
6.4 Enceinte, thermostatée à (20 ± 2) °C.
6.5 Source lumineuse, permettant de fournir à la surface du substrat un éclairage constant de 400 lx à 800 lx
suivant un cycle contrôlé lumière:obscurité compris entre (12:12) h et (16:8) h.
3
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7 Mode opératoire
7.1 Préparation de l'essai
7.1.1 Concentrations d'essai
a) Méthode NOEC:
Il convient de sélectionner au moins cinq concentrations dans une suite géométrique de raison inférieure ou
4
égale à 2 (par exemple, 10 ∼ 1,8) pour obtenir une estimation de la LOEC/NOEC du taux de reproduction.
b) Méthode CE :
x
Pour la méthode CE , il convient d'utiliser un nombre de concentrations plus élevé (par exemple 12), et de
x
soumettre à l'essai chaque concentration avec deux réplicats. L'écart entre les concentrations peut être
variable (c'est-à-dire plus petit à de faibles concentrations, et plus grand à des concentrations élevées).
Les concentrations de la substance d'essai doivent être exprimées en masse de substance par masse sèche de
substrat de sol (mg/kg) (voir 5.2).
Si aucune autre donnée pertinente de toxicité n'est disponible, les concentrations sélectionnées pour obtenir la
LOEC/NOEC ou la CE10 sont basées sur les résultats de l'essai préliminaire (voir 7.2).
7.1.2 Introduction de la substance d'essai
7.1.2.1 Substances solubles dans l'eau
Immédiatement avant le début de l'essai, dissoudre la quantité de substance d'essai dans une quantité d'eau
suffisante pour les réplicats, à une concentration donnée (ou la quantité d'eau nécessaire pour humidifier le substrat
de sol de façon à satisfaire aux exigences de 5.2.1), puis mélanger soigneusement avec le substrat de sol de base
avant de verser le tout dans les récipients d'essai.
Poursuivre l'essai comme décrit en 7.1.3.
7.1.2.2 Substances insolubles dans l'eau mais solubles dans les solvants organiques
Dissoudre dans un solvant volatil (tel que l'acétone ou l'hexane) la quantité de substance d'essai nécessaire pour
obtenir la concentration souhaitée et mélanger le tout avec la quantité de sable de quartz nécessaire. Après avoir
fait évaporer le solvant en plaçant le récipient sous une hotte aspirante, ajouter le reste du substrat de base (en
tenant compte de la quantité de sable utilisée dans la préparation de la substance d'essai) et l'eau, puis bien agiter
le tout avant de le verser dans les récipients d'essai.
Poursuivre l'essai comme décrit en 7.1.3.
NOTE Pour disperser les substances peu solubles dans l'eau, il est possible d'utiliser la méthode de dispersion par
ultrasons, des solvants organiques, des émulsifiants ou des dispersants. Lorsque de tels composés auxiliaires sont utilisés, il
convient que toutes les concentrations d'essai et un témoin supplémentaire contiennent la même quantité minimale de
composé auxiliaire.
AVERTISSEMENT — En présence de vapeurs de solvant, il convient de prendre les précautions
nécessaires pour éviter l'inhalation ou l'explosion, et pour éviter d'endommager l'équipement d'extraction,
les pompes, etc.
7.1.2.3 Substances insolubles dans l'eau ou dans les solvants organiques
Pour une substance insoluble dans un solvant volatil, préparer un mélange de 10 g de sable de quartz industriel
finement moulu (voir 5.2) et la quantité de substance d'essai nécessaire pour obtenir la concentration souhaitée.
Ajouter le reste du substrat de base (en tenant compte de la quantité de sable utilisée dans la préparation de la
substance d'essai) et l'eau, puis bien agiter le tout avant de le verser dans les récipients d'essai.
Poursuivre l'essai comme décrit en 7.1.3.
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7.1.3 Introduction des organismes d'essai
Placer dix collemboles juvéniles (âgés de 10 jours à 12 jours) dans chaque récipient d'essai.
Pour cela, tapoter sur le récipient d’élevage ou aspirer les collemboles à partir de celui-ci pour les transférer dans
les récipients d'essai. Cette opération peut être facilitée par l'utilisation d'un extracteur comme décrit à l'article A.2.
Avant de les transférer dans les récipients d'essai, compter les organismes et les examiner afin de s'assurer de leur
bon état, de manière à réduire la mortalité des témoins et à éviter les erreurs systématiques d'essai.
7.1.4 Récipient témoin
Préparer les récipients témoin de la même manière que les récipients d'essai mais sans ajouter la substance
d'essai. Si la préparation de l'essai implique l'utilisation de composés auxiliaires (voir 7.1.2.2), utiliser des récipients
témoin supplémentaires. Traiter ces récipients de la même façon que les récipients ne contenant pas la substance
d'essai.
7.2 Essai préliminaire (facultatif)
S'il est nécessaire de déterminer la gamme de concentrations à utiliser dans l'essai final, effectuer un essai
préliminaire aigu afin de déterminer la mortalité à l’aide de quatre concentrations de la substance d'essai et un
témoin (par exemple 0 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg, et 1 000 mg/kg). Utiliser dix collemboles âgés de
10 jours à 12 jours pour chaque concentration et chaque récipient. Préparer les récipients d'essai comme indiqué
en 7.1.2. Placer les récipients d'essai dans l'enceinte thermostatée (6.4) équipée d'une source lumineuse (6.5).
Au début de l'essai, ajouter environ 2 mg de levure sèche granulée dans chaque récipient d'essai, puis fermer
hermétiquement les récipients (par exemple au moyen d'un film plastique, d'un disque de verre ou d'un film
transparent). Ouvrir brièvement les récipients d'essai deux fois par semaine pour permettre l'aération.
Après 14 jours, compter les collemboles vivants de chaque récipient, et déterminer le pourcentage de mortalité pour
chaque concentration de substance d'essai. Par ailleurs, observer les collemboles ayant survécu et relever tout
symptôme éventuel. En raison de la rapidité de dégradation des collemboles morts, on suppose que les
collemboles disparus sont morts au cours de l'essai.
NOTE Afin d’obtenir des informations supplémentaires pour la détermination de la gamme de concentration de l’essai final,
la période d'essai peut être étendue à quatre semaines afin de permettre une détermination qualitative des effets à des
concentrations auxquelles les effets sur la reproduction sont possibles.
7.3 Essai final
Les concentrations sélectionnées pour l'utilisation dans l'essai sont basées sur les résultats de l'essai préliminaire,
ou sur d'autres données de toxicité. Il n'est pas nécessaire de soumettre à l'essai les substances à des
concentrations supérieures à 1 000 mg/kg de masse sèche de substrat d'essai.
Après avoir mélangé la substance d'essai (voir 7.1.2) au substrat d'essai à une concentration donnée, remplir
chaque récipient d'essai (réplicat) avec 30 g de masse humide du substrat d'essai. Afin de ne pas entraver le
déplacement des collemboles, il convient que le substrat placé dans le récipient d'essai ne soit pas comprimé.
Préparer cinq réplicats par concentration et par témoin. Si l’approche par la méthode CE est utilisée, préparer au
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moins deux réplicats pour les concentrations choisies et cinq pour le témoin. Afin de faciliter le contrôle du pH et de
l'humidité du substrat d'essai, il est recommandé d'utiliser des récipients supplémentaires pour chaque
concentration et pour le témoin.
Au début de l'essai et après une période de 14 jours, ajouter environ 2 mg de levure sèche granulée dans chaque
récipient d'essai, puis fermer hermétiquement les récipients (par exemple au moyen d'un film plastique, d'un disque
de verre ou d'un film transparent). Ouvrir brièvement les récipients d'essai deux fois par semaine pour permettre
l'aération.
Déterminer la teneur en eau et le pH (en présence de KCl à 1 mol/l) du sol artificiel au début et à la fin de l'essai.
Lorsque des substances acides ou basiques sont soumises à l'essai, ne pas ajuster le pH.
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Après deux semaines, la teneur en eau doit être vérifiée en pesant de nouveau les récipients d'essai
supplémentaires. Les pertes d'eau doivent être compensées si elles dépassent 2 % de la teneur en eau initiale.
7.4 Détermination du nombre de collemboles ayant survécu
Quatre semaines après avoir introduit les collemboles parents d
...
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