ISO 15213-2:2023
(Main)Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Clostridium spp. — Part 2: Enumeration of Clostridium perfringens by colony-count technique
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Clostridium spp. — Part 2: Enumeration of Clostridium perfringens by colony-count technique
This document specifies the enumeration of Clostridium (C.) perfringens by colony-count technique. This document is applicable to: — products intended for human consumption; — products for feeding animals; — environmental samples in the area of food and feed production and handling; — samples from the primary production stage. NOTE This method has been validated in an interlaboratory study for the following food categories: — ready-to-eat, ready-to-reheat meat products; — eggs and egg products (derivates); — processed fruits and vegetables; — infant formula and infant cereals; — multi-component foods or meal components. It has also been validated for the following other categories: — pet food and animal feed; — environmental samples (food or feed production). As this method has been validated for at least five food categories, this method is applicable for a broad range of food. For detailed information on the validation, see Clause 11 and Annex C. Since the method is not commonly used for samples in the primary production stage, this category was not included in the interlaboratory study. Therefore, no performance characteristics were obtained for this category. This horizontal method was originally developed for the examination of all samples belonging to the food chain. Based on the information available at the time of publication of this document, this method is considered to be fully suited to the examination of all samples belonging to the food chain. However, because of the large variety of products in the food chain, it is possible that this horizontal method is not appropriate in every detail for all products. Nevertheless, it is expected that the required modifications are minimized so that they do not result in a significant deviation from this horizontal method. This technique is suitable for, but not limited to, the enumeration of microorganisms in test samples with a minimum of 10 colonies counted on a plate. This corresponds to a level of contamination that is expected to be higher than 10 cfu/ml for liquid samples or higher than 100 cfu/g for solid samples.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de Clostridium spp. — Partie 2: Dénombrement de Clostridium perfringens par la technique de comptage des colonies
Le présent document spécifie le dénombrement de Clostridium (C.) perfringens par la technique de comptage des colonies. Le présent document s’applique: — aux produits destinés à la consommation humaine; — aux produits destinés à l’alimentation animale; — aux échantillons environnementaux prélevés dans les secteurs de la production et de la distribution des aliments; — aux échantillons issus du stade de la production primaire. NOTE Cette méthode a été validée dans le cadre d’une étude interlaboratoires pour les catégories d’aliments suivantes: — les produits à base de viande prêts à consommer et prêts à réchauffer; — les œufs et ovoproduits (dérivés); — les fruits et légumes transformés; — les préparations et céréales pour nourrissons; — les aliments composés et les composants de repas. Elle a également été validée pour les autres catégories suivantes: — les produits destinés à l’alimentation animale et les aliments pour animaux; — les échantillons environnementaux (production d’aliments ou d’aliments pour animaux). Cette méthode ayant été validée pour au moins cinq catégories d’aliments, elle s’applique à un large éventail d’aliments. Pour des informations détaillées sur la validation, voir l’Article 11 et l’Annexe C. Étant donné que cette méthode n’est pas couramment utilisée pour les échantillons au stade de la production primaire, cette catégorie n’a pas été incluse dans l’étude interlaboratoires. Par conséquent, aucune caractéristique de performance n’a été déterminée pour cette catégorie. Cette méthode horizontale a été initialement développée pour l’examen de tous les échantillons provenant de la chaîne alimentaire. Sur la base des informations disponibles au moment de la publication du présent document, cette méthode est considérée comme parfaitement adaptée à l’examen de tous les échantillons provenant de la chaîne alimentaire. Cependant, en raison de la grande diversité des produits de la chaîne alimentaire, il est possible que cette méthode horizontale ne soit pas appropriée dans ses moindres détails à tous les produits. Néanmoins, il est attendu que les modifications requises soient réduites au minimum afin qu’elles n’entrainent pas de déviation significative de cette méthode horizontale. Cette technique est adaptée, sans toutefois s’y limiter, au dénombrement des micro-organismes dans les échantillons d’essai avec un minimum de 10 colonies dénombrées par boîte. Cela correspond à un niveau de contamination attendu supérieur à 10 UFC/ml pour les échantillons liquides ou supérieur à 100 UFC/g pour les échantillons solides.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 15213-2
First edition
2023-11
Microbiology of the food chain —
Horizontal method for the detection
and enumeration of Clostridium
spp. —
Part 2:
Enumeration of Clostridium
perfringens by colony-count technique
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour
la recherche et le dénombrement de Clostridium spp. —
Partie 2: Dénombrement de Clostridium perfringens par la technique
de comptage des colonies
Reference number
© ISO 2023
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Email: copyright@iso.org
Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .iv
Introduction . vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 2
3 Terms and definitions . 2
4 Principle . 3
4.1 General . 3
4.2 Preparation of dilutions . 3
4.3 Enumeration . 3
4.4 Confirmation . 3
5 Culture media and reagents .4
6 Equipment and consumables .4
7 Sampling . 4
8 Preparation of test sample . 5
9 Procedure .5
9.1 General . 5
9.2 Test portion, initial suspension and dilutions . 5
9.3 Heat treatment to select spores . 5
9.4 Inoculation and incubation. 6
9.5 Enumeration of typical colonies . 6
9.6 Confirmation of C. perfringens . 7
9.6.1 Selection of colonies for confirmation . 7
9.6.2 Acid phosphatase test . 7
9.6.3 Sulfite indole motility (SIM) agar test . 7
9.6.4 Differentiation between human pathogenic and non-pathogenic
C. perfringens strains (optional) . 8
9.6.5 Interpretation . 8
10 Expression of results . 8
11 Validation of the method . 8
11.1 Interlaboratory study . 8
11.2 Performance characteristics . 8
12 Test report . 9
13 Quality assurance .10
Annex A (normative) Flow diagram of the procedure .11
Annex B (normative) Culture media and reagents .13
Annex C (informative) Method validation studies and performance characteristics .18
Annex D (informative) Molecular differentiation between pathogenic and non-pathogenic
C. perfringens .21
Bibliography .43
iii
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
ISO draws attention to the possibility that the implementation of this document may involve the use
of (a) patent(s). ISO takes no position concerning the evidence, validity or applicability of any claimed
patent rights in respect thereof. As of the date of publication of this document, ISO had not received
notice of (a) patent(s) which may be required to implement this document. However, implementers are
cautioned that this may not represent the latest information, which may be obtained from the patent
database available at www.iso.org/patents. ISO shall not be held responsible for identifying any or all
such patent rights.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to
the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see
www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 463, Microbiology of the food chain, in accordance with the Agreement on technical
cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This first edition of ISO 15213-2 cancels and replaces ISO 7937:2004, which has been technically
revised.
The main changes are as follows:
— the Scope has been expanded to samples from the primary production stage;
— the heat treatment of 10 min at 80 °C has been made optional, in the case of high background flora
or for the enumeration of only spores of Clostridium (C.) perfringens present in the sample;
— the selective medium has been re-named from sulfite-cycloserine agar (SC) to tryptose sulfite
cycloserine agar (TSC agar) without changes in the formulation;
— the confirmation methods described have been modified according to ISO 14189;
— the flow diagram in normative Annex A giving a short description of the procedure has been revised;
— in Annex B, criteria for the performance testing of culture media have been added;
— in Annex C (informative), the performance characteristics have been added;
— in Annex D (informative), two molecular methods have been added for differentiation between
pathogenic and non-pathogenic C. perfringens and one molecular method for the differentiation of
C. perfringens type A strains carrying a chromosomally encoded cpe gene or a plasmid encoded cpe
gene.
iv
A list of all parts in the ISO 15213 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
v
Introduction
Clostridium (C.) perfringens is a Gram-positive, anaerobic, spore-forming bacterium. As a ubiquitous
bacterium, C. perfringens is predominantly found in soil, but also in the intestinal tract of humans and
animals. Therefore, the presence of C. perfringens in high numbers can be an indication of inadequate
preparation or handling of food.
High numbers of C. perfringens in ready-to-eat-food can cause human illness, mainly diarrhoea. The
strains are classified into toxin types, depending on the ability to produce different so called “major”
and “minor” toxins. Food poisonings are caused by C. perfringens isolates with the ability to produce
C. perfringens enterotoxin (CPE).
A characteristic feature is the heat resistance of the spores; they have the ability to germinate and
multiply in ready-to-eat food after the cooking process. Ingestion of contaminated food is followed
by gastrointestinal disease, when enzyme-resistant C. perfringens enterotoxins are set free during
sporulation in the small intestine. The strains are classified into different types.
This document describes the horizontal method for the enumeration of C. perfringens in food,
feed, environmental samples and samples from the primary production stage. The method for the
enumeration of sulfite-reducing Clostridium spp. is described in ISO 15213-1. The method for the
detection of C. perfringens is described in ISO/TS 15213-3. These three parts are published as a series
of International Standards because the methods are closely linked to each other. These methods are
often conducted in association with each other in a laboratory and the media and their performance
characteristics can be similar.
The main technical changes listed in the Foreword, introduced in this document compared with
ISO 7937:2004, are considered as major (see ISO 17468).
These changes have a major impact on the performance characteristics of the method.
vi
INTERNATIONAL STANDARD ISO 15213-2:2023(E)
Microbiology of the food chain — Horizontal method for
the detection and enumeration of Clostridium spp. —
Part 2:
Enumeration of Clostridium perfringens by colony-count
technique
WARNING — In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that tests for
enumeration of Clostridium perfringens are only undertaken in properly equipped laboratories,
under the control of a skilled microbiologist, and that great care is taken in the disposal of all
incubated materials. Persons using this document should be familiar with normal laboratory
practice. This document does not purport to address all of the safety aspects, if any, associated
with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health
practices.
1 Scope
This document specifies the enumeration of Clostridium (C.) perfringens by colony-count technique.
This document is applicable to:
— products intended for human consumption;
— products for feeding animals;
— environmental samples in the area of food and feed production and handling;
— samples from the primary production stage.
NOTE This method has been validated in an interlaboratory study for the following food categories:
— ready-to-eat, ready-to-reheat meat products;
— eggs and egg products (derivates);
— processed fruits and vegetables;
— infant formula and infant cereals;
— multi-component foods or meal components.
It has also been validated for the following other categories:
— pet food and animal feed;
— environmental samples (food or feed production).
As this method has been validated for at least five food categories, this method is applicable for a broad range of
food. For detailed information on the validation, see Clause 11 and Annex C. Since the method is not commonly
used for samples in the primary production stage, this category was not included in the interlaboratory study.
Therefore, no performance characteristics were obtained for this category.
This horizontal method was originally developed for the examination of all samples belonging to the
food chain. Based on the information available at the time of publication of this document, this method
is considered to be fully suited to the examination of all samples belonging to the food chain. However,
because of the large variety of products in the food chain, it is possible that this horizontal method is not
appropriate in every detail for all products. Nevertheless, it is expected that the required modifications
are minimized so that they do not result in a significant deviation from this horizontal method.
This technique is suitable for, but not limited to, the enumeration of microorganisms in test samples
with a minimum of 10 colonies counted on a plate. This corresponds to a level of contamination that is
expected to be higher than 10 cfu/ml for liquid samples or higher than 100 cfu/g for solid samples.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 6887 (all parts), Microbiology of the food chain — Preparation of test samples, initial suspension and
decimal dilutions for microbiological examination
ISO 7218, Microbiology of the food chain — General requirements and guidance for microbiological
examinations
ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and
performance testing of culture media
ISO 19036:2019, , Microbiology of the food chain — Estimation of measurement uncertainty for quantitative
determinations
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
presumptive C. perfringens
presumptive Clostridium perfringens
spore-forming bacteria forming countable typical colonies in a specific selective medium under obligate
anaerobic conditions
Note 1 to entry: Presumptive C. perfringens are spore-forming bacteria that are able to produce typical colonies
under the conditions specified in this document.
3.2
confirmed C. perfringens
confirmed Clostridium perfringens
bacteria that produce characteristic colonies in the specified selective medium under obligate anaerobic
conditions and possess the enzyme acid phosphatase
3.3
human pathogenic C. perfringens
human pathogenic Clostridium perfringens
confirmed C. perfringens strains (3.2) which possess the ability to produce C. perfringens enterotoxin
(CPE), encoded by the cpe gene
Note 1 to entry: The cpe gene can be located either chromosomally or on plasmids. These isolates are able to
produce CPE in the small intestine on sporulation and cause human illness.
3.4
enumeration of C. perfringens
enumeration of Clostridium perfringens
determination of the number of colony-forming units (cfu) of confirmed C. perfringens (3.2) found per
gram, per millilitre, per square centimetres or per sampling device when a specified test is conducted
Note 1 to entry: Specified tests are given in Clause 9.
4 Principle
4.1 General
A specified quantity of the liquid test sample, or of an initial suspension in the case of other products,
is dispensed into an empty Petri dish and mixed well with a specified molten agar culture medium
to form a poured plate. Additional plates are prepared under the same conditions using decimal
dilutions of the test sample. After solidification of the agar medium, an overlay is used to prevent the
development of spreading colonies on the surface of the medium. If it is the intention to count only
spores, a heat treatment of 10 min at 80 °C is performed before plating. Additionally, a method for
molecular differentiation between human pathogenic and non-pathogenic C. perfringens strains is
described in Annex D.
When the number of cfu is expected to be at or near the limit of determination, the use of duplicate
plates is preferable. If duplicate plates are used, the minimum for the sum of colonies on both plates
should be 10 colonies. In this case, the level of contamination is expected to be higher than 5 cfu/ml for
liquid samples or higher than 50 cfu/g for solid samples.
A pour-plate technique with overlay is especially suited for the enumeration of products expected to
contain spreading colonies that can obscure colonies of the target microorganisms.
The enumeration of C. perfringens requires four successive stages as specified in the normative Annex A.
4.2 Preparation of dilutions
For the preparation of decimal dilutions from the test portion, follow the procedure as specified in the
ISO 6887 series.
4.3 Enumeration
Petri dishes are inoculated with a specified quantity of the test sample if the initial product is liquid,
or a specified quantity of the initial suspension, in the case of other products. Additional Petri dishes
are inoculated, under the same conditions, using decimal dilutions of the test sample or of the initial
suspension. A selective medium is added (pour-plate technique) and then overlaid with the same
medium.
The plates are incubated under anaerobic conditions at 37 °C for 20 h. After incubation, the number
of typical colonies, which show black or grey to yellow-brown staining, are counted. The colour of the
colonies and the surrounding zone changes due to the formation of iron(II)sulfide as a result of the
reaction between sulfide ions and trivalent iron [Fe(III)] present in the medium.
4.4 Confirmation
Confirmatory tests are carried out. The result is calculated as the colony count of confirmed
C. perfringens per sample volume. Additionally, the method described in Annex D can be used for
molecular differentiation between human pathogenic and non-pathogenic C. perfringens strains.
5 Culture media and reagents
Follow current laboratory practices in accordance with ISO 7218. The composition of culture media
and reagents and their preparation are specified in Annex B. For performance testing of culture media,
follow the procedures in accordance with ISO 11133 and Annex B.
6 Equipment and consumables
Disposable equipment is an acceptable alternative to reusable glassware if it has suitable specifications.
The usual microbiological laboratory equipment (see ISO 7218) and, in particular, the following shall be
used.
6.1 Appropriate apparatus for achieving an anaerobic atmosphere, a jar that can be hermetically
sealed or any other appropriate equipment which enables anaerobic atmosphere conditions to
be maintained for the total incubation time of the culture medium. Other systems of equivalent
performance, such as anaerobic cabinets, may be used. Follow the manufacturer’s instructions for
installation and maintenance.
The composition of the atmosphere required can be achieved by means of the addition of a gas mixture
(e.g. from a gas cylinder) after evacuation of air from the jar, by displacement of the atmosphere in
a cabinet or by any other appropriate means (such as commercially available gas packs). In general,
anaerobic incubation requires an atmosphere of less than 1 % volume fraction oxygen, 9 % volume
fraction to 13 % volume fraction carbon dioxide.
6.2 Apparatus for dry sterilization (oven) or wet sterilization (autoclave).
6.3 Freezer, capable of operating at −20 °C ± 2 °C and at −70 °C ± 3 °C.
6.4 Incubator, capable of operating at 37 °C ± 1 °C.
6.5 pH-meter, having a maximum permissible error of calibration of ±0,1 pH unit at 25 °C.
6.6 Refrigerator, capable of operating at 5 °C ± 3 °C.
6.7 Sterile bottles, flasks or tubes, of appropriate capacity. Bottles, flasks or tubes with non-toxic
metallic or plastic screw-caps may be used.
6.8 Sterile graduated pipettes or automatic pipettes, of nominal capacities 10 ml, 1 ml and 0,1 ml.
6.9 Sterile loops, of approximate diameter 3 mm (10 μl volume), and of 1 μl volume, or inoculation
needle or wire.
6.10 Sterile Petri dishes, with a diameter of approximately 90 mm and (optional) large size (diameter
approximately 140 mm).
6.11 Thermostatically controlled water bath, capable of operating at 44 °C to 47 °C and 80 °C ± 2 °C.
7 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this document. Follow the specific International
Standard dealing with the product concerned. If there is no specific International Standard dealing
with the sampling of the product concerned, it is recommended that the parties concerned come to an
agreement on this subject.
Recommended sampling techniques are given in the following documents:
— ISO/TS 17728 for food and animal feed;
— ISO 707 for milk and milk products;
— ISO 6887-3 for raw molluscs, tunicates and echinoderms from primary production areas;
— ISO 13307 for primary production stage;
— ISO 17604 for carcasses;
— ISO 18593 for surfaces.
It is important that the laboratory receives a sample that is representative of the product under
consideration. The sample should not have been damaged or changed during transport or storage.
8 Preparation of test sample
Prepare the test sample from the laboratory sample in accordance with the specific International
Standard dealing with the product concerned. Follow the procedures as specified in the ISO 6887 series.
If there is no specific International Standard available, it is recommended that the parties concerned
come to an agreement on this subject.
9 Procedure
9.1 General
The procedure as given in Annex A shall be followed.
9.2 Test portion, initial suspension and dilutions
Follow the procedures in accordance with the ISO 6887 series and the specific International Standard
dealing with the product concerned. Prepare a single decimal dilution series from the test portion if the
product is liquid, or from the initial suspension in the case of other products.
9.3 Heat treatment to select spores
If it is the intention to count only spores, heat the decimal dilution series to 80 °C in a water bath
(6.11) for 10 min ± 1 min. Heat treatment shall be given within 15 min after preparation of the initial
suspension to avoid germination of spores. If the tube is not placed in the water bath within 15 min, it
should be placed immediately in melting ice for a maximum of 2 h.
The temperature during heat treatment should be monitored by placing an appropriate thermometer in
a reference bottle of the same size as the sample bottle and containing the same volume of water at the
same initial temperature as the sample being treated (6.7). The tubes should not be hermetically sealed
during the heat treatment. The time taken to reach 80 °C shall not exceed 5 min and can be minimized
by ensuring the water level to be at least 4 cm above the level of the sample and that the water bath is
equipped with a circulating-water pump to maximize heat exchange.
Start the time of heating (10 min) when the temperature of the reference sample has reached 80 °C.
After heat treatment, the samples should be cooled immediately till approximately 20 °C.
Heat treatment should also reduce the competitive flora in some matrices containing a high level of
background flora (e.g. liquid whey, silage).
9.4 Inoculation and incubation
9.4.1 Take two sterile Petri dishes with a diameter of approximately 90 mm (6.10). Transfer to each
dish, by means of a sterile pipette (6.8), 1 ml of the test sample if liquid, or 1 ml of the initial suspension
−1
(10 dilution) in the case of other products. If plates from more than one dilution are prepared, this
may be reduced to one dish (see ISO 7218). When, for certain products, it is necessary to estimate low
numbers of C. perfringens, the limit of enumeration may be lowered by a factor of 10 by examining 10 ml
of the initial suspension in three large (140 mm) Petri dishes (6.10).
9.4.2 Take one other sterile Petri dish (6.10). Use another sterile pipette (6.8) to dispense 1 ml of the
−1 −2
10 dilution (liquid product) or 1 ml of the 10 dilution (other products).
9.4.3 If necessary, repeat the procedure with further dilutions, using a new sterile pipette (6.8) for
each decimal dilution.
9.4.4 If appropriate and possible, select only the critical dilution steps (at least two consecutive
decimal dilutions) for the inoculation of the Petri dishes (6.10) that will give colony counts of between
10 and 150 colonies per plate (on 90 mm Petri dishes) or between 10 and 365 colonies per plate (on
140 mm Petri dishes).
9.4.5 Pour about 12 ml to 15 ml for 90 mm Petri dishes or 30 ml to 35 ml for 140 mm Petri dishes of
the tryptose sulfite cycloserine agar (TSC agar) (see B.2), molten and tempered at 44 °C to 47 °C (6.11),
into each Petri dish (6.10).
9.4.6 Carefully mix the inoculum with the medium by rotating the Petri dishes and allow the mixture
to solidify by leaving the Petri dishes standing on a cool horizontal surface.
9.4.7 After complete solidification, pour about 5 ml of the TSC agar (see B.2) for 90 mm Petri dishes
(6.10) or 12 ml for 140 mm Petri dishes (6.10) as overlay, to prevent the development of spreading
colonies on the surface of the medium. Allow to solidify as specified in 9.4.6.
9.4.8 Invert the plates obtained in 9.4.7 and incubate (6.4) the plates at 37 °C in an anaerobic
atmosphere (6.1).
9.5 Enumeration of typical colonies
9.5.1 After 20 h ± 2 h of incubation, examine the plates (see 9.4.8) for presumptive C. perfringens.
Longer incubation can result in excess blackening of the plates.
Typical colonies, which show black or grey to yellow-brown staining (even if the colour is faint) on the
TSC agar, are counted.
Upon removal of the plates from the anaerobic atmosphere, plates shall be counted within 30 min as
the colour of the colonies can rapidly fade and disappear upon exposure to oxygen. If anaerobic jars are
used, the plates should be checked jar by jar or in small portions if the incubation was performed in an
anaerobic incubator (6.1, 6.4).
NOTE Diffuse, unspecific blackening of the medium can occur. The growth of anaerobic bacteria, which
produce hydrogen (not H S), can also reduce the sulfite present and lead to a general blackening of the medium,
which makes enumeration of typical colonies difficult.
9.5.2 Select the plates (see 9.5.1) containing less than 150 presumptive colonies (for 90 mm Petri
dishes) or less than 365 colonies (for 140 mm Petri dishes); count these colonies and record the
number of presumptive colonies per dish. Then choose, at random, five such colonies from each dish for
confirmation (see 9.6). For enumeration of plates with low or high numbers of presumptive colonies,
see ISO 7218.
9.6 Confirmation of C. perfringens
9.6.1 Selection of colonies for confirmation
9.6.1.1 For confirmation, take five presumptive colonies from each dish retained for enumeration
(see 9.5.2). If more than one morphology is present among the colonies, select one of each morphology
for subculture and confirmation.
9.6.1.2 Streak each of the selected colonies with a sterile loop (6.9) onto one non-selective blood
agar plates, e.g. Columbia blood agar (see B.3). If blood is not available, Columbia agar base or another
nutrient-rich medium (e.g. tryptone soya agar or brain heart infusion agar) can be used.
Allow the plates to equilibrate at room temperature if they were stored at a lower temperature. If
necessary, dry the surface of the plates before use (see ISO 11133).
Several isolates can be streaked onto identified sectors. Streaks should obtain well-isolated colonies.
Incubate the plates in an anaerobic atmosphere (6.1) at 37 °C (6.4) for 20 h ± 2 h. Right after incubation,
select well-isolated freshly grown colonies for confirmation. Confirmation may be done either by the
acid phosphatase test or by the sulfite indole motility (SIM) agar test.
NOTE Alternative procedures (see ISO 7218) can be used to confirm the isolate(s) as C. perfringens, provided
that the suitability of the alternative procedure has been validated (see ISO 16140-4 or ISO 16140-6).
After incubation, these plates can be refrigerated at 5 °C (6.6) for a maximum of 48 h before reading.
For plates which were incubated anaerobically, maintain the anaerobic atmosphere.
9.6.2 Acid phosphatase test
9.6.2.1 It is known that, beside C. perfringens, some other Clostridium strains (e.g. some strains of
C. baratii) can produce acid phosphatase, but this ability is very limited. Therefore, only a very low
percentage of false positives is expected.
9.6.2.2 Colonies grown anaerobically on blood or nutrient agar plates are spread on filter paper
and 2 to 3 drops of the acid phosphatase reagent (B.4) are placed onto the colonies. If a commercially
available test kit is used, follow the manufacturer’s instructions.
NOTE It is possible to drip acid phosphatase reagent on colonies, if no further investigation of the colonies is
needed.
9.6.2.3 A purplish colour developed within 3 min to 4 min is considered as a positive reaction.
9.6.3 Sulfite indole motility (SIM) agar test
Colonies grown anaerobically on blood agar plates or nutrient agar plates are stabbed into SIM tubes
(B.5). The tubes are incubated for 22 h ± 2 h at 37 °C (6.4). After incubation the tubes are read for:
— sulfite production: tubes showing blackening are positive;
— motility: tubes showing growth outside the inoculation stab are positive;
— indole production: tubes giving a red coloured ring directly after adding Kovacs reagent (B.6) are
positive.
C. perfringens is positive for sulfite production and negative for indole production and motility.
9.6.4 Differentiation between human pathogenic and non-pathogenic C. perfringens strains
(optional)
Additionally, the method described in Annex D can be used for molecular differentiation between
human pathogenic and non-pathogenic C. perfringens strains.
9.6.5 Interpretation
C. perfringens produces black or grey to yellow brown colonies on TSC agar, even if the colour is faint,
and possesses acid phosphatase, or is positive for sulfite production, negative for indole production and
motility in SIM agar.
10 Expression of results
For calculation of the results, follow the procedure(s) in accordance with ISO 7218. Calculate and report
the results as the number of confirmed C. perfringens or, if the method of Annex D was also used for
differentiation, of confirmed human pathogenic C. perfringens, in cfu per gram, per millilitre or per
square centimetre. When the sampled area is not known, report as per sampling device, such as a cloth,
sponge swab or stick.
If heat pre-treatment for the selection of spores (9.3) was used, the result is reported as number of
confirmed C. perfringens spores or, if the method of Annex D was also used for differentiation, of
confirmed human pathogenic C. perfringens spores in cfu per gram, per millilitre, per square centimetre
or per sampling device.
In cases when no typical colonies of C. perfringens have been detected, or when no typical colonies are
confirmed as C. perfringens, follow ISO 7218 for the expression of results for special cases.
11 Validation of the method
11.1 Interlaboratory study
Results of the interlaboratory study (step 6 in ISO 17468) to determine the performance characteristics
of the method are described in 11.2.
11.2 Performance characteristics
The performance characteristics of the method (repeatability and reproducibility standard
deviations) were determined in an interlaboratory study. It is possible that the values derived from the
interlaboratory study are not applicable to concentration ranges and (food) categories other than those
used in the study. All data are given in Annex C.
A summary of the interlaboratory repeatability standard deviation (s ) is given in Table 1.
r
Table 1 — Summary of s values from the interlaboratory study
r
(Food) category (Food) item s values of low s values of medi- s values of high
r r r
inoculation level um inoculation inoculation level
level
Ready-to-eat, ready-to-reheat Corned beef 0,292 0,272 0,100
meat products
Ready-to-eat, ready-to-reheat Canned fish 0,204 0,193 0,035
fishery products
Multi-component foods or Instant soup 0,208 0,080 0,070
meal components
Infant formula and infant Powdered infant 0,160 0,200 0,098
cereals formula
Processed fruits and vegeta- Canned pineapple 0,091 0,070 0,061
bles
Environmental samples (food Environmental 0,160 0,117 0,065
or feed production) swab
Pet food and animal feed Feed silage 0,227 0,098 0,134
A summary of the interlaboratory reproducibility standard deviation (s ) is given in Table 2.
R
Table 2 — Summary of s values from the interlaboratory study
R
(Food) category (Food) item S values of low S values of me- S values of high
R R R
inoculation level dium inoculation inoculation level
level
Ready-to-eat, ready- Corned beef 0,408 0,653 0,383
to-reheat meat
products
Ready-to-eat, ready- Canned fish 0,356 0,543 0,309
to-reheat fishery
products
Multi-component Instant soup 0,621 0,654 0,688
foods or meal compo-
nents
Infant formula and Powdered infant 0,396 0,403 0,356
infant cereals formula
Processed fruits and Canned pineapple 0,453 0,637 0,797
vegetables
Environmental Environmental swab 0,457 0,475 0,629
samples (food or feed
production)
Pet food and animal Feed silage 0,626 0,606 0,793
feed
12 Test report
The test report shall specify at least the following:
— the test method used, with reference to this document, i.e. ISO 15213-2:2023;
— the sampling method used, if known;
— all operating conditions not specified in this document, or regarded as optional or informative
(including informative annexes), together with details of any incidents which can have influenced
the test result(s);
— any deviations from this document;
— all information necessary for the complete identification of the sample;
— the test result(s) obtained;
— the date of the test;
— when necessary or if requested by the client, an estimate of the measurement uncertainty of a
quantitative test result, in accordance with ISO 19036:2019, Clause 9.
13 Quality assurance
The laboratory should have a quality control system to ensure that the equipment, reagents and
techniques are suitable for the method. The use of positive controls, negative controls and blanks are
part of the method. Performance testing of culture media is specified in Annex B and described in
ISO 11133.
Annex A
(normative)
Flow diagram of the procedure
Figure A.1 shows the diagram of procedure for the enumeration of C. perfringens by colony-count
technique in food, animal feed, environmental and primary production stage samples.
Figure A.1 — Flow diagram of the procedure for enumeration of C. perfringens by colony-count
technique
Annex B
(normative)
Culture media and reagents
B.1 General
The general specifications of ISO 11133 are applicable to the preparation and performance testing of
the culture media described in this annex. If culture media or reagents are prepared from dehydrated
complete media/reagents or if ready-to-use media/reagents are used, follow the manufacturer’s
instructions regarding preparation, storage conditions, expiry date and use.
The shelf life of the media indicated in this annex has been determined in some studies. The user shall
verify this under their own storage conditions (in accordance with ISO 11133).
Performance testing of culture media is described in B.7.
[18]
B.2 Tryptose sulfite cycloserine agar (TSC agar)
NOTE TSC agar is also known under the name “sulfite-cycloserine agar (SC agar)”.
B.2.1 Base medium
B.2.1.1 Composition
a
Peptone 15,0 g
Enzymatic digest of soya 5,0 g
Yeast extract 5,0 g
® d
Sodium disulfite (sodium metabisulfite), anhydrous (Na S O ) (CAS No. 7681-57-4) 1,0 g
2 2 5
b ®
Iron(III) ammonium citrate (C H FeNO ) (CAS No. 1185-57-5) 1,0 g
6 8 4
c
Agar 9,0 g to 18,0 g
Water 1 000 ml
a
For example, enzymatic digest of casein.
b
This reagent should contain at least 150 g/kg of iron.
c
Depending on the gel strength of the agar.
d ®
CAS No. is a trademark of CAS corporation. This information is given for the convenience of users of this document
and does not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent products may be used if they can be
shown to lead to the same results.
B.2.1.2 Preparation
Suspend the ingredients in the water and dissolve by heating and stirring. Sterilize by autoclaving (6.2)
at 121 °C for 15 min.
Allow to cool to 44 °C to 47 °C (6.11). The base medium may be stored at 5 °C (6.6) for up to four weeks
in closed containers or tubes (6.7).
Prior to the preparation of the complete medium, the stored medium is melted completely and cooled
down to 44 °C to 47 °C (6.11) before adding the D-cycloserine solution (see B.2.2).
B.2.2 D-cycloserine solution
B.2.2.1 Composition ®
D-cycloserine (C H N O ) (CAS No. 68-41-7) 4,0 g
3 6 2 2
Water 100 ml
B.2.2.2 Preparation
Dissolve the D-cycloserine in the water and filter through a membrane of 0,2 μm pore size. Dispense
aseptically into suitable volumes, store at −20 °C (6.3) and use within four weeks of preparation.
Alternatively, the dispensed volumes of cycloserine can be stored at −70 °C (6.3) for a maximum of
12 months.
B.2.3 Complete medium
B.2.3.1 Composition
Base medium (B.2.1) 100 ml
D-cycloserine solution (B.2.2) 1 ml
B.2.3.2 Preparation
Immediately before use in the pour-plate method (see 9.4.5), to each 100 ml of sterile molten base (B.2.1)
cooled to 44 °C to 47 °C (6.11), add 1 ml of D-cycloserine solution (B.2.2) to obtain a final D-cycloserine
concentration of 0,4 g per litre TSC agar. The final pH of the medium should correspond to 7,6 ± 0,2 at
25 °C (6.5).
B.3 Columbia blood agar (CBA)
B.3.1 Columbia blood agar base
B.3.1.1 Composition
Enzymatic digest of animal tissue 23,0 g ®
Starch soluble (C H O ) (CAS No. 9005-84-9) 1,0 g
12 22 11 ®
Sodium chloride (NaCL) (CAS No. 7647-14-5) 5,0 g
a
Agar 8,0 to 18,0 g
Water 1 000 ml
a
Depending on the gel strength of the agar.
B.3.1.2 Preparation
Dissolve the ingredients in
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 15213-2
Première édition
2023-11
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Méthode horizontale
pour la recherche et le dénombrement
de Clostridium spp. —
Partie 2:
Dénombrement de Clostridium
perfringens par la technique de
comptage des colonies
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection
and enumeration of Clostridium spp. —
Part 2: Enumeration of Clostridium perfringens by colony-count
technique
Numéro de référence
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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
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CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction . vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives .2
3 Termes et définitions . 2
4 Principe. 3
4.1 Généralités . 3
4.2 Préparation des dilutions . 3
4.3 Dénombrement . 3
4.4 Confirmation . 4
5 Milieux de culture et réactifs .4
6 Équipement et consommables . 4
7 Échantillonnage .5
8 Préparation de l’échantillon pour essai . 5
9 Mode opératoire . 5
9.1 Généralités . 5
9.2 Prise d’essai, suspension mère et dilutions . 5
9.3 Traitement thermique pour la sélection des spores . 6
9.4 Ensemencement et incubation . . 6
9.5 Dénombrement des colonies caractéristiques . 7
9.6 Confirmation de C. perfringens . . 7
9.6.1 Sélection des colonies à confirmer . 7
9.6.2 Essai à la phosphatase acide . 8
9.6.3 Essai sur gélose SIM (mobilité indole sulfite) . 8
9.6.4 Différenciation entre souches de C. perfringens pathogènes et non
pathogènes pour l’Homme (facultatif) . 8
9.6.5 Interprétation . 8
10 Expression des résultats . 8
11 Validation de la méthode . 9
11.1 Étude interlaboratoires . 9
11.2 Caractéristiques de performance . 9
12 Rapport d’essai .10
13 Assurance qualité .10
Annexe A (normative) Logigramme du mode opératoire .11
Annexe B (normative) Milieux de culture et réactifs .13
Annexe C (informative) Études de validation de la méthode et caractéristiques
de performance .19
Annexe D (informative) Différenciation moléculaire entre C. perfringens pathogènes et
non pathogènes.22
Bibliographie . 44
iii
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document
a été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner
l’utilisation d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et
à l’applicabilité de tout droit de propriété revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent
document, l’ISO n’avait pas reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa
mise en application. Toutefois, il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent
document que des informations plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de
brevets, disponible à l’adresse www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de brevets.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/iso/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 9, Microbiologie, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 463, Microbiologie de la chaîne
alimentaire, du Comité européen de normalisation (CEN), conformément à l’Accord de coopération
technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette première édition de l’ISO 15213-2 annule et remplace l’ISO 7937:2004, qui a fait l’objet d’une
révision technique.
Les principales modifications sont les suivantes:
— le Domaine d’application a été élargi aux échantillons prélevés au stade de la production primaire;
— le traitement thermique de 10 min à 80 °C est à présent facultatif, il est appliqué si la flore annexe
est élevée ou pour le dénombrement uniquement des spores de Clostridium (C.) perfringens dans
l’échantillon;
— le milieu sélectif précédemment appelé «gélose sulfite à la cyclosérine (SC)» est à présent appelé
«gélose tryptose-sulfite à la cyclosérine (gélose TSC)» sans changement de formulation;
— les méthodes de confirmation décrites ont été modifiées conformément à l’ISO 14189;
— le logigramme à l’Annexe A normative qui donne une brève description du mode opératoire a été
révisé;
— les critères pour les essais de performance du milieu de culture ont été ajoutés à l’Annexe B;
— les caractéristiques de performance ont été ajoutées à l’Annexe C (informative);
iv
— à l’Annexe D (informative), deux méthodes moléculaires ont été ajoutées pour une différenciation
entre les C. perfringens pathogènes et les C. perfringens non pathogènes, et une méthode moléculaire
est décrite pour la différenciation des souches de type A de C. perfringens portant un gène cpe codé
sur le matériel chromosomique de celles portant un gène cpe codé sur les plasmides.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 15213 se trouve sur le site Web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
v
Introduction
Clostridium (C.) perfringens est une bactérie à coloration de Gram-positive, anaérobie, qui forme des
spores. S’agissant d’une bactérie ubiquitaire, C. perfringens se retrouve principalement dans le sol,
mais elle se retrouve également dans le tube digestif des humains et des animaux. La présence d’un
nombre élevé de C. perfringens peut donc indiquer une préparation ou une manipulation inadéquate des
produits alimentaires.
Un nombre élevé de C. perfringens dans les aliments prêts à consommer peut provoquer des maladies
chez l’Homme, qui se traduisent essentiellement par une diarrhée. Les souches sont classées par type
toxinique, selon leur capacité à produire des toxines dites «majeures» et «mineures». Les toxi-infections
alimentaires sont causées par des isolats de C. perfringens qui produisent l’entérotoxine C. perfringens
(CPE).
Un élément caractéristique est la thermorésistance des spores: elles ont la capacité de germer et de se
multiplier dans les aliments prêts à consommer après le processus de cuisson. L’ingestion d’aliments
contaminés est suivie d’une maladie gastro-intestinale lorsque les entérotoxines enzymo-résistantes
de C. perfringens sont libérées pendant la phase de sporulation dans l’intestin grêle. Les souches sont
classées par type.
Le présent document décrit la méthode horizontale pour le dénombrement de C. perfringens dans les
aliments, les aliments pour animaux, les échantillons environnementaux et les échantillons prélevés au
stade de la production primaire. La méthode de dénombrement des bactéries Clostridium spp. Sulfito-
réductrices est décrite dans l’ISO 15213-1. La méthode de détection de C. perfringens est décrite dans
l’ISO/TS 15213-3. Ces trois parties sont publiées dans le cadre d’une série de Normes internationales,
car les méthodes sont étroitement liées les unes aux autres. Ces méthodes sont souvent utilisées
conjointement dans un laboratoire et les milieux et leurs caractéristiques de performance peuvent être
similaires.
Les principales modifications techniques énumérées dans l’Avant-propos et introduites dans le présent
document par rapport à l’ISO 7937:2004 sont considérées comme des modifications significatives
(voir l’ISO 17468).
Ces modifications ont un impact majeur sur les caractéristiques de performance de la méthode.
vi
NORME INTERNATIONALE ISO 15213-2:2023(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode
horizontale pour la recherche et le dénombrement de
Clostridium spp. —
Partie 2:
Dénombrement de Clostridium perfringens par la
technique de comptage des colonies
AVERTISSEMENT — Afin de préserver la santé du personnel de laboratoire, il est essentiel
que les essais de dénombrement de Clostridium perfringens ne soient effectués que dans des
laboratoires correctement équipés, sous la surveillance d’un microbiologiste expérimenté,
et qu’un grand soin soit apporté à l’élimination de tous les matériaux incubés. Il convient que
les utilisateurs du présent document connaissent les pratiques de laboratoire normales. Le
présent document ne prétend pas aborder la totalité des aspects liés à la sécurité qui pourraient
découler de son utilisation. Il incombe à l’utilisateur de mettre en place des pratiques de santé et
de sécurité appropriées.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie le dénombrement de Clostridium (C.) perfringens par la technique de
comptage des colonies.
Le présent document s’applique:
— aux produits destinés à la consommation humaine;
— aux produits destinés à l’alimentation animale;
— aux échantillons environnementaux prélevés dans les secteurs de la production et de la distribution
des aliments;
— aux échantillons issus du stade de la production primaire.
NOTE Cette méthode a été validée dans le cadre d’une étude interlaboratoires pour les catégories d’aliments
suivantes:
— les produits à base de viande prêts à consommer et prêts à réchauffer;
— les œufs et ovoproduits (dérivés);
— les fruits et légumes transformés;
— les préparations et céréales pour nourrissons;
— les aliments composés et les composants de repas.
Elle a également été validée pour les autres catégories suivantes:
— les produits destinés à l’alimentation animale et les aliments pour animaux;
— les échantillons environnementaux (production d’aliments ou d’aliments pour animaux).
Cette méthode ayant été validée pour au moins cinq catégories d’aliments, elle s’applique à un large éventail
d’aliments. Pour des informations détaillées sur la validation, voir l’Article 11 et l’Annexe C. Étant donné que cette
méthode n’est pas couramment utilisée pour les échantillons au stade de la production primaire, cette catégorie
n’a pas été incluse dans l’étude interlaboratoires. Par conséquent, aucune caractéristique de performance n’a été
déterminée pour cette catégorie.
Cette méthode horizontale a été initialement développée pour l’examen de tous les échantillons
provenant de la chaîne alimentaire. Sur la base des informations disponibles au moment de la publication
du présent document, cette méthode est considérée comme parfaitement adaptée à l’examen de tous
les échantillons provenant de la chaîne alimentaire. Cependant, en raison de la grande diversité des
produits de la chaîne alimentaire, il est possible que cette méthode horizontale ne soit pas appropriée
dans ses moindres détails à tous les produits. Néanmoins, il est attendu que les modifications requises
soient réduites au minimum afin qu’elles n’entrainent pas de déviation significative de cette méthode
horizontale.
Cette technique est adaptée, sans toutefois s’y limiter, au dénombrement des micro-organismes dans
les échantillons d’essai avec un minimum de 10 colonies dénombrées par boîte. Cela correspond à un
niveau de contamination attendu supérieur à 10 UFC/ml pour les échantillons liquides ou supérieur
à 100 UFC/g pour les échantillons solides.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie de la chaîne alimentaire — Préparation des échantillons, de la
suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l'eau — Préparation, production,
stockage et essais de performance des milieux de culture
ISO 19036:2019, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Estimation de l'incertitude de mesure pour les
déterminations quantitatives
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
C. perfringens présumées
Clostridium perfringens présumées
bactéries formant des spores qui forment des colonies caractéristiques dénombrables dans un milieu
sélectif spécifique dans des conditions d’anaérobiose strictes
Note 1 à l'article: Les C. perfringens présumées sont des bactéries formant des spores qui sont en mesure de
produire des colonies caractéristiques dans les conditions spécifiées dans le présent document.
3.2
C. perfringens confirmées
Clostridium perfringens confirmées
bactéries qui produisent des colonies caractéristiques dans le milieu sélectif spécifié dans des
conditions d’anaérobiose strictes et possèdent l’enzyme phosphatase acide
3.3
C. perfringens pathogènes pour l’Homme
Clostridium perfringens pathogènes pour l’Homme
souches de C. perfringens confirmées (3.2) qui sont en mesure de produire l’entérotoxine de
C. perfringens (CPE), codée par le gène cpe
Note 1 à l'article: Le gène cpe peut être localisé sur le chromosome ou sur les plasmides. Ces isolats sont en mesure
de produire la CPE dans l’intestin grêle pendant la sporulation et de provoquer des maladies chez l’Homme.
3.4
dénombrement de C. perfringens
dénombrement de Clostridium perfringens
détermination du nombre d’unités formant colonies (ufc) de C. perfringens confirmées (3.2) par gramme,
par millilitre, par centimètre carré ou par dispositif d’échantillonnage lorsqu’un essai spécifié est
réalisé
Note 1 à l'article: Les essais spécifiés sont présentés à l’Article 9.
4 Principe
4.1 Généralités
Une quantité déterminée de l’échantillon d’essai liquide, ou de la suspension mère dans le cas d’autres
produits, est déposée dans une boîte de Petri vide et bien mélangée à un milieu de culture gélosé fondu
spécifié, constituant ainsi une boîte coulée. Des boîtes supplémentaires sont préparées dans les mêmes
conditions à partir de dilutions décimales de l’échantillon pour essai. Après solidification du milieu
gélosé, une surcouche est utilisée pour empêcher les colonies d’envahir la surface du milieu. Si l’objectif
est de ne dénombrer que les spores, un traitement thermique de 10 min à 80 °C est effectué avant la mise
en culture. Par ailleurs, une méthode de différenciation moléculaire entre les souches de C. perfringens
pathogènes et non pathogènes pour l’Homme est décrite à l’Annexe D.
Lorsqu’il est attendu que le nombre d’UFC soit au niveau ou proche de la limite de détermination, il est
préférable d’utiliser des boîtes en double. En cas d’utilisation de boîtes en double exemplaire, il convient
que la somme des colonies dans les deux boîtes soit au minimum égale à 10. Dans ce cas, il est attendu
que le niveau de contamination soit supérieur à 5 UFC/ml pour les échantillons liquides ou supérieur
à 50 UFC/g pour les échantillons solides.
La technique d’ensemencement en profondeur avec une surcouche est particulièrement appropriée
pour le dénombrement de produits susceptibles de contenir des colonies envahissantes qui peuvent
masquer les colonies des micro-organismes ciblés.
Le dénombrement de C. perfringens exige quatre étapes telles que spécifiées à l’Annexe A normative.
4.2 Préparation des dilutions
Pour la préparation des dilutions décimales à partir des prises d’essai, suivre le mode opératoire
spécifié dans la série de normes ISO 6887.
4.3 Dénombrement
Des boîtes de Petri sont ensemencées avec une quantité déterminée de l’échantillon pour essai si le
produit initial est liquide, ou avec une quantité déterminée de la suspension mère dans le cas d’autres
produits. Des boîtes de Petri supplémentaires sont ensemencées dans les mêmes conditions à partir de
dilutions décimales de l’échantillon pour essai ou de la suspension mère. Un milieu sélectif est ajouté
(technique d’ensemencement en profondeur) et une surcouche du même milieu est ensuite coulée.
Les boîtes sont incubées dans des conditions anaérobies à 37 °C pendant 20 h. Après incubation,
les colonies caractéristiques, qui présentent une coloration allant du noir ou gris au jaune-brun,
sont dénombrées. La couleur des colonies et la zone environnante changent en raison de la formation de
sulfure de fer(II) résultant de la réaction entre les ions sulfures et le fer trivalent [Fe(III)] présent dans
le milieu.
4.4 Confirmation
Des essais de confirmation sont réalisés. Le résultat calculé est exprimé en unités formant colonie de
C. perfringens confirmées par volume d’échantillon. En complément, la méthode décrite à l’Annexe D
peut être utilisée pour une différenciation moléculaire entre les souches de C. perfringens pathogènes et
non pathogènes pour l’Homme.
5 Milieux de culture et réactifs
Suivre les pratiques courantes de laboratoire conformément à l’ISO 7218. La composition des milieux de
culture et des réactifs et leur préparation sont spécifiées à l’Annexe B. Pour les essais de performance
des milieux de culture, suivre les modes opératoires conformément à l’ISO 11133 et à l’Annexe B.
6 Équipement et consommables
Le matériel à usage unique est acceptable au même titre que la verrerie réutilisable, à condition que ses
spécifications soient convenables. Le matériel courant de laboratoire de microbiologie (voir ISO 7218)
et, en particulier, ce qui suit doit être utilisé.
6.1 Appareillage approprié pour créer une anaérobiose, une jarre pouvant être hermétiquement
fermée ou tout autre équipement approprié permettant de maintenir les conditions d’anaérobiose
pendant toute la durée d’incubation du milieu de culture. D’autres systèmes offrant des résultats
équivalents, tels que des chambres d’anaérobie, peuvent être utilisés. Suivre les instructions du
fabricant pour leur installation et leur entretien.
La composition de l’atmosphère requise peut être obtenue par ajout d’un mélange de gaz (par exemple
à partir d’une bouteille de gaz) après évacuation de l’air de la jarre, par déplacement de l’atmosphère
dans une chambre ou par tout autre moyen approprié (comme des cartouches de gaz disponibles dans
le commerce). En général, l’incubation anaérobie nécessite une atmosphère contenant une fraction
volumique d’oxygène de 1 % et une fraction volumique de dioxyde de carbone comprise entre 9 % et
13 %.
6.2 Appareil pour la stérilisation en chaleur sèche (four) ou en chaleur humide (autoclave)
6.3 Congélateur, réglable à −20 °C ± 2 °C et à −70 °C ± 3 °C.
6.4 Étuve, réglable à 37 °C ± 1 °C.
6.5 pH-mètre, d’une exactitude d’étalonnage de ± 0,1 unité de pH à 25 °C.
6.6 Réfrigérateur, réglable à 5 °C ± 3 °C.
6.7 Flacons, fioles ou tubes stériles, d’une capacité appropriée. Des flacons, fioles ou tubes avec
capuchons à vis en métal non toxique ou en plastique peuvent être utilisés.
6.8 Pipettes graduées ou pipettes automatiques stériles, de capacités nominales de 10 ml, 1 ml
et 0,1 ml.
6.9 Anses stériles, d’environ 3 mm de diamètre (volume de 10 µl) et d’un volume de 1 µl, ou aiguille
ou fil à ensemencer.
6.10 Boîtes de Petri stériles, d’environ 90 mm de diamètre et (facultatif) de grandes dimensions
(environ 140 mm de diamètre).
6.11 Bain-marie à régulation thermostatique, réglable à une température comprise entre 44 °C
et 47 °C et à 80 °C ± 2 °C.
7 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document. Suivre la Norme
internationale spécifique du produit concerné. S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique
traitant de l’échantillonnage du produit concerné, il est recommandé que les parties concernées
parviennent à un accord sur ce sujet.
Des techniques d’échantillonnage recommandées sont décrites dans les documents suivants:
— l’ISO/TS 17728 pour les aliments et les aliments pour animaux;
— l’ISO 707 pour le lait et les produits laitiers;
— l’ISO 6887-3 pour les mollusques crus, les tuniciers et les échinodermes de zones de production
primaire;
— l’ISO 13307 pour le stade de la production primaire;
— l’ISO 17604 pour les carcasses;
— l’ISO 18593 pour les surfaces.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon représentatif du produit étudié. Il convient
que l’échantillon n’ait pas été endommagé ni modifié au cours du transport ou du stockage.
8 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l’échantillon pour essai à partir de l’échantillon de laboratoire conformément à la Norme
internationale spécifique du produit concerné. Suivre les modes opératoires spécifiés dans la série de
normes ISO 6887. S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique, il est recommandé que les parties
concernées s’accordent sur ce sujet.
9 Mode opératoire
9.1 Généralités
Le mode opératoire présenté à l’Annexe A doit être suivi.
9.2 Prise d’essai, suspension mère et dilutions
Suivre les modes opératoires conformément à la série de normes ISO 6887 et à la Norme internationale
relative au produit concerné. Préparer une seule série de dilutions décimales à partir de la prise d’essai
si le produit est liquide et à partir de la suspension mère dans le cas des autres produits.
9.3 Traitement thermique pour la sélection des spores
S’il ne s’agit que de dénombrer les spores, chauffer la série de dilutions décimales à 80 °C au bain-
marie (6.11) pendant 10 min ± 1 min. Le traitement thermique doit être effectué dans les 15 min suivant
la préparation de la suspension mère afin d’éviter toute germination des spores. Si le tube n’est pas
placé dans le bain-marie dans les 15 min, il convient de le placer immédiatement dans un bac à glace
pendant 2 h au maximum.
Durant le traitement thermique, il convient de surveiller la température en plaçant un thermomètre
adapté dans un flacon de référence de taille identique au flacon de l’échantillon et contenant le même
volume d’eau à la même température initiale que l’échantillon traité (6.7). Il convient de ne pas fermer
hermétiquement les tubes durant le traitement thermique. Le temps nécessaire pour atteindre 80 °C
ne doit pas dépasser 5 min et peut être réduit au minimum en s’assurant que le niveau d’eau arrive
au moins 4 cm au-dessus du niveau de l’échantillon et que le bain-marie soit équipé d’une pompe de
circulation afin d’optimiser l’échange thermique.
Commencer le temps de chauffage (10 min) lorsque la température de l’échantillon de référence
atteint 80 °C. Après le traitement thermique, il convient que les échantillons soient refroidis
immédiatement jusqu’à environ 20 °C.
Il convient que le traitement thermique réduise également la flore compétitive dans certaines matrices
contenant un niveau élevé de flore annexe (par exemple, le lactosérum liquide, l’ensilage).
9.4 Ensemencement et incubation
9.4.1 Prendre deux boîtes de Petri stériles d’environ 90 mm de diamètre (6.10). Au moyen d’une
pipette stérile (6.8), transférer dans chaque boîte 1 ml d’échantillon pour essai si le produit est liquide,
−1
ou 1 ml de la suspension mère (dilution à 10 ) dans le cas d’autres produits. Si des boîtes sont préparées
à partir de plusieurs dilutions, le nombre de boîtes par dilution peut être réduit à un (voir ISO 7218).
Lorsque, pour certains produits, il est nécessaire d’estimer de faibles nombres de C. perfringens, la
limite de dénombrement peut être abaissée d’un facteur de 10 en examinant 10 ml de la suspension
mère dans trois grandes boîtes de Petri (140 mm) (6.10).
9.4.2 Prendre une autre boîte de Petri stérile (6.10). Utiliser une autre pipette stérile (6.8) pour
−1 −2
déposer 1 ml de la dilution à 10 (produits liquides) ou 1 ml de la dilution à 10 (autres produits).
9.4.3 Si nécessaire, répéter le mode opératoire avec d’autres dilutions, en utilisant une nouvelle
pipette stérile (6.8) pour chaque dilution décimale.
9.4.4 Le cas échéant et si possible, sélectionner uniquement les étapes de dilutions critiques (au
moins deux dilutions décimales successives) afin d’ensemencer des boîtes de Petri (6.10) sur lesquelles
pourront être dénombrées entre 10 et 365 colonies par boîte (de 90 mm de diamètre) ou entre
10 et 360 colonies par boîte (de 140 mm de diamètre).
9.4.5 Couler environ 12 ml à 15 ml pour les boîtes de Petri de 90 mm ou 30 ml à 35 ml pour les boîtes
de Petri de 140 mm de la gélosé de tryptose-sulfite à la cyclosérine (gélosé TSC) (voir B.2), fondu et
tempéré entre 44 °C et 47 °C (6.11), dans chaque boîte de Petri (6.10).
9.4.6 Mélanger soigneusement l’inoculum avec le milieu de culture en faisant tourner les boîtes de
Petri et laisser le mélange se solidifier en posant les boîtes de Petri sur une surface horizontale fraîche.
9.4.7 Après solidification complète, couler une surcouche d’environ 5 ml de la gélosé TSC (voir
B.2) pour les boîtes de Petri de 90 mm (6.10) ou 12 ml pour les boîtes de Petri de 140 mm (6.10) afin
d’empêcher les colonies d’envahir la surface du milieu. Laisser solidifier comme spécifié en 9.4.6.
9.4.8 Retourner les boîtes obtenues en 9.4.7 et incuber (6.4) les boîtes à 37 °C en anaérobiose (6.1).
9.5 Dénombrement des colonies caractéristiques
9.5.1 Après 20 h ± 2 h d’incubation, examiner les boîtes (voir 9.4.8) afin de rechercher la présence
de bactéries C. perfringens présumées. Une plus longue durée d’incubation peut conduire à un
noircissement excessif des boîtes.
Les colonies caractéristiques, présentant une coloration noire ou grise à jaune-brun (même si la
coloration est légère) sur la gélose TSC, sont dénombrées.
Les boîtes doivent être dénombrées dans les 30 min qui suivent la fin de l’incubation en anaérobiose, car
la couleur des colonies peut s’estomper rapidement et finir par disparaître sous l’effet de l’exposition à
l’oxygène. Si des jarres anaérobies sont utilisées, il convient de contrôler les boîtes jarre par jarre ou par
petites fractions si l’incubation a été réalisée dans une étuve anaérobie (6.1, 6.4).
NOTE Un noircissement diffus et non spécifique du milieu peut se produire. Le développement de bactéries
anaérobies, qui produisent de l’hydrogène (et non du H S), peut également réduire le sulfite présent et entraîner
un noircissement général du milieu, rendant le dénombrement des colonies caractéristiques difficile.
9.5.2 Sélectionner les boîtes (voir 9.5.1) contenant moins de 150 colonies présumées (pour les boîtes de
Petri de 90 mm de diamètre) ou moins de 365 colonies (pour les boîtes de Petri de 140 mm de diamètre).
Dénombrer ces colonies et noter le nombre de colonies présumées par boîte. Sélectionner ensuite, au
hasard, cinq de ces colonies dans chaque boîte pour confirmation (voir 9.6). Pour le dénombrement des
boîtes présentant des nombres élevés ou faibles de colonies présumées, voir l’ISO 7218.
9.6 Confirmation de C. perfringens
9.6.1 Sélection des colonies à confirmer
9.6.1.1 En vue de la confirmation, prélever cinq colonies présumées dans chaque boîte retenue
pour le dénombrement (voir 9.5.2). Si plusieurs morphologies sont présentes parmi les colonies,
sélectionner une colonie de chaque morphologie pour la sous-culture et la confirmation.
9.6.1.2 Étaler chaque colonie sélectionnée à l’aide d’une anse stérile (6.9) sur une boîte de gélose au
sang non sélective, par exemple, de la gélose Columbia (voir B.3). Si la gélose au sang n’est pas disponible,
une base de gélose Columbia ou un autre milieu riche en nutriments (par exemple, la gélose tryptone
soja ou la gélose pour infusion cœur-cervelle) peuvent être utilisés.
Laisser les boîtes de gélose se stabiliser à température ambiante si elles étaient stockées à une
température inférieure. Si nécessaire, sécher la surface des boîtes avant utilisation (voir l’ISO 11133).
Plusieurs isolats peuvent être striés sur des secteurs identifiés. Il convient que les stries donnent des
colonies bien isolées.
Incuber les boîtes en anaérobiose (6.1) à 37 °C (6.4) pendant 20 h ± 2 h. Immédiatement après
incubation, sélectionner des colonies fraîchement cultivées et bien isolées en vue de la confirmation.
La confirmation peut être réalisée soit par essai à la phosphatase acide, soit par essai sur gélose SIM
(mobilité indole sulfite).
NOTE Des modes opératoires alternatifs (voir l’ISO 7218) peuvent être utilisés pour confirmer que le ou
les isolats font partie des C. perfringens, sous réserve d’avoir validé la pertinence du mode opératoire alternatif
(voir l’ISO 16140-4 ou l’ISO 16140-6).
Après incubation, ces boîtes peuvent être réfrigérées à 5 °C (6.6) pendant 48 h au maximum avant
analyse. Pour les boîtes incubées en anaérobiose, maintenir l’atmosphère anaérobie.
9.6.2 Essai à la phosphatase acide
9.6.2.1 Il est établi que, outre C. perfringens, d’autres souches de Clostridium (par exemple,
certaines souches de C. baratii) peuvent produire de la phosphatase acide, mais cette aptitude est très
limitée. Un pourcentage très faible de faux positifs est donc attendu.
9.6.2.2 Les colonies se développant en anaérobiose sur des boîtes de gélose au sang ou de gélose
nutritive sont étalées sur un papier filtre et 2 à 3 gouttes de réactif de la phosphatase acide (B.4) sont
placées sur les colonies. Si un kit d’essai disponible dans le commerce est utilisé, suivre les instructions
du fabricant.
NOTE Il est possible d’ajouter au goutte-à-goutte le réactif de la phosphatase acide sur les colonies, si aucune
autre étude des colonies n’est nécessaire.
9.6.2.3 L’apparition d’une couleur violacée dans les 3 min à 4 min est considérée comme une réaction
positive.
9.6.3 Essai sur gélose SIM (mobilité indole sulfite)
Des colonies qui se sont développées en anaérobiose sur des boîtes de gélose au sang ou sur des boîtes
de gélose nutritive sont inoculées par piqûre droite et profonde dans des tubes contenant de la gélose
SIM (B.5). Incuber les tubes pendant 22 h ± 2 h à 37 °C (6.4). Après incubation, la lecture des tubes est
effectuée pour déterminer:
— la production de sulfite: les tubes présentant un noircissement sont positifs;
— la mobilité: les tubes présentant une croissance en dehors de la piqûre d’inoculation sont positifs;
— la production d’indole: les tubes présentant un anneau de couleur rouge après ajout du réactif de
Kovacs (B.6) sont positifs.
C. perfringens est positive à la production de sulfite et négative à la production d’indole et à la mobilité.
9.6.4 Différenciation entre souches de C. perfringens pathogènes et non pathogènes pour
l’Homme (facultatif)
En complément, la méthode décrite à l’Annexe D peut être utilisée pour une différenciation moléculaire
entre les souches de C. perfringens pathogènes et non pathogènes pour l’Homme.
9.6.5 Interprétation
C. perfringens produit des colonies de couleur noire ou grise à jaune-brune sur la gélose TSC, même
si la coloration est légère, et possède la phosphatase acide ou est positive à la production de sulfite,
négative à la production d’indole et à la mobilité dans la gélose SIM.
10 Expression des résultats
Pour le calcul des résultats, suivre le ou les modes opératoires conformément à l’ISO 7218. Calculer
et exprimer les résultats en nombre de C. perfringens confirmées ou, si la méthode de l’Annexe D a
également été utilisée, de C. perfringens, pathogènes pour l’Homme confirmées en UFC par gramme,
par millilitre ou par centimètre carré. Lorsque la zone échantillonnée n’est pas connue, exprimer les
résultats par dispositif d’échantillonnage, tel que tissu, éponge, écouvillon ou baguette.
Si un prétraitement thermique pour la sélection de spores (9.3) a été utilisé, le résultat est exprimé en
nombre de spores de C. perfringens confirmées ou si la méthode de l’Annexe D a également été utilisée
pour une différenciation, en nombre de spores de C. perfringens pathogènes pour l’Homme confirmées
en UFC par gramme, par millilitre, par centimètre carré ou par dispositif d’échantillonnage.
Lorsqu’aucune colonie caractéristique de C. perfringens n’est observée ou qu’aucune colonie
caractéristique n’est confirmée comme étant C. perfringens, suivre l’ISO 7218 pour l’expression des
résultats dans les cas particuliers.
11 Validation de la méthode
11.1 Étude interlaboratoires
Les résultats de l’étude interlaboratoires (étape 6 de l’ISO 17468) visant à déterminer les caractéristiques
de performance de la méthode sont décrits en 11.2.
11.2 Caractéristiques de performance
Les caractéristiques de performance de la méthode (écart-type de la répétabilité et de la reproductibilité)
ont été déterminées dans le cadre d’une étude interlaboratoires. Il est possible que les valeurs obtenues
dans le cadre de l’étude interlaboratoires ne soient pas applicables aux plages de concentration et
aux catégories (aliments) autres que celles utilisées dans l’étude. Toutes les données sont fournies à
l’Annexe C.
Un récapitulatif de l’écart-type de répétabilité interlaboratoires (s ) est donné dans le Tableau 1.
r
Tableau 1 — Récapitulatif des valeurs s de l’étude interlaboratoires
r
Catégorie (d’aliment) Élément (ali- Valeurs s Valeurs s de ni- Valeurs s de ni-
r r r
ment) de faible niveau veau moyen veau élevé d’ense-
d’ensemencement d’ensemencement mencement
Produits à base de viande Corned-beef 0,292 0,272 0,100
prêts à consommer et prêts
à réchauffer
Produits à base de poisson Poisson en 0,204 0,193 0,035
prêts à consommer et prêts conserve
à réchauffer
Aliments composés et les Soupe instanta- 0,208 0,080 0,070
composants de repas née
Préparations et céréales Préparation pour 0,160 0,200 0,098
pour nourrissons nourrisson en
poudre
Fruits et légumes transfor- Ananas en 0,091 0,070 0,061
més conserve
Échantillons environne- Écouvillon envi- 0,160 0,117 0,065
mentaux (production d’ali- ronnemental
ments ou d’aliments pour
animaux)
Produits destinés à l’ali- Ensilage 0,227 0,098 0,134
mentation animale et les
aliments pour animaux
Un récapitulatif de l’écart-type de reproductibilité interlaboratoires (s ) est donné dans le Tableau 2.
R
Tableau 2 — Récapitulatif des valeurs s de l’étude interlaboratoires
R
Catégorie (d’aliment) Élément (aliment) Valeurs S Valeurs S Valeurs S de ni-
R R R
de faible niveau de niveau moyen veau élevé d’ense-
d’ensemencement d’ensemencement mencement
Produits à base de Corned-beef 0,408 0,653 0,383
viande prêts à consom-
mer et prêts à réchauffer
TTabableleaauu 2 2 ((ssuuiitte)e)
Catégorie (d’aliment) Élément (aliment) Valeurs S Valeurs S Valeurs S de ni-
R R R
de faible niveau de niveau moyen veau élevé d’ense-
d’ensemencement d’ensemencement mencement
Produits à base de pois- Poisson en 0,356 0,543 0,309
son prêts à consommer conserve
et prêts à réchauffer
Aliments composés et les Soupe instantanée 0,621 0,654 0,688
composants de repas
Préparations et céréales Préparation pour 0,396 0,403 0,356
pour nourrissons nourrisson en
poudre
Fruits et légumes trans- Ananas en 0,453 0,637 0,797
formés conserve
Échantillons environ- Écouvillon envi- 0,457 0,475 0,629
nementaux (production ronnemental
d’aliments ou d’aliments
pour animaux)
Produits destinés à l’ali- Ensilage 0,626 0,606 0,793
mentati
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.
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