ISO 18074:2015
(Main)Textiles — Identification of some animal fibres by DNA analysis method — Cashmere, wool, yak and their blends
Textiles — Identification of some animal fibres by DNA analysis method — Cashmere, wool, yak and their blends
ISO 18074:2015 specifies a testing method for DNA analysis of some animal fibres to identify cashmere, wool, yak, and their blends by using extraction, amplification by the polymerase chain reaction (PCR) method and DNA detection processes. ISO 18084:2015 is applicable to cashmere, yak, and wool and their blends as a qualitative method.
Textiles — Identification de certaines fibres animales par la méthode d'analyse de l'ADN — Cachemire, laine, yack et leurs mélanges
ISO 18074:2015 spécifie une méthode d'essai pour l'analyse de l'ADN de certaines fibres animales afin d'identifier le cachemire, la laine, le yack et leurs mélanges au moyen d'une extraction, d'une amplification par la méthode PCR (réaction par polymérisation en chaîne) et de procédés de détection de l'ADN. ISO 18074:2015 internationale s'applique au cachemire, au yack, à la laine et à leurs mélanges en tant que méthode qualitative.
General Information
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 18074
First edition
2015-12-01
Textiles — Identification of some
animal fibres by DNA analysis method
— Cashmere, wool, yak and their
blends
Textiles — Identification de certaines fibres animales par la
méthode d’analyse de l’ADN — Cachemire, laine, yack et leurs
mélanges
Reference number
ISO 18074:2015(E)
©
ISO 2015
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ISO 18074:2015(E)
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ISO 18074:2015(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Caution . 1
3 Normative references . 1
4 Terms and definitions . 1
5 Principle . 2
6 Apparatus and equipment . 3
7 Reagents . 4
8 Sampling . 6
9 Test methods . 6
9.1 General . 6
9.2 Chipping sample . 6
9.3 DNA extraction . 6
9.4 DNA purification . 7
9.5 DNA amplification . 8
9.5.1 Composition of the reaction solution . 8
9.5.2 Condition of PCR amplification instrument for DNA amplification . 8
9.5.3 DNA Amplification test method . 8
9.6 Detection and confirmation of DNA amplification . 9
9.6.1 Preparation . 9
9.6.2 Electrophoretic migration test . 9
10 Verification . 9
10.1 General . 9
10.2 No amplification verification after extraction process (negative verification) . 9
10.3 Amplification verification after extraction process (positive verification) .10
10.4 Amplification verification after PCR process .10
10.5 No amplification verification after PCR process .10
10.6 Amplification verification of PCR reaction solution .10
11 Assessment .11
12 Precision .11
13 Test report .11
Annex A (informative) Amplification of the constant length DNA fragment by PCR method .13
Annex B (informative) DNA additional purification .15
Annex C (informative) Repeatability and reproducibility .17
Annex D (informative) Practical application to various textile products.21
Bibliography .22
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ISO 18074:2015(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical
Barriers to Trade (TBT), see the following URL: Foreword — Supplementary information.
The committee responsible for this document is ISO/TC 38, Textiles.
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ISO 18074:2015(E)
Introduction
The composition of fibres in textile products is one of the most important properties. Labelling of
composition of textile products is required globally by legislation or by voluntary regulation for fair trade.
The testing method to determine the composition of some animal fibres in the textile products has been
[3]
developed as ISO 17751 . This is only one method to determine the animal fibre composition currently
available. In this method, animal fibres are observed by microscope and identified from the shape of
scales by experienced examiners. Many samples can be tested with a high degree of efficiency using this
method. However, even experienced examiners have difficulties in identifying fibres, because textile
products have a broad variety of colours and finishings, and there are many blends in animal fibres.
Given this situation, several testing methods to obtain the more accurate results have been investigated
and developed. Among those methods, the DNA (deoxyribonucleic acid) analysis method has been found
to be a practical and feasible method to identify the inherent type of animal fibres.
As it is well known, DNA is specific for animals. The DNA-PCR (polymerase chain reaction) method has
recently been developed with high accuracy. A very trivial quantity of the DNA extracted from animal
fibres is amplified by PCR to yield a huge quantity of copy DNA. Mitochondrial DNA is used for this
analysis because it provides greater numbers than nuclear DNA.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 18074:2015(E)
Textiles — Identification of some animal fibres by DNA
analysis method — Cashmere, wool, yak and their blends
WARNING — The use of this International Standard can involve hazardous materials,
operations, and equipment. This International Standard does not purport to address all of the
safety problems associated with its use. It is the responsibility of the user of this International
Standard to establish appropriate safety and health practices and determine the applicability of
regulatory limitations and supplier’s requirement for safety prior to use.
1 Scope
This International Standard specifies a testing method for DNA analysis of some animal fibres to
identify cashmere, wool, yak, and their blends by using extraction, amplification by the polymerase
chain reaction (PCR) method and DNA detection processes.
This International Standard is applicable to cashmere, yak, and wool and their blends as a
qualitative method.
2 Caution
Test results for fibre identification by the DNA analysis method can be obtained with a high accuracy
for the above-mentioned textile products which were processed at lower dye concentration levels or
dyed in light colours.
However, when such textile products were processed under severe conditions or high temperatures,
the mitochondrial DNA could have been damaged. In such cases, identification can be difficult because
amplification of DNA by PCR cannot take place. If textile products were contaminated by using products
from another species, such as cashmere grease on wool fibres, this situation may be solved by checking
using microscopy techniques.
3 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
ISO 8655-2, Piston-operated volumetric apparatus — Part 2: Piston pipettes
4 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
4.1
DNA
deoxyribonucleic acid, that exists in nuclei and in mitochondria of animal fibre cells and is composed of
a linear array of 4 bases (Adenine: A, Thymine: T, Guanine: G and Cytosine: C)
Note 1 to entry: The DNA sequence is identical and intrinsic for each animal fibre.
4.2
animal fibres
cashmere, wool, or yak fibres
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ISO 18074:2015(E)
4.3
buffer solution
solution used to maintain pH of reaction solution at required value
4.4
reducing agent
agent that degrades animal fibres through reductive cleavage of S-S bonds in the fibres
4.5
DNA amplification
amplification of the specific fragment of DNA by the PCR method
4.6
PCR method
method of the polymerase chain reaction
Note 1 to entry: The amplification process of the DNA fragment with a constant length is explained in Annex A.
4.7
DNA polymerase for PCR method
heat-stable DNA polymerase that is used for PCR and has no proof reading activity
4.8
primer
short length fragment of a single strand DNA which is a reaction initiator and designed as the identical
sequence of 18-30 bases to DNA of the animal fibre
4.9
primer set
set of primer with the reaction direction of forward and reverse
4.10
primer for cashmere
primer with an identical base sequence of mitochondrial DNA of cashmere
Note 1 to entry: The sequence of base for primers will be submitted to the public database.
4.11
primer for wool
primer with an identical base sequence to mitochondrial DNA of wool
4.12
primer for yak
primer DNA with an identical base sequence to mitochondrial DNA of yak
Note 1 to entry: Information concerning the primers may be obtained from ISO/TC 38 secretariat.
4.13
gel electrophoresis migration
method to detect the amplified constant length DNA fragments
5 Principle
Mitochondrial DNA is extracted from animal fibre samples by using a chemical and enzyme reaction.
The extracted DNA is purified by using a precipitation method and centrifuge. The purified DNA is
applied for the amplification reaction of PCR method. In the PCR method, primers for cashmere, yak and
wool are respectively tested. If the sample is cashmere, only cashmere primer can amplify the constant
length of DNA fragments. Then, the constant length of DNA fragments is detected by the electrophoretic
migration method.
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ISO 18074:2015(E)
The sample fibres are identified by knowing whether amplification was observed or not for the tests
using all primers respectively.
6 Apparatus and equipment
6.1 Pipettes, capable of measuring and taking (0 to 20) μl (±0,20 µl), (20 to 200) μl (±1,60 µl), (200 to
1 000) μl (±8 µl) within systematic errors defined in ISO 8655-2.
6.2 Micro tube, capable of withstanding the centrifugation of 14 000g and autoclave.
The capacity is 2 ml for purification and 0,2 ml for PCR method. A tube of 0,2 ml for PCR method should
follow the manufacturer’s recommendation of the PCR instrument.
6.3 Cap lock, use for micro tube.
6.4 Heat block, with mounting holes for micro tubes and capable of heating up to about 80 °C (±1,0 °C).
6.5 Shaking agitator, capable of heating up to 50 °C and maintaining at the temperature of 50 °C and
shaking micro tube at around 500 r/min or higher.
6.6 Shaking machine, capable of mounting micro tubes and shaking at around 500 times/min or higher.
This machine can be replaced by an equivalent instrument such as microtube rotator which is possible
to rotate at 30 r/min or higher.
6.7 Centrifuge, capable of centrifuging of 14 000g or higher, setting up temperature from 0 °C to room
temperature and mounting micro tubes or units of centrifugal ultrafiltration.
1)
6.8 Unit of centrifugal ultrafiltration , capable of capturing molecules with the molecular weight of
100 kDa (Dalton) or more.
2)
6.9 PCR instrument , capable of programing for temperature and time.
6.10 UV illuminator, UV irradiator.
6.11 Photo booth.
6.12 Generic plastic box with a resealable lid.
6.13 Comb, used for making wells in the agarose gel of the gel electrophoresis migration test.
6.14 Mixer mill, used for mixing and homogenizing animal fibres.
6.15 Erlenmeyer flask, with capacity 200 ml.
1) Amicon Ultra is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the
convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
2) Life Technologies Corporation is a provider of a suitable product available commercially. This information is
given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
© ISO 2015 – All rights reserved 3
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ISO 18074:2015(E)
7 Reagents
7.1 Pure water.
Use pure water as defined in ISO 3696 with the purity of Grade 1. This water should not have DNase
(DNA digesting) activity. It should not contain a significant amount of DNA which can be amplified by
primers and should not show inhibitory effects for this testing method.
7.2 Chloroform/isoamyl alcohol reagent.
100 % concentration of the highest grade.
— Chloroform 9,6 ml
— Isoamyl alcohol 400 μl
7.3 Sodium perchlorate solution.
— Sodium perchlorate 6,1 g
Make the solution up to 10 ml by adding pure water.
7.4 1 mol/l Tris – HCl [tris(hydroxymethyl)aminomethane].
Dissolve 12,1 g of tris(hydroxymethyl)aminomethane in 800 ml of pure water, then adjust the pH to 8,0
by adding HCl and using a pH-meter. Then, make it up to 1 000 ml by adding pure water.
7.5 500 mmol/l EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid).
Dissolve 186,1 g of EDTA·Na ·2H O (disodium salt-dihydrate of EDTA) in 800 ml pure water, then adjust
2 2
pH to 8,0 by adding NaOH and using a pH-meter. Then, make it up to 1 000 ml by adding pure water.
7.6 Buffer solution A.
— 1 mol/l Tris-HCL (7.4) 5 ml
— 500 mmol/l EDTA (7.5) 2 ml
— Sodium lauryl sulfate (SLS) (C H SO Na) 0,2 g
12 25 4
— Sucrose 1,2 g
— Sodium chloride 170 mg
— Dithiothreitol (DTT) 920 mg
Make it up to 10 ml by adding pure water. Prepare fresh before use.
Due to its volatile nature, DTT should be added after autoclaving, so that its effectiveness is not reduced.
7.7 Buffer solution B.
— 500 mmol/l EDTA (7.5) 0,2 ml
Make it up to 100 ml by adding pure water.
7.8 Protein resolving enzyme solution, the papain solution, with a papain of 10 units dissolved in
pure water (e.g. 10 units/20 μl).
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ISO 18074:2015(E)
7.9 Heat-stable DNA polymerase, without 3‘ to 5‘ exonuclease activity.
7.10 Animal fibre A primer 1, forward primers for cashmere, yak, and wool.
7.11 Animal fibre A primer 2, reverse primers for cashmere, yak, and wool.
7.12 DNA composition component, with a grade for the PCR method.
7.13 Buffer solution for polymerase, suitable for the polymerase of the PCR reaction.
This buffer solution may be designated by manufacturers of polymerase.
7.14 Salt, potassium chloride (KCl), used to stabilize the PCR reaction.
7.15 Magnesium chloride (MgCl ), used to stabilize the PCR reaction.
2
7.16 Gel electrophoretic migration marker.
7.17 Agarose, a kind of agar with a grade for DNA electrophoretic migration.
7.18 Buffer solution for loading on the electrophoretic migration.
— Glycerol 36 g
— 500 mmol/l EDTA (7.5) 6 ml
— Bromophenol Blue 0,25 g
— Xylene cyanol 0,25 g
Make it up to 100 ml by adding pure water. After adding the solution of more than 1/6 to the sample
reaction solution, load it on the gel.
7.19 Buffer solution for electrophoretic migration.
— tris(hydroxymethyl)aminomethane base (Triz- 242 g
ma base)
— Acetic acid (glacial acetic acid) 57,1 ml
— EDTA·2Na 7,43 g
Dissolve using pure water and make the solution up to 1 l by adding pure water. Then, dilute it 50 times
with pure water.
7.20 DNA dyeing colorant, ethidium bromide.
Ethidium bromide dissolves in the buffer solution for electrophoretic migration so as to be
approximately 5 μg/ml.
NOTE Other DNA intercalating agents can be used as substitute for ethidium bromide.
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ISO 18074:2015(E)
7.21 Common DNA fragment, primer.
Common DNA fragments are common base alignments existing in all the DNAs of cashmere, yak, and
wool. Common primer 1 is a forward primer; common primer 2 is a reverse primer.
NOTE Information on primers can be obtained from ISO/TC 38 secretariat.
8 Sampling
Animal fibre samples shall represent the textile products for test. If the textile product is composed by
several parts, separate them into identical parts and describe the details of the parts in the test report.
Avoid contamination among the parts.
Two test specimens are selected from the sample. When the two results are not consistent, do not adopt
the results and perform another test for two specimens again.
NOTE ISO 17751:2007, Annex B can be used as a reference for this procedure.
9 Test methods
9.1 General
The test should be performed in parallel for the primers for cashmere, yak, and wool.
9.2 Chipping sample
Chip the animal fibre sample of 100 mg with the length of less than 2 mm by scissors, mixer mill, or
3)
other instruments. Then, put the chipped sample of 50 mg into a micro tube with a 2,0 ml capacity.
9.3 DNA extraction
Follow the procedure described in 9.3.1 to 9.3.6.
9.3.1 Add 600 μl of buffer solution A (7.6) to the micro tube with the test sample (9.2).
9.3.2 Cap the micro tube and then tumble it by hand to immerse the sample in the buffer solution
perfectly.
9.3.3 Lock the cap of the micro tube using a cap lock. Then, heat the micro tube with the test specimen at
60 °C for 20 min using the heat block. Take out the micro tube at 3 min, 6 min, 9 min, and 15 min from the
heat block and tumble it for 10 s by hand. Then, put it back on the heat block again and continue heating.
9.3.4 After 20 min, take out the micro tube from the heat block and cool it down to room temperature.
9.3.5 Add 10 units of papain solution (7.8) to the micro tube with the test specimen. Then, heat up
the micro tube to 50 °C. Maintain the temperature at 50 °C and shake it at 500 r/min for 1 h using the
shaking agitator (6.5).
9.3.6 Add 10 units of papain solution (7.8) to the micro tube of 9.3.5. Maintain the temperature at
50 °C. Shake it at 500 r/min for over 12 h. Cool it down to room temperature.
3) Eppendorf tubes are an example of suitable products available commercially. This information is given for the
convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of these products. Equivalent
products may be used if they can be shown to lead to the same results.
6 © ISO 2015 – All rights reserved
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ISO 18074:2015(E)
9.4 DNA purification
Follow the procedure described in 9.4.1 to 9.4.13.
9.4.1 Add 300 μl of sodium perchlorate solution (7.3) to the micro tube of 9.3.6. Then, shake it for
10 min at a condition of 500 r/min using the shaking machine (6.6).
9.4.2 Add 300 μl of chloroform/isoamyl alcohol (7.2) to the micro tube of 9.4.1. Tumble it about for
10 s by hand. Then, shake it for 10 min using the shaking machine (6.6) (e.g. at 500 r/min for rotating
shaker, 100 r/min for reciprocal shaker) or equivalent instrument (e.g. 30 r/min for vertical rotator) to
mix well. The solution will become clear.
9.4.3 Centrifuge the micro tube of 9.4.2 at 3 300g for 1 min at room temperature. Then, take 500 μl of
supernatant solution using a pipette (6.1) and put it in a new micro tube.
9.4.4 Add 500 μl of chloroform/isoamyl alcohol (7.2) to the micro tube of 9.4.3. Tumble it about for
10 s by hand. Then, shake it for 10 min using the shaking machine (6.6) or equivalent instrument to mix
well. The solution will become clear.
9.4.5 Centrifuge the micro tube of 9.4.4 at 5 500g for 1 min at room temperature. Then, take 400 μl of
supernatant solution by using a pipette (6.1) and put it in a new micro tube.
9.4.6 Centrifuge the micro tube of 9.4.5 at 13 000g for 7 min at 4 °C. Then, put 350 μl of supernatant
solution in the unit of centrifuge type ultrafiltration. Attach another new micro tube under the unit.
9.4.7 Centrifuge the unit of centrifuge type ultrafiltration with the supernatant solution at a condition
of 14 000g for 12 min at the temperature of 4 °C.
Filter the concentrated DNA solution on the filter membrane.
Discharge the filtrated solution as waste solution.
9.4.8 Attach the micro tube of 9.4.7 to the filtration unit again.
9.4.9 Then, add 450 μl of buffer solution B (7.7) to the unit of the centrifuge type ultrafiltration where
the concentrated DNA solution is remained. Then, centrifuge the unit at 14 000g for 10 min at the
temperature of 4 °C. Discharge the filtrated solution as the waste solution.
9.4.10 Repeat 9.4.8 and 9.4.9 procedures twice or more to purify the DNA.
9.4.11 Add 20 μl of buffer solution B (7.7) to the unit where the concentrated DNA solution remains.
9.4.12 Attach a new micro tube upside down to the upper part of the unit of centrifuge type ultrafiltration.
9.4.13 Reverse the unit and erect it and then, centrifuge it at 1 000g for 2 min at temperature of 4 °C.
Then, collect the purified DNA solution finally.
This purified DNA solution is used for the DNA test hereafter and called it as the test specimen DNA.
If animal fibres coloured by dark pigments are being tested, it is possible to remain inhibitors for PCR.
In that case, the additional purification method described in Annex B is recommended.
© ISO 2015 – All rights reserved 7
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ISO 18074:2015(E)
9.5 DNA amplification
9.5.1 Composition of the reaction solution
The composition of the reaction solution for animal A is as follows:
— Test specimen DNA (9.4.12) 2 μl
— Heat stable DNA polymerase (7.9) 1–1,5 unit
— Animal A, Primer 1 (7.10) 1 μmol/l
— Animal A, Primer 2 (7.11) 1 μmol/l
— Common primer 1 for verification (7.21) 0,5 μmol/l
— Common primer 2 for verification (7.21) 0,5 μmol/l
— substrate nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP (7.12) 200 μmol/l each
— Buffer solution for polymerase (7.13) designated amount by suppliers
— Salt, KCl 50 mmol/l
— MgCl 1,5 mmol
2
Make up the solution to 50 μl by adding pure water.
9.5.2 Condition of PCR amplification instrument for DNA amplification
The condition of PCR amplification instrument is shown in Table 1.
Table 1 — The program of PCR instrument
Item Time/temperature Number of cycles
Initiation of PCR 5 min to 10 min/95 °C 1
Amplification 30 s/95 °C 35
a
30 s/60 °C to 68 °C
30 s/72 °C
Final extension 3 min to 7 min/72 °C 1
Preservation No time limitation/4 °C 1
a
Annealing temperature for the PCR amplification depends on the design of primers.
This temperature should be adjusted to the primer to be used.
9.5.3 DNA Amplification test method
9.5.3.1 Put the reagents in a micro tube for PCR using micro pipettes according to 9.5.1 and make it up
to 50 μl by adding pure water.
9.5.3.2 Mount the micro tube to the PCR amplification instrument and run the amplification procedure
with the condition as shown in Table 1.
9.5.3.3 Run the amplification cycle up to 35 cycles.
9.5.3.4 When the reaction cycle has ended, take out the micro tube from the PCR amplification
instrument and keep it in the refrigerator at 4 °C until running the following procedure.
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...
DRAFT INTERNATIONAL STANDARD
ISO/DIS 18074
ISO/TC 38 Secretariat: JISC
Voting begins on: Voting terminates on:
2013-09-26 2013-12-26
Textiles — Identification of some animal fibres by DNA
analysis method- Cashmere, wool, yak and their blends
Textiles — Identification de certaines fibres animales par la méthode d’analyse de l’ADN - Cachemire, laine,
yak et leurs mélanges
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FOR COMMENT AND APPROVAL. IT IS
THEREFORE SUBJECT TO CHANGE AND MAY
NOT BE REFERRED TO AS AN INTERNATIONAL
STANDARD UNTIL PUBLISHED AS SUCH.
IN ADDITION TO THEIR EVALUATION AS
BEING ACCEPTABLE FOR INDUSTRIAL,
TECHNOLOGICAL, COMMERCIAL AND
USER PURPOSES, DRAFT INTERNATIONAL
STANDARDS MAY ON OCCASION HAVE TO
BE CONSIDERED IN THE LIGHT OF THEIR
POTENTIAL TO BECOME STANDARDS TO
WHICH REFERENCE MAY BE MADE IN
Reference number
NATIONAL REGULATIONS.
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RECIPIENTS OF THIS DRAFT ARE INVITED
TO SUBMIT, WITH THEIR COMMENTS,
NOTIFICATION OF ANY RELEVANT PATENT
RIGHTS OF WHICH THEY ARE AWARE AND TO
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Violators may be prosecuted.
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ISO/DIS 18074:2013(E)
Contents Page
Foreword . iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Caution . 1
3 Normative references . 1
4 Terms and definitions . 2
5 Principle. 3
6 Apparatus and equipments . 4
7 Reagents. 5
8 Sampling. 8
9 Test methods . 8
10 Verification . 12
11 Judgement . 14
12 Test report . 14
Annex A (informative) Amplification of the constant length DNA fragment by PCR method . 16
Annex B (informative) DNA additional purification . 18
Annex C (informative) Repeatability & reproducibility . 20
Annex D (informative) Practical application to various textile products . 24
Bibliography . 25
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ISO/DIS 18074:2013(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 18074 was prepared by Technical Committee ISO/TC 38, Textiles, WG22 Composition and chemical
testing.
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ISO/DIS 18074:2013(E)
Introduction
The composition of fibres in the textile products is one of the most important properties. Labelling of
composition of textile products is required globally by the legislation or the voluntary regulation for fair
trade.
The testing method to detemine the composition of some animal fibres in the textile products has been
developed as ISO 17751:2007 "Textiles -- Quantitative analysis of animal fibres by microscopy --
Cashmere, wool, speciality fibres and their blends". This is only one method to determine the animal fibre
composition currently. In this method animal fibres is observed by microscope and identified from the
shape of scales by experienced examiners. The many samples can be tested with a high efficiency in this
method. However, even though the exprienced examiners, they have been experiencing some difficulties
to identify fibres, because textile products have broad varieties of the colours and finishings, and many
blends in animal fibres.
Under the situation, the several testing methods to obtain the more accurate results has been investigated
and developed. Among those methods, DNA (deoxyribonucleic acid) analysis method has been found out
the practical and feasible method to identify the kind of animal fibres inherently.
As well known, DNA is specific for animals. DNA-PCR (polymerase chain reaction) method has been
developed well recently with high accuracy. Very trivial quantity of the DNA extracted from animal fibres is
amplified by PCR to huge quantity of a copy DNA. The mitochondrial DNA is used for this analysis
because of greater numbers than the nuclear DNA.
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ISO/DIS 18074:2013(E)
WORKING DRAFT
ISO/DIS 18074:2013(E)
Textiles — Identification of some animal fibres by DNA analysis
method — Cashmere, wool, yak and their blends
WARNING — The use of this standard may involve hazardous materials, operations and equipments.
This standard does not purport to address all of the safety problems associated with its use. It is the
responsibility of the user of this standard to establish appropriate safety and health practices and
determine the applicability of regulatory limitations and supplier’s requirement for safety prior to use.
1 Scope
This International Standard specifies a testing method for DNA analysis of some animal fibres to identify
cashmere, wool, yak and their blends by using extraction, amplification by polymerase chain reaction (PCR)
method and detection process of DNA.
This International Standard is applicable to cashmere, yak and wool and their blends, as a qulitatative method.
2 Caution
Testing results for fibre identification by DNA analysis method can be obtained with a high accuracy for the
above mentioned textile products which were processed at lower dye concentration levels or dyed in light
colours.
However, when such textile products were processed by using severe conditions or high temperature,
mitochondorial DNA may possibly have been damaged. In the cases, the identification may be difficult,
because amplification of DNA by PCR can not take place.
3 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO139, Textiles -- Standard atmospheres for conditioning and testing
ISO 6938, Textiles -- Natural fibres -- Generic names and definitions
ISO 3696, Water for analytical laboratory use – specification and test methods
ISO 8655, Piston-operated volumetric apparatus
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ISO/DIS 18074:2013(E)
4 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
4.1
DNA
Deoxyribonucleic acid, that exsits in nuclei and in mitochondria of animal fibre cells and is composed of a
linear array of 4 bases, as Adenine : A, Thymine: T, Guanine: G and Cytosine: C. DNA sequence is identical
and intrinsic for each animal fibre.
4.2
animal fibres
cashmere , wool or yak fibres
4.3
buffer solution
solution used to keep pH at desirable value of the reaction solution.
4.4
reducing agent
agent resolves the animal fibres by the reductive decomposition of S-S bonds of the protein.
4.5
DNA amplification
amplification of the specific fragment of DNA by the PCR method.
4.6
PCR method
method of the polymerase chain reaction.
NOTE The amplification process of the DNA fragment with a constant length is explained in Annex A.
4.7
DNA polymerase for PCR method
heat-stable DNA polymerase that should lack proof reading activity is specified for the PCR method.
4.8
primer
short length fragment of a single strand DNA which is a reaction initiator and designed as the identical
sequence of 18-30 bases to DNA of the animal fibre.
4.9
primer set
set of primer with the reaction direction of forward and reverse.
4.10
primer for cashmere
primer with an identical base sequence of mitochondrial DNA of cashmere.
NOTE The sequence of base for primers will be submitted to the public database.
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ISO/DIS 18074:2013(E)
4.11
primer for wool
primer with an identical base sequence to mitochondrial DNA of wool.
4.12
primer for yak
primer DNA with an identical base sequence to mitochondrial DNA of yak.
NOTE The information of the primers may be obtained from ISO/TC38 secretariat.
4.13
gel electrophoresis migration,
method to detect the amplified constant length DNA fragments.
5 Principle
Mitocondorial DNA is extracted from animal fibre samples by using a chemical and enzyme reaction. The
extracted DNA is purified by using a precipitation method and centrifuge. The purified DNA is applied for the
amplification reaction of PCR method. In the PCR method, primers for cashmere, yak and wool are
respectively tested. If the sample is cashmere, only cashmere primer can amplify the constant length of DNA
fragments. Then, the constant length of DNA fragments is detected by the electrophoretic migration method.
The sample fibres are identified by knowing whether the amplification was observed or not for the tests with
using all primers respectively.
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ISO/DIS 18074:2013(E)
6 Apparatus and equipments
6.1 Pipettes, capable of measuring and taking (0 - 20) μl (± 0,20 µl), (20 – 200) μl (± 1,60 µl), (200 – 1 000)
μl (± 8 µl) within systematic errors defined in ISO 8655.
6.2 Micro tube, capable of withstanding the centrifugation of 14 000 x g and autoclave. The capacity is 2 ml
for purification and 0,2 ml for PCR method. A tube of 0,2 ml for PCR method should follow the manufacturer's
recomendation of the PCR instrument.
6.3 Cap lock, use for micro tube
6.4 Heat block, with mounting holes for micro tubes and capable of heating up to about 80 °C (± 1, 0 °C)
6.5 Shaking agitator, capable of heating up to 50 °C and maintaining at the temperature of 50 °C and
shaking micro tube at around 500 rpm or higher.
6.6 Shaking machine, capable of mounting micro tubes and shaking at around 500 times/minute or higher.
This machine can be replaced by an equivalent instrument such as microtube rotator which is possible to
rotate at 30 rpm or higher.
6.7 Centrifuge, capable of centrifuging of 14 000 x g or higher, setting up temperature from 0 °C to room
temperature and mounting micro tubes or units of centrifugal ultrafiltration.
6.8 Unit of centrifugal ultrafiltration, capable of capturing molecules with the molecular weight of 100 kDa
(Dalton) or more.
NOTE The unit is commercially available as Amicon Ultra, etc.
6.9 PCR instrument, capable of programing for temperature and time.
NOTE An instrument is commercially available from Life Technologies Corporation. Equivalent instruments of other
suppliers are also available.
6.10 UV illuminator, UV irradiator.
6.11 Photo booth
6.12 Tupperware
6.13 Comb, used for making wells in the arogarse gel of the Gel electrophoresis migration test.
6.14 Mixer mill, used for mixing and homogenizing animal fibres.
6.15 Erlenmeyer flask, capacity of 200 ml
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ISO/DIS 18074:2013(E)
7 Reagents
7.1 Pure water
Pure water is defined in ISO 3696 as with the purity of Grade 1, which should not have activity of DNase (DNA
digesting) and should not contain significant amount of DNA which can be amplified by primers or should not
show inhibitory effects for this testing method.
7.2 Chloroform/Isoamyl alcohol reagent
100 % concentration of the highest grade.
Chloroform 9,6 ml
Isoamyl alcohol 400 l
7.3 Sodium Perchlorate solution
Sodium Perchlorate 6,1 g
Make it up to 10 ml by pure water
7.4 1 mol/l Tris – HCl (tris(hydroxymethyl)aminomethane)
Tris(hydroxymethyl)aminomethane of 12,1 g is dissolved in pure water of 800 ml, then adjust pH to 8,0 by
adding HCl and using the pH meter. Then, make it up to 1 000 ml by pure water.
7.5 500 mmol/l EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)
EDTANa ·2H O (disodium salt-dihydrate of EDTA) of 186,1 g is dissolved in pure water of 800 ml, then adjust
2 2
pH to 8,0 by adding NaOH and using pH meter. Then, make it up to 1 000 ml by pure water.
7.6 Buffer solution A
1 mol/l Tris-HCL (7.4) 5 ml
500 m mol/l EDTA, (7.5) 2 ml
Sodium lauryl sulfate (SLS) (C H SO Na) 0,2 g
12 25 4
Sucrose 1,2 g
Sodium Chloride 170 mg
Dithiothreitol (DTT) 920 mg
Make it up to 10 ml by pure water.
NOTE Prepare fresh before use
7.7 Buffer solution B
1 mol/l Tris-HCl (7.4) 1 ml,
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ISO/DIS 18074:2013(E)
500 m mol/l EDTA (7.5) 0,2 ml
Make it up to 100 ml by pure water.
7.8 Protein resolving enzyme solution, the papain solution
Papain of 10 unit is dissolved in pure water (e.g. 10 unit / 20 μl).
7.9 Heat stable DNA polymerase
Polymerse should not have 3„ to 5„ exonuclease activity.
7.10 Animal fibre A primer 1
Forward primers for cashmere, yak and wool.
7.11 Animal fibre A primer 2
Reverse primers for cashmere, yak and wool.
7.12 DNA composition component
The substrate nucleotide with a grade for PCR method.
7.13 Buffer solution for polymerase
The buffer solution should be suitable for the polymerase of the PCR reaction.
NOTE This buffer solution may be designated by manufacturers of polymerase.
7.14 Salt, Potassium Chloride (KCl)
Reagent used to stabilize PCR reaction.
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ISO/DIS 18074:2013(E)
7.15 Magnesium chloride
Reagent used to stabilize PCR reaction.
7.16 Gel electrophoretic migration marker
A marker is commercially available and DNA fragment with a constant length. The marker is used to identify
approximate length of the amplified DNA fragment from 100 bp to 500 bp, such as the phi X 174 phage DNA
following digestion using the restriction enzyme HincII or 100 bp ladder.
7.17 Agarose
A kind of agar with a grade for DNA electrophoretic migration.
7.18 Buffer solution for loading on the electrophoretic migration
Glycerol 36 g
500 mmol/l EDTA (7.5) 6 ml
Bromophenol Blue 0,25 g
Xylene cyanol 0,25 g
Make it up to 100 ml by pure water
After adding the solution of more than 1/6 to the sample reaction solution, load it on the gel.
7.19 Buffer solution for electrophoretic migration
tris(hydroxymethyl)aminomethane base (Trizma base) 242 g
Acetic acid (glacial acetic acid) 57,1 ml
EDTA·2Na 7,43 g
Dissolve by pure water and make it up to 1 l by pure water.
Then,
Dilute 50 times by pure water.
7.20 DNA dyeing colourant, ethidium bromide
Ethidium bromide dissolve in the buffer solution for electrophoretic migration so as to be approximatly 5 μg/ml
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ISO/DIS 18074:2013(E)
7.21 Common DNA fragment, primer
Common DNA fragments are common base alignments existing in the all DNAs of cashmere, yak and wool.
Common primer 1 and common primer 2 is forward and reverse primer respectively.
NOTE The information of primers may be obtained from ISO/TC38 secretariat.
8 Sampling
8.1 Animal fibre samples shall represent the textile products for test. If the textile product is composed by
several parts, separate them into identical parts and describe the details of the parts in the test report. Avoid
the contamination among the parts.
8.2 The number of the test specimens from the sample is 2. When the two results are not consistent, then
do not adopt the results and another test shall be performed for two specimens again.
NOTE Annex B (informative) of ISO 17751 can be reference of this procedure.
9 Test methods
9.1 General
The test should be performed in parallel for the primers for cashmere, yak and wool.
9.2 Chipping sample
Chip the animal fibre sample of 100 mg with the length of less than 2 mm by scissors, mixer mill or other
instruments. Then, put the chipped sample of 50 mg into the 2,0 ml of a micro tube.
NOTE Eppendorf tubes or equivalent tubes are available in the market.
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ISO/DIS 18074:2013(E)
9.3 DNA extraction
9.3.1 Add the buffer solution A (7.6) of 600 μl in the micro tube with the test sample (9.2).
9.3.2 Cap the micro tube and then tumble it by hand to immerse the sample in the buffer solution perfectly.
9.3.3 Lock the cap of the micro tube by a cap lock during the heating process. Then heat the micro tube with
the sample at 60 °C and for 20 minutes by using the heat block. During heating, at the times of after 3 minutes,
after 6 minutes, after 9 minutes, after 15 minutes from the begining, take out the micro tube temporarily from
the heat block and tumble it about for 10 seconds by hand and back to the heat block again to continue
heating until after 20 minutes from the begining.
9.3.4 After 20 minutes passed, take out the micro tube from the heat block and cool it down to room
temperature.Then,
9.3.5 Add the papain solution (7.8) of 10 units in the micro tube with the sample. Then heat up the micro
tube to 50 °C and maintaine at 50 °C and shake it at a condition of 500 rpm for 1 hour by the shaking agitator
(6.5). Then,
9.3.6 Add the papain solution (7.8) of 10 units in the micro tube of 9.3.5 and maintain it at 50 °C. Shake it at
a condition of 500 rpm for over 12 hours. Over 12 hours is acceptable. Cool it down to room temperature, and
then,
9.4 DNA purification
9.4.1 Add the sodium perchlorate solution (7.3) of 300 μl to the micro tube of 9.3.6. Then shake it for 10
minutes at a condition of 500 rpm by shaking machine (6.6). Then,
9.4.2 Add the chloroform/isoamyl alcohol (7.2) of 300 μl the micro tube of 9.4.1. Tumble it about for 10
seconds by hand. Then, shake it for 10 minutes by the shaking machine (6.6) (e.g. at 500 rpm for rotating
shaker, 100 rpm for reciprocal shaker) or equivalent instrument (e.g. 30 rpm for verical rotator) to mix well.
The solution becomes clear. Then,
9.4.3 Centrifuge the micro tube of 9.4.2 at a condition of 3 300 × g for 1 minute at room temperature. Then,
take the supernatant solution of 500 μl by using a pipette (6.1) and put it in a new micro tube. Then,
9.4.4 Add the chloroform/isoamyl alcohol (7.2) of 500 μl the micro tube of 9.4.3. Tumble it about for 10
seconds by hand. Then, shake it for 10 minutes by the shaking machine (6.6) or equivalent instrument to mix
well. The solution becomes clear.
9.4.5 Centrifuge the micro tube of 9.4.4 at a condition of 5 500 × g for 1 minute at room temperature. Then,
take the supernatant solution of 400 μl by using a pippete (6.1) and put it in a new micro tube. Then,
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ISO/DIS 18074:2013(E)
9.4.6 Centrifuge the micro tube of 9.4.5 at a condition of 13 000 × g for 7 minutes at the temperature of 4 °C.
Then, put the supernatant solution of 350 μl in the unit of centrifuge type ultrafiltration. Attach another new
micro tube under the unit.
9.4.7 Centrifuge the unit of centrifuge type ultrafiltration with the supernatant solution at a condition of 14
000 × g for 12 minutes at the temperature of 4 °C.
The concentrated DNA solution is filtered on the filter membrane.
Discharge the filtrated solution as the waste solution.
9.4.8 Attach the micro tube of 9.4.7 to the filtration unit again. Then,
9.4.9 Add the buffer solution B (7.7) of 450 μl to the unit of the centrifuge type ultrafiltration where the
concentrated DNA solution is remained. Then, centrifuge the unit at a condition of 14 000 × g for 10 minutes
at the temperature of 4 °C. Discharge the filterated solution as the waste solution.
9.4.10 Repeat 9.4.8 and 9.4.9 procedures twice or more to purify the DNA. Then,
9.4.11 Add the buffer solution B (7.7) of 20 μl to the unit where the concentrated DNA solution remains.
9.4.12 Attach a new micro tube upside down to the upper part of the unit of centrifuge type ultrafiltration.
9.4.13 Reverse the unit and erect it and then, centrifuge it at a condition of 1 000 × g for 2 minutes at
temperature of 4 °C . Then, collect the purified DNA solution finally.
This purified DNA solution is used for the DNA test hereafter and called it as the test specimen DNA.
NOTE In case of the test for animal fibres colured by dark pigments, there is possiblity to remain infibitors for PCR. In
that case an additional purification method described in Annex B is worth to apply.
9.5 DNA amplification
9.5.1 Composition of the reaction solution
The composition of the reaction solution for the animal A is as follows
Test specimen DNA ( 9.4.12) 2 μl
Heat stable DNA polymerase (7. 9) 1 – 1,5 unit
Animal A, Primer 1 (7.10) 1 μmol/l
Animal A, Primer 2 (7.11) 1 μmol/l
Common primer 1 for verification (7.21) 0,5 μmol/l
Common primer 2 for verification (7.21) 0,5 μmol/l
substrate nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP (7.12) 200 μmol/l each
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ISO/DIS 18074:2013(E)
Buffer solution for polymerase (7.13) designated amount by suppliers
Salt, KCl 50 mmol/l
MgCl 1,5 mmol
2
Pure water make up to the total amount of 50 μl
9.5.2 Condition of PCR amplification instrument for DNA amplification
The condition of PCR amplification instrument is shown in Table 1.
Tabel 1 — The program of PCR instrument
Item Time/temperature Number of cycles
Initiation of PCR 5 -10 min / 95 °C 1
Amplification 30 s / 95 °C 35
30 s / 60-68 °C*
30 s / 72 °C
Final extention 3 - 7 min / 72 °C 1
Preservation No time limitation / 4 °C 1
* Annealing temperature for the PCR amplification depends on the design of primers. This temperature should be
adjusted to the primer to be used.
9.5.3 DNA Amplification test method
9.5.3.1 Put the reagents in a micro tube for PCR by using micro pipettes according to 9.5.1 and make it up
to 50 μl by pure water.
9.5.3.2 Mount the micro tube to the PCR amplification instrument and run the amplification procedure with
the condition shown in Table 1 of 9.5.2.
9.5.3.3 Run the amplification cycle up to 35 cycles.
9.5.3.4 When the reaction cycle is ended, take out the micro tube from the PCR amplification instrument
and keep it in the refrigerator at 4 °C until running the following procedure.
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ISO/DIS 18074:2013(E)
9.6 Detection and confirmation of DNA amplification
9.6.1 Preparation
9.6.1.1 Put the agarose of 0,9 g in the Erlenmeyer flask. Then add the electrophoretic migration buffer
solution (7.19) of 60 ml in the flask. Melt the agarose completely by heating. Pour the melted agarose into a
gel container and set a comb in the gel. Keep the gel container with the gel at room temperature for 30
minutes or more and materialize the gel.
9.6.1.2 Take out the comb carefully and create the wells in the gel. Set the gel container in the unit of the
electrophoretic migration. Pour the buffer solution (7.19) to the gel container by the depth of 3 to 5 mm from
the surface of the gel to solution surface.
NOTE Take out the
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 18074
Première édition
2015-12-01
Textiles — Identification de certaines
fibres animales par la méthode
d’analyse de l’ADN — Cachemire, laine,
yack et leurs mélanges
Textiles — Identification of some animal fibres by DNA analysis
method — Cashmere, wool, yak and their blends
Numéro de référence
ISO 18074:2015(F)
©
ISO 2015
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ISO 18074:2015(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2015, Publié en Suisse
Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée
sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Tel. +41 22 749 01 11
Fax +41 22 749 09 47
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www.iso.org
ii © ISO 2015 – Tous droits réservés
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ISO 18074:2015(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Mise en garde . 1
3 Références normatives . 1
4 Termes et définitions . 1
5 Principe . 3
6 Appareillage et équipement . 3
7 Réactifs . 4
8 Échantillonnage . 6
9 Méthodes d’essai . 7
9.1 Généralités . 7
9.2 Découpage de l’échantillon . 7
9.3 Extraction de l’ADN . 7
9.4 Purification de l’ADN . 7
9.5 Amplification de l’ADN . 8
9.5.1 Composition de la solution de réaction . . 8
9.5.2 Paramètres de la machine d’amplification PCR pour l’amplification de l’ADN . 9
9.5.3 Méthode d’essai d’amplification de l’ADN . 9
9.6 Détection et confirmation de l’amplification d’ADN . 9
9.6.1 Préparation . 9
9.6.2 Essai de migration électrophorétique .10
10 Vérification .10
10.1 Généralités .10
10.2 Vérification d’absence d’amplification après le processus d’extraction
(vérification négative) .10
10.3 Vérification d’amplification après le processus d’extraction (vérification positive) .10
10.4 Vérification d’amplification après le processus de PCR .11
10.5 Vérification d’absence d’amplification après le processus de PCR .11
10.6 Vérification d’amplification de la solution de réaction PCR .11
11 Évaluation .12
12 Fidélité .12
13 Rapport d’essai .13
Annexe A (informative) Amplification du fragment d’ADN de longueur constante par la
méthode PCR.14
Annexe B (informative) Purification complémentaire de l’ADN .16
Annexe C (informative) Répétabilité et reproductibilité .18
Annexe D (informative) Application pratique à divers produits textiles .23
Bibliographie .24
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ISO 18074:2015(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer
un engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation
de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de l’OMC
concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant : Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 38, Textiles.
iv © ISO 2015 – Tous droits réservés
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ISO 18074:2015(F)
Introduction
La composition des fibres utilisées dans les produits textiles est l’une des propriétés les plus
importantes. L’étiquetage de la composition des produits textiles est exigé au niveau mondial par les
législations ou les réglementations volontaires liées au commerce équitable.
La méthode d’essai visant à déterminer la composition de certaines fibres animales utilisées dans les
[3]
produits textiles a été décrite dans l’ISO 17751. Il s’agit actuellement de la seule méthode permettant
de déterminer la composition de fibres animales. Dans cette méthode, les fibres animales sont observées
au microscope et identifiées en fonction de la forme de leurs écailles par des opérateurs expérimentés.
De cette manière, de nombreux échantillons peuvent être soumis à essai de façon très efficace. Toutefois,
des opérateurs, même expérimentés, peuvent rencontrer des difficultés dans l’identification de fibres,
car les produits textiles présentent une grande diversité de couleurs et de traitements d’ennoblissement,
et parce qu’il existe de nombreux mélanges de fibres animales.
C’est pourquoi plusieurs méthodes d’essai visant à obtenir des résultats plus précis ont été recherchées
et élaborées. Parmi elles, la méthode d’analyse de l’ADN (acide désoxyribonucléique) s’est révélée
pratique et facile à mettre en œuvre pour identifier la nature des fibres animales.
Il est bien connu que tous les animaux possèdent un ADN spécifique. La méthode d’amplification de
l’ADN par PCR (réaction de polymérisation en chaîne) a récemment évolué, atteignant une haute
précision. De très faibles quantités d’ADN extraites de fibres animales sont amplifiées par PCR afin
d’obtenir de grandes quantités d’ADN copié. Pour cette analyse, on utilise l’ADN mitochondrial, plutôt
que l’ADN nucléaire, car il engendre de plus grandes quantités.
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NORME INTERNATIONALE ISO 18074:2015(F)
Textiles — Identification de certaines fibres animales par
la méthode d’analyse de l’ADN — Cachemire, laine, yack et
leurs mélanges
AVERTISSEMENT — L’utilisation de la présente Norme internationale peut impliquer des
matériaux, opérations et équipements dangereux. La présente Norme internationale n’a pas pour
objectif de traiter l’ensemble des problèmes de sécurité associés à son utilisation. L’utilisateur de
la présente Norme internationale est tenu, avant utilisation, d’établir des pratiques de sécurité
et d’hygiène appropriées et de déterminer l’applicabilité des limitations réglementaires et des
exigences du fournisseur en matière de sécurité.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode d’essai pour l’analyse de l’ADN de certaines
fibres animales afin d’identifier le cachemire, la laine, le yack et leurs mélanges au moyen d’une
extraction, d’une amplification par la méthode PCR (réaction par polymérisation en chaîne) et de
procédés de détection de l’ADN.
La présente Norme internationale s’applique au cachemire, au yack, à la laine et à leurs mélanges en tant
que méthode qualitative.
2 Mise en garde
Les résultats d’essai pour l’identification de fibres par la méthode d’analyse de l’ADN peuvent être
obtenus avec un haut degré de précision pour les produits textiles mentionnés ci-dessus ayant été
traités avec de faibles concentrations en colorants ou ayant été teints en couleurs claires.
En revanche, lorsque les produits textiles ont été traités dans des conditions plus agressives ou à
de hautes températures, l’ADN mitochondrial est susceptible d’avoir été endommagé. Dans ce cas,
l’identification peut s’avérer difficile car l’amplification de l’ADN par PCR peut être impossible. Dans
le cas où des produits textiles sont sujets à des contaminations par d’autres espèces, telles que la
présence de suint de cachemire sur des fibres de laine, cette situation peut trouver une solution par une
vérification utilisant les techniques de microscopie.
3 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai
ISO 8655-2, Appareils volumétriques à piston — Partie 2: Pipettes à piston
4 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
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ISO 18074:2015(F)
4.1
ADN
acide désoxyribonucléique, présent dans le noyau et les mitochondries des cellules composant les fibres
animales et constitué d’une chaîne linéaire de 4 bases : l’adénine (A), la thymine (T), la guanine (G) et
la cytosine (C)
Note 1 à l’article: à l’article : Chaque fibre animale possède une séquence d’ADN identique qui lui est propre.
4.2
fibres animales
fibres de cachemire, de laine ou de yack
4.3
solution tampon
solution utilisée afin de maintenir le pH de la solution de réaction à une valeur souhaitée
4.4
agent réducteur
agent dissolvant les fibres animales par décomposition réductrice des ponts disulfure de la protéine
4.5
amplification de l’ADN
amplification du fragment spécifique d’ADN par la méthode PCR
4.6
méthode PCR
méthode d’amplification en chaîne par polymérase
Note 1 à l’article: à l’article : Le procédé d’amplification du fragment d’ADN de longueur constante est expliqué
à l’Annexe A.
4.7
ADN polymérase pour la méthode PCR
ADN polymérase thermostable, sans la fonction de correction sur épreuves, spécifiée pour la méthode
PCR
4.8
amorce
fragment de courte taille d’ADN simple brin, initiateur de réaction et défini comme la séquence de
18-30 bases identique par rapport à l’ADN de la fibre animale
4.9
jeu d’amorces
ensemble d’amorces avec la réaction direction sens et anti-sens
4.10
amorce pour le cachemire
amorce présentant une séquence de bases identique à l’ADN mitochondrial du cachemire
Note 1 à l’article: à l’article : La séquence de bases pour les amorces sera déposée auprès de la base de
données publique.
Note 2 à l’article:
4.11
amorce pour la laine
amorce présentant une séquence de bases identique à l’ADN mitochondrial de la laine
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ISO 18074:2015(F)
4.12
amorce pour le yack
amorce d’ADN présentant une séquence de bases identique à l’ADN mitochondrial du yack
Note 1 à l’article: à l’article : Des informations sur les amorces peuvent être obtenues auprès du secrétariat
de l’ISO/TC 38.
4.13
migration par électrophorèse sur gel
méthode permettant de détecter les fragments d’ADN amplifié de longueur constante
5 Principe
L’ADN mitochondrial est extrait des échantillons de fibres animales à l’aide d’une réaction chimique et
enzymatique. L’ADN extrait est purifié au moyen d’une méthode de précipitation et par centrifugation.
L’ADN purifié est employé pour la réaction d’amplification de la méthode PCR. Dans la méthode PCR,
des amorces pour le cachemire, le yack et la laine sont respectivement soumises à essai. Si l’échantillon
est constitué de cachemire, seule l’amorce de cachemire permet d’amplifier les fragments d’ADN de
longueur constante. Ensuite, les fragments d’ADN de longueur constante sont détectés par la méthode
de migration électrophorétique.
Les fibres sont identifiées par l’observation d’amplification ou d’absence d’amplification dans les essais
effectués en utilisant successivement toutes les amorces.
6 Appareillage et équipement
6.1 Pipettes, permettant de mesurer et de prélever (0 à 20) μl (± 0,20 µl), (20 à 200) μl (± 1,60 µl),
(200 à 1 000) μl (± 8 µl) dans la limite des erreurs systématiques définies dans l’ISO 8655-2.
6.2 Microtube, capable de supporter une centrifugation de 14 000 g et le séjour en autoclave.
Des capacités de 2 ml et de 0,2 ml sont respectivement nécessaires pour la purification et pour la
méthode PCR. Il convient que les tubes de 0,2 ml utilisés pour la méthode PCR soient conformes aux
recommandations du fabricant de la machine PCR.
6.3 Capuchon vissant, pour le microtube.
6.4 Bloc thermique, muni d’orifices pour accueillir les microtubes et capable de chauffer jusqu’à
environ 80 °C (± 1,0 °C).
6.5 Agitateur vibrant avec dispositif chauffant, permettant de chauffer jusqu’à 50 °C et de maintenir
cette température, ainsi que d’appliquer au microtube une agitation d’environ 500 tr/min ou plus.
6.6 Agitateur, permettant d’accueillir les microtubes et de les agiter environ 500 fois/min ou plus.
Cette machine peut être remplacée par un instrument équivalent, par exemple un agitateur rotatif à
microtubes pouvant fonctionner à 30 tr/min ou plus.
6.7 Centrifugeuse, permettant de réaliser une centrifugation à 14 000 g ou plus, de passer de 0 °C à la
température ambiante et d’accueillir des microtubes ou des unités d’ultrafiltration par centrifugation.
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1)
6.8 Unité d’ultrafiltration par centrifugation permettant de retenir les molécules présentant une
masse moléculaire de 100 kDa (Dalton) ou plus.
2)
6.9 Machine PCR , dont la température et la durée de fonctionnement sont programmables.
6.10 Illuminateur UV, émetteur d’UV.
6.11 Cabine photo.
6.12 Boîte plastique banalisée avec un couvercle refermable.
6.13 Peigne, utilisé pour former des puits dans le gel d’agarose employé dans l’essai de migration par
électrophorèse sur gel.
6.14 Broyeur, utilisé pour mélanger et homogénéiser les fibres animales.
6.15 Fiole Erlenmeyer, de capacité 200 ml.
7 Réactifs
7.1 Eau pure.
Utiliser de l’eau pure telle que définie dans l’ISO 3696, présentant une pureté correspondant à la
qualité 1. Il convient que cette eau ne présente aucune activité DNase (digestion de l’ADN). Il convient
qu’elle ne contienne pas d’ADN susceptible d’être amplifié par les amorces en quantité significative et
qu’elle ne présente aucun effet inhibiteur pour cette méthode d’essai.
7.2 Réactif chloroforme/alcool isoamylique.
Concentration à 100 % de la plus haute qualité.
— Chloroforme 9,6 ml
— Alcool isoamylique 400 μl
7.3 Solution de perchlorate de sodium.
— Perchlorate de sodium 6,1 g
Compléter la solution à 10 ml avec de l’eau pure.
7.4 Tris [tris(hydroxyméthyl)aminométhane] – HCl à 1 mol/l.
Dissoudre 12,1 g de tris(hydroxyméthyl)aminométhane dans 800 ml d’eau pure, puis ajuster le pH à une
valeur de 8,0 en ajoutant du HCl et à l’aide d’un pH-mètre. Compléter ensuite à 1 000 ml avec de l’eau pure.
1) Amicon Ultra est un exemple d’un produit approprié disponible dans le commerce. Cette information est
donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un
engagement de l’ISO à l’égard de ce produit.
2) Life Technologies Corporation est le fournisseur d’un produit approprié disponible dans le commerce. Cette
information est donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait
constituer un engagement de l’ISO à l’égard de ce produit. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il peut
être démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
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ISO 18074:2015(F)
7.5 EDTA (acide éthylène diamine tétraacétique) à 500 mmol/l.
Dissoudre 186,1 g d’EDTA·Na ·2H O (sel disodique dihydraté d’EDTA) dans 800 ml d’eau pure, puis
2 2
ajuster le pH à une valeur de 8,0 en ajoutant de la soude NaOH et à l’aide d’un pH-mètre. Compléter
ensuite à 1 000 ml avec de l’eau pure.
7.6 Solution tampon A.
— Tris-HCL à 1 mol/l (7.4) 5 ml
— EDTA à 500 mmol/l (7.5) 2 ml
— Laurylsulfate de sodium (LSS) (C H SO Na) 0,2 g
12 25 4
— Saccharose 1,2 g
— Chlorure de sodium 170 mg
— Dithiothréitol (DTT) 920 mg
Compléter à 10 ml avec de l’eau pure. Préparer directement avant utilisation.
En raison de sa nature volatile, il convient d’ajouter le DTT après le passage en autoclave, de façon à ce
que son efficacité ne soit pas réduite.
7.7 Solution tampon B.
— EDTA à 500 mmol/l (7.5) 0,2 ml
Compléter à 100 ml avec de l’eau pure.
7.8 Solution enzymatique d’extraction des protéines, solution papaïnique, avec 10 unités de
papaïne dissoutes dans de l’eau pure (par exemple, 10 unités/20 μl).
7.9 ADN polymérase thermostable, sans l’activité exonucléase 3’ à 5’.
7.10 Fibre animale A amorce 1, amorces sens pour le cachemire, le yack et la laine.
7.11 Fibre animale A amorce 2, amorces anti-sens pour le cachemire, le yack et la laine.
7.12 Élément de composition de l’ADN, de qualité adaptée à la méthode PCR.
7.13 Solution tampon pour la polymérase, adaptée à la polymérase de la réaction PCR.
Cette solution tampon peut être conçue par les personnes réalisant la polymérase.
7.14 Sel, chlorure de potassium (KCl), utilisé pour stabiliser la réaction PCR.
7.15 Chlorure de magnésium (MgCl ), utilisé pour stabiliser la réaction PCR.
2
7.16 Marqueur de migration électrophorétique sur gel.
7.17 Agarose, variété d’agar-agar de qualité adaptée pour la migration électrophorétique de l’ADN.
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7.18 Solution tampon à charger pour la migration électrophorétique.
— Glycérol 36 g
— EDTA à 500 mmol/l (7.5) 6 ml
— Bleu de bromophénol 0,25 g
— Xylène cyanol 0,25 g
Compléter à 100 ml avec de l’eau pure. Après avoir ajouté plus de 1/6 de cette solution à la solution de
réaction de l’échantillon, la charger sur le gel.
7.19 Solution tampon pour la migration électrophorétique.
— Tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Trizma base) 242 g
— Acide acétique (acide acétique glacial) 57,1 ml
— EDTA·2Na 7,43 g
Dissoudre dans de l’eau pure et compléter la solution à 1 l avec de l’eau pure. Ensuite, diluer 50 fois avec
de l’eau pure.
7.20 Colorant d’ADN, bromure d’éthidium.
Le bromure d’éthidium se dissout dans la solution tampon pour la migration électrophorétique, à raison
d’environ 5 μg/ml.
NOTE D’autres agents intercalant d’ADN peuvent se substituer au bromure d’éthidium.
7.21 Fragment d’ADN commun, amorce.
Les fragments d’ADN communs sont des enchaînements de bases communs à l’ADN du cachemire, du yack
et de la laine. L’amorce commune 1 est une amorce sens ; l’amorce commune 2 est une amorce anti-sens.
NOTE Des informations sur les amorces peuvent être obtenues auprès du secrétariat de l’ISO/TC 38.
8 Échantillonnage
Les échantillons de fibres animales doivent être représentatifs des produits textiles pour l’essai. Si le
produit textile est composé de plusieurs parties, séparer ces dernières en parties identiques et inclure
une description détaillée de ces parties dans le rapport d’essai. Éviter toute contamination entre les
différentes parties.
Deux éprouvettes d’essai sont prélevées sur l’échantillon. Lorsque les deux résultats ne sont pas cohérents,
ils ne doivent pas être retenus et un nouvel essai doit être effectué sur deux autres éprouvettes.
NOTE L’Annexe B de l’ISO 17751:2007 peut servir de référence pour ce mode opératoire.
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ISO 18074:2015(F)
9 Méthodes d’essai
9.1 Généralités
Il convient que l’essai soit mené parallèlement pour les amorces de cachemire, de yack et de laine.
9.2 Découpage de l’échantillon
Découper 100 mg d’échantillon de fibre animale en des fragments de moins de 2 mm de longueur au
moyen de ciseaux, d’un broyeur, ou de tout autre instrument. Ensuite, placer 50 mg de l’échantillon
3)
découpé dans un microtube d’une capacité de 2,0 ml.
9.3 Extraction de l’ADN
Suivre le mode opératoire décrit de 9.3.1 à 9.3.6.
9.3.1 Ajouter 600 µl de la solution tampon A (7.6) dans le microtube contenant l’échantillon pour
essai (9.2).
9.3.2 Fermer le microtube, puis le secouer à la main afin que l’échantillon soit entièrement plongé
dans la solution tampon.
9.3.3 Bloquer le capuchon vissant du microtube. Ensuite, chauffer le microtube contenant l’échantillon
à 60 °C pendant 20 min en utilisant le bloc thermique. Au bout de 3 min, 6 min, 9 min et 15 min de
chauffage, retirer le microtube du bloc thermique et le secouer à la main durant environ 10 s. Ensuite,
replacer le microtube dans le bloc thermique et poursuivre le chauffage.
9.3.4 Au bout de 20 min, retirer le microtube du bloc thermique et le refroidir à la température ambiante.
9.3.5 Ajouter 10 unités de la solution papaïnique (7.8) au microtube contenant l’échantillon. Ensuite,
chauffer le microtube à 50 °C. Maintenir sa température à 50 °C et procéder à son agitation à 500 tr/min
pendant 1 h à l’aide de l’agitateur vibrant (6.5).
9.3.6 Ajouter 10 unités de la solution papaïnique (7.8) dans le microtube décrit en 9.3.5. Maintenir
sa température à 50 °C. Procéder à son agitation à 500 tr/min pendant plus de 12 h. Refroidir à la
température ambiante.
9.4 Purification de l’ADN
Suivre le mode opératoire décrit de 9.4.1 à 9.4.13.
9.4.1 Ajouter 300 µl de la solution de perchlorate de sodium (7.3) dans le microtube décrit en 9.3.6.
Ensuite, procéder à son agitation à 500 tr/min pendant 10 min à l’aide de l’agitateur (6.6).
9.4.2 Ajouter 300 µl de chloroforme/alcool isoamylique (7.2) au microtube décrit en 9.4.1. Secouer à la
main pendant 10 s environ. Ensuite, procéder à son agitation pendant 10 min à l’aide de l’agitateur (6.6)
(par exemple, à 500 tr/min pour un agitateur rotatif ou à 100 tr/min pour un agitateur alternatif) ou d’un
instrument équivalent (par exemple, à 30 tr/min pour un agitateur rotatif vertical) afin que le contenu
soit bien mélangé. La solution va devenir claire.
3) Des tubes Eppendorf sont un exemple d’un produit approprié disponible dans le commerce. Cette
information est donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait
constituer un engagement de l’ISO à l’égard de ce produit. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il peut
être démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
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ISO 18074:2015(F)
9.4.3 Centrifuger le microtube décrit en 9.4.2 à 3 300 g pendant 1 min, à température ambiante.
Ensuite, prélever 500 µl de la solution surnageante à l’aide d’une pipette (6.1) et placer ce prélèvement
dans un microtube neuf.
9.4.4 Ajouter 500 µl de chloroforme/alcool isoamylique (7.2) au microtube décrit en 9.4.3. Secouer à la
main pendant 10 s environ. Ensuite, procéder à son agitation pendant 10 min à l’aide de l’agitateur (6.6)
ou d’un instrument équivalent afin que le contenu soit bien mélangé. La solution va devenir claire.
9.4.5 C
...
PROJET DE NORME INTERNATIONALE
ISO/DIS 18074
ISO/TC 38 Secrétariat: JISC
Début de vote: Vote clos le:
2013-09-26 2013-12-26
Textiles — Identification de certaines fibres animales par
la méthode d’analyse de l’ADN - Cachemire, laine, yak et
leurs mélanges
Textiles — Identification of some animal fibres by DNA analysis method- Cashmere, wool, yak and their
blends
ICS: 59.080.01
CE DOCUMENT EST UN PROJET DIFFUSÉ POUR
OBSERVATIONS ET APPROBATION. IL EST DONC
SUSCEPTIBLE DE MODIFICATION ET NE PEUT
ÊTRE CITÉ COMME NORME INTERNATIONALE
AVANT SA PUBLICATION EN TANT QUE TELLE.
OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR
ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES
FINS INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET
COMMERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE
DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE
CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR
POSSIBILITÉ DE DEVENIR DES NORMES
POUVANT SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA
RÉGLEMENTATION NATIONALE.
Numéro de référence
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET
ISO/DIS 18074:2013(F)
SONT INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS
OBSERVATIONS, NOTIFICATION DES DROITS
DE PROPRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT
ÉVENTUELLEMENT CONNAISSANCE ET À
©
FOURNIR UNE DOCUMENTATION EXPLICATIVE. ISO 2013
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ISO/DIS 18074:2013(F)
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ce projet ISO ne peut être reproduite, enregistrée dans un système d’extraction ou transmise sous
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Toute reproduction est soumise au paiement de droits ou à un contrat de licence.
Les contrevenants pourront être poursuivis.
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ISO/DIS 18074
Sommaire Page
Avant-propos . iv
Introduction . v
1 Domaine d'application . 1
2 Mise en garde . 1
3 Références normatives . 1
4 Termes et définitions . 2
5 Principe . 3
6 Appareillage et équipements . 3
7 Réactifs . 4
8 Échantillonnage . 7
9 Méthodes d’essai . 7
10 Vérification . 10
11 Conclusions . 12
12 Rapport d'essai . 13
Annex A (informative) Amplification du fragment d'ADN de longueur constante par la
méthode PCR . 14
Annex B (informative) Purification complémentaire de l'ADN . 16
Annex C (informative) Répétabilité & reproductibilité . 18
Annex D (informative) Application pratique à divers produits textiles . 21
Bibliographie . 22
© ISO 2013 – Tous droits réservés iii
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ISO/DIS 18074
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 18074 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 38, Textiles, GT 22 Composition et essais
chimiques.
iv © ISO 2013 – Tous droits réservés
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ISO/DIS 18074
Introduction
La composition des fibres utilisées dans les produits textiles est l’une des propriétés les plus importantes.
L'étiquetage de la composition des produits textiles est exigé au niveau mondial par les législations ou les
réglementations volontaires liées au commerce équitable.
La méthode d'essai visant à déterminer la composition de certaines fibres animales utilisées dans les produits
textiles a été décrite dans l'ISO 17751:2007 « Textiles Analyse quantitative des fibres animales par
microscopie Cachemire, laine, fibres spéciales et leurs mélanges ». Il s'agit de la seule méthode permettant
actuellement de déterminer la composition de fibres animales. Dans cette méthode, les fibres animales sont
observées au microscope et identifiées en fonction de la forme de leurs écailles par des opérateurs
expérimentés. De cette manière, de nombreux échantillons peuvent être soumis à essai de façon très
efficace. Toutefois, malgré leur expérience, les opérateurs rencontrent certaines difficultés dans l'identification
des fibres, car les produits textiles présentent une grande diversité de couleurs et de finitions, ainsi que de
nombreux mélanges de fibres animales.
C'est pourquoi plusieurs méthodes d'essai visant à obtenir des résultats plus précis ont été recherchées et
élaborées. Parmi elles, la méthode d'analyse de l'ADN (acide désoxyribonucléique) s’est révélée pratique et
facile à mettre en œuvre pour identifier la nature des fibres animales.
Il est bien connu que tous les animaux possèdent un ADN spécifique. La méthode d’amplification de l’ADN
par PCR (réaction de polymérisation en chaîne) a récemment évolué, atteignant une haute précision. De très
faibles quantités d'ADN extraites de fibres animales sont amplifiées par PCR afin d'obtenir de grandes
quantités d'ADN copié. Pour cette analyse, on utilise l'ADN mitochondrial plutôt que l'ADN nucléaire en raison
de sa présence en plus grande quantité.
© ISO 2013 – Tous droits réservés v
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PROJET DE NORME INTERNATIONALE ISO/DIS 18074
Textiles — Identification de certaines fibres animales par la
méthode d’analyse de l’ADN — Cachemire, laine, yak et leurs
mélanges
AVERTISSEMENT — L'utilisation de la présente norme peut impliquer des matériaux, opérations et
équipements dangereux. La présente norme n'a pas pour objectif de traiter l'ensemble des problèmes
de sécurité associés à son utilisation. L'utilisateur de la présente norme est tenu, avant utilisation,
d'établir des pratiques de sécurité et d'hygiène appropriées et de déterminer l'applicabilité des
limitations réglementaires et des exigences du fournisseur en matière de sécurité.
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode d'essai pour l'analyse de l'ADN de certaines fibres
animales afin d'identifier le cachemire, la laine, le yak et leurs mélanges au moyen d’une extraction, d’une
amplification par la méthode PCR (réaction par polymérisation en chaîne) et du procédé de détection de
l'ADN.
La présente Norme internationale s'applique au cachemire, au yak, à la laine et à leurs mélanges en tant que
méthode qualitative.
2 Mise en garde
Les résultats d'essai pour l'identification de fibres par la méthode d'analyse de l'ADN peuvent être obtenus
avec un haut degré de précision pour les produits textiles mentionnés ci-dessus ayant été traités avec de
faibles concentrations en colorants ou ayant été teints en couleurs claires.
En revanche, lorsque les produits textiles ont été traités dans des conditions plus agressives ou à de hautes
températures, l'ADN mitochondrial est susceptible d'avoir été endommagé. Dans ce cas, l'identification peut
s'avérer difficile car l'amplification de l'ADN par PCR peut être impossible.
3 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 139, Textiles — Atmosphères normales de conditionnement et d'essai.
ISO 6938, Textiles — Fibres naturelles — Noms génériques et définitions
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai.
ISO 8655, Appareils volumétriques à piston
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4 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
4.1
ADN
acide désoxyribonucléique, présent dans le noyau et les mitochondries des cellules composant les fibres
animales et constitué d'une chaîne linéaire de 4 bases : l'adénine (A), la thymine (T), la guanine (G) et la
cytosine (C). Chaque fibre animale possède une séquence d'ADN identique qui lui est propre
4.2
fibres animales
fibres de cachemire, de laine ou de yak
4.3
solution tampon
solution utilisée afin de maintenir le pH de la solution de réaction à une valeur souhaitée
4.4
agent réducteur
agent dissolvant les fibres animales par décomposition réductrice des ponts disulfure de la protéine
4.5
amplification de l'ADN
amplification du fragment spécifique d'ADN par la méthode PCR
4.6
méthode PCR
méthode d'amplification en chaîne par polymérase
NOTE Le procédé d'amplification du fragment d'ADN à longueur fixe est expliqué à l'Annexe A.
4.7
ADN polymérase pour la méthode PCR
ADN polymérase thermostable dont il convient que le défaut d'activité de correction sur épreuves soit spécifié
pour la méthode PCR
4.8
amorce
fragment de courte taille d'ADN simple brin, initiateur de réaction et défini comme la séquence de 18-30 bases
identique par rapport à l'ADN de la fibre animale
4.9
jeu d'amorces
ensemble d'amorces
4.10
amorce pour le cachemire
amorce présentant une séquence de bases identique à l'ADN mitochondrial du cachemire
NOTE La séquence de bases pour les amorces sera déposée auprès de la base de données publique.
4.11
amorce pour la laine
amorce présentant une séquence de bases identique à l'ADN mitochondrial de la laine
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4.12
amorce pour le yak
amorce d’ADN présentant une séquence de bases identique à l'ADN mitochondrial du yak
NOTE Des informations sur les amorces peuvent être obtenues auprès du secrétariat de l'ISO/TC 38.
4.13
migration par électrophorèse sur gel
méthode permettant de détecter les fragments d'ADN amplifié de longueur constante
5 Principe
L'ADN mitochondrial est extrait des échantillons de fibres animales à l'aide d'une réaction chimique et
enzymatique. L'ADN extrait est purifié au moyen d'une méthode de précipitation et par centrifugation. L'ADN
purifié est employé pour la réaction d'amplification de la méthode PCR. Dans la méthode PCR, des amorces
pour le cachemire, le yak et la laine sont respectivement soumises à essai. Si l'échantillon est constitué de
cachemire, seule l'amorce de cachemire permet d'amplifier le fragment d'ADN de longueur constante.
Ensuite, le fragment d'ADN de longueur constante est détecté par la méthode de migration électrophorétique.
Les fibres sont identifiées par l’observation d'amplification ou d’absence d’amplification dans les essais
effectués en utilisant successivement toutes les amorces.
6 Appareillage et équipements
6.1 Pipettes, permettant de mesurer et de prélever (0 – 20) μl (± 0,20 µl), (20 – 200) μl (± 1,60 µl), (200 –
1 000) μl (± 8 µl) dans la limite des erreurs systématiques définies dans l'ISO 8655.
6.2 Microtube, capable de supporter une centrifugation de 14 000 g et le séjour en autoclave. Des
capacités de 2 ml et de 0,2 ml sont respectivement nécessaires pour la purification et pour la méthode PCR. Il
convient que les tubes de 0,2 ml utilisés pour la méthode PCR soient conformes aux recommandations du
fabricant de la machine PCR.
6.3 Capuchon vissant, pour le microtube.
6.4 Bloc thermique, muni d'orifices pour accueillir les microtubes et capable de chauffer jusqu'à environ
80 °C (± 1,0 °C).
6.5 Agitateur secoueur, permettant de chauffer jusqu'à 50 °C et de maintenir cette température, ainsi que
d'appliquer au microtube une agitation d'environ 500 tr/min ou plus.
6.6 Agitateur, permettant d'accueillir les microtubes et de les agiter environ 500 fois/minute ou plus. Cette
machine peut être remplacée par un instrument équivalent, par exemple un agitateur rotatif à microtubes
pouvant fonctionner à 30 tr/min ou plus.
6.7 Centrifugeuse, permettant de réaliser une centrifugation à 14 000 g ou plus, de passer de 0 °C à la
température ambiante et d'accueillir des microtubes ou des unités d'ultrafiltration par centrifugation.
6.8 Unité d'ultrafiltration par centrifugation, permettant de retenir les molécules présentant une masse
moléculaire de 100 kDa (Dalton) ou plus.
NOTE Une unité de ce type est commercialisée sous le nom d'Amicon Ultra, etc.
6.9 Machine PCR, dont la température et la durée de fonctionnement sont programmables.
NOTE Une machine de ce type est commercialisée par Life Technologies Corporation. Des machines équivalentes
sont disponibles auprès d'autres fournisseurs.
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6.10 Illuminateur UV, émetteur d'UV.
6.11 Cabine photo
6.12 Contenant alimentaire en plastique
6.13 Peigne, utilisé pour former des puits dans le gel d'agarose employé dans l'essai de migration par
électrophorèse sur gel.
6.14 Broyeur, utilisé pour mélanger et homogénéiser les fibres animales.
6.15 Fiole Erlenmeyer, de capacité 200 ml.
7 Réactifs
7.1 Eau pure
L'eau pure est de l'eau de qualité 1 au sens de l'ISO 3696. Il convient qu'elle ne présente aucune activité
DNase (digestion de l'ADN), qu'elle ne contienne pas d'ADN susceptible d’être amplifié par les amorces en
quantité significative et qu'elle ne présente aucun effet inhibiteur pour cette méthode d'essai.
7.2 Réactif chloroforme/alcool isoamylique
Concentration à 100 % de la plus haute qualité.
Chloroforme 9,6 ml
Alcool isoamylique 400 l
7.3 Solution de perchlorate de sodium
Perchlorate de sodium 6,1 g
Compléter à 10 ml avec de l'eau pure.
7.4 Tris (tris(hydroxyméthyl)aminométhane) à 1 mol/l – HCl
Dissoudre 12,1 g de tris(hydroxyméthyl)aminométhane dans 800 ml d'eau pure, puis ajuster le pH à une
valeur de 8,0 en ajoutant du HCl et à l'aide du pH-mètre. Compléter ensuite à 1 000 ml avec de l'eau pure.
7.5 EDTA (acide éthylène diamine tétraacétique) à 500 mmol/l
Dissoudre 186,1 g d'EDTANa ·2H O (sel disodique dihydraté d'EDTA) dans 800 ml d'eau pure, puis ajuster
2 2
le pH à une valeur de 8,0 en ajoutant de la soude NaOH et à l'aide du pH-mètre. Compléter ensuite à
1 000 ml avec de l'eau pure.
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7.6 Solution tampon A
Tris– HCl à 1 mol/l (7.4) 5 ml
EDTA à 500 mmol/l (7.5) 2 ml
Laurylsulfate de sodium (LSS) (C H SO Na) 0,2 g
12 25 4
Saccharose 1,2 g
Chlorure de sodium 170 mg
Dithiothréitol (DTT) 920 mg
Compléter à 10 ml avec de l'eau pure.
NOTE À préparer directement avant utilisation.
7.7 Solution tampon B
Tris– HCl à 1 mol/l (7.4) 1 ml
EDTA à 500 mmol/l (7.5) 0,2 ml
Compléter à 100 ml avec de l'eau pure.
7.8 Solution enzymatique d’extraction des protéines, solution papaïnique
Dissoudre 10 unités de papaïne dans de l'eau pure (par exemple, 10 unités/20 µl).
7.9 ADN polymérase thermostable
Il convient que la polymérase ne présente pas d'activité exonucléase 3'-5'.
7.10 Fibre animale A amorce 1
Amorces sens pour le cachemire, le yak et la laine.
7.11 Fibre animale A amorce 2
Amorces anti-sens pour le cachemire, le yak et la laine.
7.12 Élément de composition de l'ADN
Substrat nucléotide de qualité adaptée à la méthode PCR.
7.13 Solution tampon pour la polymérase
Il convient que la solution tampon soit adaptée à la polymérase de la réaction PCR.
NOTE Cette solution tampon peut être conçue par les personnes réalisant la polymérase.
7.14 Sel, chlorure de potassium (KCl)
Réactif utilisé pour stabiliser la réaction PCR.
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7.15 Chlorure de magnésium
Réactif utilisé pour stabiliser la réaction PCR.
7.16 Marqueur de migration électrophorétique sur gel
Marqueur disponible dans le commerce et fragment d'ADN de longueur constante. Le marqueur est utilisé
pour identifier la longueur approximative du fragment d'ADN amplifié comprise entre 100 pb et 500 pb, par
exemple l'ADN du phage phiX174 après digestion par l'enzyme de restriction Hincll ou une échelle de 100 pb.
7.17 Agarose
Variété d'agar-agar de qualité adaptée pour la migration électrophorétique de l'ADN.
7.18 Solution tampon à charger pour la migration électrophorétique
Glycérol 36 g
EDTA à 500 mmol/l (7.5) 6 ml
Bleu de bromophénol 0,25 g
Xylène cyanol 0,25 g
Compléter à 100 ml avec de l'eau pure.
Après avoir ajouté plus de 1/6 de cette solution à la solution de réaction de l'échantillon, la charger sur le gel.
7.19 Solution tampon pour la migration électrophorétique
Tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Trizma base) 242 g
Acide acétique (acide acétique glacial) 57,1 ml
EDTA 2Na 7,43 g
Dissoudre dans de l’eau pure, en complétant à 1 l.
Ensuite
Diluer 50 fois avec de l'eau pure.
7.20 Colorant d'ADN, bromure d'éthidium
Le bromure d'éthidium se dissout dans la solution tampon pour la migration électrophorétique, à raison
d'environ 5 μg/ml.
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7.21 Fragment d'ADN commun, amorce
Les fragments d'ADN communs sont des enchaînements de bases communs à l'ADN du cachemire, du yak et
de la laine. L'amorce commune 1 et l'amorce commune 2 sont respectivement les amorces sens et anti-sens.
NOTE Des informations sur les amorces peuvent être obtenues auprès du secrétariat de l'ISO/TC 38.
8 Échantillonnage
8.1 Les échantillons de fibres animales doivent être représentatifs des produits textiles pour l'essai. Si le
produit textile est composé de plusieurs parties, séparer ces dernières en parties identiques et inclure une
description détaillée de ces parties dans le rapport d'essai. Éviter toute contamination entre les différentes
parties.
8.2 Deux éprouvettes d'essai sont prélevées sur l'échantillon. Lorsque les deux résultats ne sont pas
cohérents, ils ne doivent pas être retenus et un nouvel essai doit être effectué sur deux autres éprouvettes.
NOTE L'Annexe B (informative) de l'ISO 17751 peut servir de référence pour ce mode opératoire.
9 Méthodes d’essai
9.1 Généralités
Il convient que l'essai soit mené parallèlement pour les amorces de cachemire, de yak et de laine.
9.2 Découpage de l'échantillon
Découper 100 mg d'échantillon de fibre animale en des fragments de moins de 2 mm de longueur au moyen
de ciseaux, d'un broyeur ou de tout autre instrument. Ensuite, placer 50 mg de l'échantillon découpé dans un
microtube de 2,0 ml.
NOTE Des tubes Eppendorf ou des tubes équivalents sont disponibles dans le commerce.
9.3 Extraction de l'ADN
9.3.1 Ajouter 600 µl de la solution tampon A (7.6) dans le microtube contenant l'échantillon pour essai (9.2).
9.3.2 Fermer le microtube, puis le secouer à la main afin que l'échantillon soit entièrement plongé dans la
solution tampon.
9.3.3 Bloquer le capuchon vissant du microtube au cours du processus de chauffage. Ensuite, chauffer le
microtube contenant l'échantillon à 60 °C pendant 20 minutes en utilisant le bloc thermique. Au bout de
3 minutes, 6 minutes, 9 minutes et 15 minutes de chauffage, retirer temporairement le microtube du bloc
thermique et le secouer à la main durant environ 10 secondes, avant de l’y replacer et de poursuivre le
chauffage jusqu'à ce que 20 minutes se soient écoulées.
9.3.4 Au bout de 20 minutes, retirer le microtube du bloc thermique et le refroidir à la température
ambiante.
9.3.5 Ajouter 10 unités de la solution papaïnique (7.8) dans le microtube contenant l'échantillon. Ensuite,
chauffer le microtube à 50 °C, le maintenir à cette température et procéder à son agitation à 500 tr/min
pendant 1 heure dans l'agitateur secoueur (6.5).
9.3.6 Ajouter 10 unités de la solution papaïnique (7.8) dans le microtube décrit en 9.3.5 et le maintenir à
50 °C. Procéder à son agitation à 500 tr/min pendant plus de 12 heures. Une durée d’agitation de plus de
12 heures est acceptable. Refroidir à la température ambiante.
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9.4 Purification de l'ADN
9.4.1 Ajouter 300 µl de la solution de perchlorate de sodium (7.3) au microtube décrit en 9.3.6. Ensuite,
procéder à son agitation à 500 tr/min pendant 10 minutes dans l'agitateur (6.6).
9.4.2 Ajouter 300 µl de chloroforme/alcool isoamylique (7.2) au microtube décrit en 9.4.1. Secouer à la
main pendant 10 secondes environ. Ensuite, procéder à son agitation pendant 10 minutes au moyen de
l'agitateur (6.6) (par exemple, à 500 tr/min pour un agitateur rotatif ou à 100 tr/min pour un agitateur alternatif)
ou d'un instrument équivalent (par exemple, à 30 tr/min pour un agitateur rotatif vertical) afin que le contenu
soit bien mélangé. La solution devient claire.
9.4.3 Centrifuger le microtube décrit en 9.4.2 à 3 300 g pendant 1 minute à température ambiante. Ensuite,
prélever 500 µl de la solution surnageante à l'aide d'une pipette (6.1) et placer ce prélèvement dans un
microtube neuf.
9.4.4 Ajouter 500 µl de chloroforme/alcool isoamylique (7.2) au microtube décrit en 9.4.3. Secouer à la
main pendant 10 secondes environ. Ensuite, procéder à son agitation pendant 10 minutes au moyen de
l'agitateur (6.6) ou d'un instrument équivalent afin que le contenu soit bien mélangé. La solution devient claire.
9.4.5 Centrifuger le microtube décrit en 9.4.4 à 5 500 g pendant 1 minute à température ambiante. Ensuite,
prélever 400 µl de la solution surnageante à l'aide d'une pipette (6.1) et placer ce prélèvement dans un
microtube neuf.
9.4.6 Centrifuger le microtube décrit en 9.4.5 à 13 000 g pendant 7 minutes à une température de 4 °C.
Ensuite, placer 350 μl de la solution surnageante dans l'unité d'ultrafiltration par centrifugation. Fixer un autre
microtube neuf sous l'unité.
9.4.7 Centrifuger l'unité d'ultrafiltration par centrifugation contenant la solution surnageante à 14 000 g
pendant 12 minutes à une température de 4 °C.
La solution d'ADN concentré est filtrée sur la membrane filtrante.
Évacuer la solution filtrée, traitée comme solution résiduelle.
9.4.8 Fixer de nouveau le microtube décrit en 9.4.7 à l'unité de filtration.
9.4.9 Ajouter 450 µl de la solution tampon B (7.7) dans l'unité d'ultrafiltration par centrifugation, à l'endroit
où la solution d'ADN concentré est restée. Ensuite, centrifuger l'unité à 14 000 g pendant 10 minutes à une
température de 4 °C. Évacuer la solution filtrée, traitée comme solution résiduelle.
9.4.10 ARépéter les modes opératoires de 9.4.8 et 9.4.9 au moins deux fois pour purifier l'ADN.
9.4.11 Ajouter 20 µl de la solution tampon B (7.7) dans l'unité, à l'endroit où la solution d'ADN concentré est
restée.
9.4.12 Fixer un microtube neuf, à l'envers, sur la partie supérieure de l'unité d'ultrafiltration par centrifugation.
9.4.13 Retourner l'unité et la redresser, puis la centrifuger à 1 000 g pendant 2 minutes à une température
de 4 °C. Enfin, collecter la solution d'ADN purifié.
Cette solution d'ADN purifié est utilisée pour l'essai de l'ADN ci-après et est appelée l'éprouvette d'ADN.
NOTE En cas d'essai sur des fibres animales teintées avec des pigments sombres, il se peut que des inhibiteurs de
la PCR demeurent. Dans ce cas, il peut s'avérer utile d'appliquer la méthode de purification complémentaire décrite à
l'Annexe B.
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9.5 Amplification de l'ADN
9.5.1 Composition de la solution de réaction
La solution de réaction pour l'animal A est composée comme suit :
Éprouvette d'ADN (9.4.12) 2 μl
ADN polymérase thermostable (7.9) 1 – 1,5 unité
Animal A, Amorce 1 (7.10) 1 μmol/l
Animal A, Amorce 2 (7.11) 1 μmol/l
Amorce commune 1 pour vérification (7.21) 0,5 μmol/l
Amorce commune 2 pour vérification (7.21) 0,5 μmol/l
Substrat nucléotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP (7.12) 200 μmol/l chacun
Solution tampon pour la polymérase (7.13) quantité définie par les fournisseurs
Sel, chlorure de potassium KCl 50 mmol/l
Sel, chlorure de magnésium MgCl 1,5 mmol
2
Eau pure compléter jusqu'à un volume total de 50 μl
9.5.2 Paramètres de la machine d'amplification PCR pour l'amplification de l'ADN
Les paramètres de la machine d'amplification PCR sont présentés dans le Tableau 1.
Tableau 1 — Paramètres de la machine PCR
Élément Durée/température Nombre de cycles
Initiation de la PCR 5 – 10 min / 95 °C 1
Amplification 30 s / 95 °C 35
30 s / 60-68 °C*
30 s / 72 °C
Extension finale 3 – 7 min / 72 °C 1
Conservation Pas de limite de temps / 4 °C 1
* La température pour l'amplification PCR dépend de la conception des amorces. Il convient que cette
température soit adaptée à l'amorce à utiliser.
9.5.3 Méthode d'essai d'amplification de l'ADN
9.5.3.1 Placer les réactifs dans un microtube pour PCR en utilisant des micropipettes conformément
à 9.5.1 et compléter à 50 µl avec de l'eau pure.
9.5.3.2 Introduire le microtube dans la machine d'amplification PCR et lancer le mode opératoire
d'amplification selon les paramètres présentés dans le Tableau 1 de 9.5.2.
9.5.3.3 Exécuter jusqu'à 35 cycles d'amplification.
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9.5.3.4 Lorsque le cycle de réactions est terminé, retirer le microtube de la machine d'amplification PCR
et le conserver au réfrigérateur à 4 °C jusqu'à l'exécution du mode opératoire suivant.
9.6 Détection et confirmation de l'amplification d'ADN
9.6.1 Préparation
9.6.1.1 Placer 0,9 g d'agarose dans la fiole Erlenmeyer. Ensuite, ajouter 60 ml de la solution tampon
pour la migration électrophorétique (7.19) dans la fiole. Faire fondre complètement l'agarose par chauffage.
Verser l'agarose fondu dans un récipient à gel et placer un peigne dans le gel. Laisser le récipient à
température ambiante durant au moins 30 minutes afin que le gel se solidifie.
9.6.1.2 Retirer le peigne délicatement afin de laisser apparaître les puits créés dans le gel.
...
Questions, Comments and Discussion
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