ISO/TS 15216-1:2013

Microbiology of food and animal feed - Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR - Part 1: Method for quantification

ISO/TS 15216-1:2013 describes a method for quantification of levels of HAV and NoV genogroup I (GI) and II (GII) RNA, from test samples of foodstuffs or food surfaces. Following liberation of viruses from the test sample, viral RNA is then extracted by lysis with guanidine thiocyanate and adsorption on silica. Target sequences within the viral RNA are amplified and detected by real-time RT-PCR. This approach is also relevant for detection of the target viruses on fomites, or of other human viruses in foodstuffs, on food surfaces or on fomites following appropriate validation and using target-specific primer and probe sets.

Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche des virus de l'hépatite A et norovirus dans les aliments par la technique RT-PCR en temps réel — Partie 1: Méthode de quantification

L'ISO/TS 15216-1:2013 décrit une méthode de quantification des niveaux de VHA et NoV des génogroupes I (GI) et II (GII) présents dans des échantillons pour essai d'aliments ou sur des surfaces alimentaires. Après libération des virus contenus dans l'échantillon pour essai, l'ARN viral est extrait par lyse à l'aide de thiocyanate de guanidine et par adsorption sur silice. Les séquences cibles de l'ARN viral sont amplifiées et détectées par la technique RT-PCR en temps réel. Cette approche est aussi applicable pour la détection desdits virus sur des matières contaminées, ou d'autres virus humains dans les aliments, sur les surfaces alimentaires ou sur les matières contaminées en suivant une validation appropriée et en utilisant des jeux d'amorces et de sondes propres à la cible.

General Information

• Status: Withdrawn
• Publication Date: 06-Mar-2013
• Withdrawal Date: 06-Mar-2013
• ICS: 07.100.30 - Food microbiology
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 9 - Microbiology
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 9 - Microbiology
• Current Stage: 9599 - Withdrawal of International Standard
• Start Date: 09-Mar-2017
• Completion Date: 13-Dec-2025

Relations

• Consolidates: ISO/IEC 10118-3:2003 - Information technology - Security techniques - Hash-functions - Part 3: Dedicated hash-functions
• Effective Date: 06-Jun-2022
• Revised: ISO 15216-1:2017 - Microbiology of the food chain - Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus using real-time RT-PCR - Part 1: Method for quantification
• Effective Date: 28-Dec-2013

Standards Content (Sample)

TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 15216-1
First edition
2013-03-15
Corrected version
2013-05-01
Microbiology of food and animal feed —
Horizontal method for determination
of hepatitis A virus and norovirus in
food using real-time RT-PCR —
Part 1:
Method for quantification
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche
des virus de l’hépatite A et norovirus dans les aliments par la
technique RT-PCR en temps réel —
Partie 1: Méthode de quantification
Reference number
©
ISO 2013
© ISO 2013
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form
or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
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E-mail [e-mail]
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2013 – All rights reserved

Contents Page
Foreword .iv
Introduction .vii
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 3
4.1 Virus extraction . 3
4.2 RNA extraction . 3
4.3 Real-time reverse transcription polymerase chain reaction (real time RT-PCR) . 4
4.4 Control materials . 4
4.5 Test results. 5
5 Reagents . 5
5.1 General . 5
5.2 Reagents used as supplied . 5
5.3 Prepared reagents . 6
6 Apparatus and materials. 7
7 Sampling . 8
8 Procedure. 8
8.1 General laboratory requirements . 8
8.2 Virus extraction . 9
8.3 RNA extraction .11
8.4 Real-time RT-PCR .11
9 Interpretation of results .13
9.1 General .13
9.2 Construction of standard curves .13
9.3 Calculation of amplification efficiency .13
9.4 Calculation of extraction efficiency .14
9.5 Sample quantification .14
9.6 Theoretical limit of detection .15
10 Expression of results .15
11 Test report .15
Annex A (normative) Diagram of procedure .17
Annex B (informative) Real-time RT-PCR mastermixes and cycling parameters .18
Annex C (informative) Real-time RT-PCR primers and hydrolysis probes for the detection of HAV,
norovirus GI and GII and mengo virus (process control) .19
Annex D (informative) Growth of mengo virus strain MC for use as a process control .21 ®
Annex E (informative) RNA extraction using the BioMerieux NucliSens system .22
Annex F (normative) Composition and preparation of reagents and buffers .24
Annex G (informative) Generation of double-stranded DNA (dsDNA) control stocks .26
Annex H (informative) Generation of external control RNA (EC RNA) stocks .28
Annex I (informative) Typical optical plate layout.30
Bibliography .31
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International
Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies
casting a vote.
In other circumstances, particularly when there is an urgent market requirement for such documents, a
technical committee may decide to publish other types of document:
— an ISO Publicly Available Specification (ISO/PAS) represents an agreement between technical
experts in an ISO working group and is accepted for publication if it is approved by more than 50 %
of the members of the parent committee casting a vote;
— an ISO Technical Specification (ISO/TS) represents an agreement between the members of a
technical committee and is accepted for publication if it is approved by 2/3 of the members of the
committee casting a vote.
An ISO/PAS or ISO/TS is reviewed after three years in order to decide whether it will be confirmed for
a further three years, revised to become an International Standard, or withdrawn. If the ISO/PAS or
ISO/TS is confirmed, it is reviewed again after a further three years, at which time it must either be
transformed into an International Standard or be withdrawn.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO/TS 15216-1 was prepared by the European Committee for Standardization (CEN), in collaboration
with Technical committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9 Microbiology.
This corrected version of ISO/TS 15216-1:2013 incorporates the following corrections.
— Throughout, textual references have been updated to take reordering of the annexes into account.
Annex B was formerly Annex E; Annex C was formerly Annex D; Annex D was formerly Annex G;
Annex E was formerly Annex C; Annex F was formerly Annex B; Annex G was formerly Annex H;
Annex H was formerly Annex I; Annex I was formerly Annex F.
— Many cross-references to reagents or apparatus subclauses are added.
−1 −1
— Where units of shaking operations are mentioned, “oscillations min ” replaces “min ”.
— A phrase citing Annex A is added to the end of the introduction.
— The definitions for “food surface” (formerly 3.2 and 3.3) are combined and expanded in a redrafted
3.2; in consequence, the following terms in Clause 3 are renumbered.
— In 3.4, Note 2, “There is only one serotype” is transposed to the end of Note 1. Also, “group 2 biological
agent by the European Union and as a risk group 2 human aetiological agent by the United States
National Institutes of Health” replaces “UK Advisory Committee on Dangerous Pathogens (ACDP)
hazard group 2 pathogen”.
iv © ISO 2013 – All rights reserved

— In 3.5, Note 2, “group 2 biological agents by the European Union and as risk group 2 human
aetiological agents by the United States National Institutes of Health” replaces “ACDP hazard group
2 pathogens”.
— In 3.6 and 3.7, “estimation of number of copies” replaces “quantification”.
— In 3.13, “used in” replaces “used as template in”.
— In 5.2.11, “from Aspergillus niger or A. aculeatus” is inserted after “Pectinase”.
— In 6.1,”Aerosol resistant tips should be used unless unobstructed tips are required, e.g. for
aspiration.” is inserted.
— In 6.5, “37 ± 1,0” replaces “37 ± 10”.
— A redrafted 6.10 on centrifuge(s) and rotor(s) replaces the former 6.10 and 6.11, with consequent
renumbering of the following subclauses.
— In 6.19, the square brackets are deleted.
— In 6.27, “Real-time PCR machine(s), i.e. thermal cycler(s),” replaces “Thermal cycler(s)”.
— In 6.28, “selected real-time PCR” replaces “selected PCR”.
— In 8.1, “Samples arriving already frozen should be defrosted prior to testing.” is inserted as the
second sentence.
— 8.2.3 Is redrafted.
— In 8.2.4, paragraph 2,”buffer (5.3.5) (for soft fruit samples, add 30 units pectinase from A. niger, or
1 140 units pectinase from A. aculeatus to the buffer) and” replaces “buffer (for soft fruit samples,
add 30 units pectinase to the buffer) and”.
— In 8.2.6, paragraph 2, “and the animal is supported with a rubber block” is added.
— In 8.2.6, last paragraph, “min at room temperature, decant” replaces “min, decant”
— In 8.4.2.3, paragraph 1,”using a real-time PCR machine (6.27)” is added.
— In 9.3, Note 1, “For a dsDNA standard curve with an idealized slope of −3,32, if the C value of
q
the sample RNA + EC RNA well is <2,00 greater than the C value of the water + EC RNA well, the
q
amplification efficiency is >25 % and therefore acceptable; if the C value of the sample RNA + EC
q
RNA well is >2,00 greater than the C value of the water + EC RNA well, the amplification efficiency
q
is <25% and therefore not acceptable.” is added.
— In 9.4, Note 1 “a process control virus recovery (equal to the extraction efficiency in matrices other
than BMS) of 100 %. For a process control virus RNA standard curve with an idealized slope of
−3,32, if the C value of an undiluted sample RNA well is <6,64 greater than the C value of the
q q
undiluted process control virus RNA, the process control virus recovery for that sample is >1% and
therefore acceptable” replaces “an extraction efficiency of 100 %”.
— The title of Annex B has been expanded to read, “Real-time RT-PCR mastermixes and cycling parameters”.
— In Table B.1, footnote a, “real-time PCR machines” twice replaces “real-time machines”.
— In C.1, “This primer set amplifies a product of 173 bp corresponding to nucleotides 68–240 of HAV
isolate HM174 43c (GenBank accession number M59809).” is added as paragraph 2.
— In C.2, “This primer set amplifies a product of 86 bp corresponding to nucleotides 5291–5376 of
Norwalk virus (GenBank accession number M87661).” is added as paragraph 2.”
— In C.3, “This primer set amplifies a product of 89 bp corresponding to nucleotides 5012–5100 of
Lordsdale virus (GenBank accession number X86557).” is added as paragraph 2.”
— In C.4, “This primer set amplifies a product of 100 bp corresponding to nucleotides 110–209 of
the deletant mengo virus strain MC0 used in the development of this part of ISO/TS 15216. This
corresponds to nucleotides 110–270 of the non-deletant mengo virus isolate M (GenBank accession
number L22089).” is added as paragraph 2.”
— In H.5, “mastermix (if the C difference between EC RNA stock tested with heat-treated and
q
untreated mastermix is <10 for a dsDNA standard curve with an idealized slope of −3,32), the”
replaces “mastermix, the”.
ISO/TS 15216 consists of the following parts, under the general title Microbiology of food and animal feed —
Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR:
— Part 1: Method for quantification
— Part 2: Method for qualitative detection
vi © ISO 2013 – All rights reserved

Introduction
Hepatitis A virus (HAV) and norovirus (NoV) are important agents of food-borne human viral illness.
No routine methods exist to culture these viruses from food matrices. Detection is therefore reliant
on molecular methods using the reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). As many
food matrices contain substances that are inhibitory to RT-PCR, it is necessary to use an extraction
method that produces highly clean RNA preparations that are fit for purpose. For food surfaces,
viruses are removed by swabbing. For soft fruit and salad vegetables, virus extraction is by elution
with agitation followed by precipitation with PEG/NaCl. For bottled water, adsorption and elution using
positively charged membranes followed by concentration by ultrafiltration is used and for bivalve
molluscan shellfish, viruses are extracted from the tissues of the digestive glands using treatment
with a proteinase K solution. For all matrices which are not covered by this Technical Specification, it is
necessary to validate this method. All matrices share a common RNA extraction method based on virus
capsid disruption with chaotropic reagents followed by adsorption of RNA to silica particles. Real-time
RT-PCR monitors amplification throughout the PCR cycle by measuring the excitation of fluorescently
labelled molecules. In the 5’ fluorogenic nuclease real-time RT-PCR assay, the fluorescent labels are
attached to a sequence-specific nucleotide probe (hydrolysis probe) that also enables simultaneous
confirmation of target template. These modifications increase the sensitivity and specificity of the PCR
method, and obviate the need for additional amplification product confirmation steps post PCR. Due to
the complexity of the method, it is necessary to include a comprehensive suite of controls. The method
described in this part of ISO/TS 15216 enables quantification of levels of virus RNA in the test sample. A
schematic diagram of the testing procedure is shown in Annex A.
TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 15216-1:2013(E)
Microbiology of food and animal feed — Horizontal
method for determination of hepatitis A virus and
norovirus in food using real-time RT-PCR —
Part 1:
Method for quantification
1 Scope
This part of ISO/TS 15216 describes a method for quantification of levels of HAV and NoV genogroup I
(GI) and II (GII) RNA, from test samples of foodstuffs or food surfaces. Following liberation of viruses
from the test sample, viral RNA is then extracted by lysis with guanidine thiocyanate and adsorption on
silica. Target sequences within the viral RNA are amplified and detected by real-time RT-PCR.
This approach is also relevant for detection of the target viruses on fomites, or of other human viruses
in foodstuffs, on food surfaces or on fomites following appropriate validation and using target-specific
primer and probe sets.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 22174, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the
detection of food-borne pathogens — General requirements and definitions
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 22174 and the following apply.
3.1
foodstuff
substance used or prepared for use as food
Note 1 to entry: For the purposes of this part of ISO/TS 15216, this definition includes bottled water.
3.2
food surface
surface of food, food preparation surface or food contact surface
3.3
fomite
inanimate object or material on which infectious agents can be conveyed
3.4
hepatitis A virus
HAV
member of the Picornaviridae family responsible for infectious hepatitis
Note 1 to entry: Genetically, HAV can be subdivided into six genotypes on the basis of the VP1/2A region
(genotypes 1, 2, and 3 have been found in humans, while genotypes 4, 5, and 6 are of simian origin). There is only
one serotype.
Note 2 to entry: Transmission occurs via the faecal-oral route by person-to-person contact, through the
consumption of contaminated foodstuffs, contact with contaminated water or food surfaces, or contact with
contaminated fomites. Hepatitis A virus is classified as a group 2 biological agent by the European Union and as a
risk group 2 human aetiological agent by the United States National Institutes of Health.
3.5
norovirus
member of the Caliciviridae family responsible for sporadic cases and outbreaks of acute gastroenteritis
Note 1 to entry: Genetically, norovirus can be subdivided into five separate genogroups.
Note 2 to entry: Three of these genogroups, GI, GII and GIV have been implicated in human gastrointestinal
disease. GI and GII are responsible for the vast majority of clinical cases. Transmission occurs via the faecal-oral
route by person-to-person contact, through the consumption of contaminated foodstuffs or through contact with
contaminated water or food surfaces or contact with contaminated fomites. Genogroup I and II noroviruses are
classified as group 2 biological agents by the European Union and as risk group 2 human aetiological agents by the
United States National Institutes of Health.
3.6
quantification of hepatitis A virus
estimation of number of copies of HAV RNA in a predetermined mass or volume of foodstuff, or area
of food surface
3.7
quantification of norovirus
estimation of number of copies of norovirus RNA in a predetermined mass or volume of foodstuff, or
area of food surface
3.8
process control virus
virus added to the sample portion at the earliest opportunity prior to virus extraction to control for
extraction efficiency
3.9
process control virus RNA
RNA released from the process control virus in order to produce standard curve data for the estimation
of extraction efficiency
3.10
negative RNA extraction control
control free of target RNA carried through all steps of the RNA extraction and detection procedure to
monitor any cross-contamination events
3.11
negative process control
target pathogen-free sample of the food matrix which is run through all stages of the analytical process
3.12
hydrolysis probe
fluorescent probe coupled with two fluorescent molecules which are sterically separated by the
5′-3′-exonuclease activity of the enzyme during the amplification process
2 © ISO 2013 – All rights reserved

3.13
negative RT-PCR control
aliquot of highly pure water used in a real-time RT-PCR reaction to control for contamination in the real-
time RT-PCR reagents
3.14
external control RNA
reference RNA that can serve as target for the real-time PCR assay of relevance, e.g. RNA synthesized by
in-vitro transcription from a plasmid carrying a copy of the target gene, which is added to an aliquot of
sample RNA in a defined amount to serve as a control for amplification in a separate reaction
3.15
C value
q
quantification cycle; the PCR cycle at which the target is quantified in a given real-time PCR reaction
Note 1 to entry: This corresponds to the point at which reaction fluorescence rises above a threshold level.
3.16
theoretical limit of detection
tLOD
level that constitutes the smallest quantity of target that can in theory be detected
Note 1 to entry: This corresponds to one genome copy per volume of RNA tested in the target assay, but varies
according to the test matrix and the quantity of starting material.
3.17
practical limit of detection
pLOD
lowest concentration of target in a test sample that can be reproducibly detected (95 % confidence
interval) under the experimental conditions specified in the method, as demonstrated by a collaborative
trial or other validation
Note 1 to entry: The pLOD is related to the test portion, the quality or quantity of the template RNA, and the tLOD
of the method.
3.18
limit of quantification
LOQ
lowest concentration of target in a test sample that can be quantitatively determined with acceptable level
of precision and accuracy under the experimental conditions specified in the method, as demonstrated
by a collaborative trial or other validation
Note 1 to entry: The LOQ is related to the test portion and the quality or quantity of the template RNA.
4 Principle
4.1 Virus extraction
The foodstuffs and food surfaces covered by this part of ISO/TS 15216 are often highly complex matrices
and the target viruses can be present at low concentrations. It is therefore necessary to carry out matrix-
specific virus extraction and/or concentration in order to provide a substrate for subsequent common
parts of the process. The choice of method depends upon the matrix.
4.2 RNA extraction
It is necessary to extract RNA using a method that yields clean RNA preparations to reduce the effect
of PCR inhibitors. In this part of ISO/TS 15216 the chaotropic agent guanidine thiocyanate is used to
disrupt the viral capsid. RNA is then adsorbed to silica to assist purification through several washing
stages. Purified viral RNA is released from the silica into a buffer prior to real-time RT-PCR.
4.3 Real-time reverse transcription polymerase chain reaction (real time RT-PCR)
This part of ISO/TS 15216 uses one step real-time RT-PCR using hydrolysis probes. In one step real-time
RT-PCR, reverse transcription and PCR amplification are carried out consecutively in the same tube.
Real-time PCR using hydrolysis probes utilizes a short DNA probe with a fluorescent label and a
fluorescence quencher attached at opposite ends. The assay chemistry ensures that as the quantity
of amplified product increases, the probe is broken down and the fluorescent signal from the label
increases proportionately. Fluorescence can be measured at each stage throughout the cycle. The first
point in the PCR cycle at which amplification can be detected for any reaction is proportional to the
quantity of template, therefore analysis of the fluorescence plots enables determination of the quantity
of target sequence in the sample.
Due to the low levels of virus template often present in foodstuffs and the strain diversity in the
target viruses, selection of fit-for-purpose one step real-time RT-PCR reagents and PCR primers and
hydrolysis probes for the target viruses is important. Guidelines for their selection are given in 5.2.17
and 5.2.18. Illustrative details of reagents, primers, and probes (used in the development of this part of
ISO/TS 15216) are provided in Annexes B and C.
4.4 Control materials
4.4.1 Process control virus
Losses of target virus can occur at several stages during sample virus extraction and RNA extraction.
To control for these losses, samples are spiked prior to processing with a defined amount of a process
control virus. The level of recovery of the process control virus shall be determined for each sample.
The virus selected for use as a process control shall be a culturable non-enveloped positive-sense ssRNA
virus of a similar size to the target viruses to provide a good morphological and physicochemical model.
The process control virus shall exhibit similar persistence in the environment to the targets. The virus
shall be sufficiently distinct genetically from the target viruses that PCR assays for the target and
process control viruses do not cross-react, and shall not normally be expected to occur naturally in the
foodstuffs under test.
An example of the preparation of process control virus (used in the development of this part of
ISO/TS 15216) is provided in Annex D.
4.4.2 Double-stranded DNA (dsDNA) control
For quantification of a target virus, results shall be related to a standard of known concentration. A
dilution series of double-stranded DNA carrying the target sequence of interest (5.3.8) and quantified
using spectrophotometry shall be used to produce a standard curve in template copies per microlitre.
Reference to the standard curve enables quantification of the sample in detectable virus genome copies
per microlitre.
4.4.3 External amplification control (EC) RNA control
Many foodstuffs contain substances inhibitory to RT-PCR, and there is also a possibility of carryover of
further inhibitory substances from upstream processing. In order to control for RT-PCR inhibition in
individual samples, external control (EC) RNA (an RNA species carrying the target sequence of interest,
5.3.9) is added to an aliquot of sample RNA and tested using the RT-PCR method. Comparison of the
results of this with the results of EC RNA in the absence of sample RNA enables determination of the
level of RT-PCR inhibition in each sample under test.
Alternative approaches for RT-PCR inhibition control that can be demonstrated to provide equivalent
performance to the use of EC RNA are permitted.
4 © ISO 2013 – All rights reserved

4.5 Test results
This method provides a result expressed in detectable virus genome copies per millilitre, per gram or
per square centimetre. In samples where virus is not detected, results shall be reported as “not detected;
of detection (LOD) for the sample.
5 Reagents
5.1 General
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified.
[10]
For current laboratory practice, see ISO 7218.
5.2 Reagents used as supplied
5.2.1 Molecular biology grade water.
5.2.2 Polyethylene glycol (PEG), mean relative molecular mass 8 000.
5.2.3 Sodium chloride (NaCl).
5.2.4 Potassium chloride (KCl).
5.2.5 Disodium hydrogenphosphate (Na HPO ).
2 4
5.2.6 Potassium dihydrogenphosphate (KH PO ).
2 4
5.2.7 Tris base.
5.2.8 Glycine.
5.2.9 Beef extract powder.
5.2.10 Proteinase K (30 U/mg).
5.2.11 Pectinase from Aspergillus niger or A. aculeatus.
5.2.12 Chloroform.
5.2.13 Butanol.
5.2.14 Sodium hydroxide (NaOH).
5.2.15 Hydrochloric acid (HCl).
5.2.16 Silica, lysis, wash, and elution buffers for extraction of viral RNA. Reagents shall enable
processing of 500 μl of extracted virus, using lysis with a chaotropic buffer containing guanidine
thiocyanate (Reference [1]) and using silica as the RNA-binding matrix. Following treatment of silica-
bound RNA with wash buffer(s) to remove impurities, RNA shall be eluted in 100 μl elution buffer.
The RNA preparation shall be of a quality and concentration suitable for the intended purpose. See
Annex E for illustrative details of RNA extraction reagents (used in the development of the method
described in this part of ISO/TS 15216).
5.2.17 Reagents for one step real-time RT-PCR. Reagents shall allow processing of 5 μl RNA in 25 μl
total volume. They shall be suitable for one step RT-PCR using hydrolysis probes (the DNA polymerase
used shall possess 5’-3’ exonuclease activity) and sufficiently sensitive for the detection of levels of virus
RNA as typically found in virus-contaminated foodstuffs. See Annex B for illustrative details of one step
real-time RT-PCR reagents (used in the development of this part of ISO/TS 15216).
5.2.18 Primers and hydrolysis probes for detection of HAV and norovirus GI and GII. Primer and
hydrolysis probe sequences shall be published in a peer-reviewed journal and be verified for use against
a broad range of strains of target virus. Primers for detection of HAV shall target the 5’ non-coding region
of the genome. Primers for detection of norovirus GI and GII shall target the ORF1/ORF2 junction of the
genome. See Annex C for illustrative details of primers and hydrolysis probes (used in the development of
this part of ISO/TS 15216).
5.2.19 Primers and hydrolysis probes for detection of the process control virus. Primer and
hydrolysis probe sequences shall be published in a peer-reviewed journal and be verified for use against
the strain of process virus used. They shall demonstrate no cross-reactivity with the target virus.
5.3 Prepared reagents
Because of the large number of reagents requiring individual preparation, details of composition and
preparation are given in Annex F.
5.3.1 5 × PEG/NaCl solution (500 g/l PEG 8 000, 1,5 mol/l NaCl). See F.1.
5.3.2 Chloroform/butanol mixture. See F.2.
5.3.3 Proteinase K solution. See F.3.
5.3.4 Phosphate-buffered saline (PBS). See F.4.
5.3.5 Tris/glycine/beef extract (TGBE) buffer. See F.5.
5.3.6 Process control virus material. Process control virus stock shall be diluted by a minimum
factor of 10 in a suitable buffer, e.g. PBS (5.3.4). This dilution shall allow for inhibition-free detection of
the process control virus genome using real-time RT-PCR, but still be sufficiently concentrated to allow
reproducible determination of the lowest dilution used for the process control virus RNA standard curve
(8.4.2.2). Split the diluted process control virus material into single use aliquots and store at (−80 ± 5) °C.
See Annex D for illustrative details of the preparation of process control virus (used in the development
of the method described in this part of ISO/TS 15216).
5.3.7 Real-time RT-PCR mastermixes for target and process control virus. Reagents shall be added
in quantities as specified by the manufacturers (5.2.17) to allow 20 μl mastermix per reaction in a 25 μl
total volume. Optimal primer and probe concentrations shall be used after determination following the
recommendations of the reagent manufacturers. See Annex B for illustrative details of real-time RT-PCR
mastermixes (used in the development of this part of ISO/TS 15216).
5.3.8 Double-stranded DNA (dsDNA) control material. Separate purified plasmids carrying the
target sequence for each target virus shall be used. The preparations shall not cause RT-PCR inhibition.
6 © ISO 2013 – All rights reserved

The concentrations of each dsDNA stock in template copies per microlitre shall be determined then the
4 5
stock shall be diluted to a concentration of 1 × 10 to 1 × 10 template copies per microlitre. Split the
diluted dsDNA preparation (dsDNA control material) into single use aliquots and store frozen at −15 °C
or below. See Annex G for illustrative details of the preparation of dsDNA (used in the development of this
part of ISO/TS 15216).
5.3.9 External control (EC) RNA control material. Separate purified ssRNA carrying the target
sequence for each target virus shall be used. They shall contain levels of contaminating target DNA no
higher than 0,1 % and shall not cause RT-PCR inhibition. The concentrations of each EC RNA stock in
copies per microlitre shall be determined and stock shall be diluted to a concentration of 1 × 10 to
1 × 10 template copies per microlitre. Split the diluted EC RNA preparation (EC RNA control material)
into single use aliquots and store frozen at −15 °C or below. See Annex H for illustrative details of the
preparation of EC RNA (used in the development of this part of ISO/TS 15216).
6 Apparatus and materials
[10]
Standard microbiological laboratory equipment (ISO 7218) and in particular the following.
6.1 Micropipettes and tips of a range of sizes, e.g. 1 000 μl, 200 μl, 20 μl, 10 μl. Aerosol resistant tips
should be used unless unobstructed tips are required, e.g. for aspiration.
6.2 Pipette filler and pipettes of a range of sizes, e.g. 25 ml, 10 ml, 5 ml.
6.3 Vortex mixer.
−1
6.4 Shaker capable of operating at approximately 500 oscillations min .
−1
6.5 Shaking incubator operating at (37 ± 1,0) °C and (320 ± 20) oscillations min or equivalent.
6.6 Rocking platform(s) or equivalent for use at room temperature and (4 ± 2) °C at (60 ±
−1
5) oscillations min .
6.7 Aspirator or equivalent apparatus for removing supernatant.
6.8 Heating block capable of operating at (95 ± 1,0) °C or equivalent.
6.9 Water bath capable of operating at (60 ± 2,0) °C or equivalent.
6.10 Centrifuge(s) and rotor(s) capable of the following run speeds, run temperatures, and rotor capacities:
a) 10 000 × g at (5 ± 3) °C with capacity for tubes of at least 35 ml volume;
b) 10 000 × g at (5 ± 3) °C with capacity for narrow gauge (15 mm is too large) chloroform-resistant
tubes of at least 1 ml volume;
c) 4 000 × g at room temperature with capacity for centrifugal filter concentration devices (6.17).
6.11 Microcentrifuge.
6.12 Centrifuge and microcentrifuge tubes and bottles of a range of sizes, 1,5 ml, 5 ml, 15 ml, 50 ml,
etc. Narrow gauge (15 mm is too large) chloroform-resistant tubes with 1 ml capacity are necessary.
6.13 pH meter (or pH testing strips).
6.14 Sterile cotton swabs.
6.15 Mesh filter bags (400 ml).
6.16 Positively charged membrane filters with 0,45 μm pore size (47 mm diameter).
6.17 Centrifugal filter concentration devices with 15 ml capacity and 100 kDa relative molecular
mass cutoff.
6.18 Vacuum source or equivalent positive pressure apparatus for filtering and filtration tower with
aperture for 47 mm diameter membrane.
6.19 Sterile shucking knife for opening bivalve molluscan shellfish (BMS).
6.20 Rubber block for opening BMS.
6.21 Scissors.
6.22 Forceps.
6.23 Sterile Petri dishes.
6.24 Razor blades or equivalent homogenizer.
6.25 Heavy duty safety glove.
6.26 RNA extraction equipment suitable for extraction methods using silica and associated reagents
(5.2.16). See Annex E for illustrative details of RNA extraction apparatus (used in the development of this
part of ISO/TS 15216).
6.27 Real-time PCR machine(s), i.e. thermal cycler(s), equipped with an energy source suitable for the
excitation of fluorescent molecules, and an optical detection system for real-time detection of fluorescence
signals generated during PCR with hydrolysis probe chemistry.
6.28 Associated consumables for real-time RT-PCR, e.g. optical plates and caps, suitable for use with
the selected real-time PCR machine.
7 Sampling
If there is no specific International Standard dealing with the sampling of the product concerned, it is
recommended that the parties concerned come to an agreement on the subject.
It is important the laboratory receive a truly representative sample which has not been damaged or
changed during transport or storage.
8 Procedure
8.1 General laboratory requirements
Unfrozen samples arriving at the laboratory shall not be frozen prior to testing. Samples arriving already
frozen should be defrosted prior to testing. Sample extraction and PCR shall be carried out in separate
working areas or rooms as specified in ISO 22174.
8 © ISO 2013 – All rights reserved

8.2 Virus extraction
The selection of method is dependent upon the food matrix under test.
8.2.1 Process control virus material
Immediately before a batch of test samples is processed, pool together sufficient aliquots of process
control virus material (5.3.6) for all individual samples (allow 10 μl per test sample plus 25 μl excess).
−1
Dilute a (20 ± 0,5) μl portion of pooled process control virus material to 10 using water (5.2.1) and
store at (5 ± 3) °C for a maximum of 24 h or in single-use aliquots at −15 °C or below for longer periods.
8.2.2 Negative process control
A negative process control sample shall be run in parallel to test samples at a frequency determined as
part of the laboratory quality assurance programme.
8.2.3 Food surfaces
Using a sterile cotton swab premoistened in PBS (5.3.4), intensively swab the surface (maximum area,
100 cm ) under test, applying a little pressure to detach virus particles. Record the approximate area
swabbed in square centimetres.
Add (10 ± 0,1) μl of process control virus material (8.2.1) to the swab.
Immediately after the addition of process control virus material, immerse the swab in a tube containing
(490 ± 5) μl lysis buffer, then press against the side of the tube to release liquid. Repeat the immersion
and pressing cycle three or four times to ensure maximum yield of virus.
For rough surfaces that may cause deterioration of the swab, more than one swab may be required to
completely treat the target surface.
Retain for RNA extraction.
8.2.4 Soft fruit and salad vegetables
Coarsely chop (25 ± 0,3) g of soft fruits or salad vegetables into pieces of approximately 2,5 cm × 2,5 cm ×
2,5 cm (it is not necessary to chop if, for example, individual fruits are smaller than this) and transfer to
the sample compartment of a 400 ml mesh filter bag.
Add (40 ± 1) ml TGBE buffer (5.3.5) (for soft fruit samples, add 30 units pectinase from A. niger, or 1 140 units
pectinase from A. aculeatus to the buffer) and (10 ± 0,1) μl of process control virus material (8.2.1).
−1
Incubate at room temperature with constant rocking at approximately 60 oscillations min for (20 ±
1) min. For acidic soft fruits, the pH of the eluate shall be monitored at 10 min intervals during incubation.
If the pH falls below 9,0, it shall be adjusted to 9,5 ± 0,1 with NaOH. Extend the period of incubation
by 10 min for every time the pH is adjusted. Decant the eluate from the filtered compartment into a
centrifuge tube (use two tubes if necessary to accommodate volume).
Clarify by centrifugation at 10 000 × g for (30 ± 5) min at (5 ± 3) °C.
Decant the supernatant into a single clean tube or bottle and adjust to pH 7,0 ± 0,5 with HCl.
Add 0,25 volumes of 5 × PEG/NaCl solution (5.3.1) (to produce a final concentration of 100 g/l PEG
0,3 mol/l NaCl), homogenize by shaking for (60 ± 5) s then incubate with constant rocking at around
−1
60 oscillations min at (5 ± 3) °C for (60 ± 5) min.
Centrifuge at 10 000 × g for (30 ± 5) min at (5 ± 3) °C (split volume across two centrifuge tubes if necessary).
Decant and discard the supernatant, then centrifuge at 10 000 × g for (5 ± 1) min at (5 ± 3) °C to
compact the pellet.
Discard the supernatant and resuspend the pellet in (500 ± 10) μl PBS (5.3.4). If a single sample has been
split across two tubes, resuspend both pellets stepwise in the same aliquot of PBS.
For extraction from salad vegetables, transfer the suspension to a suitable tube and retain for RNA extraction.
For extraction from soft fruits, a further clarification step is required. Transfer the suspension to a
narrow gauge chloroform-resistant centrifuge tube (6.12). Add (500 ± 10) μl chloroform/butanol
mixture (5.3.2), vortex to mix, then incubate at room temperature for 5 min.
Centrifuge at 10 000 × g for (15 ± 1) min at (5 ± 3) °C. Carefully transfer the aqueous phase to a fresh
tube and retain for RNA extraction.
8.2.5 Bottled water
This part of ISO/TS 15216 is appropriate for volumes between 0,3 l and 5 l. For each sample, record the
volume tested.
A
...

TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 15216-1
First edition
Microbiology of food and animal feed —
Horizontal method for determination
of hepatitis A virus and norovirus in
food using real-time RT-PCR —
Part 1:
Method for quantification
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche
des virus de l’hépatite A et norovirus dans les aliments par la
technique RT-PCR en temps réel —
Partie 1: Méthode de quantification
ISO/CEN PARALLEL PROCESSING
This draft Technical Specification has been developed within the European Committee for Standardization
(CEN), and processed under the CEN-lead mode of collaboration as defined in the Vienna Agreement.
This draft Technical Specification is hereby submitted to a parallel three-month P member vote in the
ISO/TC concerned and three-month vote in CEN.
PROOF/ÉPREUVE
Reference number
ISO/TS 15216-1:2012(E)
©
ISO 2012
ISO/TS 15216-1:2012(E)
© ISO 2012
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any
means, electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the
address below or ISO’s member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail [e-mail]
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii PROOF/ÉPREUVE © ISO 2012 – All rights reserved

ISO/TS 15216-1:2012(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 3
4.1 Virus extraction . 3
4.2 RNA extraction . 3
4.3 Real-time reverse transcription polymerase chain reaction (real time RT-PCR) . 3
4.4 Control materials . 4
4.5 Test results. 4
5 Reagents . 5
5.1 General . 5
5.2 Reagents used as supplied . 5
5.3 Prepared reagents . 6
6 Apparatus and materials. 7
7 Sampling . 8
8 Procedure. 8
8.1 General laboratory requirements . 8
8.2 Virus extraction . 8
8.3 RNA extraction .10
8.4 Real-time RT-PCR .11
9 Interpretation of results .13
9.1 General .13
9.2 Construction of standard curves .13
9.3 Calculation of amplification efficiency .13
9.4 Calculation of extraction efficiency .13
9.5 Sample quantification .14
9.6 Theoretical limit of detection .14
10 Expression of results .14
11 Test report .15
Annex A (normative) Diagram of procedure .16
Annex B (normative) Composition and preparation of reagents and buffers .18 ®
Annex C (informative) RNA extraction using the BioMerieux NucliSens system .20
Annex D (informative) Real-time RT-PCR primers and hydrolysis probes for the detection of HAV,
norovirus GI and GII and mengo virus (process control) .22
Annex E (informative) Composition of one step real-time RT-PCR mastermixes using the
TM
Invitrogen RNA Ultrasense one step qRT-PCR system and cycling parameters .24
Annex F (informative) Typical optical plate layout .25
Annex G (informative) Growth of mengo virus strain MC for use as a process control .27
Annex H (informative) Generation of double-stranded DNA (dsDNA) control stocks .28
Annex I (informative) Generation of external control RNA (EC RNA) stocks .30
Bibliography .32
ISO/TS 15216-1:2012(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International
Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies
casting a vote.
In other circumstances, particularly when there is an urgent market requirement for such documents, a
technical committee may decide to publish other types of document:
— an ISO Publicly Available Specification (ISO/PAS) represents an agreement between technical
experts in an ISO working group and is accepted for publication if it is approved by more than 50 %
of the members of the parent committee casting a vote;
— an ISO Technical Specification (ISO/TS) represents an agreement between the members of a
technical committee and is accepted for publication if it is approved by 2/3 of the members of the
committee casting a vote.
An ISO/PAS or ISO/TS is reviewed after three years in order to decide whether it will be confirmed for
a further three years, revised to become an International Standard, or withdrawn. If the ISO/PAS or
ISO/TS is confirmed, it is reviewed again after a further three years, at which time it must either be
transformed into an International Standard or be withdrawn.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO/TS 15216-1 was prepared by the European Committee for Standardization (CEN), in collaboration
with Technical committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9 Microbiology.
ISO/TS 15216 consists of the following parts, under the general title Microbiology of food and animal feed —
Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR:
— Part 1: Method for quantification
— Part 2: Method for qualitative detection
iv PROOF/ÉPREUVE © ISO 2012 – All rights reserved

ISO/TS 15216-1:2012(E)
Introduction
Hepatitis A virus (HAV) and norovirus (NoV) are important agents of food-borne human viral illness.
No routine methods exist to culture these viruses from food matrices. Detection is therefore reliant on
molecular methods using the reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). As many food
matrices contain substances that are inhibitory to RT-PCR, it is necessary to use an extraction method
that produces highly clean RNA preparations that are fit for purpose. For food surfaces, viruses are
removed by swabbing. For soft fruit and salad vegetables, virus extraction is by elution with agitation
followed by precipitation with PEG/NaCl. For bottled water, adsorption and elution using positively
charged membranes followed by concentration by ultrafiltration is used and for bivalve molluscan
shellfish, viruses are extracted from the tissues of the digestive glands using treatment with a proteinase
K solution. For all matrices which are not covered by this Technical Specification, it is necessary to
validate this method. All matrices share a common RNA extraction method based on virus capsid
disruption with chaotropic reagents followed by adsorption of RNA to silica particles. Real-time RT-PCR
monitors amplification throughout the PCR cycle by measuring the excitation of fluorescently labelled
molecules. In the 5’ fluorogenic nuclease real-time RT-PCR assay, the fluorescent labels are attached to
a sequence-specific nucleotide probe (hydrolysis probe) that also enables simultaneous confirmation
of target template. These modifications increase the sensitivity and specificity of the PCR method, and
obviate the need for additional amplification product confirmation steps post PCR. Due to the complexity
of the method, it is necessary to include a comprehensive suite of controls. The method described in this
part of ISO/TS 15216 enables quantification of levels of virus RNA in the test sample.
TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 15216-1:2012(E)
Microbiology of food and animal feed — Horizontal
method for determination of hepatitis A virus and
norovirus in food using real-time RT-PCR —
Part 1:
Method for quantification
1 Scope
This part of ISO/TS 15216 describes a method for quantification of levels of HAV and NoV genogroup I
(GI) and II (GII) RNA, from test samples of foodstuffs or food surfaces. Following liberation of viruses
from the test sample, viral RNA is then extracted by lysis with guanidine thiocyanate and adsorption on
silica. Target sequences within the viral RNA are amplified and detected by real-time RT-PCR.
This approach is also relevant for detection of the target viruses on fomites, or of other human viruses
in foodstuffs, on food surfaces or on fomites following appropriate validation and using target-specific
primer and probe sets.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 22174, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the
detection of food-borne pathogens — General requirements and definitions
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 22174 and the following apply.
3.1
foodstuff
substance used or prepared for use as food
NOTE For the purposes of this part of ISO/TS 15216, this definition includes bottled water.
3.2
food surface
<1> surface of food
3.3
food surface
<2> food preparation surface
3.4
fomite
inanimate object or material on which infectious agents can be conveyed
ISO/TS 15216-1:2012(E)
3.5
hepatitis A virus
HAV
member of the Picornaviridae family responsible for infectious hepatitis
NOTE 1 Genetically, HAV can be subdivided into six genotypes on the basis of the VP1/2A region (genotypes 1,
2, and 3 have been found in humans, while genotypes 4, 5, and 6 are of simian origin).
NOTE 2 There is only one serotype. Transmission occurs via the faecal-oral route by person-to-person contact,
through the consumption of contaminated foodstuffs, contact with contaminated water or food surfaces, or
contact with contaminated fomites. Hepatitis A virus is classified as a UK Advisory Committee on Dangerous
Pathogens (ACDP) hazard group 2 pathogen.
3.6
norovirus
member of the Caliciviridae family responsible for sporadic cases and outbreaks of acute gastroenteritis
NOTE 1 Genetically, norovirus can be subdivided into five separate genogroups.
NOTE 2 Three of these genogroups, GI, GII and GIV have been implicated in human gastrointestinal disease.
GI and GII are responsible for the vast majority of clinical cases. Transmission occurs via the faecal-oral route
by person-to-person contact, through the consumption of contaminated foodstuffs or through contact with
contaminated water or food surfaces or contact with contaminated fomites. Genogroup I and II noroviruses are
classified as ACDP Hazard Group 2 pathogens.
3.7
quantification of hepatitis A virus
quantification of HAV RNA in a predetermined mass or volume of foodstuff, or area of food surface
3.8
quantification of norovirus
quantification of norovirus RNA in a predetermined mass or volume of foodstuff, or area of food surface
3.9
process control virus
virus added to the sample portion at the earliest opportunity prior to virus extraction to control for
extraction efficiency
3.10
process control virus RNA
RNA released from the process control virus in order to produce standard curve data for the estimation
of extraction efficiency
3.11
negative RNA extraction control
control free of target RNA carried through all steps of the RNA extraction and detection procedure to
monitor any cross-contamination events
3.12
negative process control
target pathogen-free sample of the food matrix which is run through all stages of the analytical process
3.13
hydrolysis probe
fluorescent probe coupled with two fluorescent molecules which are sterically separated by the
5′-3′-exonuclease activity of the enzyme during the amplification process
3.14
negative RT-PCR control
aliquot of highly pure water used as template in a real-time RT-PCR reaction to control for contamination
in the real-time RT-PCR reagents
2 PROOF/ÉPREUVE © ISO 2012 – All rights reserved

ISO/TS 15216-1:2012(E)
3.15
external control RNA
reference RNA that can serve as target for the real-time PCR assay of relevance, e.g. RNA synthesized by
in-vitro transcription from a plasmid carrying a copy of the target gene, which is added to an aliquot of
sample RNA in a defined amount to serve as a control for amplification in a separate reaction
3.16
C value
q
quantification cycle; the PCR cycle at which the target is quantified in a given real-time PCR reaction
NOTE This corresponds to the point at which reaction fluorescence rises above a threshold level.
3.17
theoretical limit of detection
tLOD
level that constitutes the smallest quantity of target that can in theory be detected
NOTE This corresponds to one genome copy per volume of RNA tested in the target assay, but varies according
to the test matrix and the quantity of starting material.
3.18
practical limit of detection
pLOD
lowest concentration of target in a test sample that can be reproducibly detected (95 % confidence
interval) under the experimental conditions specified in the method, as demonstrated by a collaborative
trial or other validation
NOTE The pLOD is related to the test portion, the quality or quantity of the template RNA, and the tLOD
of the method.
3.19
limit of quantification
LOQ
lowest concentration of target in a test sample that can be quantitatively determined with acceptable level
of precision and accuracy under the experimental conditions specified in the method, as demonstrated
by a collaborative trial or other validation
NOTE The LOQ is related to the test portion and the quality or quantity of the template RNA.
4 Principle
4.1 Virus extraction
The foodstuffs and food surfaces covered by this part of ISO/TS 15216 are often highly complex matrices
and the target viruses can be present at low concentrations. It is therefore necessary to carry out matrix-
specific virus extraction and/or concentration in order to provide a substrate for subsequent common
parts of the process. The choice of method depends upon the matrix.
4.2 RNA extraction
It is necessary to extract RNA using a method that yields clean RNA preparations to reduce the effect
of PCR inhibitors. In this part of ISO/TS 15216 the chaotropic agent guanidine thiocyanate is used to
disrupt the viral capsid. RNA is then adsorbed to silica to assist purification through several washing
stages. Purified viral RNA is released from the silica into a buffer prior to real-time RT-PCR.
4.3 Real-time reverse transcription polymerase chain reaction (real time RT-PCR)
This part of ISO/TS 15216 uses one step real-time RT-PCR using hydrolysis probes. In one step real-time
RT-PCR, reverse transcription and PCR amplification are carried out consecutively in the same tube.
ISO/TS 15216-1:2012(E)
Real-time PCR using hydrolysis probes utilizes a short DNA probe with a fluorescent label and a
fluorescence quencher attached at opposite ends. The assay chemistry ensures that as the quantity
of amplified product increases, the probe is broken down and the fluorescent signal from the label
increases proportionately. Fluorescence can be measured at each stage throughout the cycle. The first
point in the PCR cycle at which amplification can be detected for any reaction is proportional to the
quantity of template, therefore analysis of the fluorescence plots enables determination of the quantity
of target sequence in the sample.
Due to the low levels of virus template often present in foodstuffs and the strain diversity in the
target viruses, selection of fit-for-purpose one step real-time RT-PCR reagents and PCR primers and
hydrolysis probes for the target viruses is important. Guidelines for their selection are given in 5.2.17
and 5.2.18. Illustrative details of reagents, primers, and probes (used in the development of this part of
ISO/TS 15216) are provided in Annexes D and E.
4.4 Control materials
4.4.1 Process control virus
Losses of target virus can occur at several stages during sample virus extraction and RNA extraction.
To control for these losses, samples are spiked prior to processing with a defined amount of a process
control virus. The level of recovery of the process control virus shall be determined for each sample.
The virus selected for use as a process control shall be a culturable non-enveloped positive-sense ssRNA
virus of a similar size to the target viruses to provide a good morphological and physicochemical model.
The process control virus shall exhibit similar persistence in the environment to the targets. The virus
shall be sufficiently distinct genetically from the target viruses that PCR assays for the target and
process control viruses do not cross-react, and shall not normally be expected to occur naturally in the
foodstuffs under test.
An example of the preparation of process control virus (used in the development of this part of
ISO/TS 15216) is provided in Annex G.
4.4.2 Double-stranded DNA (dsDNA) control
For quantification of a target virus, results shall be related to a standard of known concentration. A
dilution series of double-stranded DNA carrying the target sequence of interest (5.3.8) and quantified
using spectrophotometry shall be used to produce a standard curve in template copies per microlitre.
Reference to the standard curve enables quantification of the sample in detectable virus genome copies
per microlitre.
4.4.3 External amplification control (EC) RNA control
Many foodstuffs contain substances inhibitory to RT-PCR, and there is also a possibility of carryover of
further inhibitory substances from upstream processing. In order to control for RT-PCR inhibition in
individual samples, external control (EC) RNA (an RNA species carrying the target sequence of interest,
5.3.9) is added to an aliquot of sample RNA and tested using the RT-PCR method. Comparison of the
results of this with the results of EC RNA in the absence of sample RNA enables determination of the
level of RT-PCR inhibition in each sample under test.
Alternative approaches for RT-PCR inhibition control that can be demonstrated to provide equivalent
performance to the use of EC RNA are permitted.
4.5 Test results
This method provides a result expressed in detectable virus genome copies per millilitre, per gram or
per square centimetre. In samples where virus is not detected, results shall be reported as “not detected;
of detection (LOD) for the sample.
4 PROOF/ÉPREUVE © ISO 2012 – All rights reserved

ISO/TS 15216-1:2012(E)
5 Reagents
5.1 General
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified.
[10]
For current laboratory practice, see ISO 7218.
5.2 Reagents used as supplied
5.2.1 Molecular biology grade water.
5.2.2 Polyethylene glycol (PEG), mean relative molecular mass 8 000.
5.2.3 Sodium chloride (NaCl).
5.2.4 Potassium chloride (KCl).
5.2.5 Disodium hydrogenphosphate (Na HPO ).
2 4
5.2.6 Potassium dihydrogenphosphate (KH PO ).
2 4
5.2.7 Tris base.
5.2.8 Glycine.
5.2.9 Beef extract powder.
5.2.10 Proteinase K (30 U/mg).
5.2.11 Pectinase.
5.2.12 Chloroform.
5.2.13 Butanol.
5.2.14 Sodium hydroxide (NaOH).
5.2.15 Hydrochloric acid (HCl).
5.2.16 Silica, lysis, wash, and elution buffers for extraction of viral RNA. Reagents shall enable
processing of 500 μl of extracted virus, using lysis with a chaotropic buffer containing guanidine
thiocyanate (Reference [1]) and using silica as the RNA-binding matrix. Following treatment of silica-
bound RNA with wash buffer(s) to remove impurities, RNA shall be eluted in 100 μl elution buffer.
The RNA preparation shall be of a quality and concentration suitable for the intended purpose. See
Annex C for illustrative details of RNA extraction reagents (used in the development of the method
described in this part of ISO/TS 15216).
5.2.17 Reagents for one step real-time RT-PCR. Reagents shall allow processing of 5 μl RNA in 25 μl
total volume. They shall be suitable for one step RT-PCR using hydrolysis probes (the DNA polymerase
used shall possess 5’-3’ exonuclease activity) and sufficiently sensitive for the detection of levels of virus
ISO/TS 15216-1:2012(E)
RNA as typically found in virus-contaminated foodstuffs. See Annex E for illustrative details of one step
real-time RT-PCR reagents (used in the development of this part of ISO/TS 15216).
5.2.18 Primers and hydrolysis probes for detection of HAV and norovirus GI and GII. Primer and
hydrolysis probe sequences shall be published in a peer-reviewed journal and be verified for use against
a broad range of strains of target virus. Primers for detection of HAV shall target the 5’ non-coding region
of the genome. Primers for detection of norovirus GI and GII shall target the ORF1/ORF2 junction of the
genome. See Annex D for illustrative details of primers and hydrolysis probes (used in the development of
this part of ISO/TS 15216).
5.2.19 Primers and hydrolysis probes for detection of the process control virus. Primer and
hydrolysis probe sequences shall be published in a peer-reviewed journal and be verified for use against
the strain of process virus used. They shall demonstrate no cross-reactivity with the target virus.
5.3 Prepared reagents
Because of the large number of reagents requiring individual preparation, details of composition and
preparation are given in Annex B.
5.3.1 5 × PEG/NaCl solution (500 g/l PEG 8 000, 1,5 mol/l NaCl). See B.1.
5.3.2 Chloroform/butanol mixture. See B.2.
5.3.3 Proteinase K solution. See B.3.
5.3.4 Phosphate-buffered saline (PBS). See B.4.
5.3.5 Tris/glycine/beef extract (TGBE) buffer. See B.5.
5.3.6 Process control virus material. Process control virus stock shall be diluted by a minimum factor
of 10 in a suitable buffer, e.g. PBS. This dilution shall allow for inhibition-free detection of the process
control virus genome using real-time RT-PCR, but still be sufficiently concentrated to allow reproducible
determination of the lowest dilution used for the process control virus RNA standard curve (8.4.2.2). Split
the diluted process control virus material into single use aliquots and store at (−80 ± 5) °C. See Annex G
for illustrative details of the preparation of process control virus (used in the development of the method
described in this part of ISO/TS 15216).
5.3.7 Real-time RT-PCR mastermixes for target and process control virus. Reagents shall be added
in quantities as specified by the manufacturers (5.2.17) to allow 20 μl mastermix per reaction in a 25 μl
total volume. Optimal primer and probe concentrations shall be used after determination following the
recommendations of the reagent manufacturers. See Annex E for illustrative details of real-time RT-PCR
mastermixes (used in the development of this part of ISO/TS 15216).
5.3.8 Double-stranded DNA (dsDNA) control material. Separate purified plasmids carrying the
target sequence for each target virus shall be used. The preparations shall not cause RT-PCR inhibition.
The concentrations of each dsDNA stock in template copies per microlitre shall be determined then the
4 5
stock shall be diluted to a concentration of 1 × 10 to 1 × 10 template copies per microlitre. Split the
diluted dsDNA preparation (dsDNA control material) into single use aliquots and store frozen at −15 °C
or below. See Annex H for illustrative details of the preparation of dsDNA (used in the development of this
part of ISO/TS 15216).
5.3.9 External control (EC) RNA control material. Separate purified ssRNA carrying the target
sequence for each target virus shall be used. They shall contain levels of contaminating target DNA no
higher than 0,1 % and shall not cause RT-PCR inhibition. The concentrations of each EC RNA stock in
copies per microlitre shall be determined and stock shall be diluted to a concentration of 1 × 10 to
6 PROOF/ÉPREUVE © ISO 2012 – All rights reserved

ISO/TS 15216-1:2012(E)
1 × 10 template copies per microlitre. Split the diluted EC RNA preparation (EC RNA control material)
into single use aliquots and store frozen at −15 °C or below. See Annex I for illustrative details of the
preparation of EC RNA (used in the development of this part of ISO/TS 15216).
6 Apparatus and materials
[10]
Standard microbiological laboratory equipment (ISO 7218) and in particular the following.
6.1 Micropipettes and tips of a range of sizes, e.g. 1 000 μl, 200 μl, 20 μl, 10 μl.
6.2 Pipette filler and pipettes of a range of sizes, e.g. 25 ml, 10 ml, 5 ml.
6.3 Vortex mixer.
−1
6.4 Shaker capable of operating at approximately 500 min .
−1
6.5 Shaking incubator operating at (37 ± 10) °C and (320 ± 20) min or equivalent.
−1
6.6 Rocking platform(s) or equivalent for use at room temperature and (4 ± 2) °C at (60 ± 5) min .
6.7 Aspirator or equivalent apparatus for removing supernatant.
6.8 Heating block capable of operating at (95 ± 1,0) °C or equivalent.
6.9 Water bath capable of operating at (60 ± 2,0) °C or equivalent.
6.10 Refrigerated centrifuge(s) and rotor(s) capable of running at 10 000 × g with capacity for tubes
for ≥ 20 ml and for narrow gauge (15 mm is too large) chloroform-resistant tubes.
6.11 Bench centrifuge and rotor capable of running at 4 000 × g with capacity for tubes of 15 ml and
50 ml capacity.
6.12 Microcentrifuge.
6.13 Centrifuge and microcentrifuge tubes and bottles of a range of sizes, 1,5 ml, 5 ml, 15 ml, 50 ml,
etc. Narrow gauge (15 mm is too large) chloroform-resistant tubes with 1 ml capacity are necessary.
6.14 pH meter (or pH testing strips).
6.15 Sterile cotton swabs.
6.16 Mesh filter bags (400 ml).
6.17 Positively charged membrane filters with 0,45 μm pore size (47 mm diameter).
6.18 Centrifugal filter concentration devices with 15 ml capacity and 100 kDa relative molecular
mass cutoff.
6.19 Vacuum source or equivalent positive pressure apparatus for filtering and filtration tower with
aperture for 47 mm diameter membrane.
6.20 Sterile shucking knife [for opening bivalve molluscan shellfish (BMS)].
ISO/TS 15216-1:2012(E)
6.21 Rubber block for opening BMS.
6.22 Scissors.
6.23 Forceps.
6.24 Sterile Petri dishes.
6.25 Razor blades or equivalent homogenizer.
6.26 Heavy duty safety glove.
6.27 RNA extraction equipment suitable for extraction methods using silica and associated reagents
(5.2.16). See Annex C for illustrative details of RNA extraction apparatus (used in the development of this
part of ISO/TS 15216).
6.28 Thermal cycler(s) equipped with an energy source suitable for the excitation of fluorescent
molecules, and an optical detection system for real-time detection of fluorescence signals generated
during PCR with hydrolysis probe chemistry.
6.29 Associated consumables for real-time RT-PCR, e.g. optical plates and caps, suitable for use with
the selected PCR machine.
7 Sampling
If there is no specific International Standard dealing with the sampling of the product concerned, it is
recommended that the parties concerned come to an agreement on the subject.
It is important the laboratory receive a truly representative sample which has not been damaged or
changed during transport or storage.
8 Procedure
8.1 General laboratory requirements
Unfrozen samples arriving at the laboratory shall not be frozen prior to testing. Sample extraction and
PCR shall be carried out in separate working areas or rooms as specified in ISO 22174.
8.2 Virus extraction
The selection of method is dependent upon the food matrix under test.
8.2.1 Process control virus material
Immediately before a batch of test samples is processed, pool together sufficient aliquots of process
control virus material for all individual samples (allow 10 μl per test sample plus 25 μl excess).
−1
Dilute a (20 ± 0,5) μl portion of pooled process control virus material to 10 using water (5.2.1) and
store at (5 ± 3) °C for a maximum of 24 h or in single-use aliquots at −15 °C or below for longer periods.
8.2.2 Negative process control
A negative process control sample shall be run in parallel to test samples at a frequency determined as
part of the laboratory quality assurance programme.
8 PROOF/ÉPREUVE © ISO 2012 – All rights reserved

ISO/TS 15216-1:2012(E)
8.2.3 Food surfaces
Using a sterile cotton swab premoistened in PBS, intensively swab the surface (maximum area, 100 cm )
under test, applying a little pressure to detach virus particles. Record the approximate area swabbed in
square centimetres.
Immerse the swab in a tube containing (490 ± 5) μl lysis buffer, then press against the side of the tube
to release liquid. Repeat the immersion and pressing cycle three or four times to ensure maximum
yield of virus.
Add (10 ± 0,1) μl of process control virus material (8.2.1).
For rough surfaces that may cause deterioration of the swab, more than one swab may be required to
completely treat the target surface.
Retain for RNA extraction.
8.2.4 Soft fruit and salad vegetables
Coarsely chop (25 ± 0,3) g of soft fruits or salad vegetables into pieces of approximately 2,5 cm × 2,5 cm ×
2,5 cm (it is not necessary to chop if, for example, individual fruits are smaller than this) and transfer to
the sample compartment of a 400 ml mesh filter bag.
Add (40 ± 1) ml TGBE buffer (for soft fruit samples, add 30 units pectinase to the buffer) and (10 ± 0,1) μl
of process control virus material (8.2.1).
−1
Incubate at room temperature with constant rocking at approximately 60 min for (20 ± 1) min. For
acidic soft fruits, the pH of the eluate shall be monitored at 10 min intervals during incubation. If the pH
falls below 9,0, it shall be adjusted to 9,5 ± 0,1 with NaOH. Extend the period of incubation by 10 min for
every time the pH is adjusted. Decant the eluate from the filtered compartment into a centrifuge tube
(use two tubes if necessary to accommodate volume).
Clarify by centrifugation at 10 000 × g for (30 ± 5) min at (5 ± 3) °C.
Decant the supernatant into a single clean tube or bottle and adjust to pH 7,0 ± 0,5 with HCl.
Add 0,25 volumes of 5 × PEG/NaCl solution (to produce a final concentration of 100 g/l PEG 0,3 mol/l
−1
NaCl), homogenize by shaking for (60 ± 5) s then incubate with constant rocking at around 60 min at
(5 ± 3) °C for (60 ± 5) min.
Centrifuge at 10 000 × g for (30 ± 5) min at (5 ± 3) °C (split volume across two centrifuge tubes if necessary).
Decant and discard the supernatant, then centrifuge at 10 000 × g for (5 ± 1) min at (5 ± 3) °C to
compact the pellet.
Discard the supernatant and resuspend the pellet in (500 ± 10) μl PBS. If a single sample has been split
across two tubes, resuspend both pellets stepwise in the same aliquot of PBS.
For extraction from salad vegetables, transfer the suspension to a suitable tube and retain for RNA extraction.
For extraction from soft fruits, a further clarification step is required. Transfer the suspension to a
narrow gauge chloroform-resistant centrifuge tube. Add (500 ± 10) μl chloroform/butanol mixture,
vortex to mix, then incubate at room temperature for 5 min.
Centrifuge at 10 000 × g for (15 ± 1) min at (5 ± 3) °C. Carefully transfer the aqueous phase to a fresh
tube and retain for RNA extraction.
8.2.5 Bottled water
This part of ISO/TS 15216 is appropriate for volumes between 0,3 l and 5 l. For each sample, record the
volume tested.
ISO/TS 15216-1:2012(E)
Add (10 ± 0,1) μl of process control virus material (8.2.1) to the sample under test. Shake to mix.
Using a vacuum or positive pressure source, filter entire sample through a positively charged 47 mm
membrane using aseptic techniques. Transfer the filter into a sterile tube, then add (4 ± 0,1) ml of TGBE buffer.
−1
Add (10 ± 0,2) ml TGBE buffer to the empty bottle. Shake both tube and bottle at approximately 500 min
for (20 ± 5) min.
Pool the eluates from the tube and bottle together in a single clean tube.
Rinse the interior walls of the bottle with an additional (2 ± 0,1) ml TGBE buffer by gentle shaking and
inversion by hand, and add to the tube.
Adjust the eluates to pH 7,0 ± 0,5 with 0,1 mol/l HCl and transfer to a centrifugal filter concentration device.
Centrifuge at 4 000 × g for (15 ± 1) min. Transfer the concentrate to a clean tube.
Adjust the volume to (500 ± 10) μl with PBS. Retain for RNA extraction.
8.2.6 Bivalve molluscan shellfish
BMS for analysis shall be live, or if frozen, undamaged. Mud adhering to the shell shall be removed. BMS
shall not be reimmersed in water.
Open the shells of a minimum of 10 BMS with a sterile shucking knife. When opening, ensure that the
hand holding the animal is protected with a heavy-duty safety glove.
Dissect out the digestive glands from all animals using scissors and forceps or equivalent and transfer
to a clean Petri dish. A minimum combined gland mass of (2,0 ± 0,2) g is required.
Finely chop the digestive glands with a razor blade or equivalent homogenizer to a paste-like consistency,
then transfer a (2,0 ± 0,2) g portion into a centrifuge tube.
Add (10 ± 0,1) μl of process control virus material (8.2.1).
Add (2,0 ± 0,2) ml of proteinase K solution and mix. Incubate at (37 ± 1,0) °C with shaking at approximately
−1
320 min in a shaking incubator or equivalent for (60 ± 5) min.
Carry out a secondary incubation by placing the tube in a water bath or equivalent at (60 ± 2,0) °C for
(15 ± 1) min.
Centrifuge at 3 000 × g for (5,0 ± 0,5) min, decant the supernatant into a clean tube, measure and record
the volume of supernatant, in millilitres, and retain for RNA extraction.
8.3 RNA extraction
Extract RNA from (500 ± 10) μl of each sample using an appropriate guanidine thiocyanate disruption
and silica adsorption-based method. Elute purified RNA into (100 ± 2) μl of elution buffer and retain for
real-time RT-PCR analysis. Extracted RNA shall be processed immediately, stored at (5 ± 3) °C for <8 h
or at −15 °C or below for up to 6 months.
For long-term storage, a temperature of (– 80 ± 5) °C is recommended.
For each batch of samples tested, a negative extraction control shall be included unless the batch includes
a negative process control (8.2.2). RNA extraction shall be carried out using the same method in parallel
on (500 ± 10) μl of water (5.2.1).
See Annex C for illustrative details of an RNA extraction method (used in the development of this part
of ISO/TS 15216).
10 PROOF/ÉPREUVE © ISO 2012 – All rights reserved

ISO/TS 15216-1:2012(E)
8.4 Real-time RT-PCR
8.4.1 General requirements
The minimum requirements for the amplification and detection of nucleic acid sequences by real-time
PCR are specified in ISO 22174.
8.4.2 Real-time RT-PCR
This part of ISO/TS 15216 describes methods for the detection of HAV, norovirus genogroup I and
norovirus genogroup II.
Under certain circumstances, testing for all three viruses in a single sample is not necessary. The
procedure described in the following enables a test sample to be analysed for one virus (i.e. HAV, norovirus
genogroup I or norovirus genogroup II) and includes a full set of recommended controls. Laboratories
wishing to test for more than one target shall adjust the reaction format to accommodate additional
tests. A typical plate layout is included as Annex F. Alternative approaches for RT-PCR inhibition control
that can be demonstrated to provide equivalent performance to the use of EC RNA are permitted.
8.4.2.1 Analysis of target virus
−1
Prepare 10 dilutions of each sample RNA in water (5.2.1).
−1 −2 −3 −4
Prepare 10 ,10 ,10 and 10 dilutions of target dsDNA control material in water (5.2.1).
For each sample prepare
— two wells of an optical plate with (5 ± 0,1) μl of undiluted sample RNA;
−1
— two wells with (5 ± 0,1) μl of 10 sample RNA;
— one well with (5 ± 0,1μl) of undiluted sample RNA and (1 ± 0,05) μl of undiluted EC RNA;
−1
— one well with (5 ± 0,1 μl) of 10 sample RNA and (1 ± 0,05) μl of undiluted EC RNA.
For the EC RNA control prepare:
— one well with (5 ± 0,1) μl of water (5.2.1) and (1 ± 0,05) μl of undiluted EC RNA.
For the dsDNA standard curve prepare:
— two wells with (5 ± 0,1) μl of undiluted dsDNA;
−1
— two wells with (5 ± 0,1) μl of 10 dsDNA;
−2
— two wells with (5 ± 0,1) μl of 10 dsDNA;
−3
— two wells with (5 ± 0,1) μl of 10 dsDNA;
−4
— two wells with (5 ± 0,1) μl of 10 dsDNA.
For negative controls prepare:
— one well with (5 ± 0,)1 μl of water (5.2.1);
— one well with (5 ± 0,1) μl of negative extraction control or negative process control RNA
Add (20 ± 0,5) μl of the relevant real-time RT-PCR mastermix (5.3.7) to each well (mastermix may also
be added to all relevant wells before addition of template material).
ISO/TS 15216-1:2012(E)
8.4.2.2 Analysis of process control virus
−1
Defrost if necessary one aliquot of diluted (10 ) process control virus material (8.2.1) for the batch used
with the samples under test.
Heat at (95 ± 2) °C for (
...

SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 15216-1
Première édition
2013-03-15
Version corrigée
2013-05-01
Microbiologie des aliments —
Méthode horizontale pour la
recherche des virus de l’hépatite A
et norovirus dans les aliments par la
technique RT-PCR en temps réel —
Partie 1:
Méthode de quantification
Microbiology of food and animal feed — Horizontal method for
determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-
time RT-PCR —
Part 1: Method for quantification
Numéro de référence
©
ISO 2013
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2013
Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée
sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail [e-mail]
Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2013 – Tous droits réservés

Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .viii
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 3
4.1 Extraction de virus . 3
4.2 Extraction d’ARN . 4
4.3 Transcription inverse suivie d’une réaction de polymérisation en chaîne en temps réel
(RT-PCR en temps réel) . 4
4.4 Témoins . 4
4.5 Résultats des essais . 5
5 Réactifs . 5
5.1 Généralités . 5
5.2 Réactifs utilisés dans l’état . 5
5.3 Réactifs préparés . 6
6 Appareillage et matériaux . 7
7 Échantillonnage . 9
8 Mode opératoire. 9
8.1 Exigences générales de laboratoire . 9
8.2 Extraction de virus . 9
8.3 Extraction d’ARN .11
8.4 RT-PCR en temps réel .12
9 Interprétation des résultats .14
9.1 Généralités .14
9.2 Élaboration des courbes étalon .14
9.3 Calcul de l’efficacité de l’amplification .14
9.4 Calcul du rendement d’extraction .15
9.5 Quantification d’échantillon .15
9.6 Limite de détection théorique .15
10 Expression des résultats.16
11 Rapport d’essai .16
Annexe A (normative) Diagramme de mode opératoire.17
Annexe B (informative) Mélanges maîtres (MasterMix) de la technique RT-PCR en temps réel et
paramètres de cycles .18
Annexe C (informative) Amorces et sondes d’hydrolyse de la technique RT-PCR en temps réel pour
la détection du VHA, du norovirus GI et GII et du virus Mengo(témoin de processus) .19
Annexe D (informative) Croissance de la souche du virus Mengo MC utilisé comme témoin
de processus .21 ®
Annexe E (informative) Extraction d’ARN par l’utilisation du système NucliSens de
chez BioMerieux .22
Annexe F (normative) Composition et préparation des réactifs et des tampons .24
Annexe G (informative) Préparations mères des témoins d’ADN double brin (ADNdb).26
Annexe H (informative) Préparations mères d’ARN témoin externe .28
Annexe I (informative) Disposition de plaque optique type .30
Bibliographie .31
iv © ISO 2013 – Tous droits réservés

Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives
ISO/CEI, Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de
Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote.
Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
Dans d’autres circonstances, en particulier lorsqu’il existe une demande urgente du marché, un comité
technique peut décider de publier d’autres types de documents:
— une Spécification publiquement disponible ISO (ISO/PAS) représente un accord entre les experts
dans un groupe de travail ISO et est acceptée pour publication si elle est approuvée par plus de 50 %
des membres votants du comité dont relève le groupe de travail;
— une Spécification technique ISO (ISO/TS) représente un accord entre les membres d’un comité technique
et est acceptée pour publication si elle est approuvée par 2/3 des membres votants du comité.
Une ISO/PAS ou ISO/TS fait l’objet d’un examen après trois ans afin de décider si elle est confirmée pour
trois nouvelles années, révisée pour devenir une Norme internationale, ou annulée. Lorsqu’une ISO/PAS
ou ISO/TS a été confirmée, elle fait l’objet d’un nouvel examen après trois ans qui décidera soit de sa
transformation en Norme internationale soit de son annulation.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’ISO/TS 15216-1 a été élaborée par le comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec
le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie, conformément à
l’Accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
La présente version corrigée de l’ISO/TS 15216-1:2013 incorpore les corrections suivantes.
— Dans l’ensemble du document, les références textuelles ont été mises à jour afin de prendre en
compte la réorganisation des annexes. Précédemment, l’Annexe B était l’Annexe E; l’Annexe C était
l’Annexe D; l’Annexe D était l’Annexe G; l’Annexe E était l’Annexe C; l’Annexe F était l’Annexe B;
l’Annexe G était l’Annexe H, l’Annexe H était l’Annexe I, l’Annexe I était l’Annexe F.
— De nombreuses références croisées aux paragraphes relatifs aux réactifs et à l’appareillage sont ajoutées.
−1 −1
— Lorsque les unités sont mentionnées pour les étapes d’agitation, «oscillations min » remplace «min ».
— Une phrase faisant référence à l’Annexe A est ajoutée à la fin de l’introduction.
— Les définitions relatives à la «surface alimentaire» (précédemment 3.2 et 3.3) ont été combinées
et développées dans un article 3.2 reformulé; en conséquence les termes suivants de l’Article 3
sont renumérotés.
— En 3.4, Note 2, «Il n’existe qu’un sérotype.» est déplacé en fin de Note 1. En outre, «un agent biologique
de groupe 2 par l’Union européenne et un agent pathogène du groupe de risque 2 selon les United
States National Institutes of Health» remplace «un agent pathogène du groupe de risque 2 selon
l’ACDP (Advisory Committee on Dangerous Pathogens, Royaume-Uni)».
— En 3.5, Note 2, «des agents biologiques de groupe 2 par l’Union européenne et des agents pathogènes
du groupe de risque 2 selon les United States National Institutes of Health» remplace «des agents
pathogènes du groupe de risque 2 selon l’ACDP».
— En 3.6 et 3.7, «estimation du nombre de copies» remplace «quantification».
— En 3.13, «utilisée» remplace «utilisée à la place de l’ADN initial».
— En 5.2.11, «d’Aspergillus niger ou A. aculeatus» est ajouté après «Pectinase».
— En 6.1, «Il convient d’utiliser des pointes résistant aux aérosols sauf si des pointes dégagées sont
requises, par exemple pour l’aspiration» est ajouté.
— En 6.5, «37 ± 1,0» remplace «37 ± 10».
— Une version reformulée de 6.10 concernant les centrifugeuse(s) et rotor(s) remplace les anciens 6.10
et 6.11, avec pour conséquence la renumérotation des paragraphes suivants.
— En 6.19, les crochets sont supprimés.
— En 6.27, «Machine(s) PCR en temps réel, c’est-à-dire thermocycleur(s)» remplace «Thermocycleur(s)».
— En 6.28, «machine PCR en temps réels sélectionnée» remplace «machine PCR sélectionnée».
— En 8.1, «Il convient de décongeler les échantillons qui arrivent déjà congelés avant d’effectuer
l’essai.» est inséré en tant que deuxième phrase.
— 8.2.3 est reformulé.
— En 8.2.4, alinéa 2, «tampon TGBE (5.3.5) (pour les fruits rouges, ajouter 30 unités de pectinase d’A.
niger ou 1 140 unités de pectinase d’A. aculeatus au tampon)» remplace «tampon TGBE (pour les
fruits rouges, ajouter 30 unités de pectinase au tampon)».
— En 8.2.6, alinéa 2, «et que l’animal est soutenu à l’aide d’un bloc de caoutchouc» est ajouté.
— En 8.2.6, dernier alinéa, «(5,0 ± 0,5) min à température ambiante, décanter» remplace
«(5,0 ± 0,5) min, décanter».
— En 8.4.2.3, alinéa 1, «au moyen d’une machine PCR en temps réel (6.27)» est ajouté.
— En 9.3, Note 1, «Pour une courbe étalon établie pour l’ADNdb ayant une pente idéale de −3,32, si
la valeur C du puits de l’échantillon ARN + ARN TE est <2,00 supérieure à la valeur C du puits
q q
eau + ARN TE, le rendement d’amplification est >25 % et donc acceptable; si la valeur C du puits de
q
l’échantillon ARN + ARN TE est >2,00 supérieure à la valeur C du puits eau + ARN TE, le rendement
q
d’amplification est <25 % et donc inacceptable» est ajouté.
— En 9.4, Note 1, «une récupération du virus témoin de processus (égale à l’efficacité d’extraction dans
des matrices autres que des matrices BMS) de 100%. Pour une courbe étalon établie pour l’ARN
viral témoin de processus ayant une pente idéale de −3,32, si la valeur C d’un puits d’échantillon
q
d’ARN non dilué est <6,64 supérieure à la valeur C de l’ARN viral témoin de processus non dilué,
q
la récupération du virus témoin de processus pour cet échantillon est >1 % et donc acceptable»
remplace «une efficacité d’amplification de 100 %».
— Le titre de l’Annexe B a été développé sous la forme «Mélanges maîtres (MasterMix) de la technique
RT-PCR en temps réel et paramètres de cycles».
— Dans le Tableau B.1, note de bas de tableau a, «machines PCR en temps réel» remplace deux fois
«machines en temps réel».
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— En C.1, «Cette série d’amorces amplifie un produit de 173 bp correspondant aux nucléotides 68-240
de l’isolat VHA HM174 43c (numéro d’accès GenBank M59809)» est ajouté comme alinéa 2.
— En C2, «Cette série d’amorces amplifie un produit de 86 bp correspondant aux nucléotides 5291-
5376 du virus Norwalk (numéro d’accès GenBank M87661)» est ajouté comme alinéa 2.
— En C.3, «Cette série d’amorces amplifie un produit de 89 bp correspondant aux nucléotides 5012-
5100 du virus Lordsdale (numéro d’accès GenBank X86557)» est ajouté comme alinéa 2.
— En C.4, «Cette série d’amorces amplifie un produit de 100 bp correspondant aux nucléotides 110-
209 de la souche du virus Mengo MC deletant utilisée pour l’élaboration de la présente partie de
l’ISO/TS 15216. Cela correspond aux nucléotides 110-270 de l’isolat M du virus Mengo non deletant
(numéro d’accès GenBank L22089)» est ajouté comme alinéa 2.
— En H.5, «mélange maître non traité (si la différence entre les valeurs C de la préparation mère de l’ARN TE
q
soumis à essai avec un mélange maître traité par la chaleur et non traité est <10 pour une courbe étalon
établie pour l’ADNdb ayant une pente idéale de −3,32)» remplace «mélange maître non traité».
L’ISO/TS 15216 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Microbiologie des
aliments — Méthode horizontale pour la recherche des virus de l’hépatite A et norovirus dans les aliments
par la technique RT-PCR en temps réel:
— Partie 1: Méthode de quantification
— Partie 2: Méthode de détection qualitative
Introduction
Le virus de l’hépatite A (VHA) et les norovirus (NoV) sont des agents importants de maladies virales
d’origine alimentaire, chez l’humain. Aucune méthode de routine n’existe pour la culture desdits virus à
partir de matrices alimentaires. La détection dépend ainsi des méthodes moléculaires qui utilisent une
transcription inverse suivie d’une réaction de polymérisation en chaîne (RT-PCR). Étant donné que de
nombreuses matrices alimentaires contiennent des substances inhibitrices de la technique RT-PCR, il est
nécessaire d’utiliser une méthode d’extraction produisant des préparations d’ARN extrêmement pures et
prêtes à l’emploi. En ce qui concerne les surfaces alimentaires, les virus sont prélevés par écouvillonnage.
L’extraction de virus dans les fruits rouges et les salades s’effectue par élution sous agitation suivie
d’une précipitation au PEG/NaCI. Pour l’eau embouteillée, une adsorption et une élution utilisant des
membranes chargées positivement, suivie d’une étape de concentration par ultrafiltration est utilisée,
les virus des mollusques bivalves, sont eux extraits des tissus des glandes digestives par traitement avec
une solution de protéinase K. Pour toutes les matrices qui ne sont couvertes par la présente Spécification
technique, il est nécessaire de valider cette méthode. La méthode d’extraction d’ARN, commune à toutes
les matrices, est basée sur la dislocation de la capside du virus par des réactifs chaotropiques, suivie
d’une adsorption de l’ARN sur des particules de silice. La technique de RT-PCR en temps réel permet de
suivre l’amplification tout au long des cycles de PCR en mesurant l’excitation de molécules marquées
par fluorescence. Lors d’une réaction RT-PCR en temps réel utilisant une nucléase marquée en 5’, les
composés fluorescents sont fixés à une sonde nucléotidique propre à une séquence (sonde d’hydrolyse),
ce qui permet aussi une confirmation simultanée de la présence de l’ADN initial ciblé. Ces modifications
augmentent la sensibilité et la spécificité de la méthode PCR, et rendent alors inutiles les étapes de
confirmation post PCR par amplifications supplémentaires. En raison de la complexité de la méthode,
il est nécessaire d’inclure une série exhaustive de témoins. La méthode décrite dans la présente partie
de l’ISO/TS 15216 permet une quantification des niveaux d’ARN de virus dans l’échantillon pour essai.
L’Annexe A présente un diagramme de mode opératoire.
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SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 15216-1:2013(F)
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour
la recherche des virus de l’hépatite A et norovirus dans les
aliments par la technique RT-PCR en temps réel —
Partie 1:
Méthode de quantification
1 Domaine d’application
La présente partie de l’ISO/TS 15216 décrit une méthode de quantification des niveaux de VHA et NoV
des génogroupes I (GI) et II (GII) présents dans des échantillons pour essai d’aliments ou sur des surfaces
alimentaires. Après libération des virus contenus dans l’échantillon pour essai, l’ARN viral est extrait
par lyse à l’aide de thiocyanate de guanidine et par adsorption sur silice. Les séquences cibles de l’ARN
viral sont amplifiées et détectées par la technique RT-PCR en temps réel.
Cette approche est aussi applicable pour la détection desdits virus sur des matières contaminées, ou
d’autres virus humains dans les aliments, sur les surfaces alimentaires ou sur les matières contaminées
en suivant une validation appropriée et en utilisant des jeux d’amorces et de sondes propres à la cible.
2 Références normatives
Les documents suivants, en tout ou partie, sont référencés de manière normative dans le présent
document et sont indispensables pour son application. Pour les références datées, seule l’édition citée
s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y
compris les éventuels amendements).
ISO 22174, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la recherche de
micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l’ISO 22174 ainsi que les
suivants s’appliquent.
3.1
aliment
substance utilisée ou préparée pour être utilisée comme aliment
Note 1 à l’article: Pour les besoins de la présente partie de l’ISO/TS 15216, cette définition inclut l’eau embouteillée.
3.2
surface alimentaire
surface des aliments, surface de préparation des aliments ou surface en contact avec les aliments
3.3
matières contaminées
objets ou matériaux inanimés sur lesquels des agents infectieux peuvent être transportés
3.4
virus de l’hépatite A
VHA
membre de la famille des Picornaviridae responsable des hépatites infectieuses
Note 1 à l’article: Génétiquement, le VHA peut être subdivisé en six génotypes sur la base de région VP1/2A (des
génotypes 1, 2 et 3 ont été trouvés chez les humains alors que les génotypes 4, 5 et 6 sont d’origine simienne). Il
n’existe qu’un sérotype.
Note 2 à l’article: La transmission se fait par voie féco-orale de personne à personne, par la consommation d’aliments
contaminés, au contact avec de l’eau ou des surfaces alimentaires contaminées, ou bien par le contact avec des
matières contaminées. Le virus de l’hépatite A est classé comme étant un agent biologique de groupe 2 par l’Union
européenne et un agent pathogène du groupe de risque 2 selon les United States National Institutes of Health.
3.5
norovirus
membre de la famille des Caliciviridae responsable des cas sporadiques et des épidémies de
gastroentérites aiguës
Note 1 à l’article: Génétiquement, les norovirus peuvent être subdivisés en cinq génogroupes distincts.
Note 2 à l’article: Trois de ces génogroupes, GI, GII et GIV ont été impliqués dans des troubles gastro-intestinaux
chez l’homme. GI et GII sont responsables de la grande majorité des cas cliniques. La transmission se fait par
voie féco-orale de personne à personne, par la consommation d’aliments contaminés, au contact avec de l’eau ou
des surfaces alimentaires contaminées, ou bien par le contact avec des matières contaminées. Les norovirus des
génogroupes I et II sont classés comme étant des agents biologiques de groupe 2 par l’Union européenne et des
agents pathogènes du groupe de risque 2 selon les United States National Institutes of Health.
3.6
quantification du virus de l’hépatite A
estimation du nombre de copies de l’ARN du VHA dans un rapport masse ou volume prédéterminé
d’aliments, ou sur une superficie de surface alimentaire
3.7
quantification des norovirus
estimation du nombre de copies de l’ARN du norovirus dans un rapport masse ou volume prédéterminé
d’aliments, ou sur une superficie de surface alimentaire
3.8
virus témoin de processus
virus ajouté à la prise d’échantillon, à la première occasion précédant l’extraction du virus, afin de
contrôler le rendement de l’extraction
3.9
ARN viral témoin de processus
ARN libéré par le virus témoin de processus permettant d’obtenir des données pour établir une courbe
étalon en vue de l’estimation du rendement de l’extraction
3.10
témoin négatif d’extraction d’ARN
témoin sans ARN cible soumis à toutes les étapes du mode opératoire d’extraction d’ARN et de détection
permettant de s’assurer de l’absence de contamination croisée
3.11
témoin négatif de processus
échantillon de la matrice d’aliment sans agent pathogène cible soumis à toutes les étapes du
processus d’analyse
3.12
sonde d’hydrolyse
sonde fluorescente couplée à deux molécules fluorescentes qui sont séparées de façon stérique par
l’activité d’exonucléase en 5’-3’ de l’enzyme pendant le processus d’amplification
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3.13
témoin négatif de RT-PCR
aliquote d’eau très pure utilisée dans une réaction RT-PCR en temps réel permettant de s’assurer de la
non-contamination des réactifs de RT-PCR en temps réel
3.14
témoin externe d’ARN
ARN de référence pouvant servir de cible pour une réaction PCR en temps réel appropriée, par exemple
un ARN synthétisé par une transcription in vitro à partir d’un plasmide portant une copie du gêne cible,
qui est ajouté à une aliquote d’ARN de l’échantillon selon une quantité donnée servant de témoin pour
l’amplification d’une réaction distincte
3.15
valeur C
q
cycle de quantification, cycle de réaction PCR durant lequel la cible est quantifiée au cours d’une réaction
donnée de PCR en temps réel
Note 1 à l’article: Cela correspond au point auquel la réaction de fluorescence dépasse un niveau seuil.
3.16
limite de détection théorique
LDDt
niveau qui constitue la plus petite quantité de cible pouvant, en théorie, être détectée
Note 1 à l’article: Cela correspond à une copie d’un génome par unité de volume d’ARN cible soumis à essai mais
qui varie en fonction de la matrice d’essai et de la quantité de matière disponible au départ.
3.17
limite de détection pratique
LDDp
plus petite concentration de cible dans un échantillon essai qui peut être détectée de façon reproductible
(intervalle de confiance de 95 %) dans les conditions expérimentales spécifiées dans la méthode, vérifiée
par un essai de reproductibilité interlaboratoires ou une autre validation
Note 1 à l’article: La LDDp dépend de la prise d’essai, de la qualité ou de la quantité d’ARN initial et de la LDDt
de la méthode.
3.18
limite de quantification
LDQ
plus petite concentration de cible dans un échantillon pour essai qui peut être déterminée de façon
quantitative avec un niveau acceptable de fidélité et d’exactitude dans les conditions expérimentales
spécifiées dans la méthode, vérifiée par un essai de reproductibilité interlaboratoires ou une autre validation
Note 1 à l’article: La LDQ dépend de la prise d’échantillon et de la qualité ou de la quantité de l’ARN initial.
4 Principe
4.1 Extraction de virus
Les aliments et les surfaces alimentaires couverts par la présente partie de l’ISO/TS 15216 sont souvent
des matrices hautement complexes et les virus cibles peuvent être présents à de petites concentrations.
Il est donc nécessaire d’effectuer une extraction et/ou une concentration du virus propre à la matrice
afin de produire un substrat pour les parties communes ultérieures du processus. Le choix de la méthode
dépend de la matrice.
4.2 Extraction d’ARN
Il est nécessaire d’extraire l’ARN en utilisant une méthode qui permette d’obtenir des préparations
d’ARN pures afin de réduire les effets des inhibiteurs de PCR. Dans la présente partie de l’ISO/TS 15216,
le thiocyanate de guanidine, réactif chaotropique, est utilisé pour la dislocation de la capside du virus.
L’ARN est ensuite adsorbé sur silice afin de faciliter la purification à travers plusieurs étapes de lavage.
L’ARN viral purifié est libéré de la silice dans un tampon avant la réaction RT-PCR en temps réel.
4.3 Transcription inverse suivie d’une réaction de polymérisation en chaîne en temps
réel (RT-PCR en temps réel)
La présente partie de l’ISO/TS 15216 se base sur la réaction RT-PCR en temps réel en une étape utilisant
des sondes d’hydrolyse. Dans la technique RT-PCR en temps réel en une étape, la transcription inverse et
l’amplification par PCR sont effectuées consécutivement dans le même tube.
La réaction PCR en temps réel utilisant des sondes d’hydrolyse emploie une sonde d’ADN courte marquée
par une molécule fluorescente à une extrémité et un quencher fluorescent à l’extrémité opposée. La
chimie de cette réaction PCR garantit qu’à mesure que la quantité de produit amplifié augmente, la sonde
d’ADN est coupée et le signal fluorescent provenant du marqueur augmente proportionnellement. La
fluorescence peut être mesurée à chaque étape tout au long du cycle. Le premier niveau d’amplification
détectable dans le cycle de toute réaction PCR est proportionnel à la quantité d’ADN initial, ainsi
l’analyse des courbes de fluorescence permet une détermination de la quantité de séquence cible dans
l’échantillon.
En raison des faibles concentrations de virus dans les aliments et de la diversité des souches dans les virus
ciblés, il est important de sélectionner de façon adéquate des réactifs pour RT-PCR en temps réel en une
étape, des amorces PCR et des sondes d’hydrolyse pour les virus ciblés. Pour cela, des recommandations
sont données en 5.2.17 et en 5.2.18. Des exemples détaillés de réactifs, d’amorces et de sondes (utilisés
lors de l’élaboration de la présente partie de l’ISO/TS 15216) sont fournis dans les Annexes B et C.
4.4 Témoins
4.4.1 Virus témoin de processus
Des pertes de virus témoins peuvent se produire à différentes étapes lors de l’extraction de virus dans
l’échantillon et de l’extraction de l’ARN. Afin de contrôler ces pertes, les échantillons sont contaminés
artificiellement avant le processus avec une quantité définie de virus témoin de processus. Le niveau de
récupération du virus témoin de processus doit être déterminé pour chaque échantillon.
Le virus sélectionné en tant que témoin de processus doit être un virus cultivable, sans enveloppe, à
ARNsb (simple brin) de polarité positive, de taille similaire aux virus cibles afin de fournir un modèle
morphologique et physico-chimique correct. Le virus témoin de processus doit montrer une persistance
dans l’environnement semblable aux virus cibles. Le virus doit être suffisamment différent sur le plan
génétique par rapport aux virus cibles afin de ne pas avoir de réactions PCR croisées entre virus cibles
et virus témoins, et sa présence dans les aliments à l’état naturel ne doit normalement pas être attendue.
Un exemple de préparation du virus témoin de processus (utilisé lors de l’élaboration de la présente
partie de l’ISO/TS 15216) est fourni dans l’Annexe D.
4.4.2 Témoin ADN double brin (ADNdb)
Pour la quantification du virus cible, les résultats doivent être associés à un étalon de concentration
connue. Une série de dilutions d’ADN double brin comportant la séquence cible d’intérêt (5.3.8) et
quantifiée par spectrophotométrie doit être utilisée pour produire une courbe étalon exprimée en
copies d’ADN initial par microlitre. Se référer à la courbe étalon permet la quantification de l’échantillon
en nombres de copies de génome viral détectable par microlitre.
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4.4.3 ARN témoin positif externe (TE)
Des substances inhibitrices de la réaction RT-PCR sont contenues dans de nombreux aliments, mais
peuvent également provenir d’une contamination due à un traitement effectué en amont. Afin de vérifier
l’éventuelle inhibition de la RT-PCR dans un échantillon individuel, un ARN témoin positif externe (une
espèce à ARN portant la séquence cible d’intérêt, 5.3.9) est ajouté à une aliquote d’ARN de l’échantillon
et soumis à essai en utilisant la méthode RT-PCR. Une comparaison des résultats de cet essai avec les
résultats d’un ARN témoin positif externe en l’absence d’ARN de l’échantillon permet la détermination
du niveau d’inhibition de la réaction RT-PCR dans chaque échantillon soumis à essai.
Il est permis d’appliquer des approches différentes pour le contrôle de l’inhibition de la réaction RT-PCR
sous réserve de faire la démonstration de l’équivalence de leurs performances par rapport à celles de la
méthode utilisant l’ARN témoin externe.
4.5 Résultats des essais
Cette méthode fournit un résultat exprimé en nombres de copies de génome viral détectable par
millilitre, par gramme, ou par centimètre carré. Dans les échantillons où le virus n’est pas détecté, les
résultats doivent être reportés comme «non détecté, par gramme, ou par centimètre carré» où z est la limite de détection (LDD) dans l’échantillon.
5 Réactifs
5.1 Généralités
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
[10]
En ce qui concerne les pratiques de laboratoires en vigueur, voir l’ISO 7218 .
5.2 Réactifs utilisés dans l’état
5.2.1 Eau de qualité biologie moléculaire.
5.2.2 Polyéthylène glycol (PEG), de masse moléculaire relative moyenne 8 000.
5.2.3 Chlorure de sodium (NaCl).
5.2.4 Chlorure de potassium (KCl).
5.2.5 Hydrogénophosphate de sodium (Na HPO ).
2 4
5.2.6 Dihydrogénophosphate de potassium (KH PO ).
2 4
5.2.7 Tris base.
5.2.8 Glycine.
5.2.9 Extrait de viande de bœuf en poudre.
5.2.10 Protéinase K (30 U/mg).
5.2.11 Pectinase d’Aspergillus niger ou A. aculeatus.
5.2.12 Chloroforme.
5.2.13 Butanol.
5.2.14 Hydroxyde de sodium (NaOH).
5.2.15 Acide chlorhydrique (HCl).
5.2.16 Silice, tampons de lyse, de lavage et d’élution pour l’extraction de l’ARN viral. Les réactifs
doivent permettre d’obtenir 500 μl de virus extrait, par réaction de lyse dans un tampon chaotropique
contenant du thiocyanate de guanidine (Référence [1]) et en utilisant la silice comme matrice liant l’ARN.
Après traitement de l’ARN lié à la silice par un ou des tampons de lavage éliminant les impuretés, l’ARN
doit être élué dans 100 µl de tampon d’élution.
La préparation d’ARN doit être d’une qualité et d’une concentration adaptée aux fins prévues. Voir
l’Annexe E pour les détails d’un exemple de réactifs d’extraction d’ARN (utilisés lors de l’élaboration de
la méthode décrite dans la présente partie de l’ISO/TS 15216).
5.2.17 Réactifs pour la réaction RT-PCR en temps réel en une étape. Les réactifs doivent permettre
le traitement de 5 µl d’ARN dans un volume total de 25 µl. Ils doivent être adaptés à la réaction de RT-
PCR en une étape en utilisant des sondes d’hydrolyses (l’ADN polymérase utilisée doit posséder une
activité exonucléasique en 5’-3’) et ils doivent présenter une sensibilité suffisante pour la détection de
concentrations d’ARN viraux, habituellement rencontrées dans les aliments contaminés en virus. Voir
l’Annexe B pour les détails d’un exemple de réactifs utilisés pour la RT-PCR en temps réel en une étape
(utilisés lors de l’élaboration de la méthode décrite dans la présente partie de l’ISO/TS 15216).
5.2.18 Amorces et sondes d’hydrolyse pour la détection de VHA et de norovirus GI et GII. Les
séquences d’amorce et de sonde d’hydrolyse doivent être publiées dans une revue révisée par des pairs
et doivent être comparées aux séquences d’un large éventail de souches du virus cible. Les amorces
de détection du VHA doivent cibler la région 5’ non codante du génome. Les amorces de détection du
norovirus GI et GII doivent cibler la jonction ORF1/ORF2 du génome. Voir l’Annexe C pour les détails d’un
exemple d’amorces et de sondes d’hydrolyse (utilisées lors de l’élaboration de la méthode décrite dans la
présente partie de l’ISO/TS 15216).
5.2.19 Amorces et sondes d’hydrolyse pour la détection de virus témoin de processus. Les
séquences d’amorce et de sonde d’hydrolyse doivent être publiées dans une revue révisée par des pairs
et doivent être comparées aux séquences de la souche de virus témoin de processus. Elles ne doivent
démontrer aucune amplification croisée avec le virus cible.
5.3 Réactifs préparés
En raison du nombre élevé de réactifs requérant une préparation individuelle, les détails de composition
et de préparation sont donnés dans l’Annexe F.
5.3.1 Solution 5 × PEG/NaCl (500 g/l PEG 8 000, 1,5 mol/l NaCl). Voir F.1.
5.3.2 Mélange chloroforme/butanol. Voir F.2.
5.3.3 Solution de protéinase K. Voir F.3.
5.3.4 Solution de tampon phosphate salin (PBS). Voir F.4.
5.3.5 Tampon Tris glycine contenant 1 % d’extrait de bœuf (TGBE). Voir F.5.
5.3.6 Matériau viral témoin de processus. La solution de virus témoin de processus doit être diluée
par un facteur de 10 au minimum dans un tampon approprié, par exemple le PBS (5.3.4). Cette dilution
doit permettre une détection sans inhibition du génome du virus témoin de processus lors d’une réaction
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RT-PCR en temps réel mais doit être suffisamment concentrée pour déterminer, de façon reproductible, la
dilution la moins concentrée, utilisée pour la courbe étalon de l’ARN viral témoin de processus (8.4.2.2).
Scinder le matériau viral témoin de processus dilué en aliquotes à usage unique et les conserver à
(–80 ± 5) °C. Voir l’Annexe D pour les détails d’un exemple de préparation de virus témoin de processus
(utilisée lors de l’élaboration de la méthode décrite dans la présente partie de l’ISO/TS 15216).
5.3.7 Mélanges maîtres de la réaction RT-PCR en temps réel pour les virus cible et témoin de
processus. Les réactifs doivent être ajoutés dans des quantités telles que spécifiées par les fabricants
(5.2.17) afin d’obtenir un mélange maître de 20 µl par réaction dans un volume total de 25 µl. Des
concentrations optimales d’amorces et de sondes doivent être utilisées, après leur détermination, en
suivant les recommandations des fabricants de réactif. Voir l’Annexe B pour les détails d’un exemple de
mélanges maîtres pour RT-PCR en temps réel (utilisés lors de l’élaboration de la méthode décrite dans la
présente partie de l’ISO/TS 15216).
5.3.8 Matériau témoin d’ADN double brin (ADNdb). Des plasmides purifiés séparément portant
chacun la séquence cible de chaque virus cible doivent être utilisés. Les préparations ne doivent pas
causer une inhibition de la RT-PCR. Les concentrations de chaque préparation mère d’ADNdb en nombre
de copies d’ADN initial par microlitre doivent être déterminées, puis la préparation doit être diluée jusqu’à
4 5
une concentration de 1 × 10 à 1 × 10 copies d’ADN initial par microlitre. Scinder la préparation d’ADNdb
diluée (matériau témoin d’ADNdb) en aliquotes à usage unique et les conserver à l’état congelé à une
température inférieure ou égale à −15 °C. Voir l’Annexe G pour les détails d’un exemple de préparation
d’ADNdb (utilisée lors de l’élaboration de la méthode décrite dans la présente partie de l’ISO/TS 15216).
5.3.9 Témoin externe (TE) matériau témoin d’ARN. Des ARNsb purifiés séparément portant chacun
la séquence cible de chaque virus cible doivent être utilisés. Ils doivent contenir des concentrations d’ADN
cible contaminant inférieures à 0,1 % et ne doivent pas causer d’inhibition de la réaction RT-PCR. Les
concentrations de chaque préparation mère d’ARN TE en nombre de copies par microlitre doivent être
6 8
déterminées et cette préparation doit être diluée jusqu’à une concentration de 1 × 10 à 1 × 10 copies
d’ADN initial par microlitre. Scinder la préparation d’ARN TE diluée (matériau témoin d’ARN TE) en
aliquotes à usage unique et les conserver à l’état congelé à une température inférieure ou égale à −15 °C.
Voir l’Annexe H pour les détails d’un exemple de préparation d’ARN TE (utilisée lors de l’élaboration de la
méthode décrite dans la présente partie de l’ISO/TS 15216).
6 Appareillage et matériaux
[10]
Un équipement de laboratoire en microbiologie normalisé (ISO 7218 ) doit être utilisé, notamment ce
qui suit.
6.1 Micropipettes et pointes de différentes capacités, par exemple 1 000 µl, 200 µl, 20 µl et 10 µl.
Il convient d’utiliser des pointes résistant aux aérosols sauf si des pointes sans filtre sont requises, par
exemple pour l’aspiration.
6.2 Poire à pipeter et pipettes de différentes capacités, par exemple 25 ml, 10 ml, 5 ml.
6.3 Agitateur vortex.
–1
6.4 Agitateur capable de fonctionner à une vitesse d’environ à 500 oscillations min .
−1
6.5 Incubateur agitateur fonctionnant à (37 ± 1,0) °C à une vitesse de (320 ± 20) oscillations min
ou équivalent.
6.6 Plateforme(s) rotative(s) ou équivalent pour une utilisation à température ambiante et à (4 ± 2) °C
−1
à une vitesse de (60 ± 5) oscillations min .
6.7 Aspirateur ou appareillage équivalent pour l’élimination du surnageant.
6.8 Bloc chauffant capable de fonctionner à (95 ±1,0) °C ou équivalent.
6.9 Bain-marie capable de fonctionner à (60 ± 2,0) °C ou équivalent.
6.10 Centrifugeuse(s) et rotor(s) ayant les fonctionnalités suivantes en terme de capacités du rotor, de
vitesses et de températures:
a) 10 000g à (5 ± 3) °C et acceptant des tubes d’un volume d’au moins 35 ml;
b) 10 000g à (5 ± 3) °C et acceptant des tubes résistants au chloroforme de petit diamètre (les tubes de
15 mm de diamètre sont trop gros), d’un volume d’au moins 1 ml;
c) 4 000g à température ambiante, fonctionnant avec des filtres centrifuges concentrateurs (6.17).
6.11 Microcentrifugeuses.
6.12 Tubes et flacons pour centrifugeuses et microcentrifugeuses de différentes capacités, 1,5 ml, 5 ml,
15 ml, 50 ml, etc. (les tubes de 15 mm de diamètre sont trop gros) ayant une capacité de 1 ml sont nécessaires.
6.13 pH-mètre (ou bandelettes indicatrices de pH).
6.14 Écouvillons stériles en coton.
6.15 Sacs avec filtres (400 ml).
6.16 Filtres à membranes chargées positivement avec une taille de pore de 0,45 µm (47 mm de diamètre).
6.17 Filtre centrifuge concentrateur d’une capacité de 15 ml et un seuil de coupure de masse
moléculaire relative 100 kDa.
6.18 Source de vide ou appareil à pression positive équivalent pour la filtration ou bien une tour de
filtration ayant une ouverture pour une membrane de 47 mm de diamètre.
6.19 Couteau à huître
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 15216-1
Première édition
Microbiologie des aliments —
Méthode horizontale pour la
recherche des virus de l’hépatite A
et norovirus dans les aliments par la
technique RT-PCR en temps réel —
Partie 1:
Méthode de quantification
Microbiology of food and animal feed — Horizontal method for
determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-
time RT-PCR —
Part 1: Method for quantification
TRAITEMENT PARALLÈLE ISO/CEN
Le présent projet de Spécification technique a été élaboré dans le cadre du Comité européen de
normalisation (CEN) et soumis selon le mode de collaboration sous la direction du CEN, tel que défini
dans l’Accord de Vienne.
Le présent projet de Spécification technique est par conséquent soumis en parallèle aux membres (P) de
l’ISO/TC concerné pour un vote de trois mois et au CEN pour un vote de trois mois.
PROOF/ÉPREUVE
Numéro de référence
ISO 15216-1:2012(F)
©
ISO 2012
ISO 15216-1:2012(F)
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ISO 15216-1:2012(F)
Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 3
4.1 Extraction de virus . 3
4.2 Extraction d’ARN . 3
4.3 Transcription inverse suivie d’une réaction de polymérisation en chaîne en temps réel
(RT-PCR en temps réel) . 4
4.4 Témoins . 4
4.5 Résultats des essais . 5
5 Réactifs . 5
5.1 Généralités . 5
5.2 Réactifs utilisés dans l’état . 5
5.3 Réactifs préparés . 6
6 Appareillage et matériaux . 7
7 Échantillonnage . 9
8 Mode opératoire. 9
8.1 Exigences générales de laboratoire . 9
8.2 Extraction de virus . 9
8.3 Extraction d’ARN .11
8.4 RT-PCR en temps réel .11
9 Interprétation des résultats .14
9.1 Généralités .14
9.2 Élaboration des courbes étalon .14
9.3 Calcul de l’efficacité de l’amplification .14
9.4 Calcul du rendement d’extraction .14
9.5 Quantification d’échantillon .15
9.6 Limite de détection théorique .15
10 Expression des résultats.15
11 Rapport d’essai .16
Annexe A (normative) Logigramme de mode opératoire .17
Annexe B (normative) Composition et préparation des réactifs et des tampons .19 ®
Annexe C (informative) Extraction d’ARN par l’utilisation du système NucliSens de
chez BioMerieux .21
Annexe D (informative) Amorces et sondes d’hydrolyse de la technique RT-PCR en temps réel pour
la détection du VHA, du norovirus GI et GII et du virus Mengo(témoin de processus) .23
Annexe E (informative) Composition des mélanges maîtres (MasterMix) de la technique RT-PCR
TM
en temps réel en une étape (One-step qRT-PCR) utilisant le système RNA Ultrasense
one-step qRT-PCR de chez Invitrogen et paramètres de cycles .25
Annexe F (informative) Disposition de plaque optique type .26
Annexe G (informative) Croissance de la souche du virus Mengo MC utilisé comme témoin
de processus .28
Annexe H (informative) Préparations mères des témoins d’ADN double brin (ADNdb) .29
ISO 15216-1:2012(F)
Annexe I (informative) Préparations mères d’ARN témoin externe .31
Bibliographie .33
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ISO 15216-1:2012(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives
ISO/CEI, Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de
Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote.
Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
Dans d’autres circonstances, en particulier lorsqu’il existe une demande urgente du marché, un comité
technique peut décider de publier d’autres types de documents:
— une Spécification publiquement disponible ISO (ISO/PAS) représente un accord entre les experts
dans un groupe de travail ISO et est acceptée pour publication si elle est approuvée par plus de 50 %
des membres votants du comité dont relève le groupe de travail;
— une Spécification technique ISO (ISO/TS) représente un accord entre les membres d’un comité technique
et est acceptée pour publication si elle est approuvée par 2/3 des membres votants du comité.
Une ISO/PAS ou ISO/TS fait l’objet d’un examen après trois ans afin de décider si elle est confirmée pour
trois nouvelles années, révisée pour devenir une Norme internationale, ou annulée. Lorsqu’une ISO/PAS
ou ISO/TS a été confirmée, elle fait l’objet d’un nouvel examen après trois ans qui décidera soit de sa
transformation en Norme internationale soit de son annulation.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’ISO/TS 15216-1 a été élaborée par le comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec
le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie, conformément à
l’Accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
L’ISO/TS 15216 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Microbiologie des
aliments — Méthode horizontale pour la recherche des virus de l’hépatite A et norovirus dans les aliments
par la technique RT-PCR en temps réel:
— Partie 1: Méthode de quantification
— Partie 2: Méthode de détection qualitative
ISO 15216-1:2012(F)
Introduction
Le virus de l’hépatite A (VHA) et les norovirus (NoV) sont des agents importants de maladies virales
d’origine alimentaire, chez l’humain. Aucune méthode de routine n’existe pour la culture desdits virus à
partir de matrices alimentaires. La détection dépend ainsi des méthodes moléculaires qui utilisent une
transcription inverse suivie d’une réaction de polymérisation en chaîne (RT-PCR). Étant donné que de
nombreuses matrices alimentaires contiennent des substances inhibitrices de la technique RT-PCR, il est
nécessaire d’utiliser une méthode d’extraction produisant des préparations d’ARN extrêmement pures et
prêtes à l’emploi. En ce qui concerne les surfaces alimentaires, les virus sont prélevés par écouvillonnage.
L’extraction de virus dans les fruits rouges et les salades s’effectue par élution sous agitation suivie
d’une précipitation au PEG/NaCI. Pour l’eau embouteillée, une adsorption et une élution utilisant des
membranes chargées positivement, suivie d’une étape de concentration par ultrafiltration est utilisée,
les virus des mollusques bivalves, sont eux extraits des tissus des glandes digestives par traitement avec
une solution de protéinase K. Pour toutes les matrices qui ne sont couvertes par la présente Spécification
technique, il est nécessaire de valider cette méthode. La méthode d’extraction d’ARN, commune à toutes
les matrices, est basée sur la dislocation de la capside du virus par des réactifs chaotropiques, suivie
d’une adsorption de l’ARN sur des particules de silice. La technique de RT-PCR en temps réel permet de
suivre l’amplification tout au long des cycles de PCR en mesurant l’excitation de molécules marquées
par fluorescence. Lors d’une réaction RT-PCR en temps réel utilisant une nucléase marquée en 5’, les
composés fluorescents sont fixés à une sonde nucléotidique propre à une séquence (sonde d’hydrolyse),
ce qui permet aussi une confirmation simultanée de la présence de l’ADN initial ciblé. Ces modifications
augmentent la sensibilité et la spécificité de la méthode PCR, et rendent alors inutiles les étapes de
confirmation post PCR par amplifications supplémentaires. En raison de la complexité de la méthode,
il est nécessaire d’inclure une série exhaustive de témoins. La méthode décrite dans la présente partie
de l’ISO/TS 15216 permet une quantification des niveaux d’ARN de virus dans l’échantillon pour essai.
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NORME INTERNATIONALE ISO 15216-1:2012(F)
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour
la recherche des virus de l’hépatite A et norovirus dans les
aliments par la technique RT-PCR en temps réel —
Partie 1:
Méthode de quantification
1 Domaine d’application
La présente partie de l’ISO/TS 15216 décrit une méthode de quantification des niveaux de VHA et NoV
des génogroupes I (GI) et II (GII) présents dans des échantillons pour essai d’aliments ou sur des surfaces
alimentaires. Après libération des virus contenus dans l’échantillon pour essai, l’ARN viral est extrait
par lyse à l’aide de thiocyanate de guanidine et par adsorption sur silice. Les séquences cibles de l’ARN
viral sont amplifiées et détectées par la technique RT-PCR en temps réel.
Cette approche est aussi applicable pour la détection desdits virus sur des matières contaminées, ou
d’autres virus humains dans les aliments, sur les surfaces alimentaires ou sur les matières contaminées
en suivant une validation appropriée et en utilisant des jeux d’amorces et de sondes propres à la cible.
2 Références normatives
Les documents suivants, en tout ou partie, sont référencés de manière normative dans le présent
document et sont indispensables pour son application. Pour les références datées, seule l’édition citée
s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y
compris les éventuels amendements).
ISO 22174, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la recherche de
micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l’ISO 22174 ainsi que les
suivants s’appliquent.
3.1
aliment
substance utilisée ou préparée pour être utilisée comme aliment
NOTE Pour les besoins de la présente partie de l’ISO/TS 15216, cette définition inclut l’eau embouteillée.
3.2
surface alimentaire
<1> surface des aliments
3.3
surface alimentaire
<2> surface de préparation des aliments
3.4
matières contaminées
objets ou matériaux inanimés sur lesquels des agents infectieux peuvent être transportés
ISO 15216-1:2012(F)
3.5
virus de l’hépatite A
VHA
membre de la famille des Picornaviridae responsable des hépatites infectieuses
NOTE 1 Génétiquement, le VHA peut être subdivisé en six génotypes sur la base de région VP1/2A (des
génotypes 1, 2 et 3 ont été trouvés chez les humains alors que les génotypes 4, 5 et 6 sont d’origine simienne).
NOTE 2 Il n’existe qu’un sérotype. La transmission se fait par voie féco-orale de personne à personne, par la
consommation d’aliments contaminés, au contact avec de l’eau ou des surfaces alimentaires contaminées, ou bien
par le contact avec des matières contaminées. Le virus de l’hépatite A est classé comme étant un agent pathogène
du groupe de risque 2 selon l’ACDP (Advisory Committee on Dangerous Pathogens, Royaume-Uni).
3.6
norovirus
membre de la famille des Caliciviridae responsable des cas sporadiques et des épidémies de
gastroentérites aiguës
NOTE 1 Génétiquement, les norovirus peuvent être subdivisés en cinq génogroupes distincts.
NOTE 2 Trois de ces génogroupes, GI, GII et GIV ont été impliqués dans des troubles gastro-intestinaux chez
l’homme. GI et GII sont responsables de la grande majorité des cas cliniques. La transmission se fait par voie
féco-orale de personne à personne, par la consommation d’aliments contaminés, au contact avec de l’eau ou des
surfaces alimentaires contaminées, ou bien par le contact avec des matières contaminées. Les norovirus des
génogroupes I et II sont classés comme étant des agents pathogènes du groupe de risque 2 selon l’ACDP.
3.7
quantification du virus de l’hépatite A
quantification de l’ARN du VHA dans un rapport masse ou volume prédéterminé d’aliments, ou sur une
superficie de surface alimentaire
3.8
quantification des norovirus
quantification de l’ARN du norovirus dans un rapport masse ou volume prédéterminé d’aliments, ou sur
une superficie de surface alimentaire
3.9
virus témoin de processus
virus ajouté à la prise d’échantillon, à la première occasion précédant l’extraction du virus, afin de
contrôler le rendement de l’extraction
3.10
ARN viral témoin de processus
ARN libéré par le virus témoin de processus permettant d’obtenir des données pour établir une courbe
étalon en vue de l’estimation du rendement de l’extraction
3.11
témoin négatif d’extraction d’ARN
témoin sans ARN cible soumis à toutes les étapes du mode opératoire d’extraction d’ARN et de détection
permettant de s’assurer de l’absence de contamination croisée
3.12
témoin négatif de processus
échantillon de la matrice d’aliment sans agent pathogène cible soumis à toutes les étapes du
processus d’analyse
3.13
sonde d’hydrolyse
sonde fluorescente couplée à deux molécules fluorescentes qui sont séparées de façon stérique par
l’activité d’exonucléase en 5’-3’ de l’enzyme pendant le processus d’amplification
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ISO 15216-1:2012(F)
3.14
témoin négatif de RT-PCR
aliquote d’eau très pure utilisée à la place de l’ADN initial dans une réaction RT-PCR en temps réel
permettant de s’assurer de la non-contamination des réactifs de RT-PCR en temps réel
3.15
témoin externe d’ARN
ARN de référence pouvant servir de cible pour une réaction PCR en temps réel appropriée, par exemple
un ARN synthétisé par une transcription in vitro à partir d’un plasmide portant une copie du gêne cible,
qui est ajouté à une aliquote d’ARN de l’échantillon selon une quantité donnée servant de témoin pour
l’amplification d’une réaction distincte
3.16
valeur C
q
cycle de quantification, cycle de réaction PCR durant lequel la cible est quantifiée au cours d’une réaction
donnée de PCR en temps réel
NOTE Cela correspond au point auquel la réaction de fluorescence dépasse un niveau seuil.
3.17
limite de détection théorique
LDDt
niveau qui constitue la plus petite quantité de cible pouvant, en théorie, être détectée
NOTE Cela correspond à une copie d’un génome par unité de volume d’ARN cible soumis à essai mais qui varie
en fonction de la matrice d’essai et de la quantité de matière disponible au départ.
3.18
limite de détection pratique
LDDp
plus petite concentration de cible dans un échantillon essai qui peut être détectée de façon reproductible
(intervalle de confiance de 95 %) dans les conditions expérimentales spécifiées dans la méthode, vérifiée
par un essai de reproductibilité interlaboratoires ou une autre validation
NOTE La LDDp dépend de la prise d’essai, de la qualité ou de la quantité d’ARN initial et de la LDDt de la méthode.
3.19
limite de quantification
LDQ
plus petite concentration de cible dans un échantillon pour essai qui peut être déterminée de façon
quantitative avec un niveau acceptable de fidélité et d’exactitude dans les conditions expérimentales
spécifiées dans la méthode, vérifiée par un essai de reproductibilité interlaboratoires ou une autre validation
NOTE La LDQ dépend de la prise d’échantillon et de la qualité ou de la quantité de l’ARN initial.
4 Principe
4.1 Extraction de virus
Les aliments et les surfaces alimentaires couverts par la présente partie de l’ISO/TS 15216 sont souvent
des matrices hautement complexes et les virus cibles peuvent être présents à de petites concentrations.
Il est donc nécessaire d’effectuer une extraction et/ou une concentration du virus propre à la matrice
afin de produire un substrat pour les parties communes ultérieures du processus. Le choix de la méthode
dépend de la matrice.
4.2 Extraction d’ARN
Il est nécessaire d’extraire l’ARN en utilisant une méthode qui permette d’obtenir des préparations
d’ARN pures afin de réduire les effets des inhibiteurs de PCR. Dans la présente partie de l’ISO/TS 15216,
ISO 15216-1:2012(F)
le thiocyanate de guanidine, réactif chaotropique, est utilisé pour la dislocation de la capside du virus.
L’ARN est ensuite adsorbé sur silice afin de faciliter la purification à travers plusieurs étapes de lavage.
L’ARN viral purifié est libéré de la silice dans un tampon avant la réaction RT-PCR en temps réel.
4.3 Transcription inverse suivie d’une réaction de polymérisation en chaîne en temps
réel (RT-PCR en temps réel)
La présente partie de l’ISO/TS 15216 se base sur la réaction RT-PCR en temps réel en une étape utilisant
des sondes d’hydrolyse. Dans la technique RT-PCR en temps réel en une étape, la transcription inverse et
l’amplification par PCR sont effectuées consécutivement dans le même tube.
La réaction PCR en temps réel utilisant des sondes d’hydrolyse emploie une sonde d’ADN courte marquée
par une molécule fluorescente à une extrémité et un quencher fluorescent à l’extrémité opposée. La
chimie de cette réaction PCR garantit qu’à mesure que la quantité de produit amplifié augmente, la sonde
d’ADN est coupée et le signal fluorescent provenant du marqueur augmente proportionnellement. La
fluorescence peut être mesurée à chaque étape tout au long du cycle. Le premier niveau d’amplification
détectable dans le cycle de toute réaction PCR est proportionnel à la quantité d’ADN initial, ainsi
l’analyse des courbes de fluorescence permet une détermination de la quantité de séquence cible dans
l’échantillon.
En raison des faibles concentrations de virus dans les aliments et de la diversité des souches dans les virus
ciblés, il est important de sélectionner de façon adéquate des réactifs pour RT-PCR en temps réel en une
étape, des amorces PCR et des sondes d’hydrolyse pour les virus ciblés. Pour cela, des recommandations
sont données en 5.2.17 et en 5.2.18. Des exemples détaillés de réactifs, d’amorces et de sondes (utilisés
lors de l’élaboration de la présente partie de l’ISO/TS 15216) sont fournis dans les Annexes D et E.
4.4 Témoins
4.4.1 Virus témoin de processus
Des pertes de virus témoins peuvent se produire à différentes étapes lors de l’extraction de virus dans
l’échantillon et de l’extraction de l’ARN. Afin de contrôler ces pertes, les échantillons sont contaminés
artificiellement avant le processus avec une quantité définie de virus témoin de processus. Le niveau de
récupération du virus témoin de processus doit être déterminé pour chaque échantillon.
Le virus sélectionné en tant que témoin de processus doit être un virus cultivable, sans enveloppe, à
ARNsb (simple brin) de polarité positive, de taille similaire aux virus cibles afin de fournir un modèle
morphologique et physico-chimique correct. Le virus témoin de processus doit montrer une persistance
dans l’environnement semblable aux virus cibles. Le virus doit être suffisamment différent sur le plan
génétique par rapport aux virus cibles afin de ne pas avoir de réactions PCR croisées entre virus cibles
et virus témoins, et sa présence dans les aliments à l’état naturel ne doit normalement pas être attendue.
Un exemple de préparation du virus témoin de processus (utilisé lors de l’élaboration de la présente
partie de l’ISO/TS 15216) est fourni dans l’Annexe G.
4.4.2 Témoin ADN double brin (ADNdb)
Pour la quantification du virus cible, les résultats doivent être associés à un étalon de concentration
connue. Une série de dilutions d’ADN double brin comportant la séquence cible d’intérêt (5.3.8) et
quantifiée par spectrophotométrie doit être utilisée pour produire une courbe étalon exprimée en
copies d’ADN initial par microlitre. Se référer à la courbe étalon permet la quantification de l’échantillon
en nombres de copies de génome viral détectable par microlitre.
4.4.3 ARN témoin positif externe (TE)
Des substances inhibitrices de la réaction RT-PCR sont contenues dans de nombreux aliments, mais
peuvent également provenir d’une contamination due à un traitement effectué en amont. Afin de vérifier
l’éventuelle inhibition de la RT-PCR dans un échantillon individuel, un ARN témoin positif externe (une
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ISO 15216-1:2012(F)
espèce à ARN portant la séquence cible d’intérêt, 5.3.9) est ajouté à une aliquote d’ARN de l’échantillon
et soumis à essai en utilisant la méthode RT-PCR. Une comparaison des résultats de cet essai avec les
résultats d’un ARN témoin positif externe en l’absence d’ARN de l’échantillon permet la détermination
du niveau d’inhibition de la réaction RT-PCR dans chaque échantillon soumis à essai.
Il est permis d’appliquer des approches différentes pour le contrôle de l’inhibition de la réaction RT-PCR
sous réserve de faire la démonstration de l’équivalence de leurs performances par rapport à celles de la
méthode utilisant l’ARN témoin externe.
4.5 Résultats des essais
Cette méthode fournit un résultat exprimé en nombres de copies de génome viral détectable par
millilitre, par gramme, ou par centimètre carré. Dans les échantillons où le virus n’est pas détecté, les
résultats doivent être reportés comme «non détecté, par gramme, ou par centimètre carré» où z est la limite de détection (LDD) dans l’échantillon.
5 Réactifs
5.1 Généralités
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
[10]
En ce qui concerne les pratiques de laboratoires en vigueur, voir l’ISO 7218 .
5.2 Réactifs utilisés dans l’état
5.2.1 Eau de qualité biologie moléculaire.
5.2.2 Polyéthylène glycol (PEG), de masse moléculaire relative moyenne 8 000.
5.2.3 Chlorure de sodium (NaCl).
5.2.4 Chlorure de potassium (KCl).
5.2.5 Hydrogénophosphate de sodium (Na HPO ).
2 4
5.2.6 Dihydrogénophosphate de potassium (KH PO ).
2 4
5.2.7 Tris base.
5.2.8 Glycine.
5.2.9 Extrait de viande de bœuf en poudre.
5.2.10 Protéinase K (30 U/mg).
5.2.11 Pectinase.
5.2.12 Chloroforme.
5.2.13 Butanol.
5.2.14 Hydroxyde de sodium (NaOH).
ISO 15216-1:2012(F)
5.2.15 Acide chlorhydrique (HCl).
5.2.16 Silice, tampons de lyse, de lavage et d’élution pour l’extraction de l’ARN viral. Les réactifs
doivent permettre d’obtenir 500 μl de virus extrait, par réaction de lyse dans un tampon chaotropique
contenant du thiocyanate de guanidine (Référence [1]) et en utilisant la silice comme matrice liant l’ARN.
Après traitement de l’ARN lié à la silice par un ou des tampons de lavage éliminant les impuretés, l’ARN
doit être élué dans 100 µl de tampon d’élution.
La préparation d’ARN doit être d’une qualité et d’une concentration adaptée aux fins prévues. Voir
l’Annexe C pour les détails d’un exemple de réactifs d’extraction d’ARN (utilisés lors de l’élaboration de
la méthode décrite dans la présente partie de l’ISO/TS 15216).
5.2.17 Réactifs pour la réaction RT-PCR en temps réel en une étape. Les réactifs doivent permettre
le traitement de 5 µl d’ARN dans un volume total de 25 µl. Ils doivent être adaptés à la réaction de RT-
PCR en une étape en utilisant des sondes d’hydrolyses (l’ADN polymérase utilisée doit posséder une
activité exonucléasique en 5’-3’) et ils doivent présenter une sensibilité suffisante pour la détection de
concentrations d’ARN viraux, habituellement rencontrées dans les aliments contaminés en virus. Voir
l’Annexe E pour les détails d’un exemple de réactifs utilisés pour la RT-PCR en temps réel en une étape
(utilisés lors de l’élaboration de la méthode décrite dans la présente partie de l’ISO/TS 15216).
5.2.18 Amorces et sondes d’hydrolyse pour la détection de VHA et de norovirus GI et GII. Les
séquences d’amorce et de sonde d’hydrolyse doivent être publiées dans une revue révisée par des pairs
et doivent être comparées aux séquences d’un large éventail de souches du virus cible. Les amorces
de détection du VHA doivent cibler la région 5’ non codante du génome. Les amorces de détection du
norovirus GI et GII doivent cibler la jonction ORF1/ORF2 du génome. Voir l’Annexe D pour les détails d’un
exemple d’amorces et de sondes d’hydrolyse (utilisées lors de l’élaboration de la méthode décrite dans la
présente partie de l’ISO/TS 15216).
5.2.19 Amorces et sondes d’hydrolyse pour la détection de virus témoin de processus. Les
séquences d’amorce et de sonde d’hydrolyse doivent être publiées dans une revue révisée par des pairs
et doivent être comparées aux séquences de la souche de virus témoin de processus. Elles ne doivent
démontrer aucune amplification croisée avec le virus cible.
5.3 Réactifs préparés
En raison du nombre élevé de réactifs requérant une préparation individuelle, les détails de composition
et de préparation sont donnés dans l’Annexe B.
5.3.1 Solution 5 × PEG/NaCl (500 g/l PEG 8 000, 1,5 mol/l NaCl). Voir B.1.
5.3.2 Mélange chloroforme/butanol. Voir B.2.
5.3.3 Solution de protéinase K. Voir B.3.
5.3.4 Solution de tampon phosphate salin (PBS). Voir B.4.
5.3.5 Tampon Tris glycine contenant 1 % d’extrait de bœuf (TGBE). Voir B.5.
5.3.6 Matériau viral témoin de processus. La solution de virus témoin de processus doit être diluée
par un facteur de 10 au minimum dans un tampon approprié, par exemple le PBS. Cette dilution doit
permettre une détection sans inhibition du génome du virus témoin de processus lors d’une réaction
RT-PCR en temps réel mais doit être suffisamment concentrée pour déterminer, de façon reproductible, la
dilution la moins concentrée, utilisée pour la courbe étalon de l’ARN viral témoin de processus (8.4.2.2).
Scinder le matériau viral témoin de processus dilué en aliquotes à usage unique et les conserver à
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(–80 ± 5) °C. Voir l’Annexe G pour les détails d’un exemple de préparation de virus témoin de processus
(utilisée lors de l’élaboration de la méthode décrite dans la présente partie de l’ISO/TS 15216).
5.3.7 Mélanges maîtres de la réaction RT-PCR en temps réel pour les virus cible et témoin de
processus. Les réactifs doivent être ajoutés dans des quantités telles que spécifiées par les fabricants
(5.2.17) afin d’obtenir un mélange maître de 20 µl par réaction dans un volume total de 25 µl. Des
concentrations optimales d’amorces et de sondes doivent être utilisées, après leur détermination, en
suivant les recommandations des fabricants de réactif. Voir l’Annexe E pour les détails d’un exemple de
mélanges maîtres pour RT-PCR en temps réel (utilisés lors de l’élaboration de la méthode décrite dans la
présente partie de l’ISO/TS 15216).
5.3.8 Matériau témoin d’ADN double brin (ADNdb). Des plasmides purifiés séparés portant chacun
la séquence cible de chaque virus cible doivent être utilisés. Les préparations ne doivent pas causer une
inhibition de la RT-PCR. Les concentrations de chaque préparation mère d’ADNdb en nombre de copies
d’ADN initial par microlitre doivent être déterminées, puis la préparation doit être diluée jusqu’à une
4 5
concentration de 1 × 10 à 1 × 10 copies d’ADN initial par microlitre. Scinder la préparation d’ADNdb
diluée (matériau témoin d’ADNdb) en aliquotes à usage unique et les conserver à l’état congelé à une
température inférieure ou égale à −15 °C. Voir l’Annexe H pour les détails d’un exemple de préparation
d’ADNdb (utilisée lors de l’élaboration de la méthode décrite dans la présente partie de l’ISO/TS 15216).
5.3.9 Témoin externe (TE) matériau témoin d’ARN. Des ARNsb purifiés séparés portant chacun la
séquence cible de chaque virus cible doivent être utilisés. Ils doivent contenir les concentrations d’ADN
cible contaminant inférieures à 0,1 % et ne doivent pas causer d’inhibition de la réaction RT-PCR. Les
concentrations de chaque préparation mère d’ARN TE en nombre de copies par microlitre doivent être
6 8
déterminées et cette préparation doit être diluée jusqu’à une concentration de 1 × 10 à 1 × 10 copies
d’ADN initial par microlitre. Scinder la préparation d’ARN TE diluée (matériau témoin d’ARN TE) en
aliquotes à usage unique et les conserver à l’état congelé à une température inférieure ou égale à −15 °C.
Voir l’Annexe I pour les détails d’un exemple de préparation d’ARN TE (utilisée lors de l’élaboration de la
méthode décrite dans la présente partie de l’ISO/TS 15216).
6 Appareillage et matériaux
[10]
Un équipement de laboratoire en microbiologie normalisé (ISO 7218 ) doit être utilisé, notamment ce
qui suit.
6.1 Micropipettes et pointes de différentes capacités, par exemple 1 000 µl, 200 µl, 20 µl et 10 µl.
6.2 Poire à pipeter et pipettes de différentes capacités, par exemple 25 ml, 10 ml, 5 ml.
6.3 Agitateur vortex.
–1
6.4 Agitateur capable de fonctionner à une vitesse d’environ à 500 min .
−1
6.5 Incubateur agitateur fonctionnant à (37 ± 10) °C à une vitesse de (320 ± 20) min ou équivalent.
6.6 Plateforme(s) rotative(s) ou équivalent pour une utilisation à température ambiante et à (4 ± 2) °C
−1
à une vitesse de (60 ± 5) min .
6.7 Aspirateur ou appareillage équivalent pour l’élimination du surnageant.
6.8 Bloc chauffant capable de fonctionner à (95 ±1,0) °C ou équivalent.
6.9 Bain-marie capable de fonctionner à (60 ± 2,0) °C ou équivalent.
ISO 15216-1:2012(F)
6.10 Centrifugeuse(s) et rotor(s) réfrigéré(s) capables de tourner à 10 000g acceptant des
tubes ≥ 20 ml et des tubes résistants au chloroforme de petit diamètre (les tubes de 15 mm de diamètre
sont trop gros).
6.11 Centrifugeuse de paillasse et rotor capables de tourner à 4 000g acceptant des tubes de volumes
15 ml ou 50 ml.
6.12 Microcentrifugeuse.
6.13 Tubes et flacons pour centrifugeuses et microcentrifugeuses de différentes capacités, 1,5 ml,
5 ml, 15 ml, 50 ml, etc. Des tubes résistants au chloroforme de petit diamètre (les tubes de 15 mm de
diamètre sont trop gros) ayant une capacité de 1 ml sont nécessaires.
6.14 pH-mètre (ou bandelettes indicatrices de pH).
6.15 Écouvillons stériles en coton.
6.16 Sacs avec filtres (400 ml).
6.17 Filtres à membranes chargées positivement avec une taille de pore de 0,45 µm (47 mm de diamètre).
6.18 Filtre centrifuge concentrateur d’une capacité de 15 ml et un seuil de coupure de masse
moléculaire relative 100 kDa.
6.19 Source de vide ou appareil à pression positive équivalent pour la filtration ou bien une tour de
filtration ayant une ouverture pour une membrane de 47 mm de diamètre.
6.20 Couteau à huître stérile [pour l’ouverture des mollusques bivalves (BMS)].
6.21 Bloc de caoutchouc pour l’ouverture des BMS.
6.22 Ciseaux.
6.23 Pinces.
6.24 Boîtes de Petri stériles.
6.25 Lames de rasoir ou matériel homogénéisateur équivalent.
6.26 Gants de sécurité résistants.
6.27 Appareillage d’extraction de l’ARN, approprié pour les méthodes utilisant la silice et les réactifs
associés (5.2.16). Voir l’Annexe C pour les détails d’un exemple d’appareillage d’extraction d’ARN (utilisé
lors de l’élaboration de la méthode décrite dans la présente partie de l’ISO/TS 15216).
6.28 Thermocycleur(s) équipé(s) d’une source d’alimentation appropriée pour l’excitation des
molécules fluorescentes et un système de détection optique pour la détection en temps réel des signaux
de fluorescence générés pendant la réaction PCR avec la chimie des sondes d’hydrolyse.
6.29 Consommables associés à la technique RT-PCR en temps réel, par exemple des plaques optiques
et des bouchons, appropriés à l’utilisation avec la machine PCR sélectionnée.
8 PROOF/ÉPREUVE © ISO 2012 – Tous droits réservés

ISO 15216-1:2012(F)
7 Échantillonnage
S’il n’existe aucune Norme internationale spécifique traitant de l’échantillonnage du produit concerné, il
est recommandé que les parties concernées parviennent à un accord sur le sujet.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou
modifié lors du transport ou de l’entreposage.
8 Mode opératoire
8.1 Exigences générales de laboratoire
Une fois arrivés au laboratoire, des échantillons décongelés ne doivent pas être congelés avant l’essai.
L’extraction de l’échantillon et la réaction PCR doivent être effectuées dans des zones ou des salles de
travail telles que spécifiées dans l’ISO 22174.
8.2 Extraction de virus
Le choix de la méthode dépend de la matrice alimentaire soumise à essai.
8.2.1 Matériau viral témoin de processus
Juste avant le traitement d’un lot d’échantillons pour essai, regrouper suffisamment d’aliquotes du
matériau viral témoin de processus pour tous les échantillons pour essai individuels (prévoir 10 µl par
échantillon pour essai et un excédent de 25 µl).
Diluer au dixième une portion de (20 ± 0,5) μl du matériau viral témoin de processus regroupé en
utilisant de l’eau (5.2.1) et la stocker à (5 ± 3) °C pendant 24 h au maximum ou en aliquotes à usage
unique à une température inférieure ou égale à −15 °C pendant une plus grande période.
8.2.2 Témoin de processus négatif
Un échantillon de témoin de processus négatif doit être soumis à essai en parallèle des échantillons pour
essai à une fréquence établie dans le cadre du programme d’assurance qualité du laboratoire.
8.2.3 Surfaces alimentaires
En utilisant un écouvillon en coton stérile préalablement imbibé de PBS, effectuer un prélèvement de la
surface soumise à essai (zone maximale de 100 cm ), en appliquant une légère pression afin de détacher
les particules virales. Estimer approximativement la zone prélevée en centimètres carrés.
Plonger l’écouvillon dans un tube contenant (490 ± 5) µl de tampon de lyse, puis presser contre la paroi
du tube afin de libérer le liquide. Répéter le cycle d’immersion et de pression trois ou quatre fois afin
d’assurer une récolte maximale de virus.
Ajouter (10 ± 0,1) μl de matériau viral témoin de processus (8.2.1).
Pour les surfaces rugueuses qui peuvent causer une détérioration de l’écouvillon, plus d’un écouvillon
peut être nécessaire afin de traiter de manière complète la surface ciblée.
Réserver pour l’extraction d’ARN.
8.2.4 Fruits rouges et salades
Hacher grossièrement (25 ± 0,3) g de fruits rouges ou de salades en morceaux d’environ 2,5 cm × 2,5 cm × 2,5cm
(il n’est pas nécessaire de hacher si, par exemple, les fruits sont plus petits que la taille susmentionnée) et
les disposer dans le compartiment réservé à l’échantillon d’un sac avec filtre de 400 ml.
ISO 15216-1:2012(F)
Ajouter (40 ± 1) ml de tampon TGBE (pour les fruits rouges, ajouter 30 unités de pectinase au tampon)
et (10 ± 0,1) μl de matériau viral témoin de processus (8.2.1).
−1
Incuber à température ambiante avec un basculement constant à une vitesse de 60 min pendant
(20 ± 1) min. En ce qui concerne les fruits rouges acides, le pH de l’éluat doit être contrôlé toutes les
10 min pendant l’incubation. Si le pH descend en dessous de 9,0, il doit être ajusté à 9,5 ± 0,1 avec du NaOH.
Prolonger la période d’incubation de 10 min chaque fois que le pH est ajusté. Décanter l’éluat à partir du
compartiment filtré dans le tube à centrifuger (utiliser deux tubes si nécessaire pour contenir le volume).
Clarifier par centrifugation à 10 000g pendant (30 ± 5) min à (5 ± 3) °C.
Décanter le surnageant dans un seul tube ou flacon propre et ajuster le pH à 7,0 ± 0,5 avec du HCl.
Ajouter 0,25 volume de solution de 5 × PEG/NaCI (pour obtenir une concentration finale de 100 g/l de
PEG - 0,3 mol/l NaCl), homogénéiser par agitation pendant (60 ± 5) s puis incuber avec un basculement
−1
constant à une vitesse d’environ 60 min à (5 ± 3) °C pendant (60 ± 5) min.
Centrifuger à 10 000g pendant (30 ± 5) min à (5 ± 3) °C (répartir le volume dans deux tubes à centrifuger
si nécessaire).
Décanter et retirer le surnageant, puis centrifuger à 10 000g pendant (5 ± 1) min à (5 ± 3) °C pour
obtenir un culot de centrifugation plus compact.
Retirer le surnageant et mettre de nouveau en suspension le culot de centrifugation dans (500 ± 10) μl
de PBS. Si un seul échantillon a été réparti dans deux tubes, remettre en suspension les deux culots de
centrifugation au fur et à mesure dans une même aliquote de PBS.
Pour une extraction à partir de salade, transférer la suspension dans un tube approprié et le réserver
pour l’extraction d’ARN.
Pour une extraction à partir de fruits rouges, une étape supplémentaire de clarification est requise.
Transférer la suspension dans un tube à centrifuger résistant au chloroforme de petit diamètre. Ajouter
(500 ± 10) μl de mélange ch
...