ISO 15216-1:2017
(Main)Microbiology of the food chain — Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus using real-time RT-PCR — Part 1: Method for quantification
Microbiology of the food chain — Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus using real-time RT-PCR — Part 1: Method for quantification
ISO 15216-1:2017 specifies a method for the quantification of levels of HAV and norovirus genogroup I (GI) and II (GII) RNA, from test samples of foodstuffs (soft fruit, leaf, stem and bulb vegetables, bottled water, BMS) or food surfaces. Following liberation of viruses from the test sample, viral RNA is then extracted by lysis with guanidine thiocyanate and adsorption on silica. Target sequences within the viral RNA are amplified and detected by real-time RT-PCR. This method is not validated for detection of the target viruses in other foodstuffs (including multi-component foodstuffs), or any other matrices, nor for the detection of other viruses in foodstuffs, food surfaces or other matrices.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour la recherche des virus de l'hépatite A et norovirus par la technique RT-PCR en temps réel — Partie 1: Méthode de quantification
ISO 15216-1:2017 décrit une méthode de quantification des niveaux d'ARN de VHA et norovirus des génogroupes I (GI) et II (GII) présents dans des échantillons pour essai d'aliments (fruits tendres, légumes feuilles, tiges et bulbes, eau embouteillée, MBV) ou sur des surfaces alimentaires. Après libération des virus contenus dans l'échantillon pour essai, l'ARN viral est extrait par lyse à l'aide de thiocyanate de guanidine et par adsorption sur silice. Les séquences cibles de l'ARN viral sont amplifiées et détectées par la technique RT-PCR en temps réel. Cette méthode n'est pas validée pour la détection des virus ciblés dans d'autres aliments (y compris les aliments à plusieurs composants) ou d'autres matrices, ni pour la détection d'autres virus dans les aliments, sur les surfaces alimentaires ou dans d'autres matrices.
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Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 15216-1
First edition
2017-03
Microbiology of the food chain —
Horizontal method for determination
of hepatitis A virus and norovirus
using real-time RT-PCR —
Part 1:
Method for quantification
Microbiologie dans la chaîne alimentaire — Méthode horizontale
pour la recherche des virus de l’hépatite A et norovirus par la
technique RT-PCR en temps réel —
Partie 1: Méthode de quantification
Reference number
ISO 15216-1:2017(E)
©
ISO 2017
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ISO 15216-1:2017(E)
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ISO 15216-1:2017(E)
Contents Page
Foreword .v
Introduction .vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 3
4.1 Virus extraction . 3
4.2 RNA extraction . 4
4.3 Real-time RT-PCR . 4
4.4 Control materials . 4
4.4.1 Process control virus . 4
4.4.2 Double-stranded DNA (dsDNA) control . 4
4.4.3 EC RNA control . 4
4.5 Test results. 5
5 Reagents . 5
5.1 General . 5
5.2 Reagents used as supplied . 5
5.3 Prepared reagents . 6
6 Equipment and consumables . 7
7 Sampling . 9
8 Procedure. 9
8.1 General laboratory requirements . 9
8.2 Virus extraction . 9
8.2.1 Process control virus material . 9
8.2.2 Negative process control . 9
8.2.3 Food surfaces . 9
8.2.4 Soft fruit, leaf, stem and bulb vegetables . 9
8.2.5 Bottled water .10
8.2.6 Bivalve molluscan shellfish .11
8.3 RNA extraction .11
8.4 Real-time RT-PCR .12
8.4.1 General requirements .12
8.4.2 Real-time RT-PCR analysis .12
9 Interpretation of results .14
9.1 General .14
9.2 Construction of standard curves .14
9.3 Calculation of RT-PCR inhibition .15
9.4 Calculation of extraction efficiency .15
9.5 Sample quantification .16
10 Expression of results .17
11 Precision .17
11.1 Interlaboratory study .17
11.2 Repeatability .17
11.3 Reproducibility limit .18
12 Test report .18
Annex A (normative) Diagram of procedure .19
Annex B (normative) Composition and preparation of reagents and buffers .20
Annex C (informative) Real-time RT-PCR mastermixes and cycling parameters .23
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ISO 15216-1:2017(E)
Annex D (informative) Real-time RT-PCR primers and hydrolysis probes for the detection of
HAV, norovirus GI and GII and mengo virus (process control) .24
Annex E (informative) Growth of mengo virus strain MC for use as a process control .27
0
®
Annex F (informative) RNA extraction using the NucliSENS system .28
Annex G (informative) Generation of dsDNA control stocks .30
Annex H (informative) Generation of EC RNA stocks .33
Annex I (informative) Typical optical plate layout.35
Annex J (informative) Method validation studies and performance characteristics .37
Bibliography .48
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ISO 15216-1:2017(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following
URL: w w w . i s o .org/ iso/ foreword .html.
This document was prepared by the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 275, in collaboration with ISO Technical Committee ISO/TC 34, Food products,
Subcommittee SC 9, Microbiology, in accordance with the agreement on technical cooperation between
ISO and CEN (Vienna Agreement).
This first edition cancels and replaces ISO/TS 15216-1:2013, which has been technically revised with
the following changes:
— use of linear dsDNA molecules for quantification prescribed;
— use of a suitable buffer for dilution of control materials prescribed;
— change to the method for generating process control virus RNA for the standard curve;
— addition of breakpoints with defined temperature and time parameters in the extraction methods;
— change in terminology from amplification efficiency to RT-PCR inhibition;
— addition of extra real-time RT-PCR reactions for negative controls;
— addition of precision data and results of interlaboratory study.
A list of all parts in the ISO 15216 series can be found on the ISO website.
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ISO 15216-1:2017(E)
Introduction
Hepatitis A virus (HAV) and norovirus are important agents of food-borne human viral illness. No
routine methods exist for culture of norovirus, and HAV culture methods are not appropriate for routine
application to food matrices. Detection is therefore reliant on molecular methods using the reverse-
transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). As many food matrices contain substances that
are inhibitory to RT-PCR, it is necessary to use an extraction method that produces highly clean RNA
preparations that are fit for purpose. For food surfaces, viruses are removed by swabbing. For soft fruit,
leaf, stem and bulb vegetables, virus extraction is by elution with agitation followed by precipitation
with PEG/NaCl. For bottled water, adsorption and elution using positively charged membranes followed
by concentration by ultrafiltration is used and for bivalve molluscan shellfish (BMS), viruses are
extracted from the tissues of the digestive glands using treatment with a proteinase K solution. For all
matrices that are not covered by this document, it is necessary to validate this method. All matrices
share a common RNA extraction method based on virus capsid disruption with chaotropic reagents
followed by adsorption of RNA to silica particles. Real-time RT-PCR monitors amplification throughout
the real-time RT-PCR cycle by measuring the excitation of fluorescently labelled molecules. In real-
time RT-PCR with hydrolysis probes, the fluorescent label is attached to a sequence-specific nucleotide
probe that also enables simultaneous confirmation of target template. These modifications increase
the sensitivity and specificity of the real-time RT-PCR method, and obviate the need for additional
amplification product confirmation steps post real-time RT-PCR. Due to the complexity of the method,
it is necessary to include a comprehensive suite of controls. The method described in this document
enables quantification of levels of virus RNA in the test sample. A schematic diagram of the testing
procedure is shown in Annex A.
The main changes, listed in the Foreword, introduced in this document compared to ISO/TS 15216-
1:2013 are considered as minor (see ISO 17468).
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 15216-1:2017(E)
Microbiology of the food chain — Horizontal method for
determination of hepatitis A virus and norovirus using
real-time RT-PCR —
Part 1:
Method for quantification
1 Scope
This document specifies a method for the quantification of levels of HAV and norovirus genogroup I
(GI) and II (GII) RNA, from test samples of foodstuffs (soft fruit, leaf, stem and bulb vegetables, bottled
water, BMS) or food surfaces. Following liberation of viruses from the test sample, viral RNA is then
extracted by lysis with guanidine thiocyanate and adsorption on silica. Target sequences within the
viral RNA are amplified and detected by real-time RT-PCR.
This method is not validated for detection of the target viruses in other foodstuffs (including multi-
component foodstuffs), or any other matrices, nor for the detection of other viruses in foodstuffs, food
surfaces or other matrices.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
ISO 20838, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the
detection of food-borne pathogens — Requirements for amplification and detection for qualitative methods
ISO 22119, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Real-time polymerase chain reaction (PCR) for
the detection of food-borne pathogens — General requirements and definitions
ISO 22174, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the
detection of food-borne pathogens — General requirements and definitions
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 22174, ISO 22119 and
ISO 20838 and the following apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: available at http:// www .iso .org/ obp
3.1
foodstuff
substance used or prepared for use as food
Note 1 to entry: For the purposes of this document, this definition includes bottled water.
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ISO 15216-1:2017(E)
3.2
food surface
surface of food, food preparation surface or food contact surface
3.3
soft fruit
small edible stoneless fruit
EXAMPLE Strawberries, raspberries or currants
3.4
leaf, stem and bulb vegetables
leaves, stems and bulbs of plants, eaten as a vegetable
3.5
hepatitis A virus
HAV
member of the Picornaviridae family responsible for infectious hepatitis
Note 1 to entry: Genetically, HAV can be subdivided into six genotypes on the basis of the VP1/2A region
(genotypes 1, 2, and 3 have been found in humans, while genotypes 4, 5, and 6 are of simian origin). There is only
one serotype.
Note 2 to entry: Transmission occurs via the faecal-oral route by person-to-person contact, through the
consumption of contaminated foodstuffs, contact with contaminated water or food surfaces, or contact with
contaminated fomites. HAV is classified as a group 2 biological agent by the European Union and as a risk group 2
human aetiological agent by the United States National Institutes of Health.
3.6
norovirus
member of the Caliciviridae family responsible for sporadic cases and outbreaks of acute gastroenteritis
Note 1 to entry: Genetically, norovirus can be subdivided into seven separate genogroups. Three of these
genogroups, GI, GII and GIV have been implicated in human gastrointestinal disease. GI and GII are responsible
for the vast majority of clinical cases.
Note 2 to entry: Transmission occurs via the faecal-oral route by person-to-person contact, through the
consumption of contaminated foodstuffs or through contact with contaminated water or food surfaces or contact
with contaminated fomites. GI and GII noroviruses are classified as group 2 biological agents by the European
Union and as risk group 2 human aetiological agents by the United States National Institutes of Health.
3.7
quantification of HAV
estimation of number of copies of HAV RNA in a predetermined mass or volume of foodstuff, or area of
food surface
3.8
quantification of norovirus
estimation of number of copies of norovirus RNA in a predetermined mass or volume of foodstuff, or
area of food surface
3.9
process control virus
virus added to the sample portion at the earliest opportunity prior to virus extraction to control for
extraction efficiency
3.10
process control virus RNA
RNA extracted from the process control virus in order to produce standard curve data for the estimation
of extraction efficiency
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ISO 15216-1:2017(E)
3.11
negative RNA extraction control
control free of target RNA carried through all steps of the RNA extraction and detection procedure to
monitor any contamination events
3.12
negative process control
target pathogen-free sample of the food matrix, or target pathogen-free non-matrix sample, that is run
through all stages of the analytical process
3.13
hydrolysis probe
fluorescent probe coupled with a fluorescent reporter molecule and a quencher molecule, which are
sterically separated by the 5′-3′-exonuclease activity of the enzyme during the amplification process
3.14
negative real-time RT-PCR control
aliquot of highly pure water used in a real-time RT-PCR reaction to control for contamination in the
real-time RT-PCR reagents
3.15
external control RNA
EC RNA
reference RNA that can be used to assess inhibition of amplification for the real-time RT-PCR assay of
relevance by being added in a defined amount to an aliquot of sample RNA in a separate reaction
EXAMPLE RNA synthesized by in-vitro transcription from a plasmid carrying a copy of the target gene
3.16
C value
q
quantification cycle; the cycle at which the target is quantified in a given real-time RT-PCR reaction
Note 1 to entry: This corresponds to the point at which reaction fluorescence rises above a threshold level.
3.17
limit of detection
LOD
lowest concentration of target in a test sample that can be reproducibly detected (95 % confidence
interval) under the experimental conditions specified in the method
Note 1 to entry: The LOD is related to the test portion and the quality of the template RNA.
3.18
limit of quantification
LOQ
lowest concentration of target in a test sample that can be quantitatively determined with acceptable
level of precision and accuracy under the experimental conditions specified in the method
Note 1 to entry: The LOQ is related to the test portion and the quality of the template RNA.
4 Principle
4.1 Virus extraction
The foodstuffs and food surfaces covered by this document are often highly complex matrices and
the target viruses can be present at low concentrations. It is therefore necessary to carry out matrix-
specific virus extraction and/or concentration in order to provide a substrate for subsequent common
parts of the process. The choice of method depends upon the matrix.
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ISO 15216-1:2017(E)
4.2 RNA extraction
It is necessary to extract RNA using a method that yields RNA preparations of suitable purity to reduce
the effect of RT-PCR inhibitors. In this document the chaotropic agent guanidine thiocyanate is used to
disrupt the viral capsid. RNA is then adsorbed to silica to assist purification through several washing
stages. Purified viral RNA is released from the silica into a buffer prior to real-time RT-PCR.
4.3 Real-time RT-PCR
This document uses one step real-time RT-PCR using hydrolysis probes. In one step real-time RT-PCR,
reverse transcription and PCR amplification are carried out consecutively in the same tube.
Real-time RT-PCR using hydrolysis probes utilizes a short DNA probe with a fluorescent label and a
fluorescence quencher attached at opposite ends. The assay chemistry ensures that as the quantity of
amplified product increases, the probe is hydrolysed and the fluorescent signal from the label increases
proportionately. Fluorescence can be measured at each stage throughout the cycle. The first cycle in the
real-time RT-PCR at which amplification can be detected for any reaction is proportional to the quantity
of template; therefore, analysis of the fluorescence plots enables determination of the concentration of
target sequence in the sample.
Due to the low levels of virus template often present in foodstuffs or food surfaces and the strain
diversity in the target viruses, selection of fit-for-purpose one step real-time RT-PCR reagents and PCR
primers and hydrolysis probes for the target viruses is important. Guidelines for their selection are
given in 5.2.18 and 5.2.19. Illustrative details of reagents, primers, and probes (used in the development
of this document) are provided in Annexes C and D.
4.4 Control materials
4.4.1 Process control virus
Losses of target virus can occur at several stages during sample virus extraction and RNA extraction.
To account for these losses, samples are spiked at the earliest opportunity prior to virus extraction
with a defined amount of a process control virus. The level of recovery of the process control virus shall
be determined for each sample.
The virus selected for use as a process control shall be a culturable non-enveloped positive-sense
ssRNA virus of a similar size to the target viruses to provide a good morphological and physicochemical
model. The process control virus shall exhibit similar persistence in the environment to the targets.
The virus shall be sufficiently distinct genetically from the target viruses that real-time RT-PCR assays
for the target and process control viruses do not cross-react, and shall not normally be expected to
occur naturally in the foodstuffs or food surfaces under test.
An example of the preparation of process control virus (used in the development of this document) is
provided in Annex E.
4.4.2 Double-stranded DNA (dsDNA) control
For quantification of a target virus, results shall be related to a standard of known concentration. A
dilution series of linear dsDNA carrying the target sequence of interest (5.3.11) and quantified using
an appropriate method, e.g. spectrophotometry, fluorimetry, digital PCR etc. shall be used to produce a
standard curve in template copies per microlitre. Reference to the standard curve enables quantification
of the sample RNA in detectable virus genome copies per microlitre.
4.4.3 EC RNA control
Many food matrices contain substances inhibitory to RT-PCR, and there is also a possibility of carryover
of further inhibitory substances from upstream processing. In order to control for RT-PCR inhibition in
individual samples, EC RNA (an RNA species carrying the target sequence of interest, 5.3.12) is added
4 © ISO 2017 – All rights reserved
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ISO 15216-1:2017(E)
to an aliquot of sample RNA and tested using the real-time RT-PCR method. Comparison of the results of
this with the results of EC RNA in the absence of sample RNA enables determination of the level of RT-
PCR inhibition in each sample under test.
Alternative approaches for the assessment of inhibition of RT-PCR that can be demonstrated to provide
equivalent performance to the use of EC RNA control are permitted.
4.5 Test results
This method provides a result expressed in detectable virus genome copies per millilitre, per gram
or per square centimetre. In samples where virus is not detected, results shall be reported as “not
detected;
is the LOD for the sample.
5 Reagents
5.1 General
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified.
Follow current labor
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 15216-1
Première édition
2017-03
Microbiologie dans la chaîne
alimentaire — Méthode horizontale
pour la recherche des virus de
l’hépatite A et norovirus par la
technique RT-PCR en temps réel —
Partie 1:
Méthode de quantification
Microbiology of the food chain — Horizontal method for determination
of hepatitis A virus and norovirus using real-time RT-PCR —
Part 1: Method for quantification
Numéro de référence
ISO 15216-1:2017(F)
©
ISO 2017
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ISO 15216-1:2017(F)
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sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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ii © ISO 2017 – Tous droits réservés
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ISO 15216-1:2017(F)
Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 4
4.1 Extraction de virus . 4
4.2 Extraction d’ARN . 4
4.3 RT-PCR en temps réel . 4
4.4 Témoins . 4
4.4.1 Virus témoin d’extraction . 4
4.4.2 Contrôle ADN double brin (ADNdb) . 5
4.4.3 Contrôle ARN CE . 5
4.5 Résultats des essais . 5
5 Réactifs . 5
5.1 Généralités . 5
5.2 Réactifs utilisés dans l’état . 5
5.3 Réactifs préparés . 6
6 Matériel et consommables . 8
7 Échantillonnage . 9
8 Mode opératoire. 9
8.1 Exigences générales de laboratoire . 9
8.2 Extraction de virus . 9
8.2.1 Virus témoin d’extraction .10
8.2.2 Témoin négatif de processus .10
8.2.3 Surfaces alimentaires . .10
8.2.4 Fruits tendres, légumes feuilles, tiges ou bulbes.10
8.2.5 Eau embouteillée .11
8.2.6 Mollusques bivalves .12
8.3 Extraction d’ARN .12
8.4 RT-PCR en temps réel .13
8.4.1 Exigences générales .13
8.4.2 Analyse de RT-PCR en temps réel .13
9 Interprétation des résultats .15
9.1 Généralités .15
9.2 Élaboration des courbes étalons .15
9.3 Calcul de l’inhibition de la réaction RT-PCR .16
9.4 Calcul du rendement d’extraction .16
9.5 Quantification d’échantillon .17
10 Expression des résultats.18
11 Fidélité .18
11.1 Études interlaboratoires .18
11.2 Répétabilité .18
11.3 Limite de reproductibilité .19
12 Rapport d’essai .19
Annexe A (normative) Diagramme de mode opératoire.20
Annexe B (normative) Composition et préparation des réactifs et des tampons .21
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ISO 15216-1:2017(F)
Annexe C (informative) Mélanges réactionnels (MasterMix) pour la RT-PCR en temps réel et
paramètres de cycles .24
Annexe D (informative) Amorces et sondes d’hydrolyse de la RT-PCR en temps réel pour la
détection du VHA, du norovirus GI et GII et du mengovirus (témoin d’extraction) .25
Annexe E (informative) Multiplication de la souche MC du mengovirus utilisée comme
0
témoin d’extraction .28
®
Annexe F (informative) Extraction d’ARN avec le système NucliSENS .29
Annexe G (informative) Préparation des contrôles ADNdb .31
Annexe H (informative) Préparation des ARN CE .34
Annexe I (informative) Disposition de plaque optique type .36
Annexe J (informative) Études de validation des méthodes et caractéristiques de performance .38
Bibliographie .49
iv © ISO 2017 – Tous droits réservés
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ISO 15216-1:2017(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: w w w . i s o .org/ iso/ fr/ avant -propos .html
Le présent document a été élaboré par le comité européen de normalisation (CEN), comité technique
CEN/TC 275, en collaboration avec le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 9, Microbiologie, conformément à l’accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN
(Accord de Vienne).
Cette première édition annule et remplace l’ISO/TS 15216-1:2013, qui a fait l’objet d’une révision
technique avec les modifications suivantes:
— l’utilisation de molécules d’ADNdb linéaire pour la quantification prescrite;
— l’utilisation d’un tampon adéquat pour la dilution des matériaux de contrôle prescrite;
— la modification de la méthode utilisée pour générer l’ARN viral témoin pour la courbe étalon;
— l’addition de points de rupture avec des paramètres définis de température et de temps dans les
méthodes d’extraction;
— la modification de la terminologie de rendement d’amplification en inhibition de la RT-PCR;
— l’addition de réactions de RT-PCR en temps réel supplémentaires pour les témoins négatifs;
— l’addition de données relatives à la fidélité et des résultats de l’étude interlaboratoires.
La liste de toutes les parties de la série de normes ISO 15216 est fournie sur le site web de l’ISO website.
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ISO 15216-1:2017(F)
Introduction
Le virus de l’hépatite A (VHA) et les norovirus sont des agents fréquemment impliqués dans des
maladies virales d’origine alimentaire, chez l’humain. Aucune méthode de routine n’existe pour la
culture des norovirus et les méthodes de culture du VHA ne sont pas adaptées à une application en
routine aux matrices alimentaires. La détection dépend ainsi des méthodes moléculaires qui utilisent
une transcription inverse suivie d’une réaction de polymérisation en chaîne (RT-PCR). Étant donné que
de nombreuses matrices alimentaires contiennent des substances inhibitrices de la technique RT-PCR,
il est nécessaire d’utiliser une méthode d’extraction produisant des préparations d’ARN extrêmement
pures et prêtes à l’emploi. En ce qui concerne les surfaces alimentaires, les virus sont prélevés par
écouvillonnage. L’extraction de virus dans les fruits tendres, et les légumes feuilles, tiges et bulbes,
s’effectue par élution sous agitation suivie d’une précipitation au PEG/NaCI. Pour l’eau embouteillée,
une adsorption et une élution utilisant des membranes chargées positivement, suivies d’une étape de
concentration par ultrafiltration sont utilisées et les virus des mollusques bivalves (MBV) sont extraits
des tissus digestifs par traitement avec une solution de protéinase K. Pour toutes les matrices qui ne
sont pas couvertes par le présent documente, il est nécessaire de valider cette méthode. La méthode
d’extraction d’ARN, commune à toutes les matrices, est basée sur la lyse de la capside du virus par
des réactifs chaotropiques, suivie d’une adsorption de l’ARN sur des particules de silice. La technique
de RT-PCR en temps réel permet de suivre l’amplification tout au long des cycles de RT-PCR en temps
réel en mesurant l’excitation de molécules marquées par fluorescence. Lors d’une RT-PCR en temps réel
utilisant une sonde d’hydrolyse, le composé fluorescent est fixé à une sonde nucléotidique propre à une
séquence (sonde d’hydrolyse), ce qui permet aussi une confirmation simultanée de la présence de la
séquence cible. Ces modifications augmentent la sensibilité et la spécificité de la méthode RT-PCR en
temps réel, et rendent alors inutiles les étapes de confirmation post RT-PCR du produit amplifié. En
raison de la complexité de la méthode, il est nécessaire d’inclure une série exhaustive de témoins. La
méthode décrite dans le présent document permet une quantification des ARN viraux dans l’échantillon
pour essai. L’Annexe A présente un diagramme de mode opératoire.
Les principales modifications, énumérées dans l’Avant-propos, introduites dans le présent document
par rapport à l’ISO/TS 15216-1:2013 sont considérées comme mineures (voir l’ISO 17468).
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NORME INTERNATIONALE ISO 15216-1:2017(F)
Microbiologie dans la chaîne alimentaire — Méthode
horizontale pour la recherche des virus de l’hépatite A et
norovirus par la technique RT-PCR en temps réel —
Partie 1:
Méthode de quantification
1 Domaine d’application
Le présent document décrit une méthode de quantification des niveaux d’ARN de VHA et norovirus
des génogroupes I (GI) et II (GII) présents dans des échantillons pour essai d’aliments (fruits tendres,
légumes feuilles, tiges et bulbes, eau embouteillée, MBV) ou sur des surfaces alimentaires. Après
libération des virus contenus dans l’échantillon pour essai, l’ARN viral est extrait par lyse à l’aide
de thiocyanate de guanidine et par adsorption sur silice. Les séquences cibles de l’ARN viral sont
amplifiées et détectées par la technique RT-PCR en temps réel.
Cette méthode n’est pas validée pour la détection des virus ciblés dans d’autres aliments (y compris
les aliments à plusieurs composants) ou d’autres matrices, ni pour la détection d’autres virus dans les
aliments, sur les surfaces alimentaires ou dans d’autres matrices.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 7218, Microbiologie — Directives générales pour les examens microbiologiques
ISO 20838, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection des
micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences relatives à l’amplification et à la détection
pour les méthodes qualitatives
ISO 22119, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) en temps réel pour la
détection des micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions
ISO 22174, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la recherche de
micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l’ISO 22174, l’ISO 22119 et
l’ISO 20838 ainsi que les suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http:// www .iso .org/ obp
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ISO 15216-1:2017(F)
3.1
aliment
substance utilisée ou préparée pour être utilisée comme aliment
Note 1 à l’article: Pour les besoins du présent document, cette définition inclut l’eau embouteillée.
3.2
surface alimentaire
surface des aliments, surface de préparation des aliments ou surface en contact avec les aliments
3.3
fruit tendre
petit fruit comestible sans noyau
EXEMPLE Fraises, framboises ou groseilles
3.4
légumes feuilles, tiges ou bulbes
feuilles, tiges et bulbes de plantes consommés en tant que légumes
3.5
virus de l’hépatite A
VHA
membre de la famille des Picornaviridae, responsable d’hépatite infectieuse
Note 1 à l’article: Génétiquement, le VHA peut être subdivisé en six génotypes sur la base de région VP1/2A
(des génotypes 1, 2 et 3 ont été trouvés chez les humains alors que les génotypes 4, 5 et 6 sont d’origine simienne).
Il n’existe qu’un sérotype.
Note 2 à l’article: La transmission se fait par voie féco-orale de personne à personne, par la consommation
d’aliments contaminés, au contact avec de l’eau ou des surfaces alimentaires contaminées, ou bien par le contact
avec des matières contaminées. Le VHA est classé comme étant un agent biologique de groupe 2 par l’Union
européenne et un agent pathogène du groupe de risque 2 selon les United States National Institutes of Health.
3.6
norovirus
membre de la famille des Caliciviridae, responsable de cas sporadiques et d’épidémies de
gastroentérites aiguës
Note 1 à l’article: Génétiquement, les norovirus peuvent être subdivisés en sept génogroupes distincts. Trois de
ces génogroupes, GI, GII et GIV ont été impliqués dans des troubles gastro-intestinaux chez l’homme. GI et GII
sont responsables de la grande majorité des cas cliniques.
Note 2 à l’article: La transmission se fait par voie féco-orale de personne à personne, par la consommation
d’aliments contaminés, au contact avec de l’eau ou des surfaces alimentaires contaminées, ou bien par le contact
avec des matières contaminées. Les norovirus des GI et GII sont classés comme étant des agents biologiques de
groupe 2 par l’Union européenne et des agents pathogènes du groupe de risque 2 selon les United States National
Institutes of Health.
3.7
quantification du VHA
estimation du nombre de copies de l’ARN du VHA dans un rapport masse ou volume prédéterminé
d’aliments, ou sur une superficie de surface alimentaire
3.8
quantification des norovirus
estimation du nombre de copies de l’ARN du norovirus dans un rapport masse ou volume prédéterminé
d’aliments, ou sur une superficie de surface alimentaire
3.9
virus témoin d’extraction
virus ajouté à la prise d’essai, avant de commencer l’extraction du virus, afin de contrôler le rendement
d’extraction
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3.10
ARN viral témoin d’extraction
ARN extrait du virus témoin d’extraction permettant d’établir une courbe étalon en vue de l’estimation
du rendement d’extraction
3.11
témoin négatif d’extraction d’ARN
témoin sans ARN cible soumis à toutes les étapes du mode opératoire d’extraction d’ARN et de détection
permettant de s’assurer de l’absence de contamination
3.12
témoin négatif de processus
échantillon de la matrice d’aliment sans agent pathogène cible, ou échantillon n’appartenant pas à la
matrice sans agent pathogène cible, qui est soumis à toutes les étapes du processus d’analyse
3.13
sonde d’hydrolyse
sonde fluorescente couplée à une molécule fluorescente et une molécule quencher qui sont séparées de
façon stérique par l’activité d’exonucléase en 5’-3’ de l’enzyme pendant le processus d’amplification
3.14
témoin négatif de RT-PCR en temps réel
aliquote d’eau très pure utilisée dans une réaction RT-PCR en temps réel permettant de s’assurer de la
non-contamination des réactifs de RT-PCR en temps réel
3.15
ARN contrôle externe
ARN CE
ARN de référence pouvant être utilisé pour évaluer l’inhibition de l’amplification dans la réaction RT-
PCR en temps réel appropriée, qui est ajouté à une aliquote d’ARN de l’échantillon selon une quantité
donnée dans une réaction distincte
EXEMPLE ARN synthétisé par une transcription in vitro à partir d’un plasmide portant une copie du gène cible
3.16
Valeur
C
q
cycle de quantification correspondant au moment réactionnel où la cible est quantifiée pour une
réaction donnée de PCR en temps réel
Note 1 à l’article: Cela correspond au point auquel la réaction de fluorescence dépasse un niveau seuil.
3.17
limite de détection
LOD
plus petite concentration de cible dans un échantillon pouvant être détectée de façon reproductible
(intervalle de confiance de 95 %) dans les conditions expérimentales spécifiées dans la méthode
Note 1 à l’article: La LOD dépend de la prise d’échantillon et de la qualité de l’ARN initial.
3.18
limite de quantification
LOQ
plus petite concentration de cible dans un échantillon pouvant être déterminée de façon quantitative
avec un niveau acceptable de fidélité et d’exactitude dans les conditions expérimentales spécifiées dans
la méthode
Note 1 à l’article: La LOQ dépend de la prise d’échantillon et de la qualité de l’ARN initial.
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4 Principe
4.1 Extraction de virus
Les aliments et les surfaces alimentaires couverts par le présent document sont souvent des matrices
hautement complexes et les virus cibles peuvent être présents à de faibles concentrations. Il est donc
nécessaire d’effectuer une extraction et/ou une concentration du virus propre à la matrice afin de
produire un substrat pour les parties communes ultérieures du processus. Le choix de la méthode
dépend de la matrice.
4.2 Extraction d’ARN
Il est nécessaire d’extraire l’ARN par une méthode permettant d’obtenir des préparations d’ARN de
pureté appropriée afin de réduire les effets des inhibiteurs de RT-PCR. Dans le présent document, le
thiocyanate de guanidine, réactif chaotropique, est utilisé pour la lyse de la capside virale. L’ARN est
ensuite adsorbé sur de la silice afin de faciliter la purification au travers de plusieurs étapes de lavage.
L’ARN viral purifié est libéré de la silice par un tampon avant la réaction RT-PCR en temps réel.
4.3 RT-PCR en temps réel
Le présent document utilise la RT-PCR en temps réel en une étape utilisant des sondes d’hydrolyse.
Dans la technique RT-PCR en temps réel en une étape, la transcription inverse et l’amplification par PCR
sont effectuées consécutivement dans le même tube.
La réaction RT-PCR en temps réel utilisant des sondes d’hydrolyse comprend une sonde d’ADN courte
marquée par une molécule fluorescente à une extrémité et un quencher fluorescent à l’extrémité
opposée. La chimie de cette réaction RT-PCR garantit qu’au cours du processus d’amplification de la cible,
la sonde d’ADN est hydrolysée et le signal fluorescent libéré par la sonde augmente proportionnellement.
La fluorescence peut être mesurée à chaque étape tout au long du cycle. Le premier cycle d’amplification
détectable dans la réaction RT-PCR en temps réel est proportionnel à la quantité d’ADN initial, et ainsi
l’analyse des courbes de fluorescence permet une détermination de la concentration de séquence cible
dans l’échantillon.
En raison des faibles concentrations de virus initial souvent présentes dans les aliments ou les surfaces
alimentaires et de la diversité des souches dans les virus ciblés, il est important de sélectionner de
façon adéquate des réactifs pour RT-PCR en temps réel en une étape, des amorces PCR et des sondes
d’hydrolyse pour les virus ciblés. Pour cela, des recommandations sont données en 5.2.18 et 5.2.19.
Des exemples détaillés de réactifs, d’amorces et de sondes (utilisés lors de l’élaboration du présent
document) sont fournis dans les Annexes C et D.
4.4 Témoins
4.4.1 Virus témoin d’extraction
Des pertes de virus cible peuvent se produire à différentes étapes lors de l’extraction de virus dans
l’échantillon et de l’extraction de l’ARN. Afin de contrôler ces pertes, les échantillons sont contaminés
artificiellement dès que cela est possible avant de commencer l’extraction du virus avec une quantité
définie de virus témoin d’extraction. Le niveau de récupération du virus témoin d’extraction doit être
déterminé pour chaque échant
...
Questions, Comments and Discussion
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