ISO 22184:2021

Milk and milk products — Determination of the sugar contents — High performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection method (HPAEC-PAD)

This document specifies the quantitative liquid chromatographic determination of specific sugars (galactose, glucose, fructose, sucrose, lactose and maltose) in various milk and milk products, applying arabinose as an internal standard. The method is applicable to the following dairy matrices: milk, sweetened condensed milk, milk powder, cheese, whey powder, infant formula, milk dessert and yoghurt. The method does not apply to dairy products containing soy or to the determination of the lactose content in low-lactose milk products at levels below 1 mg/g. A high performance anion exchange chromatography method in combination with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD) method is applied[5][3][4]. With this method, thirteen different monosaccharides, disaccharides and trisaccharides can be separated: fucose, arabinose, galactose, glucose, fructose, sucrose, lactose, lactulose, maltose, melibiose, trehalose, isomaltulose and maltotriose. The method is applicable to labelling for the six most important sugars that can be present by nature or by addition in milk and milk products. The method does not apply to sugar contents less than 0,1 %.

Lait et produits laitiers — Détermination de la teneur en sucre — Chromatographie d’échange d’anions haute performance couplée à la détection par ampérométrie pulsée (HPAEC-PAD)

Le présent document spécifie la détermination quantitative par chromatographie en phase liquide de certains sucres (galactose, glucose, fructose, saccharose, lactose et maltose) dans divers laits et produits laitiers, en utilisant l'arabinose comme étalon interne. Cette méthode s'applique aux matrices laitières suivantes: lait, lait concentré sucré, lait en poudre, fromage, lactosérum en poudre, formule infantile, dessert lacté et yaourt. Cette méthode ne s'applique pas aux produits laitiers contenant du soja ni à la détermination de la teneur en lactose des produits laitiers à faible teneur en lactose inférieure à 0,1 mg/g. Cette méthode s'appuie sur la chromatographie d'échange d'anions à haute performance couplée à la détection par ampérométrie pulsée (HPAEC-PAD)[5][3][4]. Treize monosaccharides, disaccharides et trisaccharides différents peuvent être séparés par cette méthode: fucose, arabinose, galactose, glucose, fructose, saccharose, lactose, lactulose, maltose, mélibiose, tréhalose, isomaltulose et maltotriose. Cette méthode s'applique à l'étiquetage des six principaux sucres qui peuvent être présents naturellement ou ajoutés dans le lait et les produits laitiers. Cette méthode ne s'applique pas aux teneurs en sucre inférieures à 0,1 %.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 02-Feb-2021
• ICS: 67.100.01 - Milk and milk products in general
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Current Stage: 6060 - International Standard published
• Start Date: 03-Feb-2021
• Due Date: 10-Mar-2020
• Completion Date: 03-Feb-2021

Relations

• Consolidates: ISO 11298-3:2018 - Plastics piping systems for renovation of underground water supply networks — Part 3: Lining with close-fit pipes
• Effective Date: 06-Jun-2022

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 22184
IDF 244
First edition
2021-02
Milk and milk products —
Determination of the sugar contents
— High performance anion exchange
chromatography with pulsed
amperometric detection method
(HPAEC-PAD)
Lait et produits laitiers — Détermination de la teneur en sucre —
Chromatographie d’échange d’anions haute performance couplée à la
détection par ampérométrie pulsée (HPAEC-PAD)
Reference numbers
ISO 22184:2021(E)
IDF 244:2021(E)
©
ISO and IDF 2021

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COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
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Contents Page
Foreword .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
5 Reagents . 2
6 Apparatus . 4
7 Sampling . 6
8 Preparation of the test sample . 6
8.1 General . 6
8.2 Sample preparation of sweetened condensed milk . 6
8.2.1 Samples of recently manufactured products in which no appreciable
separation of components can be expected . 6
8.2.2 Samples of older products and samples in which separation of
components can be expected . 6
9 Procedure. 7
9.1 Sample extraction and clean up . 7
9.1.1 General. 7
9.1.2 Sample extraction and clean-up . 7
9.2 Chromatographic analysis . 9
10 Calculation and expression of the results .10
11 Precision .11
11.1 General .11
11.2 Repeatability .11
11.3 Reproducibility .13
12 Test report .16
Annex A (informative) Precision data .17
Annex B (informative) Accuracy data .23
Bibliography .25
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Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national
standards bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally
carried out through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which
a technical committee has been established has the right to be represented on that committee.
International organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part
in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all
matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www .iso .org/
iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC
5, Milk and milk products, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN)
Technical Committee CEN/TC 302, Milk and milk products — Methods of sampling and analysis, in
accordance with the Agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement),
and the International Dairy Federation (IDF). It is being published jointly by ISO and IDF.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
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IDF (the International Dairy Federation) is a non-profit private sector organization representing the
interests of various stakeholders in dairying at the global level. IDF members are organized in National
Committees, which are national associations composed of representatives of dairy-related national
interest groups including dairy farmers, dairy processing industry, dairy suppliers, academics and
governments/food control authorities.
ISO and IDF collaborate closely on all matters of standardization relating to methods of analysis
and sampling for milk and milk products. Since 2001, ISO and IDF jointly publish their International
Standards using the logos and reference numbers of both organizations.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
This document was prepared by the IDF Standing Committee on Analytical Methods for Composition and
ISO Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk products. It is
being published jointly by ISO and IDF.
The work was carried out by the IDF/ISO Action Team C22 of the Standing Committee on Analytical
Methods for Composition under the aegis of its project leader Mr H. Cruijsen (NL).
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INTERNATIONAL STANDARD
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Milk and milk products — Determination of the
sugar contents — High performance anion exchange
chromatography with pulsed amperometric detection
method (HPAEC-PAD)
1 Scope
This document specifies the quantitative liquid chromatographic determination of specific sugars
(galactose, glucose, fructose, sucrose, lactose and maltose) in various milk and milk products, applying
arabinose as an internal standard.
The method is applicable to the following dairy matrices: milk, sweetened condensed milk, milk powder,
cheese, whey powder, infant formula, milk dessert and yoghurt.
The method does not apply to dairy products containing soy or to the determination of the lactose
content in low-lactose milk products at levels below 1 mg/g.
A high performance anion exchange chromatography method in combination with pulsed amperometric
[5][3][4]
detection (HPAEC-PAD) method is applied . With this method, thirteen different monosaccharides,
disaccharides and trisaccharides can be separated: fucose, arabinose, galactose, glucose, fructose,
sucrose, lactose, lactulose, maltose, melibiose, trehalose, isomaltulose and maltotriose.
The method is applicable to labelling for the six most important sugars that can be present by nature
or by addition in milk and milk products. The method does not apply to sugar contents less than 0,1 %.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
3 Terms and definitions
No terms and definitions are listed in this document.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
4 Principle
The sugars present in the sample are extracted with an aqueous ethanol buffer solution in order to
inhibit potential probiotic activities. The obtained extract is deproteinized with a Carrez clarification.
After clarification, the solution is diluted and the sugars present are separated and quantified by
HPAEC. HPAE allows carbohydrates separation at high pH. In order to improve sensitivity and stability,
post-column sodium hydroxide solution is added to the HPAEC-PAD. GOS (galacto-oligosaccharides) and
[5]
fructans do not interfere with the analysis of the sugars . Arabinose is applied as an internal standard
for the quantification of the sugars.
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5 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade and water in accordance with ISO 3696, unless
otherwise specified.
5.1 Water, conforming to ISO 3696, grade 3 and grade 1.
5.2 Sodium hydroxide (NaOH) pellets.
5.3 Aqueous sodium hydroxide solution, substance concentration c = 1 mol/l.
Add to a 1 000 ml volumetric flask 40 g ± 1 g NaOH pellets (5.2), dissolve in about 500 ml of water and,
after cooling down, dilute with water to the mark and homogenize.
5.4 Sodium hydroxide solution, mass fraction w(NaOH) = 33 % in water.
5.5 Sodium hydroxide solution, mass fraction w(NaOH) = 50 % in water.
The amount of carbonate and mercury in the reagent should be minimized. Do not shake or stir the
solution before use. A suitable commercially available carbonate sodium hydroxide solution may also
be used.
5.6 Concentrated hydrochloric acid (HCl), mass fraction of 36 % to 38 % in water.
5.7 Aqueous hydrochloric acid solution, c = 1 mol/l.
Add to a 1 000 ml volumetric flask (6.2) 500 ml of water followed by 83 ml of concentrated HCl (5.6)
and, after cooling down, dilute with water to the mark and homogenize.
5.8 Acetonitrile (HPLC quality).
5.9 Acetonitrile in water, a volume fraction of 5 % in water.
Add to a 1 000 ml volumetric flask (6.2) 50 ml of acetonitrile (5.8), dilute with water grade 3 to the
mark and homogenize.
5.10 Anhydrous sodium acetate (CH COONa) (HPLC quality).
3
5.11 Eluent 1 (E1), aqueous solution of sodium acetate (CH COONa), c = 1,0 mol/l.
3
Add to a 1 000 ml volumetric flask (6.2) about 800 ml of degassed water grade 1 (eluent 3, 5.13) followed
by 82,0 g sodium acetate (5.10). Then dilute the aqueous solution with degassed water (eluent 3, 5.13)
to the mark and homogenize. Store the eluent under an inert atmosphere.
5.12 Eluent 2 (E2), aqueous solution of carbonate free sodium hydroxide (NaOH), c = 0,2 mol/l.
Add to a 1 000 ml volumetric flask (6.2) about 800 ml of degassed water grade 1 (eluent 3, 5.13) and
purge for 15 min with helium. Add 16,0 g of sodium hydroxide solution (5.5). Then quickly dilute the
aqueous solution with degassed water grade 1 (eluent 3, 5.13) to the mark, immediately close the bottle
and homogenize. Store the eluent under an inert atmosphere.
5.13 Eluent 3 (E3), degassed water grade 1, stored under an inert atmosphere.
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5.14 Eluent 4 (E4), aqueous solution of sodium acetate (CH COONa), c = 0,025 mol/l.
3
Add to a 1 000 ml volumetric flask (6.2) about 800 ml of degassed water grade 1 (eluent 3, 5.13) followed
by 2,05 g of sodium acetate (5.10). Then dilute the aqueous solution with degassed water (eluent 3,
5.13) to the mark and homogenize. Store the eluent under an inert atmosphere.
5.15 Post column reagent, aqueous solution of sodium hydroxide, c = 0,3 mol/l.
Add to a 1 000 ml volumetric flask (6.2) about 800 ml of degassed water grade 1 (eluent 3, 5.13). Purge
for 15 min with helium. Add 24,0 g of sodium hydroxide solution (5.5) and quickly fill up to the mark
with the degassed water grade 1 (eluent 3, 5.13). Immediately close the flask and homogenize. Store the
post column reagent under an inert atmosphere.
IMPORTANT — It is extremely important to remove dissolved carbon dioxide from the eluents
and post column reagent prior to use and during use to avoid fast reduction in detector
sensitivity. The eluents and post column reagent are maintained under an inert gas during use.
5.16 Mixture of a volume fraction of 95 % of ethanol (with a volume fraction of 96 % ethanol and
4 % of water) and a volume fraction of 5 % methanol.
5.17 Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate, K Fe(CN) ·3H O.
4 6 2
5.18 Zinc acetate dihydrate, Zn(CH COO) ·2H O.
3 2 2
5.19 Glacial acetic acid.
5.20 Carrez reagent I.
Weigh 106 g of K Fe(CN) ·3H O (5.17) in a 1 000 ml volumetric flask (6.2), dissolve in 800 ml of water
4 6 2
(5.1) and dilute with water grade 3 to the mark. Store the Carrez reagent I in the refrigerator.
5.21 Carrez reagent II.
Weigh 220 g of Zn(CH COO) ·2H O (5.18) in a 1 000 ml volumetric flask (6.2), dissolve in 800 ml water,
3 2 2
add 30 ml of glacial acetic acid (5.19) and dilute with water grade 3 to the mark. Store the Carrez reagent
II in the refrigerator.
IMPORTANT — Do not use Carrez reagent II with zinc sulfate.
5.22 Buffer solution of piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) (c = 1,5 mol/l and
pH = 6,9).
Add 22,5 g of the PIPES buffer solution to a 100 ml conical flask and add 20 ml of sodium hydroxide
solution (5.3). Adjust the pH to pH = 6,9 with NaOH 33 % (5.4) in water. Transfer the PIPES buffer
solution quantitatively into a 50 ml calibrated tube and fill up with water grade 3 till 50 ml. The pH of
the obtained buffer solution shall be within the range of 6,8 to 7,0.
5.23 Arabinose.
5.24 Galactose.
5.25 Glucose.
5.26 Fructose.
5.27 Sucrose.
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IDF 244:2021(E)
5.28 Lactose.
5.29 Maltose.
5.30 Internal standard stock solution arabinose.
Weigh, to the nearest mg, approximately 7 g of arabinose (5.23) into a 50 ml volumetric flask (6.2). Add
about 30 ml of water grade 3 and dissolve the arabinose. Add 2,5 ml of acetonitrile (5.8), fill up to the
mark with water and homogenize the solution.
5.31 Sugar standard stock solution.
Weigh, to the nearest 0,1 mg, approximately 260 mg of the monosaccharides galactose (5.24), glucose
(5.25) and fructose (5.26), and approximately 400 mg of the disaccharide sucrose (5.27), lactose (5.28)
and maltose (5.29) into a 500 ml volumetric flask (6.2). Add about 200 ml of water grade 3 and dissolve
the sugars. Add 25 ml of acetonitrile (5.8), fill up to the mark with water grade 3 and homogenize the
solution.
5.32 Sugar standard solutions for calibration.
Prepare the different dilutions of the sugar calibration standards as specified in Table 1. Mix the
specified volumes of the internal standard stock solution arabinose (5.30) and sugar standard stock
solution (5.31) in a 200 ml volumetric flask, add about 50 ml of water grade 3 and homogenize. Add
10 ml of acetonitrile (5.8), fill up to the mark with water and homogenize.
Table 1 — Preparation of the sugar standard solutions for calibration
Volume of sugar standard Volume of arabinose internal
Sugar standard solution stock solution (5.31) standard stock solution (5.30)
ml ml
1 0,2 0,050
2 1,0 0,050
3 6,0 0,050
4 10,0 0,050
5 20,0 0,050
6 40,0 0,050
7 80,0 0,050
8 100,0 0,050
6 Apparatus
6.1 Analytical balance, capable of weighing to an accuracy of ±0,1 mg.
6.2 Volumetric flask, volume of 50 ml, 500 ml and 1 000 ml.
6.3 pH meter.
6.4 Black band filter paper.
6.5 Centrifugation tubes.
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ISO 22184:2021(E)
IDF 244:2021(E)
1)
6.6 Homogenizer .
6.7 Vortex mixer.
6.8 Screw cap closed graduated tubes, 50 ml volume.
6.9 Positive displacement multipipette.
6.10 Dispensers, resistant to organic solvent and adjusted to 2,5 ml and 25 ml.
6.11 HPLC vials.
2)
6.12 Metal-free liquid chromatographic system, e.g. Thermo Dionex ICS 3000 , applicable for a
(quaternary) gradient elution.
6.13 Column oven, with a temperature stability of ±1 °C with an operating temperature of 20 °C to 35 °C.
3)
6.14 High performance anion exchange analytical column , filled with pellicular polystyrene-
divinylbenzene resin or filled with an anion exchanger resin enabling the required separation.
4)
6.15 High performance anion exchange guard column , filled with pellicular polystyrene-
divinylbenzene resin or filled with an anion exchanger resin enabling the required separation.
5)
6.16 Pulsed amperometric detector (PAD) with a stability of ±1 °C and an operating temperature
range of 20 °C to 35 °C.
Use pulsed amperometric detection and potential settings and waveforms recommended by the
instrument supplier. Example detector potential settings (versus Ag/AgCl reference) are given in
Table 2.
6)
6.17 Metal-free post column reagent pump .
1) An Ultra turrax with an appropriate probe is an example of a suitable homogenizer available commercially. This
information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO
or IDF of this product.
2) Thermo Dionex ICS 3000 is an example of a suitable homogenizer available commercially. This information is
given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of this
product.
3) A Thermo-Dionex Carbopac PA1 analytical column (2 mm × 250 mm) is an example of a suitable high
performance anion exchange column available commercially. This information is given for the convenience of users
of this document and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of this product.
4) A Dionex Carbopac PA1 guard column (2 mm × 50 mm) is an example of a suitable high performance anion
exchange column available commercially. This information is given for the convenience of users of this document
and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of this product.
5) A Thermo-Dionex model PAD is an example of a suitable PAD available commercially. This information is given
for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of this product.
6) A single piston Thermo Dionex Axp pump is an example of a suitable metal-free post column reagent pump
available commercially. This information is given for the convenience of users of this document and does not
constitute an endorsement by ISO or IDF of this product.
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ISO 22184:2021(E)
IDF 244:2021(E)
7)
6.18 Integrator chromatography data system .
Table 2 — Time programming of the detector potential settings of the gold working electrode
a
Time Potential gold electrode Integration detector
Step
s signal
1 0,00 0,10
2 0,20 0,10 Start
3 0,40 0,10 End
4 0,41 −2,00
5 0,42 −2,00
6 0,43 0,60
7 0,44 −0,10
8 0,50 −0,10
a
Potential versus Ag/AgCl reference electrode.
NOTE The integration window is 0,20 s to 0,40 s.
7 Sampling
It is important that the laboratory receives a sample that is truly representative and has not been
damaged or changed during transport and/or storage. Sampling is not a part of the method specified in
this document.
8 Preparation of the test sample
8.1 General
Prepare the sample in accordance with an appropriate sampling procedure. Sweetened condensed milk
requires a dedicated sample preparation, see ISO 2911 | IDF 35 and 8.2.
8.2 Sample preparation of sweetened condensed milk
8.2.1 Samples of recently manufactured products in which no appreciable separation of
components can be expected
Open the container, transfer all material adhering to the lid into the container and thoroughly mix by an
up-and-down movement of a spoon, in such a way that the top layers and contents of the lower corners
are moved and mixed. When the product is in a can, transfer the contents into a jar with a well-fitting
lid. When the product is in a collapsible tube, transfer as much as possible of the content to a jar with a
well-fitting lid, then cut open the tube, scrape out all material adhering to the interior and also transfer
this to the jar. Mix the contents of the jar as described above.
8.2.2 Samples of older products and samples in which separation of components can be
expected
Heat the sample in a water bath at about 40 °C until the sample has nearly reached this temperature.
Open the container and proceed as described in 8.2.1. When the product is in a can or tube, transfer
the contents to a jar, scrape out all material adhering to the walls (in the case of a collapsible tube, after
cutting open the tube) and continue the mixing until the whole mass is homogeneous, reducing the size
of any crystals by crushing with a glass rod. Close the jar with a well-fitting lid. Allow to cool.
7) A Thermo Dionex Chromeleon software package is an example of a suitable chromatographic integration
software package available commercially. This information is given for the convenience of users of this document
and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of this product.
6 © ISO and IDF 2021 – All rights reserved

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ISO 22184:2021(E)
IDF 244:2021(E)
9 Procedure
9.1 Sample extraction and clean up
9.1.1 General
In cases where the integrator chromatography software package has the option “variable internal
8)
standard” (e.g. in Chromeleon™ ), apply the procedure given in 9.1.2. In these cases, just one sample
extraction and a clean-up procedure with two different dilutions have to be done. Adjust the integrator
settings in the variable internal standard option for the 50-fold dilution.
For low sugar contents, apply the procedure given in 9.1.2.2. For high sugar contents, apply the
procedure given in 9.1.2.3. The limits for low and high sugar contents are given in Table 3.
Table 3 — Limits for low and high sugar content
Low content High content
Sugar
g/100 g g/100 g
Galactose ≤ 12 > 12
Glucose ≤ 12 > 12
Fructose ≤ 12 > 12
Sucrose ≤ 18 > 18
Lactose ≤ 18 > 18
Maltose ≤ 18 > 18
In cases where the chromatographic integration software has no option for “variable internal standard”
and there is no prior knowledge about the sugar levels in the dairy sample to be investigated, it is
recommended to apply the procedure given in 9.1.2.2 for the low sugar levels. In cases where a sugar
peak is bigger than the corresponding sugar peak in the highest calibration standard, the procedure
given in 9.1.2.3 shall be applied for a correct quantitation of the sugar content.
9.1.2 Sample extraction and clean-up
9.1.2.1 General
Weigh, to the nearest 0,000 1 g, 1,0 g ± 0,1 g in a 50 ml calibrated tube (6.8).
Add 4 ml of the denatured ethanol (5.16), 0,125 ml of the arabinose internal standard solution (5.30)
and 0,5 ml of the PIPES buffer solution (5.22).
Mix well by vortexing (6.7) and let the sample suspension rest for 10 min at an ambient temperature.
Fill up the calibrated tube to the 25 ml mark with demineralized water grade 3 (5.1) with a temperature
of 40 °C ± 2 °C, followed by homogenization with a homogenizer (6.6) for 1 min.
NOTE Already well-dissolved samples can be homogenized by shaking.
Check the pH of the homogenized sample solution. The pH shall be within the values pH = 5,0 to pH = 7,0.
If necessary, adjust the pH with NaOH solution (5.3) or HCl solution (5.7).
Add 0,5 ml of the Carrez reagent I solution (5.20), mix and then add 0,5 ml of the Carrez reagent II
solution (5.21). Add 2,5 ml acetonitrile (5.8) and fill up with water (5.1) to the 50 ml mark. Close the
calibrated tube with the screw cap and mix well.
Filter the suspension over black band filter paper (6.4) and collect the filtrate.
8) This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement
by ISO or IDF of this product.
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NORME ISO
INTERNATIONALE 22184
FIL 244
Première édition
2021-02
Lait et produits laitiers —
Détermination de la teneur en sucre
— Chromatographie d’échange
d’anions haute performance couplée à
la détection par ampérométrie pulsée
(HPAEC-PAD)
Milk and milk products — Determination of the sugar contents —
High performance anion exchange chromatography with pulsed
amperometric detection method (HPAEC-PAD)
Numéros de référence
ISO 22184:2021(F)
FIL 244:2021(F)
©
ISO et FIL 2021

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Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 1
5 Réactifs . 2
6 Appareillage . 4
7 Échantillonnage . 6
8 Préparation de l’échantillon pour essai . 6
8.1 Généralités . 6
8.2 Préparation des échantillons de lait concentré sucré . 6
8.2.1 Échantillons de produits fabriqués récemment dans lesquels aucune
séparation appréciable des constituants ne peut être attendue . 6
8.2.2 Échantillons de produits plus anciens et échantillons dans lesquels une
séparation des constituants peut être attendue . 7
9 Mode opératoire. 7
9.1 Extraction et nettoyage de l’échantillon . 7
9.1.1 Généralités . 7
9.1.2 Extraction et nettoyage de l’échantillon . 7
9.2 Analyse chromatographique . 9
10 Calcul et expression des résultats .10
11 Fidélité .12
11.1 Généralités .12
11.2 Répétabilité .12
11.3 Reproductibilité .14
12 Rapport d’essai .17
Annexe A (informative) Données de fidélité .18
Annexe B (informative) Données de précision.23
Bibliographie .25
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Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/ avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires,
sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 302, Lait et
produits laitiers — Méthodes d’échantillonnage et d’analyse, du Comité européen de normalisation (CEN)
conformément à l’Accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne). Il est publié
conjointement par l’ISO et la FIL.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
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La FIL (Fédération internationale du lait) est une organisation privée à but non lucratif qui représente
les intérêts des divers acteurs de la filière laitière au niveau international. Les membres de la FIL sont
organisés en comités nationaux, qui sont des associations nationales composées de représentants de
groupes d’intérêt nationaux dans le secteur des produits laitiers, incluant des producteurs laitiers, des
acteurs de l’industrie de transformation des produits laitiers, des fournisseurs de produits laitiers, des
universitaires et des représentants des gouvernements/autorités chargées du contrôle des aliments.
L’ISO et la FIL collaborent étroitement à toutes les activités de normalisation concernant les méthodes
d’analyse et d’échantillonnage du lait et des produits laitiers. Depuis 2001, l’ISO et la FIL publient
conjointement leurs Normes internationales en utilisant les logos et les numéros de référence des
deux organisations.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Le présent document a été élaboré par le Comité permanent des méthodes d’analyse de la composition de
la FIL et le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers.
Il est publié conjointement par l’ISO et la FIL.
Ce travail a été accompli par le groupe de projet mixte FIL/ISO C22 du Comité permanent des méthodes
d’analyse de la composition sous la conduite de son chef de projet, M. H. Cruijsen (NL).
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NORME INTERNATIONALE
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Lait et produits laitiers — Détermination de la teneur
en sucre — Chromatographie d’échange d’anions haute
performance couplée à la détection par ampérométrie
pulsée (HPAEC-PAD)
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie la détermination quantitative par chromatographie en phase liquide
de certains sucres (galactose, glucose, fructose, saccharose, lactose et maltose) dans divers laits et
produits laitiers, en utilisant l’arabinose comme étalon interne.
Cette méthode s’applique aux matrices laitières suivantes: lait, lait concentré sucré, lait en poudre,
fromage, lactosérum en poudre, formule infantile, dessert lacté et yaourt.
Cette méthode ne s’applique pas aux produits laitiers contenant du soja ni à la détermination de la
teneur en lactose des produits laitiers à faible teneur en lactose inférieure à 0,1 mg/g.
Cette méthode s’appuie sur la chromatographie d’échange d’anions à haute performance couplée à la
[5][3][4]
détection par ampérométrie pulsée (HPAEC-PAD) . Treize monosaccharides, disaccharides et
trisaccharides différents peuvent être séparés par cette méthode: fucose, arabinose, galactose, glucose,
fructose, saccharose, lactose, lactulose, maltose, mélibiose, tréhalose, isomaltulose et maltotriose.
Cette méthode s’applique à l’étiquetage des six principaux sucres qui peuvent être présents
naturellement ou ajoutés dans le lait et les produits laitiers. Cette méthode ne s’applique pas aux teneurs
en sucre inférieures à 0,1 %.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai
3 Termes et définitions
Aucun terme n’est défini dans le présent document.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/
4 Principe
Les sucres présents dans l’échantillon sont extraits à l’aide d’une solution tampon aqueuse contenant de
l’éthanol afin d’inhiber d’éventuelles activités probiotiques. L’extrait ainsi obtenu est déprotéinisé par
clarification de Carrez. Après clarification, la solution est diluée et les sucres présents sont séparés et
quantifiés par HPAEC. HPAE permet la séparation des glucides à pH élevé. Afin d’améliorer la sensibilité
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et la stabilité, une solution d’hydroxyde de sodium est ajoutée en post-colonne de l’HPAEC. Les GOS
[5]
(galacto-oligosaccharide) et les fructanes n’interfèrent pas avec l’analyse des sucres . L’arabinose est
utilisé comme étalon interne pour la quantification des sucres.
5 Réactifs
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l’eau conformément à l’ISO 3696,
sauf indication contraire.
5.1 Eau, conformément à l’ISO 3696, grade 3 et grade 1.
5.2 Pastilles d’hydroxyde de sodium (NaOH).
5.3 Solution aqueuse d’hydroxyde de sodium, de concentration c = 1 mol/l.
Introduire 40 g ± 1 g de pastilles de NaOH (5.2) dans une fiole jaugée de 1 000 ml, les dissoudre dans
environ 500 ml d’eau et, après refroidissement, diluer avec de l’eau jusqu’au repère et homogénéiser.
5.4 Solution d’hydroxyde de sodium, de fraction massique w(NaOH) = 33 % dans l’eau.
5.5 Solution d’hydroxyde de sodium, de fraction massique w(NaOH) = 50 % dans l’eau.
Il convient que le réactif contienne le moins possible de carbonate et de mercure. Ne pas agiter
ou mélanger la solution avant utilisation. Une solution d’hydroxycarbonate de sodium appropriée
disponible dans le commerce peut également être utilisée.
5.6 Acide chlorhydrique concentré (HCl), fraction massique de 36 % à 38 % dans l’eau.
5.7 Solution aqueuse d’acide chlorhydrique, c = 1 mol/l.
Introduire 500 ml d’eau et 83 ml d’HCl concentré (5.6) dans une fiole jaugée de 1 000 ml (6.2) et, après
refroidissement, diluer avec de l’eau jusqu’au repère et homogénéiser.
5.8 Acétonitrile (qualité HPLC).
5.9 Acétonitrile dans l’eau, à une fraction volumique de 5 % dans l’eau.
Introduire 50 ml d’acétonitrile (5.8) dans une fiole jaugée de 1 000 ml (6.2), diluer avec de l’eau de
grade 3 jusqu’au repère et homogénéiser.
5.10 Acétate de sodium anhydre (CH COONa) (qualité HPLC).
3
5.11 Éluant 1 (E1), solution aqueuse d’acétate de sodium (CH COONa), c = 1,0 mol/l.
3
Introduire environ 800 ml d’eau dégazée de grade 1 (éluant 3, 5.13) et 82,0 g d’acétate de sodium
(5.10) dans une fiole jaugée de 1 000 ml (6.2). Diluer ensuite la solution aqueuse à l’aide d’eau dégazée
(éluant 3, 5.13) jusqu’au repère et homogénéiser. Conserver l’éluant sous atmosphère inerte.
5.12 Éluant 2 (E2), solution aqueuse d’hydroxyde de sodium exempte de carbonate (NaOH),
c = 0,2 mol/l.
Introduire environ 800 ml d’eau dégazée de grade 1 (éluant 3, 5.13) dans une fiole jaugée de 1 000 ml (6.2)
et purger avec de l’hélium pendant 15 min. Ajouter 16,0 g de solution d’hydroxyde de sodium (5.5).
Diluer ensuite rapidement la solution aqueuse à l’aide d’eau dégazée de grade 1 (éluant 3, 5.13) jusqu’au
repère, fermer immédiatement la fiole et homogénéiser. Conserver l’éluant sous atmosphère inerte.
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5.13 Éluant 3 (E3), eau dégazée de grade 1, conservée sous atmosphère inerte.
5.14 Éluant 4 (E4), solution aqueuse d’acétate de sodium (CH COONa), c = 0,025 mol/l.
3
Introduire environ 800 ml d’eau dégazée de grade 1 (éluant 3, 5.13) et 2,05 g d’acétate de sodium
(5.10) dans une fiole jaugée de 1 000 ml (6.2). Diluer ensuite la solution aqueuse à l’aide d’eau dégazée
(éluant 3, 5.13) jusqu’au repère et homogénéiser. Conserver l’éluant sous atmosphère inerte.
5.15 Réactif post-colonne, solution aqueuse d’hydroxyde de sodium, c = 0,3 mol/l.
Introduire environ 800 ml d’eau dégazée de grade 1 (éluant 3, 5.13) dans une fiole jaugée de 1 000 ml (6.2).
Purger avec de l’hélium pendant 15 min. Ajouter 24,0 g de solution d’hydroxyde de sodium (5.5)
et compléter rapidement jusqu’au repère avec de l’eau dégazée de grade 1 (éluant 3, 5.13). Fermer
immédiatement la fiole et homogénéiser. Conserver le réactif post-colonne sous atmosphère inerte.
IMPORTANT — Il est extrêmement important d’éliminer le dioxyde de carbone dissous dans
les éluants et le réactif post-colonne avant et en cours d’utilisation pour éviter une réduction
rapide de la sensibilité du détecteur. Les éluants et le réactif post-colonne sont maintenus dans
un environnement de gaz inerte en cours d’utilisation.
5.16 Mélange d’une fraction volumique de 95 % d’éthanol (avec une fraction volumique de 96 %
d’éthanol et de 4 % d’eau) et d’une fraction volumique de 5 % de méthanol.
5.17 Hexacyanoferrate (II) de potassium trihydraté, K Fe(CN) ·3H O.
4 6 2
5.18 Acétate de zinc dihydraté, Zn(CH COO) ·2H O.
3 2 2
5.19 Acide acétique glacial.
5.20 Réactif de Carrez I.
Introduire 106 g de K Fe(CN) .3H O (5.17) dans une fiole jaugée de 1 000 ml (6.2), dissoudre à l’aide
4 6 2
de 800 ml d’eau (5.1) et diluer à l’eau de grade 3 jusqu’au repère. Conserver le réactif de Carrez I au
réfrigérateur.
5.21 Réactif de Carrez II.
Introduire 220 g de Zn(CH COO) .2H O (5.18) dans une fiole jaugée de 1 000 ml (6.2), dissoudre à l’aide
3 2 2
de 800 ml d’eau, ajouter 30 ml d’acide acétique glacial (5.19), et diluer à l’eau de grade 3 jusqu’au repère.
Conserver le réactif de Carrez II au réfrigérateur.
IMPORTANT — Ne pas utiliser le réactif de Carrez II en présence de sulfate de zinc.
5.22 Solution tampon d’acide pipérazine-N,N′-bis(2-éthanesulfonique) (PIPES) (c = 1,5 mol/l
et pH = 6,9).
Introduire 22,5 g de solution tampon de PIPES dans une fiole conique de 100 ml et ajouter 20 ml de
solution d’hydroxyde de sodium (5.3). Ajuster le pH à pH = 6,9 à l’aide de NaOH à 33 % (5.4) dans l’eau.
Transférer quantitativement la solution tampon de PIPES dans un tube étalonné de 50 ml et compléter
avec de l’eau de grade 3 jusqu’à atteindre 50 ml. Le pH de la solution tampon ainsi obtenue doit être
compris entre 6,8 et 7,0.
5.23 Arabinose.
5.24 Galactose.
© ISO et FIL 2021 – Tous droits réservés 3

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5.25 Glucose.
5.26 Fructose.
5.25 Saccharose.
5.28 Lactose.
5.29 Maltose.
5.30 Solution mère d’étalon interne d’arabinose.
Peser, au mg près, environ 7 g d’arabinose (5.23) dans une fiole jaugée de 50 ml (6.2). Ajouter
environ 30 ml d’eau de grade 3 et dissoudre l’arabinose. Ajouter 2,5 ml d’acétonitrile (5.8), compléter
jusqu’au repère avec de l’eau et homogénéiser la solution.
5.31 Solution mère d’étalon de sucre.
Peser, à 0,1 mg près, environ 260 mg des monosaccharides galactose (5.24), glucose (5.25) et
fructose (5.26) et environ 400 mg des disaccharides saccharose (5.27), lactose (5.28) et maltose (5.29)
dans une fiole jaugée de 500 ml (6.2). Ajouter environ 200 ml d’eau de grade 3 et dissoudre les sucres.
Ajouter 25 ml d’acétonitrile (5.8), compléter jusqu’au repère avec de l’eau de grade 3, et homogénéiser
la solution.
5.32 Solutions étalons de sucre pour l’étalonnage.
Préparer les différentes dilutions des solutions d’étalonnage de sucre indiquées dans le Tableau 1.
Mélanger les volumes indiqués de solution mère d’étalon interne d’arabinose (5.30) et de solution
mère d’étalon de sucre (5.31) dans une fiole jaugée de 200 ml, ajouter environ 50 ml d’eau de grade 3
et homogénéiser. Ajouter 10 ml d’acétonitrile (5.8), compléter jusqu’au repère avec de l’eau et
homogénéiser.
Tableau 1 — Préparation des solutions étalons de sucre en vue de l’étalonnage
Volume de solution mère d’étalon Volume de solution mère d’étalon interne
Solution étalon de sucre de sucre (5.31) d’arabinose (5.30)
ml ml
1 0,2 0,050
2 1,0 0,050
3 6,0 0,050
4 10,0 0,050
5 20,0 0,050
6 40,0 0,050
7 80,0 0,050
8 100,0 0,050
6 Appareillage
6.1 Balance analytique, d’une précision de ±0,1 mg.
6.2 Fioles jaugées, de 50 ml, 500 ml et 1 000 ml.
6.3 pH-mètre.
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6.4 Papier filtre à bande noire.
6.5 Tubes de centrifugation.
1)
6.6 Homogénéisateur .
6.7 Agitateur vortex.
6.8 Tubes gradués fermés par un bouchon à vis, d’un volume de 50 ml.
6.9 Multipipette à déplacement positif.
6.10 Distributeurs, résistants aux solvants organiques et réglés sur 2,5 ml et 25 ml.
6.11 Flacons HPLC.
6.12 Système chromatographique ne contenant aucun composant métallique, par exemple,
2)
un ICS 3000 de Thermo Dionex , pouvant être utilisé pour une élution avec un gradient quaternaire.
6.13 Four pour colonne, avec une stabilité de température de ±1 °C et une température de
fonctionnement de 20 °C à 35 °C.
3)
6.14 Colonne analytique d’échange d’anions à haute performance , garnie d’une résine de
polystyrène-divinylbenzène pelliculaire ou garnie d’une résine d’échange d’anions permettant la
séparation requise.
4)
6.15 Colonne de garde d’échange d’anions à haute performance , garnie d’une résine de
polystyrène-divinylbenzène pelliculaire ou garnie d’une résine d’échange d’anions permettant la
séparation requise.
5)
6.16 Détecteur par ampérométrie pulsée (PAD) avec une stabilité de ±1 °C et une plage de
température de fonctionnement de 20 °C à 35 °C.
Utiliser la détection par ampérométrie pulsée et les réglages de potentiel ainsi que les formes d’onde
recommandés par le fournisseur de l’instrument. Des exemples de réglages de potentiel du détecteur
(par rapport à la référence Ag/AgCl) sont présentés dans le Tableau 2.

1) Un Ultraturrax équipé d’une sonde adaptée est un exemple d’homégénéisateur approprié disponible sur le
marché. Cette information est donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et
ne saurait constituer un engagement de l’ISO ou de la FIL à l’égard de ce produit.

2) Cette information est donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et
ne saurait constituer un engagement de l’ISO ou de la FIL à l’égard de ce produit.

3) Une colonne analytique Carbopac PA1 (2 mm × 250 mm) de Thermo-Dionex est un exemple de colonne
d’échange d’anions à haute performance adaptée disponible sur le marché. Cette information est donnée par souci
de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de l’ISO ou
de la FIL à l’égard de ce produit.

4) Une colonne de garde Carbopac PA1 de Dionex (2 mm × 50 mm) est un exemple de colonne d’échange
d’anions à haute performance adaptée disponible sur le marché. Cette information est donnée par souci de
commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de l’ISO ou de
la FIL à l’égard de ce produit.

5) Un modèle de PAD de Thermo-Dionex est un exemple de PAD adapté disponible sur le marché. Cette
information est donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait
constituer un engagement de l’ISO ou de la FIL à l’égard de ce produit.
© ISO et FIL 2021 – Tous droits réservés 5

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6)
6.17 Pompe pour réactif post-colonne ne contenant aucun composant métallique .
7)
6.18 Système d’intégration de données chromatographiques .
Tableau 2 — Programmation horaire des réglages de potentiel du détecteur pour l’électrode de
travail en or
a
Temps Potentiel de l’électrode en or Intégration du signal du détecteur
Étape
s
1 0,00 0,10
2 0,20 0,10 Début
3 0,40 0,10 Fin
4 0,41 −2,00
5 0,42 −2,00
6 0,43 0,60
7 0,44 −0,10
8 0,50 −0,10
a
 Potentiel par rapport à l’électrode de référence Ag/AgCl.
NOTE La fenêtre d’intégration va de 0,20 s à 0,40 s.
7 Échantillonnage
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou
modifié lors du transport et/ou du stockage. L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée
dans le présent document.
8 Préparation de l’échantillon pour essai
8.1 Généralités
Préparer l’échantillon conformément à un mode opératoire d’échantillonnage approprié. Le lait
concentré sucré implique une préparation de l’échantillon dédiée (voir l’ISO 2911 | FIL 35 et en 8.2).
8.2 Préparation des échantillons de lait concentré sucré
8.2.1 Échantillons de produits fabriqués récemment dans lesquels aucune séparation
appréciable des constituants ne peut être attendue
Ouvrir le récipient, transférer la totalité du produit adhérant au couvercle dans le récipient et bien
homogénéiser le tout en déplaçant verticalement une cuillère, de façon à déplacer et à mélanger les
couches supérieures ainsi que le contenu des coins inférieurs. Lorsque le produit se trouve dans un
récipient en métal, transférer son contenu dans un bocal muni d’un couvercle bien ajusté. Lorsque le
produit se trouve dans un tube souple, transférer le maximum de son contenu dans un bocal muni d’un
couvercle bien ajusté, et ouvrir le tube en le découpant, gratter l’ensemble du produit adhérant aux
parois internes et le transférer également dans le bocal. Mélanger le contenu du bocal comme indiqué
ci-dessus.

6) Une pompe mono-piston Axp de Thermo Dionex est un exemple de pompe pour réactif post-colonne ne
contenant aucun composant métallique adaptée et disponible sur le marché. Cette information est donnée par souci
de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de l’ISO ou
de la FIL à l’égard de ce produit.

7) Un progiciel Chromeleon de Thermo Dionex est un exemple de progiciel d’intégration chromatographique
adapté disponible sur le marché. Cette information est donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs
du présent document et ne saurait constituer un engagement de l’ISO ou de la FIL à l’égard de ce produit.
6 © ISO et FIL 2021 – Tous droits réservés

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ISO 22184:2021(F)
FIL 244:2021(F)
8.2.2 Échantillons de produits plus anciens et échantillons dans lesquels une séparation des
constituants peut être attendue
Chauffer l’échantillon au bain-marie à environ 40 °C jusqu’à ce que l’échantillon ait quasiment atteint
cette température. Ouvrir le récipient et procéder comme indiqué en 8.2.1. Lorsque le produit se trouve
dans un récipient en métal ou dans un tube, transférer son contenu dans un bocal, gratter l’ensemble du
produit adhérant aux parois (dans le cas d’un tube souple, après avoir ouvert le tube en le découpant) et
continuer à mélanger jusqu’à ce que la masse soit entièrement homogène, en veillant à réduire la taille
d’éventuels cristaux en les écrasant avec une tige de verre.
...

DRAFT INTERNATIONAL STANDARD
ISO/DIS 22184
IDF 224
ISO/TC 34/SC 5 Secretariat: NEN
Voting begins on: Voting terminates on:
2019-10-07 2019-12-30
Milk and milk products — Determination of the
sugar contents — High performance anion exchange
chromatographic method (HPAEC-PAD)
ICS: 67.100.01
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This document is circulated as received from the committee secretariat.
FOR COMMENT AND APPROVAL. IT IS
THEREFORE SUBJECT TO CHANGE AND MAY
NOT BE REFERRED TO AS AN INTERNATIONAL
STANDARD UNTIL PUBLISHED AS SUCH.
IN ADDITION TO THEIR EVALUATION AS
ISO/CEN PARALLEL PROCESSING
BEING ACCEPTABLE FOR INDUSTRIAL,
TECHNOLOGICAL, COMMERCIAL AND
USER PURPOSES, DRAFT INTERNATIONAL
STANDARDS MAY ON OCCASION HAVE TO
BE CONSIDERED IN THE LIGHT OF THEIR
POTENTIAL TO BECOME STANDARDS TO
WHICH REFERENCE MAY BE MADE IN
Reference numbers
NATIONAL REGULATIONS.
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RECIPIENTS OF THIS DRAFT ARE INVITED
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TO SUBMIT, WITH THEIR COMMENTS,
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IDF 224:2019(E)
Contents Page
Forewords .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Principle . 1
4 Reagents . 1
5 Apparatus . 4
6 Sampling . 6
7 Preparation of the test sample . 6
7.1 General . 6
7.2 Sample preparation of sweetened condensed milk . 6
7.2.1 Samples of recently manufactured products in which no appreciable
separation of components may be expected. 6
7.2.2 Samples of older products and samples in which separation of
components may be expected . 6
8 Procedure. 6
8.1 Sample extraction and clean up . 6
8.1.1 General. 6
8.1.2 Sample extraction and clean-up . 7
8.2 Chromatographic analysis . 8
9 Calculation and expression of the results . 9
10 Precision .10
10.1 General .10
10.2 Repeatability .10
10.3 Reproducibility .12
11 Test report .15
Annex A (informative) Typical chromatogram .16
Annex B (informative) Precision data .17
Annex C (informative) Accuracy data .21
Bibliography .23
© ISO and IDF 2019 – All rights reserved iii

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ISO/DIS 22184:2019(E)
IDF 224:2019(E)
Forewords
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national
standards bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally
carried out through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which
a technical committee has been established has the right to be represented on that committee.
International organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part
in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all
matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
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on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
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constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO's adherence to the WTO principles in the Technical
Barriers to Trade (TBT) see the following URL: www .iso. org/ iso/ foreword. html
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5,
Milk and milk products and the International Dairy Federation (IDF). It is being published jointly by ISO
and IDF.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
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IDF 224:2019(E)
IDF (the International Dairy Federation) is a non-profit private sector organization representing the
interests of various stakeholders in dairying at the global level. IDF members are organized in National
Committees, which are national associations composed of representatives of dairy-related national
interest groups including dairy farmers, dairy processing industry, dairy suppliers, academics and
governments/food control authorities.
ISO and IDF collaborate closely on all matters of standardization relating to methods of analysis
and sampling for milk and milk products. Since 2001, ISO and IDF jointly publish their International
Standards using the logos and reference numbers of both organizations.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute and endorsement.
This document was prepared by the IDF Standing Committee on Analytical Methods for Composition and
ISO Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk products. It is
being published jointly by ISO and IDF.
The work was carried out by the IDF/ISO Action Team C22 of the Standing Committee on Analytical
Methods for Composition under the aegis of its project leader Mr. H. Cruijsen (NL).
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ISO/DIS 22184:2019(E)
DRAFT INTERNATIONAL STANDARD
IDF 224:2019(E)
Milk and milk products — Determination of the
sugar contents — High performance anion exchange
chromatographic method (HPAEC-PAD)
1 Scope
The document specifies the quantitative liquid chromatographic determination of specific sugars
(galactose, glucose, fructose, sucrose, lactose, and maltose) in various milk and milk products, applying
arabinose as internal standards. The method is applicable for the following different dairy matrices:
milk, milk powder, cheese, whey powder, infant formula, milk dessert and yogurt.
Soy containing dairy products are excluded. The determination of the lactose content in low lactose
milk products is excluded.
High performance anion exchange chromatographic method in combination with pulsed amperometric
detection (HPAEC-PAD) is applied.
With this method the following thirteen different mono- and disaccharides can be separated: fucose,
arabinose, galactose, glucose, fructose, sucrose, lactose, lactulose, maltose, melibiose, trehalose,
TM
isomaltulose (e.g. palatinose ) and maltotriose.
The method is especially meant for labelling purposes of the six most important sugars which can be
present by nature or by addition in milk and milk products. The method is not applicable for sugar
contents less than 0,1%.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
EN ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
3 Principle
The sugars present in the sample are extracted with an aqueous ethanol buffer solution in order to
inhibit possible probiotic activities. The obtained extract is deproteinized with Carrez clarification.
After clarification the solution is diluted and the sugars present are separated and quantified by high
performance anion exchange chromatography (HPAEC). In order to improve the sensitivity and stability
of the pulsed amperometric detector (PAD), post-column a sodium hydroxide solution was added to the
HPAEC effluent with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). GOS and fructans don’t interfere.
Arabinose is applied as internal standard for the quantitation of the sugars.
4 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade and water according to EN ISO 3696, unless otherwise
specified.
4.1 Water, complying with EN ISO 3696, grade 3.
4.2 Sodium hydroxide (NaOH) pellets.
© ISO and IDF 2019 – All rights reserved 1

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ISO/DIS 22184:2019(E)
IDF 224:2019(E)
4.3 Aqueous sodium hydroxide solution, substance concentration c = 1 mol/l
Add to a 1 000 ml volumetric flask 40 g ± 1 g NaOH pellets (4.2), dissolve in about 500 ml of water and
after cooling down, dilute with water to the mark and homogenize.
4.4 Aqueous sodium hydroxide solution, c = 4 mol/l
Add to a 1 000 ml volumetric flask 160 g ± 1 g NaOH pellets (4.2), dissolve in about 500 ml of water and
after cooling down, dilute with water to the mark and homogenize.
4.5 Sodium hydroxide solution, mass fraction w(NaOH) = 33 % in water.
4.6 Sodium hydroxide solution, w(NaOH) = 50 % in water.
The reagent should contain the minimum amount of carbonate and mercury. Do not shake or stir the
solution before use.
4.7 Concentrated hydrochloric acid, 36 % to 38 %
4.8 Aqueous hydrochloric acid solution, c = 1 mol/l
Add to a 1 000 ml volumetric flask (5.2) 500 ml of water followed by 83 ml of concentrated HCl (4.7) and
after cooling down, dilute with water to the mark and homogenize.
4.9 Acetonitrile
4.10 Acetonitrile in water, 5 % in water
Add to a 1 000 ml volumetric flask (5.2) 50 ml of acetonitrile (4.9), dilute with water to the mark and
homogenize.
4.11 Anhydrous sodium acetate (CH COONa)
3
4.12 Eluent 1 (E1), aqueous solution of sodium acetate (CH COONa), c = 1,0 mol/l.
3
Add to a 1 000 ml volumetric flask (5.2) about 800 ml of degassed water (eluent 3, 4.14) followed by
82 g sodium acetate (4.11). Then dilute the aqueous solution with degassed water (eluent 3, 4.14) to the
mark and homogenize. Store the eluent under inert atmosphere.
4.13 Eluent 2 (E2), aqueous solution of carbonate free sodium hydroxide (NaOH), c = 0,2 mol/l
Add to a 1 000 ml volumetric flask (5.2) about 800 ml of degassed water (eluent 3, 4.14) and purge for
15 min. with helium. Add 16,0 g of sodium hydroxide solution (4.6). Then quickly dilute the aqueous
solution with degassed water (eluent 3, 4.14) to the mark, close immediately the bottle and homogenize.
Store the eluent under inert atmosphere.
4.14 Eluent 3 (E3), degassed water, stored under inert atmosphere.
4.15 Eluent 4 (E4), aqueous solution of sodium acetate (CH COONa), c = 0,025 mol/l
3
Add to a 1 000 ml volumetric flask (5.2) about 800 ml of degassed water (eluent 3, 4.14) followed by
2.05 g of sodium acetate (4.11). Then dilute the aqueous solution with degassed water (eluent 3, 4.14) to
the mark and homogenize. Store the eluent under inert atmosphere.
2 © ISO and IDF 2019 – All rights reserved

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ISO/DIS 22184:2019(E)
IDF 224:2019(E)
4.16 Post column reagent, aqueous solution of sodium hydroxide, c = 0,3 mol/l.
Add to a 1 000 ml volumetric flask (5.2) about 800 ml of degassed water (eluent 3, 4.14). Purge for 15
min. with helium. Add 24 g of sodium hydroxide solution (4.6) and quickly fill up to the mark with the
degassed water (eluent 3, 4.14), close immediately the flask and homogenize. Store the post column
reagent under inert atmosphere.
Important — It is extremely important to remove dissolved carbon dioxide from the eluens
and post column reagent prior to use and during use. The eluents and post column reagent are
maintained under inert gas during use.
4.17 Mixture of ethanol 96 % (v/v) and 5 % (v/v) methanol
4.18 Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate, K Fe(CN) .3H O.
4 6 2
4.19 Zinc acetate dihydrate, Zn(CH COO) .2H O.
3 2 2
4.20 Glacial acetic acid
4.21 Carrez reagent I
Weigh 106 g of K Fe(CN) .3H O (4.18) in a 1 000 ml volumetric flask (5.2), dissolve in 800 ml of water
4 6 2
(4.1) and dilute with water to the mark. Store the Carrez I reagent in the refrigerator.
4.22 Carrez II reagent
Weigh 220 g of Zn(CH COO) .2H O (4.19) in a 1 000 ml volumetric flask (5.2), dissolve in 800 ml water,
3 2 2
add 30 ml of glacial acetic acid (4.20) and dilute with water to the mark. Store the Carrez II reagent in
the refrigerator.
IMPORTANT — Do not use Carrez II reagent with zinc sulfate.
4.23 Buffer solution of piperazine-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) (c = 1,5 mol/l and
pH = 6,9)
Add 22,5 g of PIPES to an 100 ml Erlenmeyer flask and dissolve in 20 ml of sodium hydroxide solution
(4.3). Adjust the pH to pH = 6,9 with NaOH 33 % (4.5) in water. Transfer the PIPES buffer solution
quantitatively into a 50 ml calibrated tube and fill up with demineralized water till 50 ml. The pH of the
obtained buffer solution shall be within the range of 6,8 to 7,0.
4.24 Arabinose
4.25 Galactose
4.26 Glucose
4.27 Fructose
4.28 Sucrose
4.29 Lactose
4.30 Maltose
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ISO/DIS 22184:2019(E)
IDF 224:2019(E)
4.31 Internal standard stock solution arabinose
Weigh to the nearest mg, approximately 7 g of arabinose (4.24) into a 50 ml volumetric flask (5.2). Add
about 30 ml of water and dissolve the arabinose. Add 2,5 ml of acetonitrile (4.9), fill up to the mark with
water and homogenize the solution.
4.32 Sugar standard stock solutions
Weigh to the nearest 0,1 mg, approximately 260 mg of the monosaccharide galactose (4.25), glucose
(4.26) and fructose (4.27) and approximately 400 mg of the disaccharides sucrose (4.28), lactose (4.29),
and maltose (4.30) into a 500 ml volumetric flask (5.2). Add about 200 ml of water and dissolve the
sugars. Add 25 ml of acetonitrile (4.9), fill up to the mark with water and homogenize the solution.
4.33 Sugar standard solutions for calibration
Prepare the different dilutions of the sugar calibration standards as specified in Table 1. Dilute the
specified volumes of the internal standard stock solution arabinose (4.31) and sugar standard stock
solution (4.32) in a 200 ml volumetric flask, add about 50 ml of water and homogenize. Add 10 ml of
acetonitrile (4.9), fill up to the mark with water and homogenize.
Table 1 — Preparation of the sugar standard solutions for calibration
Volume of sugar standard Volume of arabinose
stock solution (‎4.32) internal standard stock
Sugar standard solution
ml solution (‎4.31)
ml
1 0,2 0,050
2 1,0 0,050
3 6,0 0,050
4 10,0 0,050
5 20,0 0,050
6 40,0 0,050
7 80,0 0,050
8 100,0 0,050
5 Apparatus
5.1 Analytical balance, capable of weighing to an accuracy of ± 0,1 mg
5.2 Volumetric flask, volume of 50 ml, 500 ml and 1 000 ml
5.3 pH meter
5.4 Black band filter paper
5.5 Glass centrifugation tubes
1)
5.6 Homogenizer
5.7 Vortex mixer
1) An IKA Ultra turrax with an appropriate probe is an example of a suitable commercially available homogenizer
4 © ISO and IDF 2019 – All rights reserved

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ISO/DIS 22184:2019(E)
IDF 224:2019(E)
2)
5.8 Screw cap closes graduated tubes, 50 ml volume
5.9 Positive displacement multipipet
5.10 Dispensors, resistant to organic solvent and adjusted to 2,5 ml and 25 ml
5.11 HPLC vials
3)
5.12 Metal free liquid chromatographic system , applicable for a quaternary gradient elution profile
5.13 Column oven, adjusted at 20 °C ± 1 °C
4)
5.14 High performance anion exchange analytical column , filled with pellicular polystyrene-
divinylbenzene resin
5)
5.15 High performance anion exchange guard column , filled with pellicular polystyrene-
divinylbenzene resin
6)
5.16 Pulsed amperometric detector , with a gold working electrode, situated with the
chromatographic columns together in the column oven at 20 °C
Detector potential settings (vs Ag/AgCl reference) are as presented in Table 2.
7)
5.17 Metal free post column reagent pump
8)
5.18 Integrator chromatography data system
Table 2 — Time programming of the detector potential settings of the gold working electrode
a
Time Potential gold electrode Integration detector
Step
s signal
1 0,00 0,10
2 0,20 0,10 Start
3 0,40 0,10 End
4 0,41 -2,00
5 0,42 -2,00
a
potential versus Ag/AgCl reference electrode
2) Sarstedt tubes (art.no 62.547.254) is an example of a suitable commercially available 50 ml screw cap closed
calibrated tube.
3) The Thermo-Dionex ICS 3000 module is an example of a suitable commercially available metal free
chromatographic system with a quaternair gradient elution pump.
4) The Dionex Carbopac PA1analytical column (2 x 250 mm) is an example of a suitable commercially available
high performance anion exchange column.
5) The Dionex Carbopac PA1 guardcolumn (2 x 50 mm) is an example of a suitable commercially available high
performance anion exchange column.
6) The Thermo-Dionex model PAD is an example of a suitable commercially available pulsed amperometric
detector.
7) The single piston Thermo Dionex Axp pump is an example of a suitable commercially available metal free post
column reagent pump.
8) The Thermo Dionex Chromeleon software package is an example of a suitable chromatographic integration
software package.
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ISO/DIS 22184:2019(E)
IDF 224:2019(E)
Table 2 (continued)
a
Time Potential gold electrode Integration detector
Step
s signal
6 0,43 0,60
7 0,44 -0,10
8 0,50 -0,10
a
potential versus Ag/AgCl reference electrode
Integration window is 0,20 s to 0,40 s.
6 Sampling
It is important that the laboratory receives a sample which is truly representative and has not been
damaged or changed during transport and/or storage. Sampling is not a part of the method specified in
this Standard.
7 Preparation of the test sample
7.1 General
Prepare the sample in accordance with an appropriate sampling procedure. Sweetend condensed milk
[[4]]
requires a dedicated sample preparation , see 7.2.
7.2 Sample preparation of sweetened condensed milk
7.2.1 Samples of recently manufactured products in which no appreciable separation of
components may be expected
Open the container, transfer all material adhering to the lid into the container and thoroughly mix
by an up-and-down movement of a spoon, in such a way that the top layers and contents of the lower
corners are moved and mixed. When the product is in a can, transfer the contents into a jar with a
well-fitting lid. When the product is in a collapsible tube, transfer as much as possible of the content to
a jar with a well-fitting lid, then cut open the tube, scrape out all material adhering to the interior and
transfer this also to the jar. Mix the conents of the jar as described above.
7.2.2 Samples of older products and samples in which separation of components may be
expected
Heat in a water bath at about 40°C until the sample has nearly reached this temperature. Open the
container and proceed as described in 7.2.1. When the product is in a can or tube, transfer the contents
to a jar, scrape out all material adhering to the walls (in case of a collapsible tube, after cutting open the
tube) and continue the mixing until the whole mass is homogeneous, reducing the size of any cristals by
crushing with a glass rod. Close the jar with a well-fitting lid. Allow to cool.
8 Procedure
8.1 Sample extraction and clean up
8.1.1 General
In case the integrator chromatography software package does have the option “variable internal
standard” (e.g. in Chromeleon) apply the procedure 8.1.2. In that case just one sample extraction and
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ISO/DIS 22184:2019(E)
IDF 224:2019(E)
clean-up procedure with two different dilutions have to be done. Adjust the integrator settings for in
the variable internal standard option for the 50-fold dilution.
Apply for low sugar contents procedure 8.1.2.1 and for high sugar contents procedure 8.1.2.2. The limits
for low and high sugar contents are given in Table 3.
Table 3 — Limits for low and high sugar content
Low content High content
Sugar
g/100 g g/100 g
Galactose < 12 > 12
Glucose < 12 > 12
Fructose < 12 > 12
Sucrose < 18 > 18
Lactose < 18 > 18
Maltose < 18 > 18
In case the chromatographic integration software has no option for “variable internal standard”
and there is no prior knowledge about the sugar levels in the dairy sample to be investigated, it is
recommended to start apply the protocol 8.1.2.1 for the low sugar levels. In case a sugar peak is bigger
than the corresponding sugar peak in the highest calibration standard, procedure 8.1.2.2 shall be
applied for a correct quantitation of the sugar content.
8.1.2 Sample extraction and clean-up
Weigh to the nearest 0,0001 g, approximately 1,0 g ± 0,1 g in a 50 ml calibrated tube (5.8).
Add 4 ml of the mixture of ethanol and methanol (4.17), 0,125 ml of arabinose internal standard solution
(4.31) and 0,5 ml PIPES buffer solution (4.23).
Mix well by vortexing (5.7) and let the sample suspension rest for 10 min at ambient temperature.
Fill up the calibrated tube to the 25 ml mark with demineralized water grade 3 (4.1) with a temperature
of 40 °C ± 2 °C, followed by homogenization with an ultra-turrax (5.6) during 1 min.
NOTE Already well dissolved samples can be homogenized by shaking.
Check the pH of the homogenized sample solution. The pH shall be within the values pH = 5,0 to pH = 7,0.
If necessary, adjust the pH with NaOH solution (4.3) or HCl solution (4.8).
Add with a dispenser (5.10) first 0,5 ml Carrez I reagent solution (4.21), mix, 0,5 ml Carrez II reagent
solution (4.22), add with a dispenser (5.10) 2,5 ml acetonitrile (4.9) and fill up with water (4.1) to the
50 ml mark, close the calibrated tube with the screw cap and mix well.
Filter the suspension over black band filter paper (5.4) and collect the filtrate.
Prepare from each filtrate two different dilutions directly in the HPLC vials (5.11)
— 10-fold dilution: mix 100 μl of filtrate with 900 μl of water grade 3 (4.1)
— 50-fold dilution: mix 20 μl of filtrate with 980 μl of water grade 3 (4.1) and adjust the integrator
settings for these 50-fold diluted filtrates in the variable internal standard procedure.
Inject 5 μl of the diluted filtrates in the high performance anion exchange chromatographic system (5.12).
In case of the measured sugar peak is outside the calibration graph in the 10-fold diluted sample, use
the results which are measured in the 50-fold diluted samples after proper adjusting the settings for
the variable internal standard option.
© ISO and IDF 2019 – All rights reserved 7

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ISO/DIS 22184:2019(E)
IDF 224:2019(E)
8.1.2.1 Sample extraction and clean-up for the low sugar contents (10-fold dilution)
Weigh to the nearest 0,0001 g, approximately 1,0 g ± 0,1 g in a 50 ml calibrated tube (5.8).
Add 4 ml of the mixture of ethanol and methanol (4.17), 0,125 ml of arabinose internal standard solution
(4.31) and 0,5 ml PIPES buffer solution (4.23).
Mix well by vortexing (5.7) and let the sample suspension rest for 10 min at ambient temperature.
Fill up the calibrated tube to the 25 ml mark with demineralized water grade 3 (4.1) with a temperature
of 40 °C ± 2 °C, followed by homogenization with an ultra-turrax (5.6) during 1 min.
NOTE Already well dissolved samples can be homogenized by shaking.
Chec
...

PROJET DE NORME INTERNATIONALE
ISO/DIS 22184
FIL 224
ISO/TC 34/SC 5 Secrétariat: NEN
Début de vote: Vote clos le:
2019-10-06 2019-12-29
Lait et produits laitiers — Détermination de la teneur
en sucre — Chromatographie d’échange d’anions haute
performance couplée à la détection par ampérométrie
pulsée (HPAEC-PAD)
Milk and milk products — Determination of the sugar contents — High performance anion exchange
chromatographic method (HPAEC-PAD)
ICS: 67.100.01
CE DOCUMENT EST UN PROJET DIFFUSÉ POUR
OBSERVATIONS ET APPROBATION. IL EST DONC
SUSCEPTIBLE DE MODIFICATION ET NE PEUT
Le présent document est distribué tel qu’il est parvenu du secrétariat du comité.
ÊTRE CITÉ COMME NORME INTERNATIONALE
AVANT SA PUBLICATION EN TANT QUE TELLE.
OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR
ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES
FINS INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET
COMMERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE TRAITEMENT PARALLÈLE ISO/CEN
DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE
CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR
POSSIBILITÉ DE DEVENIR DES NORMES
POUVANT SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA
RÉGLEMENTATION NATIONALE.
Numéro de référence
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET
ISO/DIS 22184:2019(F)
SONT INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS
FIL 224:2019(F)
OBSERVATIONS, NOTIFICATION DES DROITS
DE PROPRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT
ÉVENTUELLEMENT CONNAISSANCE ET À
©
FOURNIR UNE DOCUMENTATION EXPLICATIVE. ISO et FIL 2019

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ISO/DIS 22184:2019(F)
FIL 224:2019(F)
Sommaire Page
Avant-propos . iv
1 Domaine d’application .1
2 Références normatives .1
3 Principe .1
4 Réactifs .2
5 Appareillage .4
6 Échantillonnage .6
7 Préparation de l’échantillon pour essai .6
7.1 Généralités .6
7.2 Préparation des échantillons de lait concentré sucré .6
7.2.1 Échantillons de produits fabriqués récemment dans lesquels aucune séparation
appréciable des constituants ne peut être attendue .6
7.2.2 Échantillons de produits plus anciens et échantillons dans lesquels une séparation
des constituants peut être attendue .7
8 Mode opératoire.7
8.1 Extraction de l’échantillon et nettoyage .7
8.1.1 Généralités .7
8.1.2 Extraction de l’échantillon et nettoyage .7
8.2 Analyse chromatographique .9
9 Calcul et expression des résultats . 11
10 Fidélité . 11
10.1 Généralités . 11
10.2 Répétabilité . 11
10.3 Reproductibilité . 13
11 Rapport d’essai . 15
Annexe A (informative) Chromatogrammes types . 16
Annexe B (informative) Données de fidélité . 17
Annexe C (informative) Données relatives à la précision . 23
Bibliographie . 26

DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO et FIL 2019
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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
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être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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ISO/DIS 22184:2019(F)
FIL 224:2019(F)
Sommaire Page
Avant-propos . iv
1 Domaine d’application .1
2 Références normatives .1
3 Principe .1
4 Réactifs .2
5 Appareillage .4
6 Échantillonnage .6
7 Préparation de l’échantillon pour essai .6
7.1 Généralités .6
7.2 Préparation des échantillons de lait concentré sucré .6
7.2.1 Échantillons de produits fabriqués récemment dans lesquels aucune séparation
appréciable des constituants ne peut être attendue .6
7.2.2 Échantillons de produits plus anciens et échantillons dans lesquels une séparation
des constituants peut être attendue .7
8 Mode opératoire.7
8.1 Extraction de l’échantillon et nettoyage .7
8.1.1 Généralités .7
8.1.2 Extraction de l’échantillon et nettoyage .7
8.2 Analyse chromatographique .9
9 Calcul et expression des résultats . 11
10 Fidélité . 11
10.1 Généralités . 11
10.2 Répétabilité . 11
10.3 Reproductibilité . 13
11 Rapport d’essai . 15
Annexe A (informative) Chromatogrammes types . 16
Annexe B (informative) Données de fidélité . 17
Annexe C (informative) Données relatives à la précision . 23
Bibliographie . 26

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Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le
droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet
de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour
responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails
concernant les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés
lors de l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations
de brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation
de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de l’OMC
concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant :
www.iso.org/iso/fr/foreword.html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires,
sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers et la Fédération internationale du lait (FIL). Il est publié
conjointement par l’ISO et la FIL.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.

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iv

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ISO/DIS 22184:2019(F)
FIL 224:2019(F)
La FIL (Fédération internationale du lait) est une organisation privée à but non lucratif qui
représente les intérêts des divers acteurs de la filière laitière au niveau international. Les membres de
la FIL sont organisés en comités nationaux, qui sont des associations nationales composées de
représentants de groupes d’intérêt nationaux dans le secteur des produits laitiers, incluant des
producteurs laitiers, des acteurs de l’industrie de transformation des produits laitiers, des fournisseurs
de produits laitiers, des universitaires et des représentants des gouvernements/autorités chargées du
contrôle des aliments.
L’ISO et la FIL collaborent étroitement à toutes les activités de normalisation concernant les méthodes
d’analyse et d’échantillonnage du lait et des produits laitiers. Depuis 2001, l’ISO et la FIL publient
conjointement leurs Normes internationales en utilisant les logos et les numéros de référence des deux
organisations.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet
de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour
responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails
concernant les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés
lors de l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations
de brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Le présent document a été élaboré par le Comité permanent chargé des Méthodes d’analyse pour la
composition (SCAMC) de la Fédération internationale du lait (FIL) et le comité technique ISO/TC 34,
Produits alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers. Il est publié conjointement par l’ISO et
la FIL.
L’ensemble des travaux a été confié au groupe de projet mixte ISO/FIL C22 du Comité permanent chargé
des Méthodes d’analyse pour la composition (SCAMC), sous la conduite de son chef de projet, M. H.
Cruijsen (NL).

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ISO/DIS 22184:2019(F)
PROJET DE NORME INTERNATIONALE
FIL 224:2019(F)

Lait et produits laitiers — Détermination de la teneur en
sucre — Chromatographie d’échange d’anions haute
performance couplée à la détection par ampérométrie pulsée
(HPAEC-PAD)
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie la détermination quantitative par chromatographie en phase liquide de
certains sucres (galactose, glucose, fructose, saccharose, lactose et maltose) dans divers laits et produits
laitiers, en utilisant l’arabinose comme étalon interne. Cette méthode s’applique aux différentes
matrices laitières suivantes : lait, lait en poudre, fromage, lactosérum en poudre, formule infantile,
dessert lacté et yaourt.
Les produits laitiers contenant du soja sont exclus du domaine d’application du présent document. La
détermination de la teneur en lactose des produits laitiers à faible teneur en lactose est également
exclue.
Cette méthode s’appuie sur la chromatographie d’échange d’anions à haute performance couplée à la
détection par ampérométrie pulsée (HPAEC-PAD).
Les treize différents mono et disaccharides suivants peuvent être séparés par cette méthode : fucose,
arabinose, galactose, glucose, fructose, saccharose, lactose, lactulose, maltose, mélibiose, tréhalose,
TM
isomaltulose (par exemple palatinose ) et maltotriose.
Cette méthode est spécialement destinée à l’étiquetage des six principaux sucres qui peuvent être
présents naturellement ou ajoutés dans le lait et les produits laitiers. Cette méthode ne s’applique pas
aux teneurs en sucre inférieures à 0,1 %.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
EN ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai.
3 Principe
Les sucres présents dans l’échantillon sont extraits à l’aide d’une solution tampon aqueuse contenant de
l’éthanol afin d’inhiber d’éventuelles activités probiotiques. L’extrait ainsi obtenu est déprotéinisé par
clarification de Carrez. Après clarification, la solution est diluée et les sucres présents sont séparés et
quantifiés par chromatographie d’échange d’anions à haute performance (HPAEC). Afin d’améliorer la
sensibilité et la stabilité du détecteur par ampérométrie pulsée (PAD), une solution d’hydroxyde de
sodium a été ajoutée en post-colonne à l’effluent de HPAEC avec détection par ampérométrie pulsée
(HPAEC-PAD). Les GOS et les fructanes ne provoquent pas d’interférence. L’arabinose est utilisé comme
étalon interne pour la quantification des sucres.
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4 Réactifs
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l’eau conformément à
l’EN ISO 3696, sauf indication contraire.
4.1 Eau, conforme à l’EN ISO 3696, de grade 3.
4.2 Pastilles d’hydroxyde de sodium (NaOH)
4.3 Solution aqueuse d’hydroxyde de sodium, de concentration en substance c = 1 mol/l.
Introduire 40 g ± 1 g de pastilles de NaOH (4.2) dans une fiole jaugée de 1 000 ml, les dissoudre dans
environ 500 ml d’eau puis, après refroidissement, diluer avec de l’eau jusqu’au repère et homogénéiser.
4.4 Solution aqueuse d’hydroxyde de sodium, c = 4 mol/l.
Introduire 160 g ± 1 g de pastilles de NaOH (4.2) dans une fiole jaugée de 1 000 ml, les dissoudre dans
environ 500 ml d’eau puis, après refroidissement, diluer avec de l’eau jusqu’au repère et homogénéiser.
4.5 Solution d’hydroxyde de sodium, de fraction massique w(NaOH) = 33 % dans l’eau.
4.6 Solution d’hydroxyde de sodium, w(NaOH) = 50 % dans l’eau.
Il convient que le réactif contienne le moins possible de carbonate et de mercure. Ne pas agiter ou
mélanger la solution avant utilisation.
4.7 Acide chlorhydrique concentré, de 36 % à 38 %.
4.8 Solution aqueuse d’acide chlorhydrique, c = 1 mol/l.
Introduire 500 ml d’eau puis 83 ml d’HCl concentré (4.7) dans une fiole jaugée de 1 000 ml (5.2) puis,
après refroidissement, diluer avec de l’eau jusqu’au repère et homogénéiser.
4.9 Acétonitrile
4.10 Acétonitrile dans l’eau, à 5 % dans l’eau.
Introduire 50 ml d’acétonitrile (4.9) dans une fiole jaugée de 1 000 ml (5.2), diluer avec de l’eau
jusqu’au repère et homogénéiser.
4.11 Acétate de sodium anhydre (CH COONa).
3
4.12 Éluant 1 (E1), solution aqueuse d’acétate de sodium (CH COONa), c = 1,0 mol/l.
3
Introduire environ 800 ml d’eau dégazée (éluant 3, 4.14) puis 82 g d’acétate de sodium (4.11) dans une
fiole jaugée de 1 000 ml (5.2). Puis diluer la solution aqueuse à l’aide d’eau dégazée (éluant 3, 4.14)
jusqu’au repère et homogénéiser. Conserver l’éluant sous atmosphère inerte.
4.13 Éluant 2 (E2), solution aqueuse d’hydroxyde de sodium exempte de carbonate (NaOH),
c = 0,2 mol/l.
Introduire environ 800 ml d’eau dégazée (éluant 3, 4.14) dans une fiole jaugée de 1 000 ml (5.2) puis
purger avec de l’hélium pendant 15 min. Ajouter 16,0 g de solution d’hydroxyde de sodium (4.6). Puis
diluer rapidement la solution aqueuse à l’aide d’eau dégazée (éluant 3, 4.14) jusqu’au repère, fermer
immédiatement la fiole et homogénéiser. Conserver l’éluant sous atmosphère inerte.
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2

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4.14 Éluant 3 (E3), eau dégazée, conservée sous atmosphère inerte.
4.15 Éluant 4 (E4), solution aqueuse d’acétate de sodium (CH COONa), c = 0,025 mol/l.
3
Introduire environ 800 ml d’eau dégazée (éluant 3, 4.14) puis 2,05 g d’acétate de sodium (4.11) dans
une fiole jaugée de 1 000 ml (5.2). Puis diluer la solution aqueuse à l’aide d’eau dégazée (éluant 3, 4.14)
jusqu’au repère et homogénéiser. Conserver l’éluant sous atmosphère inerte.
4.16 Réactif post-colonne, solution aqueuse d’hydroxyde de sodium, c = 0,3 mol/l.
Introduire environ 800 ml d’eau dégazée (éluant 3, 4.14) dans une fiole jaugée de 1 000 ml (5.2). Purger
avec de l’hélium pendant 15 min. Ajouter 24 g de solution d’hydroxyde de sodium (4.6) puis compléter
rapidement jusqu’au repère avec de l’eau dégazée (éluant 3, 4.14), fermer immédiatement la fiole et
homogénéiser. Conserver le réactif post-colonne sous atmosphère inerte.
IMPORTANT — Il est extrêmement important d’éliminer le dioxyde de carbone dissous dans les
éluants et le réactif post-colonne avant et en cours d’utilisation. Les éluants et le réactif post-
colonne sont maintenus dans un environnement de gaz inerte en cours d’utilisation.
4.17 Mélange d’éthanol à 96 % (v/v) avec 5 % (v/v) de méthanol
4.18 Hexacyanoferrate (II) de potassium trihydraté, K Fe(CN) .3H O.
4 6 2
4.19 Acétate de zinc dihydraté, Zn(CH COO) .2H O.
3 2 2
4.20 Acide acétique glacial
4.21 Réactif de Carrez I
Introduire 106 g de K Fe(CN) .3H O (4.18) dans une fiole jaugée de 1 000 ml (5.2), dissoudre à l’aide de
4 6 2
800 ml d’eau (4.1) puis diluer à l’eau jusqu’au repère. Conserver le réactif de Carrez I au réfrigérateur.
4.22 Réactif de Carrez II
Introduire 220 g de Zn(CH COO) .2H O (4.19) dans une fiole jaugée de 1 000 ml (5.2), dissoudre à l’aide
3 2 2
de 800 ml d’eau, ajouter 30 ml d’acide acétique glacial (4.20), puis diluer à l’eau jusqu’au repère.
Conserver le réactif de Carrez II au réfrigérateur.
IMPORTANT — Ne pas utiliser le réactif de Carrez II en présence de sulfate de zinc.
4.23 Solution tampon d’acide pipérazine-N,N’-bis(2-éthanesulfonique) (PIPES) (c = 1,5 mol/l et
pH = 6,9)
Introduire 22,5 g de PIPES dans un erlenmeyer de 100 ml et les dissoudre dans 20 ml de solution
d’hydroxyde de sodium (4.3). Ajuster le pH à pH = 6,9 à l’aide de NaOH à 33 % (4.5) dans l’eau.
Transférer quantitativement la solution tampon de PIPES dans un tube étalonné de 50 ml et compléter
avec de l’eau déminéralisée jusqu’à atteindre 50 ml. Le pH de la solution tampon ainsi obtenue doit être
compris entre 6,8 et 7,0.
4.24 Arabinose
4.25 Galactose
4.26 Glucose
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3

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4.27 Fructose
4.28 Saccharose
4.29 Lactose
4.30 Maltose
4.31 Solution mère d’étalon interne d’arabinose
Peser, au mg près, environ 7 g d’arabinose (4.24) dans une fiole jaugée de 50 ml (5.2). Ajouter environ
30 ml d’eau et dissoudre l’arabinose. Ajouter 2,5 ml d’acétonitrile (4.9), compléter jusqu’au repère avec
de l’eau puis homogénéiser la solution.
4.32 Solutions mères d’étalons de sucre
Peser, à 0,1 mg près, environ 260 mg des monosaccharides galactose (4.25), glucose (4.26) et fructose
(4.27) et environ 400 mg des disaccharides saccharose (4.28), lactose (4.29) et maltose (4.30) dans une
fiole jaugée de 500 ml (5.2). Ajouter environ 200 ml d’eau et dissoudre les sucres. Ajouter 25 ml
d’acétonitrile (4.9), compléter jusqu’au repère avec de l’eau puis homogénéiser la solution.
4.33 Solutions étalons de sucre pour l’étalonnage
Préparer les différentes dilutions des solutions d’étalonnage de sucre indiquées dans le Tableau 1.
Diluer les volumes indiqués de solution mère d’étalon interne d’arabinose (4.31) et de solution mère
d’étalon de sucre (4.32) dans une fiole jaugée de 200 ml, ajouter environ 50 ml d’eau et homogénéiser.
Ajouter 10 ml d’acétonitrile (4.9), compléter jusqu’au repère avec de l’eau puis homogénéiser.
Tableau 1 — Préparation des solutions étalons de sucre en vue de l’étalonnage
Volume de solution mère Volume de solution mère
d’étalon de sucre ( 4.32) d’étalon interne
Solution étalon de sucre
ml d’arabinose ( 4.31)
ml
1 0,2 0,050
2 1,0 0,050
3 6,0 0,050
4 10,0 0,050
5 20,0 0,050
6 40,0 0,050
7 80,0 0,050
8 100,0 0,050
5 Appareillage
5.1 Balance analytique, d’une précision de ± 0,1 mg.
5.2 Fioles jaugées, de 50 ml, 500 ml et 1 000 ml.
5.3 pH-mètre
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5.4 Papier filtre à bande noire
5.5 Tubes de centrifugation en verre
1)
5.6 Homogénéisateur
5.7 Agitateur vortex
2)
5.8 Tubes gradués fermés par un bouchon à vis, d’un volume de 50 ml .
5.9 Multipipette à déplacement positif
5.10 Distributeurs, résistants aux solvants organiques et réglés sur 2,5 ml et 25 ml.
5.11 Flacons de HPLC
3)
5.12 Système chromatographique ne contenant aucun composant métallique , pouvant être
utilisé avec un profil d’élution à gradient quaternaire.
5.13 Four pour colonne réglé sur 20 °C ± 1 °C.
4)
5.14 Colonne analytique d’échange d’anions à haute performance , garnie d’une résine de
polystyrène-divinylbenzène pelliculaire.
5)
5.15 Colonne de garde pour échange d’anions à haute performance , garnie d’une résine de
polystyrène-divinylbenzène pelliculaire.
6)
5.16 Détecteur par ampérométrie pulsée , doté d’une électrode de travail en or, situé avec les
colonnes chromatographiques dans le four pour colonne à 20 °C.
Les réglages de potentiel du détecteur (par rapport à la référence Ag/AgCl) sont présentés dans le
Tableau 2.
7)
5.17 Pompe pour réactif post-colonne ne contenant aucun composant métallique

1)
Un Ultraturrax d’IKA équipé d’une sonde adaptée est un exemple de produit approprié disponible sur le
marché.
2)
Le tube Sarstedt (référence 62.547.254) est un exemple de tube étalonné de 50 ml fermé par un bouchon à vis
disponible sur le marché.
3)
Le module ICS 3000 de Thermo-Dionex est un exemple de système chromatographique ne contenant aucun
composant métallique et équipé d’une pompe d’élution pour gradient quaternaire adaptée disponible sur le
marché.
4)
La colonne analytique Carbopac PA1 (2 x 250 mm) de Dionex est un exemple de colonne d’échange d’anions à
haute performance disponible sur le marché.
5)
La colonne de garde Carbopac PA1 (2 x 50 mm) de Dionex est un exemple de colonne d’échange d’anions à
haute performance adaptée disponible sur le marché.
6)
Le modèle de PAD de Thermo-Dionex est un exemple de détecteur par ampérométrie pulsée adapté
disponible sur le marché.
7)
La pompe mono-piston Axp de Thermo Dionex est un exemple de pompe pour réactif post-colonne ne
contenant aucun composant métallique adaptée et disponible sur le marché.
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8)
5.18 Système d’intégration de données chromatographiques
Tableau 2 — Programmation horaire des réglages de potentiel du détecteur pour l’électrode de
travail en or
Temps Électrode de potentiel Intégration du signal du
Étape
a
s en or détecteur
1 0,00 0,10
2 0,20 0,10 Début
3 0,40 0,10 Fin
4 0
...