ISO 11267:2014

Soil quality - Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida) by soil contaminants

ISO 11267:2014 specifies one of the methods for evaluating the habitat function of soils and determining effects of soil contaminants and substances on the reproduction of Folsomia candida Willem by dermal and alimentary uptake. This chronic test is applicable to soils and soil materials of unknown quality, e.g. from contaminated sites, amended soils, soils after remediation, industrial, agricultural or other sites of concern and waste materials. Effects of substances are assessed using a standard soil, preferably a defined artificial soil substrate. For contaminated soils, the effects are determined in the soil to be tested and in a control soil. According to the objective of the study, the control and dilution substrate (dilution series of contaminated soil) are either an uncontaminated soil comparable to the soil to be tested (reference soil) or a standard soil (e.g. artificial soil). ISO 11267:2014 provides information on how to use this method for testing substances under temperate conditions. The method is not applicable to volatile substances, i.e. substances for which H (Henry's constant) or the air/water partition coefficient is greater than 1, or for which the vapour pressure exceeds 0,013 3 Pa at 25 °C.

Qualité du sol — Inhibition de la reproduction de Collembola (Folsomia candida) par des contaminants du sol

L'ISO 11267:2014 spécifie l'une des méthodes permettant d'évaluer la fonction d'habitat des sols et de déterminer les effets de contaminants du sol et de substances sur la reproduction de Folsomia candida Willem par absorption cutanée et ingestion. Cet essai chronique s'applique aux sols et matériaux du sol de qualité inconnue, par exemple provenant de sites contaminés, de sols amendés, de sols après remédiation, de sites industriels, agricoles ou d'autres sites d'intérêt et de déchets. Les effets des substances sont évalués à l'aide d'un sol standard, de préférence un substrat de sol artificiel défini. Pour les sols contaminés, les effets sont déterminés dans le sol soumis à essai et dans un sol témoin. Selon l'objectif de l'étude, il convient que le substrat témoin et de dilution (gamme de dilutions d'un sol contaminé) soit un sol non contaminé comparable au sol à évaluer (sol de référence) ou un sol standard (par exemple un sol artificiel). L'ISO 11267:2014 fournit des informations sur la manière d'utiliser cette méthode pour évaluer des substances dans des conditions tempérées. La méthode ne s'applique pas aux substances volatiles, c'est-à-dire aux substances pour lesquelles H (constante de Henry) ou le coefficient de partage air/eau est supérieur à 1, ou pour lesquelles la pression de vapeur excède 0,013 3 Pa à 25 °C.

General Information

• Status: Withdrawn
• Publication Date: 05-Feb-2014
• ICS: 13.080.30 - Biological properties of soils
• Technical Committee: ISO/TC 190/SC 4 - Biological characterization
• Drafting Committee: ISO/TC 190/SC 4/WG 2 - Effects on soil fauna
• Current Stage: 9599 - Withdrawal of International Standard
• Start Date: 10-Aug-2023
• Completion Date: 13-Dec-2025

Relations

• Consolidates: ISO 10426-3:2003 - Petroleum and natural gas industries - Cements and materials for well cementing - Part 3: Testing of deepwater well cement formulations
• Effective Date: 06-Jun-2022
• Revised: ISO 11267:2023 - Soil quality - Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida) by soil contaminants
• Effective Date: 23-Apr-2020
• Revises: ISO 11267:1999 - Soil quality - Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida) by soil pollutants
• Effective Date: 06-Nov-2010

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11267
Second edition
2014-02-15
Soil quality — Inhibition of
reproduction of Collembola (Folsomia
candida) by soil contaminants
Qualité du sol — Inhibition de la reproduction de Collembola
(Folsomia candida) par des contaminants du sol
Reference number
©
ISO 2014
© ISO 2014
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ii © ISO 2014 – All rights reserved

Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 3
5 Reagents and material . 4
6 Apparatus . 6
7 Procedure. 6
7.1 Experimental design . 6
7.2 Preparation of test mixture . 7
7.3 Addition of the biological material . 9
7.4 Test conditions and measurements . 9
7.5 Determination of surviving Collembola . 9
8 Calculation and expression of results . 9
8.1 Calculation . 9
8.2 Expression of results . 9
9 Validity of the test .10
10 Statistical analysis .10
10.1 General .10
10.2 Single-concentration tests .10
10.3 Multi-concentration tests.11
11 Test report .11
Annex A (informative) Techniques for rearing and breeding of Collembola .13
Annex B (informative) Determination of water-holding capacity .15
Annex C (informative) Guidance on adjustment of pH of artificial soil .16
Annex D (informative) Extraction and counting of Collembola .17
Bibliography .18
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of any
patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or on
the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical Barriers
to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4, Biological
methods.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 11267:1999), which has been technically
revised.
iv © ISO 2014 – All rights reserved

Introduction
Ecotoxicological test systems are applied to obtain information about the effects of contaminants in soil
and are proposed to complement conventional chemical analysis (see [2] and [4]). Reference [2] includes
a list and short characterization of recommended and standardized test systems and [4] gives guidance
on the choice and evaluation of the bioassays. Aquatic test systems with soil eluate are applied to obtain
information about the fraction of contaminants potentially reaching the groundwater by the water path
(retention function of soils), whereas terrestrial test systems are used to assess the habitat function of
soils.
Soil-dwelling Collembola are ecologically relevant species for ecotoxicological testing. Springtails are
prey animals for a variety of endogeic and epigeic invertebrates and they contribute to decomposition
processes in soils. In acidic soils they may be the most important soil invertebrates besides enchytraeids
[19]
with respect to that function, since earthworms are typically absent. Additionally, Collembola
represent arthropod species with a different route and a different rate of exposure compared to
[1] [3]
earthworms and enchytraeids. Various species were used in bioassays of which four species were
used most commonly, Folsomia candida, Folsomia fimetaria, Onychiurus armatus, and Orchesella cincta.
[20]
Numerous soil toxicity tests supported by Environment Canada (EC) resulted in the development
and standardization of a biological test method for determining the lethal and sublethal toxicity of
[10]
samples of contaminated soil to Collembola. The method prepared by EC includes three species,
Orthonychiurus folsomi, Folsomia candida, and Folsomia fimetaria. As standardized test systems using
Collembola as indicator organisms for the habitat function of soil, another two methods exist. One is
designed for assessing the effects of substances on the reproductive output of the Collembola, Folsomia
[19] [21]
fimetaria L. and Folsomia candida Willem in soil, , , and the other method described here, focuses on
testing contaminated soil. Optionally the method can be used for testing substances added to standard
soils (e.g. artificial soil) for their sublethal hazard potential to Collembola.
This International Standard describes a method that is based on the determination of sublethal effects
of contaminated soils to adult Collembola of the species Folsomia candida Willem. The species is
[10] [19]
distributed worldwide. It plays a similar ecological role to Folsomia fimetaria. , Folsomia candida
reproduces parthenogenetically and is an easily accessible species as it is commercially available and
easy to culture. Folsomia candida is considered to be a representative of soil arthropods and Collembola
in particular. Background information on the ecology of springtails and their use in ecotoxicological
[22]
testing is available.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 11267:2014(E)
Soil quality — Inhibition of reproduction of Collembola
(Folsomia candida) by soil contaminants
1 Scope
This International Standard specifies one of the methods for evaluating the habitat function of soils and
determining effects of soil contaminants and substances on the reproduction of Folsomia candida Willem
by dermal and alimentary uptake. This chronic test is applicable to soils and soil materials of unknown
quality, e.g. from contaminated sites, amended soils, soils after remediation, industrial, agricultural or
other sites of concern and waste materials.
Effects of substances are assessed using a standard soil, preferably a defined artificial soil substrate. For
contaminated soils, the effects are determined in the soil to be tested and in a control soil. According to
the objective of the study, the control and dilution substrate (dilution series of contaminated soil) are
either an uncontaminated soil comparable to the soil to be tested (reference soil) or a standard soil (e.g.
artificial soil).
This International Standard provides information on how to use this method for testing substances
under temperate conditions.
The method is not applicable to volatile substances, i.e. substances for which H (Henry’s constant) or the
air/water partition coefficient is greater than 1, or for which the vapour pressure exceeds 0,013 3 Pa at
25 °C.
NOTE The stability of the test substance cannot be ensured over the test period. No provision is made in the
test method for monitoring the persistence of the substance under test.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 10381-6, Soil quality — Sampling — Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil under
aerobic conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory
ISO 10694, Soil quality — Determination of organic and total carbon after dry combustion (elementary
analysis)
ISO 10390, Soil quality — Determination of pH
ISO 11260, Soil quality — Determination of effective cation exchange capacity and base saturation level
using barium chloride solution
ISO 11277, Soil quality — Determination of particle size distribution in mineral soil material — Method by
sieving and sedimentation
ISO 11465, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis — Gravimetric
method
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
contaminant
substance or agent present in the soil as a result of human activity
3.2
ECx
effect concentration for x % effect
concentration (mass fraction) of a test substance that causes x % of an effect on a given end-point within
a given exposure period when compared with a control
EXAMPLE An EC50 is a concentration estimated to cause an effect on a test end-point in 50 % of an exposed
population over a defined exposure period.
Note 1 to entry: The ECx is expressed as a percentage of soil to be tested (dry mass) per soil mixture (dry mass).
When substances are tested, the ECx is expressed as mass of the test substance per dry mass of soil in milligrams
per kilogram.
3.3
ERx
effect rate
rate of a soil to be tested that causes an x % of an effect on a given end-point within a given exposure
period when compared with a control
3.4
limit test
single concentration test consisting of at least four replicates each, the soil to be tested without any
dilution or the highest concentration of test substance mixed into the control soil and the control
3.5
LOEC
lowest observed effect concentration
lowest test substance concentration that has a statistically significant effect (probability p < 0,05)
Note 1 to entry: In this test, the LOEC is expressed as a mass of test substance per dry mass of the soil to be
tested. All test concentrations above the LOEC should usually show an effect that is statistically different from
the control.
3.6
LOER
lowest observed effect rate
lowest rate of a soil to be tested in a control soil at which a statistically significant effect is observed
3.7
NOEC
no observed effect concentration
highest test substance concentration immediately below the LOEC at which no effect is observed
Note 1 to entry: In this test, the concentration corresponding to the NOEC has no statistically significant effect
(probability p < 0,05) within a given exposure period when compared with the control.
3.8
NOER
no observed effect rate
lowest rate of a soil to be tested immediately below the LOER which, when compared to the control, has
no statistically significant effect (probability p < 0,05) within a given exposure period
3.9
reference soil
uncontaminated soil with comparable pedological properties (nutrient concentrations, pH, organic
carbon content and texture) to the soil being studied
2 © ISO 2014 – All rights reserved

3.10
standard soil
field-collected soil or artificial soil whose main properties (pH, texture, organic matter content) are
within a known range
EXAMPLE Euro soils, artificial soil, LUFA Standard soil.
Note 1 to entry: The properties of standard soils can differ from the soil to be tested.
3.11
control soil
reference or standard soil used as a control and as a medium for preparing dilution series with soils to
be tested or a reference substance, which fulfils the validity criteria
Note 1 to entry: In the case of natural soil, it is advisable to demonstrate its suitability for a test and for achieving
the test validity criteria before using the soil in a definitive test.
3.12
test mixture
mixture of contaminated soil or the test substance (e.g. chemical, biosolid, waste) with control soil
3.13
test mixture ratio
ratio between the soil to be tested and the control soil in a test mixture
4 Principle
The effects on reproduction of 10 d to 12 d old Collembola (Folsomia candida) exposed to the soil to be
tested are compared to those observed in a control soil. If appropriate, effects based on exposure to a
test mixture of contaminated soil and control soil or a range of concentrations of a test substance mixed
into control soil are determined. Test mixtures are prepared at the start of the test and are not renewed
within the test period.
The Collembola are incubated until offspring (F ) emerge from eggs laid by mature adults, and the
number of offspring is determined. Usually offspring emerge within 28 d in control experiments. The
results obtained from the tests are compared with a control or, if appropriate, are used to determine
the concentrations which cause no effects on mortality and reproduction (NOER/NOEC) and the
concentration resulting in x% reduction of juveniles hatched from eggs compared to the control
(ERx/ECx, 28 d) respectively.
If testing a concentration series, all test dilutions/concentrations above the LOER/LOEC have a harmful
effect equal to or greater than that observed at the LOER/LOEC. Where there is no prior knowledge of
the concentration of the soil to be tested or the test substance likely to have an effect, then it is useful to
conduct the test in two steps:
— An acute toxicity test (range-finding test) is carried out, to give an indication of the effect
dilution/concentration, and the dilution/concentration giving no mortality (NOER/NOEC).
Dilutions/concentrations to be used in the definitive test can then be selected;
— the definitive test on reproduction to determine sublethal effects of (dilutions of) contaminated
soil or the concentration of a substance which, when evenly mixed into the standard soil, causes
no significant effects on numbers of offspring hatched from eggs compared with the control
(NOER/NOEC), and the lowest concentration causing effects (LOER/LOEC).
NOTE The use of a reference soil is an essential requirement to demonstrate the present status of the test
population, and to avoid misinterpretation of results.
5 Reagents and material
5.1 Biological material, in this test, 10 d to 12 d old juvenile springtails of the species Folsomia candida
Willem are used (see A.1 for details on synchronization of breeding).
5.2 Test mixture, which may consist of field-collected soil or control soil amended by the test substance.
5.2.1 Field-collected soil or waste
The sample(s) can be field-collected soil from an industrial, agricultural or other site of concern, or
waste materials (e.g. dredged material, municipal sludge from a wastewater treatment plant, composed
material, or manure) under consideration for possible land disposal.
The field-collected soils used in the test shall be passed through a sieve of 4 mm square mesh to remove
coarse fragments and thoroughly mixed. If necessary, soil may be air-dried without heating before
sieving. Storage of soil to be tested should be as short as possible. The soil shall be stored in accordance
with ISO 10381-6 using containers that minimize losses of soil contaminants by volatilization and
sorption to the container walls. If soils or test mixtures have been stored, they should be mixed a second
time immediately before use. Soil pH should not be corrected as it can influence bioavailability of soil
contaminants.
For interpretation of test results, the following characteristics shall be determined for each soil sampled
from a field site:
a) pH in accordance with ISO 10390,
b) texture (sand, loam, silt) in accordance with ISO 11277
c) water content in accordance with ISO 11465,
d) water-holding capacity according to Annex B,
e) cationic exchange capacity in accordance with ISO 11260,
f) organic carbon in accordance with ISO 10694,
g) percentage of material removed by the 4 mm sieve
NOTE It is important to measure the water holding capacity of all mixtures used in the test.
5.2.2 Control soil, either a) reference soil (3.9) or b) standard soil (3.10) that allows the presence of
Collembola. Control soil and soil used for dilution shall not differ in one test (either a) or b)).
a) If reference soils from uncontaminated areas near a contaminated site are available, they should
be treated and characterized like the soils to be tested. If a toxic contamination or unusual soil
properties cannot be ruled out, standard control soils should be preferred.
b) For testing the effects of substances mixed into soil, standard soils (e.g. artificial soil, LUFA) shall be
used as test substrate. The properties of the field-collected standard soil shall be reported.
4 © ISO 2014 – All rights reserved

The substrate called artificial soil can be used as a standard soil and has the following composition:
Percentage expressed on dry mass basis
− Sphagnum peat finely ground [a particle size of          10 %
(2 ± 1) mm is acceptable] and with no visible plant remains
− Kaolinite clay containing not less than 30 % kaolinite          20 %
− Industrial quartz sand (dominant fine sand with more          69 %
than 50 % of particle size 0,05 mm to 0,2 mm)
Approximately 0,3 % to 1,0 % calcium carbonate (CaCO , pulverized, analytical grade) are necessary to
get a pH of 6,0 ± 0,5.
NOTE 1 Taking the properties of highly non-polar (log K > 2) or ionizing substances into account, 5 % of peat
ow
have proven to be sufficient for maintaining the desired structure of the artificial soil.
NOTE 2 It has been demonstrated that Folsomia candida can comply with the validity criteria even on
reproduction when tested in field soils with lower organic carbon content (e.g. 2,7 %), and there is experience
that this can be achieved in artificial soil with 5 % peat. Therefore, it is not necessary before using such a soil in a
definitive test to demonstrate the suitability of the artificial soil for allowing the test to comply with the validity
criteria unless the peat contents is lower than specified above.
Prepare the artificial soil at least three days prior to the start of the test, by mixing the dry constituents
listed above thoroughly in a large-scale laboratory mixer. A portion of the deionized water required
is added during mixing. Allowance should be made for any water that is used for introducing the test
substance into the soil. The amount of calcium carbonate required can vary, depending on properties of
the individual batch of sphagnum peat and should be determined by measuring sub-samples immediately
before the test. Store the mixed artificial soil at room temperature for at least two days to equilibrate
acidity. To determine pH and the maximum water holding capacity, the dry artificial soil is pre-moistened
one or two days before starting the test by adding deionized water to obtain approximately half of the
required final water content of 40 % to 60 % of the maximum water holding capacity.
The total water-holding capacity is determined according to Annex C, the pH is determined according
to ISO 10390.
5.3 Food
A sufficient amount, e.g. 2 mg to 10 mg, of granulated dried baker’s yeast, commercially available for
household use, is added to each container as a suitable food source, at the beginning of the test and after
about two weeks.
5.4 Reference substance
To ensure the quality of the test system, tests should be performed regularly (once or twice a year) with
a reference substance.
1)
Boric acid and the plant protection product Betosip (a.i. 157 g/l phenmedipham) have been tested in a
ring test, and are recommended as reference substances.
WARNING — When handling these substances, appropriate precautions should be taken to avoid
ingestion or skin contact.
NOTE 1 Boric acid: Effects on reproduction were observed at concentrations (EC50) of 147 mg boric acid/kg
[5] [21]
dry mass of artificial soil and 169 mg boric acid/kg clay-loam soil dry mass). ,
1) Betosip is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience
of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent products
may be used if they can be shown to lead to the same results.
NOTE 2 Betosip: Effects on reproduction (α = 0,05) were observed at concentrations between 100 mg and
200 mg of the product per kilogram dry mass of the substrate.
6 Apparatus
Use laboratory equipment and the following apparatus.
6.1 Test containers made of glass or other chemically inert material of about 100 ml capacity and with
a diameter of about 5 cm, with lids (e.g. plastic, glass discs or parafilm, able to be closed tightly).
6.2 Apparatus to determine the dry mass of the substrate in accordance with ISO 11465.
6.3 Large scale laboratory mixer for the preparation of the test mixture (5.2).
6.4 Suitable accurate balances.
6.5 Apparatus capable of measuring pH and water content of the substrate.
6.6 Exhauster for transfer of springtails (see A.2).
6.7 Test environment.
6.7.1 Enclosure, capable of being controlled to a temperature of (20 ± 2) °C.
6.7.2 Light source, capable of delivering a constant light intensity of 400 Ix to 800 Ix at the substrate
surface at a controlled light:dark cycle of between 12 h:12 h and 16 h:8 h.
7 Procedure
7.1 Experimental design
7.1.1 General
A sample of field-collected soil can be tested at a single concentration (typically 100 %) or evaluated for
toxicity in a multi-concentration test whereby a series of concentrations (dilutions) is prepared by mixing
measured quantities with a control soil (5.2.2). When testing substances a series of concentrations
is prepared by mixing quantities of the test substance with a standard soil (e.g. artificial soil). The
concentrations being expressed in milligrams of test substance per kilogram of dried control soil (5.2.2).
Depending on the knowledge of relevant response levels a range-finding test may precede the definitive
test. Each definitive test consists of a series of soil mixtures (treatments).
7.1.2 Range-finding test
A test to find the range of mixture ratio affecting Collembola is optional, e.g. 0 %, 1 %, 5 %, 25 %, 50 %,
75 %, 100 %, or of the test substance, e.g. 0 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg and 1 000 mg/kg.
The range-finding test is conducted without replication.
When no effects are observed, even at 100 % contaminated soil or at concentrations of 1 000 mg test
substance/kg standard soil (dry mass), the definitive test can be designed as a limit test.
Each test container (replicate) is filled with 30 g wet mass of the test sample. To ensure easy migration
of springtails, the substrate in the test container should not be compressed.
6 © ISO 2014 – All rights reserved

Use 10 specimens of 10 d to 12 d old Collembola per container. Prepare the test containers as indicated
in 7.2.1. Place the test containers in the test enclosure (6.7.1) with the light source (6.7.2).
At the beginning of the test, add about 2 mg of granulated dry yeast (5.3) to each test container, and
cover the containers tightly (e.g. using plastic, glass discs or parafilm). Open the test containers briefly
twice a week to allow aeration.
After 14 d, count the live Collembola in each container, and determine the percentage mortality for each
test substance concentration. Also observe surviving Collembola and record any symptoms. Due to the
rapid degradation of dead Collembola, missing Collembola are assumed to have died during the test
period.
NOTE To obtain additional information for the determination of the concentration range for the final test, the
test period can be extended to four weeks to allow qualitative determination of effects at concentrations at which
effects on reproduction could be expected.
7.1.3 Definitive test
The design of the definitive test depends on the test objectives. Typically the habitat properties of
samples of a field-collected soil are characterized by comparison of the biological effects found in the soil
to be tested(s) with those found in a reference soil, or if not available or not appropriate due to toxicity
or atypical physicochemical characteristics, in a standard soil. Results for the standard soil assist in
distinguishing contaminant effects from non-contaminant effects caused by soil physicochemical
properties. Regardless of whether a reference soil or standard soil is used for the statistical comparisons,
[20]
the results from standard soil shall be used to judge the validity and acceptability of the test.
If for characterization purposes a test design including dilution series is required, three designs are
possible (the concentrations shall be spaced by a factor not exceeding 2):
— For the NOEC/NOER approach, at least
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 11267
Deuxième édition
2014-02-15
Qualité du sol — Inhibition de la
reproduction de Collembola (Folsomia
candida) par des contaminants du sol
Soil quality — Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia
candida) by soil contaminants
Numéro de référence
©
ISO 2014
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 3
5 Réactifs et matériel . 4
6 Appareillage . 6
7 Mode opératoire. 7
7.1 Plan d’expérimentation . 7
7.2 Préparation du mélange d’essai . 8
7.3 Ajout du matériel biologique . 9
7.4 Conditions d’essai et mesures.10
7.5 Détermination du nombre de collemboles survivants .10
8 Calcul et expression des résultats .10
8.1 Calcul .10
8.2 Expression des résultats .10
9 Validité de l’essai .11
10 Analyse statistique .11
10.1 Généralités .11
10.2 Essais à une seule concentration .11
10.3 Essais à plusieurs concentrations.12
11 Rapport d’essai .12
Annexe A (informative) Techniques d’élevage des collemboles .14
Annexe B (informative) Détermination de la capacité de rétention d’eau .17
Annexe C (informative) Lignes directrices pour l’ajustement du pH d’un sol artificiel .19
Annexe D (informative) Extraction et comptage des collemboles .20
Bibliographie .21
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/CEI, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration
du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou sur la liste ISO des déclarations de brevets reçues
(voir www.iso.org/brevets).
Les éventuelles appellations commerciales utilisées dans le présent document sont données pour
information à l’intention des utilisateurs et ne constituent pas une approbation ou une recommandation.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation
de la conformité, aussi bien que pour des informations au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de
l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC) voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Méthodes biologiques.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 11267:1999) qui a fait l’objet d’une
révision technique.
iv © ISO 2014 – Tous droits réservés

Introduction
Des systèmes d’essais d’écotoxicité sont mis en œuvre pour obtenir des informations sur les effets des
contaminants présents dans le sol et sont proposés en complément d’une analyse chimique conventionnelle
(voir Références [2] et [4]). La Référence [2] contient une liste et une brève caractérisation des systèmes
d’essai recommandés et normalisés et la Référence [4] donne des lignes directrices pour le choix et
l’évaluation des essais. Les systèmes d’essais aquatiques avec un éluat de sol sont mis en œuvre pour
obtenir des informations sur la fraction des contaminants susceptibles d’être entraînés jusqu’aux eaux
souterraines par le mouvement de l’eau (fonction de rétention des sols), alors que les systèmes d’essais
terrestres sont utilisés pour évaluer la fonction d’habitat des sols.
Les collemboles, qui peuplent les sols, sont des espèces écologiquement pertinentes pour les essais
d’écotoxicité. Les collemboles sont des prédateurs d’un vaste éventail d’invertébrés endogés et épigés et
contribuent aux processus de décomposition dans les sols acides où ils peuvent être, avec les enchytréides,
les principaux invertébrés présents dans le sol, puisque les vers de terre en sont généralement absents.
[19]
En outre, les collemboles constituent des espèces d’arthropodes caractérisées par une autre voie et
[1] [3]
un autre taux d’exposition que les vers de terre et les enchytréides. Diverses espèces ont été utilisées
dans les essais biologiques, parmi lesquelles quatre espèces ont été les plus couramment utilisées:
[20]
Folsomia candida, Folsomia fimetaria, Onychiurus armatus et Orchesella cincta. De nombreux essais
de toxicité des sols, réalisés avec le soutien d’Environnement Canada (EC), ont abouti au développement
et à la normalisation d’une méthode d’essai biologique pour déterminer la toxicité létale et sublétale
[10]
d’échantillons d’un sol contaminé pour les collemboles. La méthode élaborée par Environnement
Canada (EC) concerne trois espèces: Orthonychiurus folsomi, Folsomia candida et Folsomia fimetaria.
Comme systèmes d’essais normalisés utilisant des collemboles comme organismes indicateurs pour la
fonction d’habitat du sol, il existe deux autres méthodes: une méthode qui est destinée à évaluer les effets
de substances sur la reproductivité des collemboles Folsomia fimetaria L. et Folsomia candida Willem dans
[19][21]
le sol et une autre méthode, décrite dans le présent document, qui s’intéresse particulièrement à
l’essai d’un sol contaminé. La méthode peut éventuellement être utilisée pour évaluer le pouvoir toxique
aigu pour les collemboles de substances ajoutées à un sol standard (par exemple un sol artificiel).
La présente Norme internationale décrit une méthode fondée sur la détermination des effets sublétaux
des sols contaminés sur les collemboles adultes de l’espèce Folsomia candida (Willem). L’espèce a une
[10][19]
répartition mondiale. Son rôle écologique est similaire à celui de Folsomia fimetaria. Folsomia
candida se reproduit par parthénogénèse et constitue une espèce facilement accessible car elle est
disponible dans le commerce et facile à élever. Folsomia candida est considérée comme représentative
des arthropodes du sol en général et des collemboles en particulier. Des informations contextuelles sur
[22]
l’écologie des collemboles et sur leur utilisation dans les essais d’écotoxicité sont disponibles.
NORME INTERNATIONALE ISO 11267:2014(F)
Qualité du sol — Inhibition de la reproduction de
Collembola (Folsomia candida) par des contaminants du
sol
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie l’une des méthodes permettant d’évaluer la fonction d’habitat
des sols et de déterminer les effets de contaminants du sol et de substances sur la reproduction de
Folsomia candida Willem par absorption cutanée et ingestion. Cet essai chronique s’applique aux sols et
matériaux du sol de qualité inconnue, par exemple provenant de sites contaminés, de sols amendés, de
sols après remédiation, de sites industriels, agricoles ou d’autres sites d’intérêt et de déchets.
Les effets des substances sont évalués à l’aide d’un sol standard, de préférence un substrat de sol artificiel
défini. Pour les sols contaminés, les effets sont déterminés dans le sol soumis à essai et dans un sol
témoin. Selon l’objectif de l’étude, il convient que le substrat témoin et de dilution (gamme de dilutions
d’un sol contaminé) soit un sol non contaminé comparable au sol à évaluer (sol de référence) ou un sol
standard (par exemple un sol artificiel).
La présente Norme internationale fournit des informations sur la manière d’utiliser cette méthode pour
évaluer des substances dans des conditions tempérées.
La méthode ne s’applique pas aux substances volatiles, c’est-à-dire aux substances pour lesquelles H
(constante de Henry) ou le coefficient de partage air/eau est supérieur à 1, ou pour lesquelles la pression
de vapeur excède 0,013 3 Pa à 25 °C.
NOTE La stabilité de la substance d’essai ne peut pas être garantie pendant toute la durée de l’essai. La
méthode d’essai ne prévoit aucune disposition permettant de contrôler la persistance de la substance soumise à
essai.
2 Références normatives
Les documents suivants, en tout ou partie, sont référencés de manière normative dans le présent
document et sont indispensables pour son application. Pour les références datées, seule l’édition citée
s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y
compris les éventuels amendements).
ISO 10381-6, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 6: Lignes directrices pour la collecte, la manipulation
et la conservation, dans des conditions aérobies, de sols destinés à l’évaluation en laboratoire des processus,
de la biomasse et de la diversité microbiens
ISO 10694, Qualité du sol — Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche
(analyse élémentaire)
ISO 10390, Qualité du sol — Détermination du pH
ISO 11260, Qualité du sol — Détermination de la capacité d’échange cationique effective et du taux de
saturation en bases échangeables à l’aide d’une solution de chlorure de baryum
ISO 11277, Qualité du sol — Détermination de la répartition granulométrique de la matière minérale des
sols — Méthode par tamisage et sédimentation
ISO 11465, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau — Méthode
gravimétrique
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
contaminant
substance ou agent présent(e) dans le sol du fait de l’activité humaine
3.2
CEx
concentration efficace à x %
concentration (fraction massique) d’une substance d’essai qui engendre un effet de x % sur un résultat
final donné durant une période d’exposition déterminée, par rapport au témoin
EXEMPLE Une CE50 est une concentration estimée produire un effet sur un résultat final de l’essai dans
50 % d’une population exposée durant une période d’exposition déterminée.
Note 1 à l’article: La CEx est exprimée en pourcentage de sol soumis à essai (masse sèche) par mélange de sols
(masse sèche). Lorsque des substances sont soumises à essai, la CEx est exprimée en masse de substance soumise
à essai par masse sèche de sol en milligrammes par kilogramme.
3.3
REx
taux efficace
taux d’un sol soumis à essai qui engendre un effet de x % sur un résultat final donné durant une période
d’exposition déterminée, par rapport au témoin
3.4
essai limite
essai à une seule concentration comprenant au moins quatre réplicats pour chaque concentration, le sol
soumis à essai sans dilution ou la concentration la plus élevée de substance soumise à essai mélangée
dans le sol témoin et le témoin
3.5
CMEO
concentration minimale avec effet observé
concentration la plus faible d’une substance soumise à essai ayant un effet statistiquement significatif
(à p < 0,05)
Note 1 à l’article: Dans cette méthode d’essai, la CMEO est exprimée en masse de substance soumise à essai
par masse sèche du sol soumis à essai. Il convient que toutes les concentrations d’essai supérieures à la CMEO
présentent un effet statistiquement différent du témoin.
3.6
RMEO
taux minimal avec effet observé
pourcentage le plus faible d’un sol soumis à essai dans un sol témoin auquel un effet statistiquement
significatif est observé
3.7
CSEO
concentration maximale sans effet observé
concentration la plus élevée d’une substance soumise à essai, immédiatement inférieure à la CMEO,
à laquelle aucun effet n’est observé
Note 1 à l’article: Dans cette méthode d’essai, la concentration correspondant à la CSEO ne présente aucun effet
statistiquement significatif (probabilité p < 0,05) durant une période d’exposition déterminée, en comparaison
avec le témoin.
2 © ISO 2014 – Tous droits réservés

3.8
RSEO
taux maximal sans effet observé
pourcentage le plus élévé d’un sol soumis à essai, immédiatement inférieur au RMEO, qui, en comparaison
avec le témoin, ne présente aucun effet statistiquement significatif (probabilité p < 0,05) durant une
période d’exposition déterminée
3.9
sol de référence
sol non contaminé avec des propriétés pédologiques comparables (concentrations d’éléments nutritifs,
pH, teneur en carbone organique et texture) à celles du sol étudié
3.10
sol standard
sol prélevé sur le terrain ou sol artificiel dont les propriétés principales (pH, texture, teneur en matières
organiques) se situent dans une gamme connue
EXEMPLE Euro-Sols, sol artificiel, sol standard LUFA.
Note 1 à l’article: Les propriétés des sols standards peuvent différer de celles du sol soumis à essai.
3.11
sol témoin
sol de référence ou sol standard utilisé comme témoin et comme milieu pour préparer une gamme de
sols soumis à essai ou une substance de référence, qui satisfait aux critères de validité
Note 1 à l’article: Dans le cas d’un sol naturel, il est recommandé de démontrer sa capacité à être utilisé pour un
essai et à atteindre les critères de validité de l’essai avant d’utiliser un essai définitif.
3.12
mélange d’essai
mélange d’un sol contaminé ou de la substance soumise à essai (par exemple, substance chimique,
matière biosolide, déchets) avec un sol témoin
3.13
rapport de mélange d’essai
rapport entre le sol soumis à essai et le sol témoin dans un mélange d’essai
4 Principe
Les effets sur la reproduction de collemboles (Folsomia candida) âgés de 10 à 12 jours et exposés au
sol soumis à essai sont comparés à ceux observés dans un sol témoin. Si cela est approprié, les effets
observés sont déterminés sur la base de l’exposition à un mélange d’essai de sol contaminé et de sol
témoin ou à une gamme de concentrations d’une substance soumise à essai mélangée dans le sol témoin.
Les mélanges d’essai sont préparés au début de l’essai et ne sont pas renouvelés au cours de la période
d’essai.
Les collemboles sont incubés jusqu’à ce que les larves (F ) sortent des œufs pondus par les adultes et le
nombre de larves est déterminé. L’éclosion des œufs intervient généralement dans un délai de 28 jours
lors d’expérimentations témoins. Les résultats obtenus lors des essais sont comparés avec un témoin, ou,
le cas échéant, sont utilisés pour déterminer respectivement les concentrations qui ne provoquent pas
d’effets sur la mortalité et la reproduction (RSEO/CSEO) et la concentration entraînant une réduction de
x % du nombre de juvéniles éclos des cocons par rapport au témoin (REx/CEx, 28 j).
Lorsqu’une gamme de concentration est soumise à essai, toutes les dilutions/concentrations d’essai
supérieures au RMEO/à la CMEO ont un effet dommageable supérieur ou égal à celui observé au RMEO/à
la CMEO. Lorsque l’on ne connaît pas la concentration à laquelle le sol/la substance soumis(e) à essai est
susceptible de produire un effet, il est utile de conduire l’essai en deux étapes:
— un essai de toxicité aigüe (essai préliminaire) est réalisé pour obtenir une indication de la
dilution/concentration produisant un effet, et de la dilution/concentration ne provoquant pas de
mortalité (RSEO/CSEO). Les dilutions/concentrations à utiliser au cours de l’essai définitif peuvent
ensuite être choisies;
— un essai définitif concernant la reproduction pour déterminer les effets sublétaux du (des dilutions
de) sol contaminé ou de la concentration d’une substance qui, lorsqu’elle est uniformément répartie
dans le sol standard, n’a pas d’effet significatif sur le nombre de larves écloses des cocons comparé
au témoin (RSEO/CSEO), et la plus faible concentration produisant un effet (RMEO/CMEO).
NOTE L’utilisation d’un sol de référence est une exigence essentielle pour démontrer l’état actuel de la
population soumise à essai et éviter la mauvaise interprétation des résultats.
5 Réactifs et matériel
5.1 Matériel biologique: au cours de cet essai, des collemboles juvéniles âgés de 10 à 12 jours, de
l’espèce Folsomia candida (Willem), sont utilisés (voir A.1 pour les détails concernant la synchronisation
de l’élevage).
5.2 Mélange d’essai, pouvant être constitué d’un sol prélevé sur le terrain ou d’un sol témoin amendé
par la substance soumise à essai.
5.2.1 Sol ou déchets prélevé(s) sur le terrain
Le ou les échantillons peuvent être un sol prélevé sur le terrain d’un site industriel, agricole ou d’un
autre site d’intérêt, ou des déchets (par exemple, matériau de dragage, boues provenant d’une station
d’épuration des eaux urbaines, matériau composite ou fumier) pour lesquels une éventuelle mise en
dépôt terrestre est envisagée.
Les sols prélevés sur le terrain et utilisés au cours l’essai doivent être passés dans un tamis à mailles
carrées de 4 mm et être soigneusement mélangés. Si nécessaire, le sol peut être séché à l’air sans
chauffage avant le tamisage. Il convient que la conservation des sols soumis à essai soit aussi courte
que possible. Le sol doit être conservé conformément à l’ISO 10381-6 en utilisant des récipients qui
réduisent au minimum les pertes de contaminants du sol par volatilisation et sorption sur les parois des
récipients. Si des sols ou des mélanges d’essai ont été conservés, il convient de les mélanger une nouvelle
fois avant de les utiliser. Il convient de ne pas rectifier le pH du sol car il peut avoir une incidence sur la
biodisponibilité des contaminants du sol.
Pour l’interprétation des résultats d’essai, les caractéristiques suivantes doivent être déterminées pour
chaque échantillon de sol prélevé sur un terrain:
a) pH conformément à l’ISO 10390;
b) texture (sable, limon, vase) conformément à l’ISO 11277;
c) teneur en eau conformément à l’ISO 11465;
d) capacité de rétention d’eau conformément à l’Annexe B;
e) capacité d’échange cationique conformément à l’ISO 11260;
f) carbone organique conformément à l’ISO 10694;
g) pourcentage de matériel retenu par le tamis de 4 mm.
NOTE Il est important de mesurer la capacité de rétention d’eau de tous les mélanges utilisés dans l’essai.
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5.2.2 Sol témoin, soit a) sol de référence (3.9) soit b) sol standard (3.10) permettant la présence de
collemboles. Le sol témoin et le sol utilisé pour la dilution ne doivent pas différer l’un de l’autre au cours
d’un essai [soit a) soit b)].
a) Si des sols de référence provenant de zones non contaminées voisines d’un site contaminé sont
disponibles, il convient de les traiter et de les caractériser de la même manière que les sols soumis
à essai. S’il est impossible d’exclure une contamination toxique ou des propriétés inhabituelles, il
convient de préférer des sols témoins standards.
b) Pour évaluer les effets de substances mélangées au sol, des sols standards (par exemple, sol artificiel,
sol LUFA) doivent être utilisés comme substrat d’essai. Les propriétés du sol standard prélevé sur le
terrain doivent être consignées dans le rapport.
Le substrat appelé «sol artificiel» peut être utilisé comme un sol standard et a la composition suivante:
Pourcentage exprimé en masse sèche
− Tourbe de sphaignes, finement moulue          10 %
(une classe granulométrique de (2 ± 1) mm est
acceptable), exempte de tout résidu végétal
visible
− Argile kaolinique contenant au moins          20 %
30 % de kaolinite
− Sable de quartz industriel (contenant en          69 %
majorité du sable fin constitué à plus de 50 %
de grains dans la classe granulométrique de
0,05 mm à 0,2 mm)
Environ 0,3 % à 1,0 % de carbonate de calcium (CaCO , pulvérisé, de qualité analytique) sont nécessaires
pour obtenir un pH de 6,0 ± 0,5.
NOTE 1 Compte tenu des propriétés des substances fortement non polaires (log K > 2) ou ionisantes, 5 % de
ow
tourbe se sont avérés suffisants pour maintenir la structure souhaitée du sol artificiel.
NOTE 2 Il a été démontré que Folsomia candida peut respecter les critères de validité, même en ce qui concerne
la reproduction, lorsqu’il est soumis à essai dans des sols ayant une plus faible teneur en carbone organique
(par exemple 2,7 %), et des expériences prouvent que cette teneur peut être obtenue dans un sol artificiel avec 5 %
de tourbe. Par conséquent, avant d’utiliser un tel sol dans un essai définitif, il n’est pas nécessaire de démontrer
que le sol artificiel permet de réaliser l’essai conformément aux critères de validité, sauf si la teneur en tourbe est
inférieure à la valeur spécifiée ci-dessus.
Préparer le sol artificiel au moins trois jours avant le début de l’essai, en mélangeant soigneusement
les constituants secs indiqués ci-dessus dans un mélangeur de laboratoire de grandes dimensions.
Une partie de l’eau déionisée nécessaire est ajoutée pendant le mélange. Il convient de tenir compte de
l’eau qui est utilisée pour introduire la substance soumise à essai dans le sol. La quantité de carbonate
de calcium nécessaire peut varier selon les propriétés du lot particulier de tourbe de sphaignes et il
convient qu’elle soit déterminée par des mesurages effectués sur des sous-échantillons immédiatement
avant l’essai. Conserver le sol artificiel mélangé à température ambiante pendant au moins deux jours
pour équilibrer l’acidité. Pour déterminer le pH et la capacité maximale de rétention d’eau, le sol artificiel
sec est pré-humidifié un ou deux jours avant le début de l’essai en ajoutant de l’eau déionisée de manière
à atteindre la moitié de la teneur finale en eau requise comprise entre 40 % et 60 % de la capacité
maximale de rétention d’eau.
La capacité totale de rétention d’eau est déterminée conformément à l’Annexe C, le pH est déterminé
conformément à l’ISO 10390.
5.3 Alimentation
Une source de nourriture appropriée, constituée d’une quantité suffisante, de 2 à 10 mg par exemple, de
levure de boulanger sèche en granulés, disponible dans le commerce pour un usage ménager, est ajoutée
à chaque récipient au début de l’essai puis deux semaines environ après le début de l’essai.
5.4 Substance de référence
Pour assurer la qualité du système d’essai, il convient d’effectuer des essais à intervalles réguliers (une
ou deux fois par an) en utilisant une substance de référence.
1)
L’acide borique et le produit phytosanitaire Betosip (157 g/l phenmedipham) ont été soumis à essai lors
d’un essai interlaboratoires, et leur utilisation en tant que substances de référence est recommandée.
AVERTISSEMENT — Lors de la manipulation de ces substances, il convient de prendre toutes les
précautions nécessaires pour éviter toute ingestion ou tout contact avec la peau.
NOTE 1 Acide borique: des effets sur la reproduction ont été observés à des concentrations (CE ) de 147 mg
d’acide borique/kg de sol artificiel en masse sèche et de 169 mg d’acide borique/kg de sol de limon argileux en
[5] [21]
masse sèche.
NOTE 2 Betosip: des effets sur la reproduction (α = 0,05) ont été observés à des concentrations comprises entre
100 mg et 200 mg du produit par kilogramme de masse sèche de substrat.
6 Appareillage
Utiliser du matériel de laboratoire et l’appareillage suivant:
6.1 Récipients d’essai, en verre ou autre matériau chimiquement inerte, d’une capacité d’environ
100 ml et d’un diamètre d’environ 5 cm, munis d’opercules (par exemple, couvercle en plastique, disques
en verre ou film plastique) pouvant être fermés hermétiquement.
6.2 Appareillage permettant de déterminer la masse sèche du substrat conformément à l’ISO 11465.
6.3 Mélangeur de laboratoire de grandes dimensions pour la préparation du mélange d’essai (5.2).
6.4 Balances de précision adaptée.
6.5 Appareillage permettant de mesurer le pH et la teneur en eau du substrat.
6.6 Appareil d’aspiration pour le transfert des collemboles (voir A.2).
6.7 Environnement d’essai.
6.7.1 Enceinte, thermostatée à 20 °C ± 2 °C.
6.7.2 Source lumineuse, permettant de soumettre les récipients à une intensité lumineuse constante
de 400 Ix à 800 Ix à la surface du substrat, selon un cycle contrôlé lumière/obscurité compris entre
12 h:12 h et 16 h:8 h.
1) Betosip est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l’intention
des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif
du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux
mêmes résultats.
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7 Mode opératoire
7.1 Plan d’expérimentation
7.1.1 Généralités
Un échantillon de sol prélevé sur le terrain peut être soumis à essai à une seule concentration
(généralement 100 %) ou évalué en termes de toxicité par un essai à plusieurs concentrations pour lequel
une gamme de concentrations (dilutions) est préparée en mélangeant des quantités mesurées avec un
sol témoin (5.2.2). Lorsque des substances sont soumises à essai, une gamme de concentrations est
préparée en mélangeant des quantités de la substance soumise à essai avec un sol standard (par exemple
un sol artificiel). Les concentrations étant exprimées en milligrammes de substance soumise à essai
par kilogramme de sol témoin équivalent sec (5.2.2). Selon que les niveaux de réponse pertinents sont
connus ou non, un essai préliminaire peut précéder l’essai définitif. Chaque essai définitif comprend une
gamme de mélanges de sols (traitements).
7.1.2 Essai préliminaire
L’essai permettant de déterminer la gamme de ratios de mélange de concentrations de substances
soumises à essai affectant les Collembola est facultatif, par exemple ratios de mélange de 0 %, 1 %,
5 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %, ou concentrations de substance soumise à essai de 0 mg/kg, 1 mg/kg,
10 mg/kg, 100 mg/kg et 1 000 mg/kg. L’essai préliminaire est effectué sans répétition.
Lorsqu’aucun effet n’est observé, même avec un sol contaminé à 100 % ou à une concentration de
substance soumise à essai de 1 000 mg/kg de sol standard (équivalent sec), l’essai définitif peut être
conçu comme un essai limite.
Chaque récipient d’essai (réplicat) est rempli de 30 g de masse humide de l’échantillon d’essai. Pour
assurer une migration aisée des collemboles, il convient que le substrat dans le récipient d’essai ne soit
pas tassé.
Utiliser 10 spécimens de collemboles âgés de 10 à 12 jours par récipient. Préparer les récipients d’essai
en procédant comme indiqué en 7.2.1. Placer les récipients d’essai dans l’enceinte d’essai (6.7.1) avec la
source lumineuse (6.7.2).
Au début de l’essai, ajouter environ 2 mg de levure sèche en granulés (5.3) à chaque récipient d’essai
et couvrir hermétiquement les récipients (par exemple, à l’aide de couvercle en plastique, de disques
en verre ou d’un film plastique). Aérer les récipients d’essai en les ouvrant brièvement deux fois par
semaine.
Au bout de 14 jours, compter le nombre de collemboles vivants dans chaque récipient et déterminer le
pourcentage de mortalité pour chaque concentration en substance soumise à essai. Observer également
les collemboles survivants et noter tout symptôme. En raison de la dégradation rapide des collemboles
morts, on suppose que les collemboles manquants sont morts durant la période d’essai.
NOTE Pour obtenir des informations supplémentaires pour la détermination de la gamme de concentrations
pour l’essai final, la période d’essai peut être étendue à quatre semaines afin de permettre une détermination
qualitative des effets à des concentrations auxquelles des effets sur la reproduction pourraient être attendus.
7.1.3 Essai définitif
La conception de l’essai définitif dépend des objectifs de l’essai. Les propriétés d’habitat des échantillons
de sol prélevé sur le terrain sont généralement caractérisées en comparant les effets biologiques
observés dans le(s) sol(s) soumis à essai avec ceux observés dans un sol de référence, ou si celui-ci n’est
pas disponible ou n’est pas approprié en raison de sa toxicité ou de caractéristiques physico-chimiques
atypiques, dans un sol standard. Les résultats pour le sol standard aident à faire la distinction entre
les effets liés aux contaminants et les effets non liés aux contaminants provoqués par des propriétés
physico-chimiques. Indépendamment du fait qu’un sol de référence ou un sol standard soit utilisé pour
les comparaisons statistiques, les résultats obtenus à partir du sol standard doivent être utilisés pour
[20]
évaluer la validité et l’acceptabilité de l’essai.
Si, à des fins de caractérisation, une conception d’essai incluant une gamme de dilutions est nécessaire,
trois conceptions sont possibles (les concentrations doivent être espacées par un facteur inférieur ou
égal à 2):
— Pour la méthode CSEO/RSEO, il convient d’utiliser une série géométrique d’au moins
cinq concentrations. Quatre réplicats pour chaque concentration et huit témoins sont recommandés.
— Pour la méthode CEx, il convient d’utiliser 12 concentrations. Deux réplicats pour chaque
concentration et six témoins sont recommandés. Le facteur de séparation peut être variable: plus
petit pour les concentrations faibles, plus grand pour les concentrations élevées.
— Pour la méthode mixte, il convient d’utiliser une série géométrique de six à huit concentrations.
Quatre réplicats pour chaque concentration et huit témoins sont recommandés. Cette méthode
mixte permet d’évaluer la CSEO ainsi que la CEx.
Un essai limite peut suffire si aucun effet toxique n’a été observé au cours de l’essai préliminaire.
Pour faciliter la vérification du pH et de l’humidité de l’échantillon d’essai, il est recommandé d’utiliser
des récipients supplémentaires pour chaque concentration et pour le témoin.
Chaque récipient d’essai (réplicat) est rempli de 30 g de masse humide de l’échantillon d’essai. Pour
assurer une migration aisée des collemboles, il convient que le substrat dans le récipient d’essai ne soit
pas tassé.
7.2 Préparation du mélange d’essai
7.2.1 Essai d’un sol contaminé
Conformément à la gamme de dilutions choisie, le sol soumis à essai est soigneusement mélangé au sol
de référence ou au sol standard (manuellement ou à l’aide d’un mélangeur à main). L’homogénéité du
mélange est contrôlée visuellement. La masse totale du sol soumis à essai et du sol de référence ou du
sol standard doit être de 30 g (masse humide) dans chaque récipient d’essai (6.1). Le mélange d’essai doit
être humidifié avec de l’eau déionisée pour atteindre 40 % à 60 % de la capacité totale de rétention d’eau
déterminée conformément à l’Annexe B. Dans certains cas, par exemple lorsque l’essai est réalisé sur des
déchets, des pourcentages plus élevés sont nécessaires. Une vérification sommaire de la teneur en eau
du sol peut être obtenue en comprimant légèrement le sol dans la main; si la teneur en eau est correcte,
de petites gouttes d’eau apparaissent entre les doigts.
Déterminer le pH pour chaque mélange d’essai (un récipient par concentration) conformément à
l’ISO 10390 au début et à la fin de l’essai (lorsque des substances acides ou basiques sont soumises à
essai, ne pas ajuster le pH).
Réaliser l’essai simultanément sur au moins quatre réplicats par concentration et sur le(s) témoin(s).
AVERTISSEMENT — Les sols contaminés peuvent contenir des mélanges inconnus de substances
toxiques, mutagènes ou nocives ou des micro-organismes infectieux. Des risques pour la santé
au travail peuvent survenir en raison de la poussière ou de l’évaporation de substances ainsi que
par contact cutané pendant la manipulation et l’incubation.
7.2.2 Essai de substances ajoutées au substrat d’essai
Un sol témoin (5.2.2) est utilisé pour préparer l’échantillon d’essai. Pour chaque récipient d’essai (6.1),
la masse du substrat utilisé doit être de 30 g (masse humide). Des substances sont ajoutées au substrat
d’essai, puis le tout est soigneusement mélangé.
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Pour l’introduction des substances soumises à essai, utiliser la méthode a), b) ou c), selon le cas:
a) Substance hydrosoluble
— immédiatement avant le début de l’essai, dissoudre la quantité de substance soumise à essai
dans l’eau ou une partie nécessaire de cette substance pour humidifier les échantillons de sol
pour les réplicats d’une concentration afin de satisfaire aux exigences de 5.2.2, puis mélanger
soigneusement avec le sol avant d’introduire le tout dans le récipient d’essai.
b) Substances insolubles dans l’eau mais solubles dans les solvants organiques
— Dissoudre dans un solvant volatile (tel que l’acétone ou l’hexane) la quantité de substance
soumise à essai nécessaire pour obtenir la concentration désirée et la mélanger avec la quantité
nécessaire de sable de quartz. Après avoir évaporé le solvant en installant le récipient sous une
hotte aspirante, ajouter le reste du sol et l’eau et mélanger soigneusement avant d’introduire le
tout dans les récipients d’essai.
NOTE Pour disperser les substances peu solubles dans l’eau, il est possible d’avoir recours aux ultrasons, à
des solvants organiques, à des émulsifiants ou à des dispersants. Dans ce cas, il convient que les concentrations
soumises à essai et un témoin supplémentaire contiennent la même quantité minimale de substance auxiliaire.
AVERTISSEMENT — Les vapeurs de solvant imposent que l’on prenne des précautions appropriées
pour éviter les risques d’inhalation ou d’explosion, et pour éviter d’endommager le matériel
d’extraction, les pompes, etc.
c) Substances insolubles dans l’eau ou dans les solvants organiques
— Pour une substance insoluble dans un solvant volatile, préparer un mélange de 10 g de sable
de quartz industriel finement broyé (voir 5.2.2) et la quantité de substance soumise à essai
nécessaire pour obtenir la concentration souhaitée. Ajouter ce mélange au reste du sol et à l’eau
et mélanger soigneusement avant d’introduire le tout dans un récipient d’essai.
Les concentrations permettant d’obtenir la CMEO/CSEO doivent être choisies sur la base des résultats de
l’essai préliminaire. Les concentrations doivent être espacées par un facteur inférieur ou égal à 2.
Il n’est pas nécessaire de soumettre à essai les substances mélangées au substrat à des concentrations
supérieures à 1 000 mg/kg d’échantillon d’essai.
Réaliser l’essai simultanément sur tous les réplicats par concentration et sur le(s) témoin(s) nécessaires
conformément à l’approche choisie.
Déterminer le pH pour chaque mélange d’essai (un récipient par concentration) conformément à
l’ISO 10390 au début et à la fin de l’essai.
7.2.3 Préparation du récipient témoin
Le récipient témoin contient le sol témoin (5.2.2) humidifié avec de l’eau déionisée pour atteindre 40 %
à 60 % de la capacité totale de rétention d’eau (déterminée conformément à l’Annexe B).
Préparer un récipient témoin pour l’essai préliminaire et au moins quatre récipients témoins pour l’essai
définitif.
Préparer les récipients témoins de la même manière que les récipients d’essai. Si la préparation de l’essai
nécessite l’utilisation d’un solvant (voir 7.2.2), utiliser un témoin supplémentaire préparé avec le solvant
mais sans la substance soumise à essai. Couvrir les récipients comme indiqué en 6.1.
7.3 Ajout du matériel biologique
Dix collemboles juvéniles (âgés de 10 à 12 jours) sont placés dans chaque récipient d’essai.
Les collemboles sont soutirés ou aspirés dans les récipients d’élevage pour être transférés dans les
récipients d’essai. Cette opération peut être aisément réalisée au moyen d’un appareil d’aspiration tel
que décrit en A.2. Avant d’être transférés vers les récipients d’essai, les organismes sont comptés et leur
état est vérifié afin de réduire la mortalité témoin et d’éviter les erreurs systématiques d’essai.
7.4 Conditions d’essai et mesures
Au début de l’essai et après une période de 14 jours, ajouter environ 2 mg de levure sèche en granulés (5.3)
à chaque récipient d’essai et couvrir hermétiquement les récipients (par exemple à l’aide de couvercle
en plastique, de disques en verre ou de film plastique). Pour aérer les récipients d’essai, les ouvrir
brièvement deux fois par semaine.
Déterminer la teneur en eau et le pH du sol au début et à la fin de l’essai pour un récipient dans chacune
des conditions d’essai. Lorsque les essais portent sur des substances acides ou basiques, l’ajustement du
pH n’est pas nécessaire.
Au bout de deux semaines, vérifier la teneur en eau en pesant à nouveau les récipients d’essai
supplémentaires et compenser la perte d’eau si celle-ci dépasse 2 % de la teneur en eau initiale.
7.5 Détermination du nombre de collemboles survivants
Déterminer le nombre de collemboles présents, quatre semaines après avoir introduit les collemboles
parents sur les substrats d’essai et les substrats témoins. Verser l’échantillon d’essai dans un récipient
d’essai d’une capacité de 500 ml à 600 ml et ajouter de l’eau. Après une agitation modérée de la
suspension à l’aide d’une spatule, les collemboles remontent à la surface de l’eau. Compter les adultes et
les juvéniles, s’ils sont présents, en utilisant une méthode appropriée (voir Annexe D) et consigner les
nombres d’individus.
NOTE D’autres méthodes d’extraction (par exemple extraction à gradient élevé) peuvent être employées si
leur efficacité a été démontrée.
8 Calcul et expression des résultats
8.1 Calcul
Déterminer pour chaque dilution ou concentration, le pourcentage de mortalité et le nombre de larves
produites après une période de quatre semaines.
8.2 Expression des résultats
Il convient de préparer une représentation graphique des valeurs moyennes des critères d’effet, incluant
l’écart-type des valeurs mesurées pour le(s) sol(s) soumis à essai, le(s) sol(s) témoin(s) ou les ratios
de mélange d’essai. Cette comparaison ou courbe donne un aperçu de la qualité des
...