ISO 20166-4:2021
(Main)Molecular in vitro diagnostic examinations — Specifications for preexamination processes for formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) tissue — Part 4: In situ detection techniques
Molecular in vitro diagnostic examinations — Specifications for preexamination processes for formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) tissue — Part 4: In situ detection techniques
This document specifies requirements and gives recommendations for the collection, handling, documentation, transport, storage and processing during the pre-examination phase of formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) tissue specimens intended for qualitative and/or (semi-)quantitative in situ examination of the morphology and of biomolecules, such as metabolites, proteins, DNA and/or RNA, on FFPE tissue sections by using different in situ detection techniques. This document is applicable to in vitro diagnostic examinations using in situ detection techniques. These include laboratory developed tests performed by pathology laboratories (histopathology laboratories) as well as by molecular pathology laboratories and other medical laboratories. It is also intended to be used by laboratory customers, in vitro diagnostics developers and manufacturers, biobanks, as well as institutions and commercial organizations performing biomedical research, and regulatory authorities. This document is not applicable to the pre-examination phase of RNA, proteins and DNA isolated from FFPE tissue for examination. These are covered in ISO 20166-1, ISO 20166-2 and ISO 20166-3, Molecular in vitro diagnostic examinations — Specifications for pre-examination processes for isolated RNA, proteins and DNA, respectively. Different dedicated measures are taken for pre-examination processes for fine needle aspirates (FNAs). These are covered in CEN WI 00140128, CEN WI 00140126, and CEN WI 00140129, Molecular in vitro diagnostic examinations — Specifications for pre-examination processes for Fine Needle Aspirates (FNAs) isolated cellular RNA, isolated proteins, and isolated genomic DNA, respectively. NOTE International, national or regional regulations or requirements can also apply to specific topics covered in this document.
Analyses de diagnostic moléculaire in vitro — Spécifications relatives aux processus préanalytiques pour les tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) — Partie 4: Techniques de détection in situ
Le présent document spécifie des exigences et formule des recommandations concernant le prélèvement, la manipulation, la documentation, le transport, le stockage et le traitement durant la phase préanalytique de prélèvements de tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) destinés à l’analyse in situ qualitative et/ou (semi‑)quantitative de la morphologie et de biomolécules, telles que des métabolites, des protéines, l’ADN et/ou l’ARN sur des coupes de tissu FFPE à l’aide de différentes techniques de détection in situ. Le présent document s’applique aux analyses de diagnostic in vitro, utilisant des techniques de détection in situ. Celles‑ci englobent les analyses développées en laboratoire réalisées par des laboratoires de pathologie (laboratoires d’histopathologie) ainsi que par des laboratoires de pathologie moléculaire et autres laboratoires de biologie médicale. Il est également destiné à être utilisé par des clients de laboratoires, des développeurs et fabricants de l’industrie du diagnostic in vitro, des biobanques, ainsi que par des institutions et des organismes commerciaux spécialisés en recherche biomédicale, de même que des autorités de réglementation. Le présent document ne s’applique pas à la phase préanalytique de l’analyse d’ARN, de protéines et d’ADN extraits de tissus FFPE, ces biomolécules étant respectivement couvertes par les normes ISO 20166‑1, ISO 20166‑2 et ISO 20166‑3, Analyses de diagnostic moléculaire in vitro — Spécifications relatives aux processus préanalytiques pour l’ARN extrait, les protéines extraites et l’ADN extrait. Des mesures spéciales différentes sont prises pour les processus préanalytiques applicables aux prélèvements de biopsie à l’aiguille fine (BAF). Les mesures applicables aux différents prélèvements BAF (ARN cellulaire extrait, protéines extraites, et ADN génomique extrait) sont respectivement traitées par les CEN WI 00140128, CEN WI 00140126, et CEN WI 00140129, Molecular in vitro diagnostic examinations — Specifications for pre‑examination processes for Fine Needle Aspirates (FNAs) isolated cellular RNA, isolated proteins, and isolated genomic DNA (disponibles en anglais seulement). NOTE Des réglementations ou exigences internationales, nationales ou régionales peuvent également s’appliquer à des sujets spécifiques traités dans le présent document.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 20166-4
First edition
2021-07
Molecular in vitro diagnostic
examinations — Specifications
for preexamination processes for
formalin-fixed and paraffin-embedded
(FFPE) tissue —
Part 4:
In situ detection techniques
Analyses de diagnostic moléculaire in vitro — Spécifications relatives
aux processus préanalytiques pour les tissus fixés au formol et inclus
en paraffine (FFPE) —
Partie 4: Techniques de détection in situ
Reference number
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ISO 2021
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ISO 20166-4:2021(E)
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Published in Switzerland
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ISO 20166-4:2021(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 General considerations . 8
5 Activities outside the laboratory .10
5.1 Specimen collection .10
5.1.1 General.10
5.1.2 Information about the patient/specimen donor .10
5.1.3 Information about the specimen .10
5.1.4 Specimen processing, intermediate storage and preparation for transport .11
5.2 Transport .12
6 Activities inside the laboratory .12
6.1 Specimen reception .12
6.2 Formalin fixation of the specimen or sample(s) .12
6.3 Evaluation of the pathology of the specimen and selection of the sample(s) .13
6.3.1 General.13
6.3.2 Macroscopic evaluation .14
6.3.3 Selection of the sample(s).14
6.4 Post-fixation of frozen samples from intraoperative consultation .15
6.5 Sample decalcification/softening .15
6.6 Tissue processing and paraffin embedding .16
6.6.1 General.16
6.6.2 Dehydration and clearing .16
6.6.3 Impregnation with paraffin and paraffin embedding .17
6.7 Storage of FFPE tissue blocks .17
6.8 Sectioning of FFPE tissue blocks and storage of slide-mounted sections .18
6.9 Deparaffinization and rehydration of slide-mounted sections .19
6.10 Pretreatment of slide-mounted sections for in situ detection techniques .19
6.10.1 General.19
6.10.2 Pretreatment for antibody- or other affinity binder-based in situ detection
techniques .19
6.10.3 Pretreatment for hybridization-based in situ detection techniques.20
6.10.4 Pretreatment for other in situ detection techniques .20
6.11 Quality assessment of the pre-analytical part of in situ detection .20
Annex A (informative) Recommendations relating to verification and validation of
laboratory developed in situ detection tests . .21
Annex B (informative) Example protocol for tissue processing .22
Bibliography .23
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ISO 20166-4:2021(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www .iso .org/
iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 212, Clinical laboratory testing and in
vitro diagnostic test systems.
A list of all parts in the ISO 20166 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
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ISO 20166-4:2021(E)
Introduction
Molecular in vitro diagnostics, including molecular pathology, has enabled significant progress
in medicine. Further progress is expected by new technologies analyzing tissue morphology and
biomolecules, such as (e.g. proteins, DNA, RNA and/or metabolites (e.g. glucose) in human tissues and
body fluids.
In pathology, the majority of diagnoses are based on in situ staining of formalin-fixed and paraffin-
embedded (FFPE) tissue sections. In the context of personalized medicine, classical histological staining
(e.g. hematoxylin and eosin) for morphological evaluation is increasingly complemented by additional
in situ detection techniques, such as immunohistochemistry or in situ hybridization, as well as
molecular analysis of isolated biomolecules. For example, many regulatory bodies approved companion
diagnostics in oncology are based on in situ detection techniques applied on FFPE tissue sections.
Developments in personalized medicine and new technologies, such as multi-label immunostaining
and computer-based analysis of digital images (e.g. generated by using a slide scanner) pose new
requirements on standardization of pre-analytical procedures to obtain reproducible qualitative and
quantitative results.
Profiles and/or integrity of biomolecules and their in situ localization, amount and accessibility for
in situ detection in tissues can change drastically during the pre-examination process comprising
specimen collection, tissue processing, embedding, transport, storage, sectioning and pretreatment for
in situ detection. This makes the outcome from in situ detection in diagnostics or research unreliable or
even impossible because the subsequent examination will not represent the in vivo state of molecules,
but instead, an artificial profile or morphology generated during the pre-examination process.
Therefore, a standardization of the entire pre-examination process of FFPE tissue specimens intended
for in situ examinations of morphology and biomolecules on FFPE tissue sections by using different in
situ detection techniques, is needed.
There is multiple scientific evidence that several factors of the pre-examination phase influence the
outcome (e.g. quality or quantity in terms of specificity or sensitivity) of in situ detection and, thus, can
have major impact on the diagnostic results.
This document draws upon such work to organize and standardize the steps for formalin-fixed and
paraffin-embedded (FFPE) tissue with regard to various in situ detection techniques in what is referred
to as the pre-examination phase. This document is for the pre-examination phase of in situ detection
techniques and is applicable to the whole spectrum of in situ detection techniques.
These include but are not limited to:
— Classical histological staining, e.g. Hematoxylin & Eosin staining (H&E);
— Histochemical techniques, e.g. Lipid staining, Periodic Acid Schiff (PAS) reaction, Perls’ Prussian
Blue reaction, Feulgen’s reaction, enzyme histochemistry;
— Immunohistochemical staining (IHC) or immunofluorescence staining using antibodies (polyclonal,
monoclonal or recombinant antibodies) or other affinity binders;
— Hybridization-based techniques such as RNA or DNA in situ hybridization (ISH) techniques, e.g.
fluorescence in situ hybridization (FISH), chromogenic in situ hybridization (CISH), or silver
enhanced in situ hybridization (SISH);
— Molecular analysis of isolated biomolecules that can be mapped to a defined region of an FFPE
section (by e.g. in situ sequencing, imaging mass spectrometry).
In this document, the following verbal forms are used:
— "shall" indicates a requirement;
— "should" indicates a recommendation;
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ISO 20166-4:2021(E)
— "may" indicates a permission;
— "can" indicates a possibility or a capability.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 20166-4:2021(E)
Molecular in vitro diagnostic examinations —
Specifications for preexamination processes for formalin-
fixed and paraffin-embedded (FFPE) tissue —
Part 4:
In situ detection techniques
1 Scope
This document specifies requirements and gives recommendations for the collection, handling,
documentation, transport, storage and processing during the pre-examination phase of formalin-fixed
and paraffin-embedded (FFPE) tissue specimens intended for qualitative and/or (semi-)quantitative
in situ examination of the morphology and of biomolecules, such as metabolites, proteins, DNA and/or
RNA, on FFPE tissue sections by using different in situ detection techniques.
This document is applicable to in vitro diagnostic examinations using in situ detection techniques. These
include laboratory developed tests performed by pathology laboratories (histopathology laboratories)
as well as by molecular pathology laboratories and other medical laboratories. It is also intended to be
used by laboratory customers, in vitro diagnostics developers and manufacturers, biobanks, as well as
institutions and commercial organizations performing biomedical research, and regulatory authorities.
This document is not applicable to the pre-examination phase of RNA, proteins and DNA isolated from
FFPE tissue for examination. These are covered in ISO 20166-1, ISO 20166-2 and ISO 20166-3, Molecular
in vitro diagnostic examinations — Specifications for pre-examination processes for isolated RNA,
proteins and DNA, respectively.
Different dedicated measures are taken for pre-examination processes for fine needle aspirates (FNAs).
These are covered in CEN WI 00140128, CEN WI 00140126, and CEN WI 00140129, Molecular in vitro
diagnostic examinations — Specifications for pre-examination processes for Fine Needle Aspirates
(FNAs) isolated cellular RNA, isolated proteins, and isolated genomic DNA, respectively.
NOTE International, national or regional regulations or requirements can also apply to specific topics
covered in this document.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 15189, Medical laboratories — Requirements for quality and competence
ISO 15190, Medical laboratories — Requirements for safety
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 15189 and the following apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
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ISO 20166-4:2021(E)
3.1
affinity binder
molecules including affibodies, peptides, antibody (3.3) fragments or other small molecules that interact
with biomolecules (3.6) and structures in a cell, and can be used in in situ detection (3.27) techniques
3.2
ambient temperature
unregulated temperature of the surrounding air
[SOURCE: ISO 20166-1:2018, 3.2]
3.3
antibody
protein (3.36) (immunoglobulin) produced and secreted by B lymphocytes in response to a molecule
recognized as foreign (antigen (3.4)) and which is capable of binding to that specific antigen (3.4)
[SOURCE: ISO 16577:2016, 3.10, modified — “Note 1 to entry” has been deleted.]
3.4
antigen
substance that stimulates the production of antibodies (3.3) and reacts with them
[SOURCE: ISO 15089:2000, 3.5]
3.5
antigen retrieval
epitope retrieval
procedure(s) to unmask antigens (3.4)/epitopes (3.14) and restore their binding properties for antibodies
(3.3) used in immunohistochemistry (3.25) by neutralizing the modifications introduced by formalin
fixation (3.19), tissue processing (3.47) and paraffin embedding (3.33) of tissue
3.6
biomolecule
organic molecule produced in living organisms that is involved in the maintenance and metabolic
processes of organisms
Note 1 to entry: The examples of organic molecule are protein (3.37), carbohydrate, lipid, or nucleic acid.
3.7
clearing
process step in tissue processing (3.47) in which formalin-fixed tissue is transferred from dehydration
(3.10) reagent to clearing agent (for example, xylene) to prepare the tissue for impregnation (3.26)
3.8
cold ischemia
condition after removal of the tissue from the body until its stabilization or fixation
[SOURCE: ISO 20166-1:2018, 3.5]
3.9
decalcification
technique using chemical agents for removal of mineral (inorganic calcium) from bone or other calcified
tissue to adjust the hard tissue components to the softness of paraffin (3.32) for sectioning
3.10
dehydration
process step in tissue processing (3.47) for removal of water from formalin-fixed tissue by immersing
the tissue in a series of dehydrating reagent solutions of increasing concentration finishing with water
free (100 %) solution
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ISO 20166-4:2021(E)
3.11
deviation
departure from an approved instruction, procedure and/or method
[SOURCE: ISO 15378:2017, 3.7.5 modified — “approved (3.7.1) standard operating procedure (SOP)
(3.7.10)” replaced by “approved instruction, procedure and/or method”.]
3.12
diagnosis
identification of a health or disease state from its signs and/or symptoms, where the diagnostic process
can involve examinations (3.15) and tests for classification of an individual’s condition into separate
and distinct categories or subclasses that allow medical decisions about treatment and prognosis to be
made
[SOURCE: ISO 20166-1:2018, 3.7]
3.13
DNA
deoxyribonucleic acid
polymer of deoxyribonucleotides occurring in a double-stranded (dsDNA) or single-stranded (ssDNA)
form
[SOURCE: ISO 22174:2005, 3.1.2]
3.14
epitope
antibody (3.3) binding site on a biomolecule (3.6) that is an antigen (3.4)
3.15
examination
analytical test
set of operations with the objective of determining the value or characteristics of a property
Note 1 to entry: Processes that start with the in situ detection (3.27) using antibodies (3.3), nucleic acid probes
or dyes and include all kinds of parameter testing or chemical manipulation for quantitative or qualitative
examination.
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.7, modified — Notes to entry 1 to 3 have been removed, Note 1 to entry has
been added and “analytical test” has been added as a preferred term.]
3.16
examination manufacturer
analytical test manufacturer
entity that manufactures and/or produces the specific analytical test (3.15)
3.17
FFPE tissue
formalin-fixed, paraffin-embedded tissue
tissue specimens (3.42)/samples (3.41) having undergone fixation in formalin (3.18, 3.19), tissue
processing (3.47), and paraffin embedding (3.33) in a tissue cassette
3.18
formalin
saturated aqueous formaldehyde solution which at 100 % contains 37 % formaldehyde by mass
(corresponding to 40 % by volume)
[SOURCE: ISO 20166-1:2018, 3.11]
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ISO 20166-4:2021(E)
3.19
formalin fixation
treatment of a sample (3.41) with standard buffered formalin solution (3.45) for stabilization
[SOURCE: ISO 20166-1:2018, 3.12]
3.20
formalin pigment
acid formalin haematin pigment acid
hematin
black to brown amorphous to microcrystalline granules representing an artefact in histologic sections
prepared from tissues fixed in formalin (3.18, 3.19) having an increased formic acid concentration,
which is produced by acid acting upon haemoglobin
3.21
grossing
gross examination
inspection of pathology specimens (3.42) with the bare eye to obtain diagnostic information, while
being processed for further microscopic examination (3.15)
[SOURCE: ISO 20166-1:2018, 3.13]
3.22
histochemical technique(s)
in situ detection (3.27) technique(s) for the visualization and characterization of biomolecules (3.6) that
involves chemical reactions with specific groups, radicals, or chemical bonds in biomolecules (3.6) and
provide(s) information on the biomolecules’ (3.6) in situ localization in tissue sections (3.49)
Note 1 to entry: The examples of biomolecules (3.6) are carbohydrates, lipids, other metabolites, proteins (3.36),
amino acids, nucleic acids, pigments, or enzymes etc.
3.23
histological staining
in situ detection (3.27) technique undertaken to prepare tissue sections (3.49) by using histological
stains (e.g. Haematoxylin-Eosin (HE), Chromotrop-Anilinblue (CAB)) to highlight features of the tissue
section (3.49) and enhance tissue section (3.49) contrast
3.24
homogeneous
uniform in structure and composition
[SOURCE: ISO 20166-1:2018, 3.31]
3.25
immunohistochemistry
IHC
in situ detection (3.27) technique that uses the principle of antibodies (3.3) binding specifically to
antigens (3.4) / epitopes (3.14) in biological tissues or cells to visualize antigens (3.4) (e.g. proteins
(3.36)) using brightfield microscopy
3.26
impregnation
impregnation with paraffin
process step in tissue processing (3.47) for replacement of clearing agent and infiltration of tissue with
molten paraffin (3.32)
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ISO 20166-4:2021(E)
3.27
in situ detection
technique that allows for precise localization of a specific biomolecule (3.6) within a slide-mounted
section
EXAMPLE Immunohistochemistry (3.25) for protein (3.36) detection, in situ hybridization (3.30) for nucleic
acid detection, histological staining (3.23), histochemical techniques (3.22), MALDI imaging mass spectrometry,
imaging mass cytometry, in situ Raman spectroscopy.
3.28
in situ detection system
detection system
set of reagents used to visualize the binding of molecules to their target in situ within a tissue section
(3.49)
Note 1 to entry: Examples of molecules are antibody (3.3), affinity binder (3.1), and nucleic acid.
Note 2 to entry: Most common for in situ detection (3.27) are enzyme- and fluorophore-based detection systems.
3.29
in situ examination
analytical in situ test
examination (3.15) based on in situ detection (3.27)
3.30
in situ hybridization
ISH
in situ detection (3.27) technique that uses the principle of complementary nucleic acid probes binding
specifically to segments of RNA (3.37) or DNA (3.13) in biological tissues or cells to visualize nucleic
acids (e.g. DNA (3.13) or RNA (3.37)) using brightfield or fluorescence microscope
3.31
nonconformity
nonfulfillment of a requirement
[SOURCE: ISO 9000:2015, 3.6.9 modified — Note 1 removed.]
3.32
paraffin
paraffin wax
product obtained from distillates, consisting essentially of a mixture of saturated hydrocarbons, solid
at room temperatures (3.40) used for paraffin embedding (3.33) of formalin-fixed tissue specimens
(3.42)/samples (3.41)
3.33
paraffin embedding
embedding in paraffin
process following tissue processing (3.47) in which a tissue sample (3.41), is placed in melted paraffin
(3.32) to achieve a hard surrounding matrix so that thin microscopic sections can be cut
3.34
post-translational modification
modifications on a protein (3.36), catalysed by enzymes, after its translation by ribosomes is complete
that can be the addition of a functional group covalently to a protein (3.36) such as phosphorylation
and neddylation, the proteolytic processing and/or folding processes necessary for a protein (3.36) to
mature functionally
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ISO 20166-4:2021(E)
3.35
pre-examination process
pre-analytical workflow
pre-analytical phase
pre-examination phase
process that starts, in chronological order, from the clinician’s request and includes the examination
(3.15) request, preparation and identification of the patient, collection of the speciment(s) (3.42),
transportation to and within the medical laboratory, evaluation, tissue processing (3.47), paraffin
embedding (3.33), FFPE block storage (3.46) and retrieval, sectioning (including mounting onto glass
slides and drying), storage (3.46) of unstained slide-mounted tissue sections (3.49) (if applicable), and
pre-treatment steps for in situ detection (3.27) techniques, and ends when the analytical examination
(3.15) begins
Note 1 to entry: The pre-examination phase for in situ detection (3.27) includes preparative processes, e.g.
antigen/epitope retrieval (3.5) and pre-hybridization procedures, which influence the outcome of the intended
examination (3.15).
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.15, modified — An additional term was added, and more details were
included.]
3.36
protein
type of biological biomolecules (3.6) composed of one or more chains with a defined sequence of amino
acids connected through peptide bonds
[SOURCE: ISO 20166-2:2018, 3.14, modified – The terms "biological macromolecules" were replaced
with "biological biomolecules"]
3.37
RNA
ribonucleic acid
polymer of ribonucleotides occurring in a double-stranded or single-stranded form
[SOURCE: ISO 20166-1:2018, 3.20]
3.38
RNA profile
amounts of the individual RNA (3.37) molecules that are present in a sample (3.41) and that can be
measured in the absence of any losses, inhibition and interference
[SOURCE: ISO 20166-1:2018, 3.19]
3.39
RNase
ribonuclease
enzyme that catalyzes the degradation of RNA (3.37) into smaller components
[SOURCE: ISO 20166-1:2018, 3.21]
3.40
room temperature
for the purpose of this document, temperature in the range of 18 °C to 25 °C
Note 1 to entry: Local or national regulations can have different definitions.
[SOURCE: ISO 20166-1:2018, 3.22]
3.41
sample
one or more parts taken from a specimen (3.42)
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.24, modified — EXAMPLE has been removed.]
6 © ISO 2021 – All rights reserved
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ISO 20166-4:2021(E)
3.42
specimen
primary sample
discrete portion of a body fluid, breath, hair or tissue taken for examination (3.15), study or analysis of
one or more quantities or properties assumed to apply for the whole
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.16, modified — The term and definition is used here without the original
notes.]
3.43
specimen container
container into which the tissue specimen (3.42) is transferred after its collection for further pre-
analytical workflow (3.35) steps (e.g. transport and/or fixation)
3.44
stability
ability of a sample (3.41) material, when stored under specified conditions, to maintain a stated property
value within specified limits for a specified period of time
Note 1 to entry: The analytes for the purpose of this document are biomolecules (3.6) located in situ/in the tissue.
[SOURCE: ISO 20166-1:2018, 3.24, modified — Note 1 to entry has been deleted and new Note 1 to entry
has been added.]
3.45
standard buffered formalin solution
neutral buffered formalin
NBF
10 % formalin (3.18) solution in water with a mass fraction of 3,7 % (corresponding to a volume fraction
of 4 %) formaldehyde, buffered to pH 6,8 to pH 7,2
Note 1 to entry: Standard buffered formalin solutions often contain small amounts of methanol to inhibit
oxidation and polymerization of formaldehyde.
[SOURCE: ISO
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 20166-4
Première édition
2021-07
Analyses de diagnostic moléculaire
in vitro — Spécifications relatives
aux processus préanalytiques pour
les tissus fixés au formol et inclus en
paraffine (FFPE) —
Partie 4:
Techniques de détection in situ
Molecular in vitro diagnostic examinations — Specifications for
preexamination processes for formalin-fixed and paraffin-embedded
(FFPE) tissue —
Part 4: In situ detection techniques
Numéro de référence
ISO 20166-4:2021(F)
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ISO 20166-4:2021(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Considérations générales . 9
5 Activité en dehors du laboratoire .11
5.1 Recueil des prélèvements .11
5.1.1 Généralités .11
5.1.2 Informations relatives au patient/donneur .11
5.1.3 Informations relatives au prélèvement .11
5.1.4 Traitement du prélèvement, stockage intermédiaire et préparation au
transport .12
5.2 Transport .13
6 Dans le laboratoire .13
6.1 Réception des prélèvements .13
6.2 Fixation au formol du prélèvement ou de l’échantillon ou des échantillons .13
6.3 Évaluation de la pathologie du prélèvement et sélection de l’échantillon ou des
échantillons .15
6.3.1 Généralités .15
6.3.2 Examen macroscopique .15
6.3.3 Sélection de l’échantillon ou des échantillons .15
6.4 Post‑fixation d’échantillons congelés d’un examen peropératoire .16
6.5 Décalcification/ramollissement des échantillons .16
6.6 Préparation du tissu et inclusion en paraffine .17
6.6.1 Généralités .17
6.6.2 Déshydratation et nettoyage .18
6.6.3 Imprégnation à la paraffine et inclusion en paraffine .18
6.7 Stockage des blocs de tissu FFPE .19
6.8 Découpage des blocs de tissu FFPE et stockage des coupes montées sur lame .19
6.9 Déparaffinage et réhydratation des coupes montées sur lame .21
6.10 Prétraitement des coupes montées sur lame pour les techniques de détection in situ.21
6.10.1 Généralités .21
6.10.2 Prétraitement pour les techniques de détection in situ basées sur des
anticorps ou d’autres ligands d’affinité .21
6.10.3 Prétraitement pour les techniques de détection in situ reposant sur une
hybridation .22
6.10.4 Prétraitement pour les autres techniques de détection in situ .22
6.11 Évaluation qualitative de la phase préanalytique de la détection in situ .22
Annexe A (informative) Recommandations relatives à la vérification et à la validation des
analyses de détection in situ développées par le laboratoire .23
Annexe B (informative) Exemple de protocole de préparation du tissu .24
Bibliographie .25
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ISO 20166-4:2021(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/ avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 212, Laboratoires d'analyses de
biologie médicale et systèmes de diagnostic in vitro.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 20166 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
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ISO 20166-4:2021(F)
Introduction
Le diagnostic moléculaire in vitro, y compris la pathologie moléculaire, a permis de faire considérablement
progresser la médecine. D’autres avancées sont attendues avec les nouvelles technologies d’analyse de
la morphologie tissulaire et des biomolécules (telles que les protéines, l’ADN, l’ARN, par exemple) et/ou
des métabolites (par exemple, le glucose) dans les tissus humains et les fluides corporels.
En pathologie, la majorité des diagnostics s’établissent à partir d’une coloration in situ de coupes de tissu
fixé au formol et inclus en paraffine (FFPE). Dans le cadre de la médecine personnalisée, la coloration
histologique classique (par exemple, hématoxyline et éosine) à des fins d’examen morphologique est de
plus en plus souvent complétée par des techniques de détection in situ, telles que l’immunohistochimie
ou l’hybridation in situ, ainsi que par l’analyse moléculaire de biomolécules extraites. En oncologie
par exemple, de nombreux diagnostics compagnons homologués par des organismes réglementaires
s’appuient sur des techniques de détection in situ appliquées à des coupes de tissu FFPE. Les avancées
en médecine personnalisée et les nouvelles technologies, telles que l’immunocoloration à marqueurs
multiples et l’analyse informatique d’images numériques (par exemple, générées à l’aide d’un
scanner pour lames) imposent de nouvelles exigences concernant la normalisation des procédures
préanalytiques afin d’obtenir des résultats qualitatifs et quantitatifs reproductibles.
Les profils et/ou l’intégrité des biomolécules in situ ainsi que leurs positions, quantités et accessibilités
pour une détection in situ dans des tissus peuvent varier considérablement au cours du processus
préanalytique englobant le prélèvement des échantillons primaires, la préparation du tissu, l’inclusion,
le transport, le stockage, la réalisation des coupes et le prétraitement en vue d’une détection in situ.
De ce fait, le résultat d’une détection in situ à des fins de diagnostic ou de recherche est peu fiable, voire
inexploitable, car l’analyse subséquente ne représentera pas l’état in vivo des molécules, mais un profil
ou une morphologie artificiel généré pendant le processus préanalytique.
Par conséquent, une normalisation de l’ensemble du processus préanalytique des prélèvements de tissu
FFPE destinés à des analyses in situ de morphologie et de biomolécules sur des coupes de tissu FFPE à
l’aide de différentes techniques de détection in situ, est nécessaire.
Des preuves scientifiques démontrent que plusieurs facteurs de la phase préanalytique influencent le
résultat (c’est-à-dire la qualité ou le niveau de sélectivité ou de sensibilité) de la détection in situ et,
de ce fait, peuvent avoir un impact considérable sur les résultats de diagnostic.
Le présent document se fonde sur ces travaux pour organiser et normaliser les étapes des processus
dits de la phase préanalytique pour tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) au regard des
diverses techniques de détection in situ. Le présent document est applicable à la phase préanalytique
des techniques de détection in situ et couvre l’ensemble du spectre des techniques de détection in situ.
Celles-ci incluent notamment (liste non exhaustive):
— la coloration histologique classique, par exemple la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E);
— les techniques histochimiques, par exemple la coloration des lipides, la coloration PAS (de l’anglais
« Periodic Acid Schiff »), la coloration au bleu de Prusse ou coloration de Perls, la coloration de
Feulgen, l’histochimie enzymatique;
— la coloration immunohistochimique (IHC) ou la coloration par immunofluorescence utilisant des
anticorps (anticorps polyclonaux, monoclonaux ou recombinés) ou d’autres ligands d’affinité;
— les techniques reposant sur une hybridation, telles que les techniques d’hybridation in situ (HIS)
d’ADN ou d’ARN, par exemple l’hybridation in situ en fluorescence (FISH, de l’anglais « fluorescence
in situ hybridization »), l’hybridation in situ chromogène (CISH, de l’anglais « chromogenic in situ
hybridization »), ou l’hybridation in situ améliorée à l’argent (SISH, de l’anglais « silver enhanced
in situ hybridization »);
— l’analyse moléculaire de biomolécules extraites qui peuvent être reliées à une région définie d’une
coupe FFPE (par exemple, au moyen d’un séquençage in situ, d’une spectrométrie de masse à
imagerie).
© ISO 2021 – Tous droits réservés v
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ISO 20166-4:2021(F)
Dans le présent document, les formes verbales suivantes sont utilisées:
— « doit » indique une exigence;
— « il convient de/que » indique une recommandation;
— « peut/il est admis/permis » indique une autorisation;
— « peut/il est possible » indique une possibilité ou une capacité.
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NORME INTERNATIONALE ISO 20166-4:2021(F)
Analyses de diagnostic moléculaire in vitro —
Spécifications relatives aux processus préanalytiques pour
les tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) —
Partie 4:
Techniques de détection in situ
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie des exigences et formule des recommandations concernant le
prélèvement, la manipulation, la documentation, le transport, le stockage et le traitement durant la
phase préanalytique de prélèvements de tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) destinés
à l’analyse in situ qualitative et/ou (semi-)quantitative de la morphologie et de biomolécules, telles que
des métabolites, des protéines, l’ADN et/ou l’ARN sur des coupes de tissu FFPE à l’aide de différentes
techniques de détection in situ.
Le présent document s’applique aux analyses de diagnostic in vitro, utilisant des techniques de détection
in situ. Celles-ci englobent les analyses développées en laboratoire réalisées par des laboratoires de
pathologie (laboratoires d’histopathologie) ainsi que par des laboratoires de pathologie moléculaire
et autres laboratoires de biologie médicale. Il est également destiné à être utilisé par des clients de
laboratoires, des développeurs et fabricants de l’industrie du diagnostic in vitro, des biobanques, ainsi
que par des institutions et des organismes commerciaux spécialisés en recherche biomédicale, de même
que des autorités de réglementation.
Le présent document ne s’applique pas à la phase préanalytique de l’analyse d’ARN, de protéines
et d’ADN extraits de tissus FFPE, ces biomolécules étant respectivement couvertes par les normes
ISO 20166-1, ISO 20166-2 et ISO 20166-3, Analyses de diagnostic moléculaire in vitro — Spécifications
relatives aux processus préanalytiques pour l’ARN extrait, les protéines extraites et l’ADN extrait.
Des mesures spéciales différentes sont prises pour les processus préanalytiques applicables aux
prélèvements de biopsie à l’aiguille fine (BAF). Les mesures applicables aux différents prélèvements
BAF (ARN cellulaire extrait, protéines extraites, et ADN génomique extrait) sont respectivement
traitées par les CEN WI 00140128, CEN WI 00140126, et CEN WI 00140129, Molecular in vitro diagnostic
examinations — Specifications for pre‑examination processes for Fine Needle Aspirates (FNAs) isolated
cellular RNA, isolated proteins, and isolated genomic DNA (disponibles en anglais seulement).
NOTE Des réglementations ou exigences internationales, nationales ou régionales peuvent également
s’appliquer à des sujets spécifiques traités dans le présent document.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 15189, Laboratoires de biologie médicale — Exigences concernant la qualité et la compétence
ISO 15190, Laboratoires de biologie médicale — Exigences pour la sécurité
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ISO 20166-4:2021(F)
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions de l'ISO 15189 ainsi que les suivants,
s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp;
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/ .
3.1
ligand d’affinité
molécules englobant les afficorps, les peptides, les fragments d’anticorps (3.3) ou d’autres petites
molécules qui interagissent avec des biomolécules (3.6) et structures dans une cellule, et qui peuvent
être utilisées dans le cadre de techniques de détection in situ (3.27)
3.2
température ambiante
température non régulée de l’air environnant
[SOURCE: ISO 20166-1:2018, 3.2]
3.3
anticorps
protéine (3.37) (immunoglobuline) produite et sécrétée par les lymphocytes B en réponse à une
molécule reconnue comme étrangère (antigène (3.4)), et qui est capable de se lier à cet antigène (3.4)
spécifique
[SOURCE: ISO 16577:2016, 3.10, modifiée — La Note 1 à l’article a été supprimée.]
3.4
antigène
substance qui stimule la production d’anticorps (3.3) et qui réagit à leur contact
[SOURCE: ISO 15089:2000, 3.5]
3.5
récupération d’antigènes
récupération d’épitopes
procédure(s) permettant de démasquer des antigènes (3.4)/épitopes (3.14) et de restaurer leurs
propriétés de liaison aux anticorps (3.3) utilisées en immunohistochimie (3.25) en neutralisant les
modifications introduites par la fixation au formol (3.19), la préparation du tissu (3.47) et l’inclusion en
paraffine (3.33) du tissu
3.6
biomolécule
molécule organique produite chez les organismes vivants qui est impliquée dans les processus
métaboliques et de soutien des organismes
Note 1 à l'article: Les protéines (3.37), les carbohydrates, les lipides, ou encore l’acide nucléique sont des exemples
de molécule organique.
3.7
nettoyage
étape de processus de la préparation du tissu (3.47) lors de laquelle un tissu fixé au formol est transféré
d’un réactif de déshydratation (3.10) vers un produit nettoyant (par exemple, xylène) afin de préparer le
tissu à l’imprégnation (3.26)
2 © ISO 2021 – Tous droits réservés
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ISO 20166-4:2021(F)
3.8
ischémie froide
état d’un tissu suite à son prélèvement de l’organisme jusqu’à sa stabilisation ou sa fixation
[SOURCE: ISO 20166-1:2018, 3.5]
3.9
décalcification
technique utilisant des produits chimiques permettant d’éliminer la fraction minérale (calcium
inorganique) d’un os ou d’un autre tissu calcifié de sorte à adapter les composants de tissu rigide à la
souplesse de la paraffine (3.32) pour la réalisation des coupes
3.10
déshydratation
étape de processus de la préparation du tissu (3.47) destinée à éliminer l’eau d’un tissu fixé au formol
en le plongeant dans une série de solutions de réactif de déshydratation de concentration croissante en
terminant par une solution exempte (à 100 %) d’eau
3.11
écart
écart par rapport à une instruction, une procédure et/ou une méthode approuvées ou à une norme
établie
[SOURCE: ISO 15378:2017, 3.7.5 modifiée — Le terme « procédure d’utilisation normalisée (SOP) (3.7.10)
approuvée (3.7.1) » a été remplacé par « une instruction, une procédure et/ou une méthode
approuvées ».]
3.12
diagnostic
identification d’un état de santé sain ou pathologique à partir de ses signes et/ou symptômes, dans
laquelle le processus de diagnostic peut impliquer des analyses (3.15) et essais pour la classification
de l’état d’un individu en catégories ou sous-classes distinctes, laquelle permet la prise de décisions
médicales concernant le traitement et le pronostic à établir
[SOURCE: ISO 20166-1:2018, 3.7]
3.13
ADN
acide désoxyribonucléique
polymère de désoxyribonucléotides se présentant sous la forme de double brin (ADNdb) ou de simple
brin (ADNsb)
[SOURCE: ISO 22174:2005, 3.1.2]
3.14
épitope
site de liaison d’anticorps (3.3) sur une biomolécule (3.6) qui est un antigène (3.4)
3.15
examen
analyse
ensemble des opérations destinées à déterminer la valeur ou les caractéristiques d’une propriété
Note 1 à l'article: Processus qui débutent par la détection in situ (3.27) à l’aide d’anticorps (3.3), de sondes
d’acide nucléique ou de colorants et qui comprennent toutes sortes d’essais paramétriques ou de manipulations
chimiques en vue de réaliser l’analyse quantitative ou qualitative.
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.7, modifiée — Les Notes à l’article 1 à 3 ont été supprimées, la Note 1 à
l’article a été ajoutée et « analyse » a été ajouté comme terme privilégié.]
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ISO 20166-4:2021(F)
3.16
fabricant d’examen
fabricant d’analyse
entité qui fabrique et/ou produit l’analyse (3.15) donnée
3.17
tissu FFPE
tissu fixé au formol et inclus en paraffine
échantillons primaires (3.36)/échantillons (3.42) de tissu ayant subi une fixation au formol (3.18, 3.19),
une préparation du tissu (3.47), et une inclusion en paraffine (3.33) dans une cassette d’inclusion
3.18
formol
solution aqueuse saturée en formaldéhyde qui, à 100 %, contient 37 % de formaldéhyde en masse
(correspondant à 40 % en volume)
[SOURCE: ISO 20166-1:2018, 3.11]
3.19
fixation au formol
traitement d’un échantillon (3.42) avec une solution de formol tamponnée standard (3.45) à des fins de
stabilisation
[SOURCE: ISO 20166-1:2018, 3.12]
3.20
pigment formolique
pigment formolique d’hématine acide
hématine
granules amorphes à microcristallines noires à marron représentant un artéfact sur des coupes
histologiques préparées à partir de tissus fixés au formol (3.18, 3.19) ayant une concentration accrue en
acide formique, lequel est produit par la réaction d’acide avec l’hémoglobine
3.21
macroscopie
analyse macroscopique
contrôle de prélèvements pathologiques à l’œil nu, au cours de leur traitement à des fins d’analyse (3.15)
microscopique ultérieure, en vue d’obtenir des informations de diagnostic
[SOURCE: ISO 20166-1:2018, 3.13]
3.22
technique(s) histochimique(s)
technique(s) de détection in situ (3.27) utilisée(s) pour visualiser et caractériser des biomolécules (3.6)
qui implique(nt) des réactions chimiques avec des groupements, radicaux ou liaisons chimiques donnés
des biomolécules (3.6) et fourni(ssen)t des informations sur la position in situ des biomolécules (3.6)
dans les coupes de tissu (3.49)
Note 1 à l'article: Les carbohydrates, lipides, autres métabolites, protéines (3.37), acides aminés, acides nucléiques,
pigments, ou enzymes, etc., sont des exemples de biomolécules (3.6).
3.23
coloration histologique
technique de détection in situ (3.27) entreprise pour préparer des coupes de tissu (3.49) en utilisant des
colorants histologiques (par exemple, hématoxyline-éosine (HE), chromotrope-bleu d’aniline (CAB))
pour mettre en évidence des caractéristiques de la coupe de tissu (3.49) et améliorer le contraste de la
coupe de tissu (3.49)
4 © ISO 2021 – Tous droits réservés
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ISO 20166-4:2021(F)
3.24
homogène
de structure et de composition uniformes
[SOURCE: ISO 20166-1:2018, 3.31]
3.25
immunohistochimie
IHC
technique de détection in situ (3.27) qui utilise le principe de liaison sélective d’anticorps (3.3) à des
antigènes (3.4) / épitopes (3.14) dans des tissus biologiques ou des cellules pour visualiser des antigènes
(3.4) (par exemple, des protéines (3.37)) par microscopie en champ clair
3.26
imprégnation
imprégnation à la paraffine
étape de processus de la préparation du tissu (3.47) destinée à remplacer le produit nettoyant et à
infiltrer un tissu avec de la paraffine (3.32) fondue
3.27
détection in situ
technique qui permet de localiser précisément une biomolécule (3.6) donnée dans une coupe montée
sur lame
EXEMPLE Immunohistochimie (3.25) pour la détection de protéine (3.37), hybridation in situ (3.30) pour la
détection d’acide nucléique, coloration histologique (3.23), techniques histochimiques (3.22), spectrométrie de
masse à imagerie MALDI, cytométrie de masse à imagerie, spectroscopie Raman in situ.
3.28
système de détection in situ
système de détection
ensemble de réactifs utilisés pour visualiser la liaison de molécules à leur cible in situ dans une coupe de
tissu (3.49)
Note 1 à l'article: Les anticorps (3.3), un ligand d’affinité (3.1), et l’acide nucléique sont des exemples de molécules.
Note 2 à l'article: Les systèmes de détection les plus courants pour la détection in situ (3.27) sont ceux qui
détectent des enzymes et des fluorophores.
3.29
examen in situ
analyse in situ
analyse (3.15) reposant sur une détection in situ (3.27)
3.30
hybridation in situ
HIS ou ISH (de l’anglais « In situ Hybridization »)
technique de détection in situ (3.27) qui utilise le principe de liaison sélective de sondes d’acide nucléique
complémentaires à des fragments d’ARN (3.38) ou d’ADN (3.13) dans des tissus biologiques ou des
cellules pour visualiser des acides nucléiques (par exemple, ADN (3.13) ou ARN (3.38)) par microscopie
en champ clair ou de fluorescence
3.31
non-conformité
non-satisfaction d’une exigence
[SOURCE: ISO 9000:2015, 3.6.9, modifiée — La Note 1 a été supprimée.]
© ISO 2021 – Tous droits réservés 5
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ISO 20166-4:2021(F)
3.32
paraffine
cire de paraffine
produit obtenu à partir de distillats, constitué principalement d’un mélange d’hydrocarbures saturés,
solide aux températures de laboratoire (3.41) utilisé pour l’inclusion en paraffine (3.33) d’échantillons
primaires (3.36)/échantillons (3.42) de tissus fixés au formol
3.33
inclusion en paraffine
inclusion dans la paraffine
processus intervenant après la préparation du tissu (3.47) dans lequel un échantillon (3.42) de tissu est
placé dans de la paraffine (3.32) fondue en vue d’obtenir une matrice rigide environnante permettant le
découpage de fines coupes microscopiques
3.34
modification post-traductionnelle
modifications apportées à une protéine (3.37), catalysées par des enzymes, après achèvement de
sa traduction par des ribosomes, qui peuvent être l’ajout d’un groupement fonctionnel par une
liaison covalente à une protéine (3.37) telle qu’une phosphorylation et une neddylation, le traitement
protéolytique et/ou les processus de repli nécessaires à une protéine (3.37) pour arriver à maturation
...
FINAL
INTERNATIONAL ISO/FDIS
DRAFT
STANDARD 20166-4
ISO/TC 212
Molecular in vitro diagnostic
Secretariat: ANSI
examinations — Specifications
Voting begins on:
2021-02-22 for preexamination processes for
formalin-fixed and paraffin-embedded
Voting terminates on:
2021-04-19
(FFPE) tissue —
Part 4:
In situ detection techniques
Analyses de diagnostic moléculaire in vitro — Spécifications relatives
aux processus préanalytiques pour les tissus fixés au formol et inclus
en paraffine (FFPE) —
Partie 4: Techniques de détection in situ
ISO/CEN PARALLEL PROCESSING
RECIPIENTS OF THIS DRAFT ARE INVITED TO
SUBMIT, WITH THEIR COMMENTS, NOTIFICATION
OF ANY RELEVANT PATENT RIGHTS OF WHICH
THEY ARE AWARE AND TO PROVIDE SUPPOR TING
DOCUMENTATION.
IN ADDITION TO THEIR EVALUATION AS
Reference number
BEING ACCEPTABLE FOR INDUSTRIAL, TECHNO-
ISO/FDIS 20166-4:2021(E)
LOGICAL, COMMERCIAL AND USER PURPOSES,
DRAFT INTERNATIONAL STANDARDS MAY ON
OCCASION HAVE TO BE CONSIDERED IN THE
LIGHT OF THEIR POTENTIAL TO BECOME STAN-
DARDS TO WHICH REFERENCE MAY BE MADE IN
©
NATIONAL REGULATIONS. ISO 2021
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ISO/FDIS 20166-4:2021(E)
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ISO/FDIS 20166-4:2021(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 General considerations . 8
5 Activity outside the laboratory .10
5.1 Specimen collection .10
5.1.1 General.10
5.1.2 Information about the patient/specimen donor .10
5.1.3 Information about the specimen .10
5.1.4 Specimen processing, intermediate storage and preparation for transport .11
5.2 Transport .11
6 Inside the laboratory .12
6.1 Specimen reception .12
6.2 Formalin fixation of the specimen or sample(s) .12
6.3 Evaluation of the pathology of the specimen and selection of the sample(s) .13
6.3.1 General.13
6.3.2 Macroscopic evaluation .13
6.3.3 Selection of the sample(s).14
6.4 Post-fixation of frozen samples from intraoperative consultation .15
6.5 Sample decalcification/softening .15
6.6 Tissue processing and paraffin embedding .15
6.6.1 General.15
6.6.2 Dehydration and clearing .16
6.6.3 Impregnation with paraffin and paraffin embedding .16
6.7 Storage of FFPE tissue blocks .17
6.8 Sectioning of FFPE tissue blocks and storage of slide-mounted sections .17
6.9 Deparaffinization and rehydration of slide-mounted sections .18
6.10 Pretreatment of slide-mounted sections for in situ detection techniques .19
6.10.1 General.19
6.10.2 Pretreatment for antibody- or other affinity binder-based in situ detection
techniques .19
6.10.3 Pretreatment for hybridization-based in situ detection techniques.19
6.10.4 Pretreatment for other in situ detection techniques .19
6.11 Quality assessment of the pre-analytical part of in situ detection .20
Annex A (informative) Recommendations relating to verification and validation of
laboratory developed in situ detection tests . .21
Annex B (informative) Example protocol for tissue processing .22
Bibliography .23
© ISO 2021 – All rights reserved iii
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ISO/FDIS 20166-4:2021(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www .iso .org/
iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 212, Clinical laboratory testing and in
vitro diagnostic test systems.
A list of all parts in the ISO 20166 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
iv © ISO 2021 – All rights reserved
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ISO/FDIS 20166-4:2021(E)
Introduction
Molecular in vitro diagnostics, including molecular pathology, has enabled significant progress
in medicine. Further progress is expected by new technologies analyzing tissue morphology and
biomolecules, such as (e.g. proteins, DNA, RNA and/or metabolites (e.g. glucose) in human tissues and
body fluids.
In pathology, the majority of diagnoses are based on in situ staining of formalin-fixed and paraffin-
embedded (FFPE) tissue sections. In the context of personalized medicine, classical histological staining
(e.g., hematoxylin and eosin) for morphological evaluation is increasingly complemented by additional
in situ detection techniques, such as immunohistochemistry or in situ hybridization, as well as
molecular analysis of isolated biomolecules. For example, many regulatory bodies approved companion
diagnostics in oncology are based on in situ detection techniques applied on FFPE tissue sections.
Developments in personalized medicine and new technologies, such as multi-label immunostaining
and computer-based analysis of digital images (e.g. generated by using a slide scanner) pose new
requirements on standardization of pre-analytical procedures to obtain reproducible qualitative and
quantitative results.
Profiles and/or integrity of biomolecules and their in situ localization, amount and accessibility for
in situ detection in tissues can change drastically during the pre-examination process comprising
specimen collection, tissue processing, embedding, transport, storage, sectioning and pretreatment for
in situ detection. This makes the outcome from in situ detection in diagnostics or research unreliable or
even impossible because the subsequent examination will not represent the in vivo state of molecules,
but instead, an artificial profile or morphology generated during the pre-examination process.
Therefore, a standardization of the entire pre-examination process of FFPE tissue specimens intended
for in situ examinations of morphology and biomolecules on FFPE tissue sections by using different in
situ detection techniques, is needed.
There is multiple scientific evidence that several factors of the pre-examination phase influence the
outcome (e.g. quality or quantity in terms of specificity or sensitivity) of in situ detection and, thus, can
have major impact on the diagnostic results.
This document draws upon such work to organize and standardize the steps for formalin-fixed and
paraffin-embedded (FFPE) tissue with regard to various in situ detection techniques in what is referred
to as the pre-examination phase. This document is for the pre-examination phase of in situ detection
techniques and is applicable to the whole spectrum of in situ detection techniques.
These include but are not limited to:
— Classical histological staining, e.g. Hematoxylin & Eosin staining (H&E);
— Histochemical techniques, e.g. Lipid staining, Periodic Acid Schiff (PAS) reaction, Perls’ Prussian
Blue reaction, Feulgen’s reaction, enzyme histochemistry;
— Immunohistochemical staining (IHC) or immunofluorescence staining using antibodies (polyclonal,
monoclonal or recombinant antibodies) or other affinity binders;
— Hybridization-based techniques such as RNA or DNA in situ hybridization (ISH) techniques, e.g.
fluorescence in situ hybridization (FISH), chromogenic in situ hybridization (CISH), or silver
enhanced in situ hybridization (SISH);
— Molecular analysis of isolated biomolecules that can be mapped to a defined region of an FFPE
section (by e.g. in situ sequencing, imaging mass spectrometry).
In this document, the following verbal forms are used:
— "shall" indicates a requirement;
— "should" indicates a recommendation;
© ISO 2021 – All rights reserved v
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ISO/FDIS 20166-4:2021(E)
— "may" indicates a permission;
— "can" indicates a possibility or a capability.
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FINAL DRAFT INTERNATIONAL STANDARD ISO/FDIS 20166-4:2021(E)
Molecular in vitro diagnostic examinations —
Specifications for preexamination processes for formalin-
fixed and paraffin-embedded (FFPE) tissue —
Part 4:
In situ detection techniques
1 Scope
This document specifies requirements and gives recommendations for the collection, handling,
documentation, transport, storage and processing during the pre-examination phase of formalin-fixed
and paraffin-embedded (FFPE) tissue specimens intended for qualitative and/or (semi-)quantitative
in situ examination of the morphology and of biomolecules, such as metabolites, proteins, DNA and/or
RNA, on FFPE tissue sections by using different in situ detection techniques.
This document is applicable to in vitro diagnostic examinations using in situ detection techniques. These
include laboratory developed tests performed by pathology laboratories (histopathology laboratories)
as well as by molecular pathology laboratories and other medical laboratories. It is also intended to be
used by laboratory customers, in vitro diagnostics developers and manufacturers, biobanks, as well as
institutions and commercial organizations performing biomedical research, and regulatory authorities.
This document is not applicable to the pre-examination phase of RNA, proteins and DNA isolated from
FFPE tissue for examination. These are covered in ISO 20166-1, ISO 20166-2 and ISO 20166-3, Molecular
in vitro diagnostic examinations — Specifications for pre-examination processes for isolated RNA,
proteins and DNA, respectively.
Different dedicated measures are taken for pre-examination processes for fine needle aspirates (FNAs).
These are covered in CEN WI 00140128, CEN WI 00140126, and CEN WI 00140129, Molecular in vitro
diagnostic examinations — Specifications for pre-examination processes for Fine Needle Aspirates
(FNAs) isolated cellular RNA, isolated proteins, and isolated genomic DNA, respectively.
NOTE International, national or regional regulations or requirements can also apply to specific topics
covered in this document.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 15189, Medical laboratories — Requirements for quality and competence
ISO 15190, Medical laboratories — Requirements for safety
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 15189 and the following apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
© ISO 2021 – All rights reserved 1
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ISO/FDIS 20166-4:2021(E)
3.1
affinity binder
molecules including affibodies, peptides, antibody (3.3) fragments or other small molecules that interact
with biomolecules (3.6) and structures in a cell, and can be used in in situ detection (3.27) techniques
3.2
ambient temperature
unregulated temperature of the surrounding air
[SOURCE: ISO 20166-1:2018, 3.2]
3.3
antibody
protein (3.37) (immunoglobulin) produced and secreted by B lymphocytes in response to a molecule
recognized as foreign (antigen (3.4)) and which is capable of binding to that specific antigen (3.4)
[SOURCE: ISO 16577:2016, 3.10, modified — “Note 1 to entry” has been deleted.]
3.4
antigen
substance that stimulates the production of antibodies (3.3) and reacts with them
[SOURCE: ISO 15089:2000, 3.5]
3.5
antigen retrieval
epitope retrieval
procedure(s) to unmask antigens (3.4)/epitopes (3.14) and restore their binding properties for antibodies
(3.3) used in immunohistochemistry (3.25) by neutralizing the modifications introduced by formalin
fixation (3.19), tissue processing (3.47) and paraffin embedding (3.33) of tissue
3.6
biomolecule
organic molecule produced in living organisms that is involved in the maintenance and metabolic
processes of organisms
Note 1 to entry: The examples of organic molecule are protein (3.37), carbohydrate, lipid, or nucleic acid.
3.7
clearing
process step in tissue processing (3.47) in which formalin-fixed tissue is transferred from dehydration
(3.10) reagent to clearing agent (for example, xylene) to prepare the tissue for impregnation (3.26)
3.8
cold ischemia
condition after removal of the tissue from the body until its stabilization or fixation
[SOURCE: ISO 20166-1:2018, 3.5]
3.9
decalcification
technique using chemical agents for removal of mineral (inorganic calcium) from bone or other calcified
tissue to adjust the hard tissue components to the softness of paraffin (3.32) for sectioning
3.10
dehydration
process step in tissue processing (3.47) for removal of water from formalin-fixed tissue by immersing
the tissue in a series of dehydrating reagent solutions of increasing concentration finishing with water
free (100 %) solution
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ISO/FDIS 20166-4:2021(E)
3.11
deviation
departure from an approved instruction, procedure and/or method or established standard
[SOURCE: ISO 15378:2017, 3.7.5 modified — “approved (3.7.1) standard operating procedure (SOP)
(3.7.10)” replaced by “instruction, procedure and/or method”.]
3.12
diagnosis
identification of a health or disease state from its signs and/or symptoms, where the diagnostic process
can involve examinations (3.15) and tests for classification of an individual’s condition into separate and
distinct categories or subclasses that allow medical decisions about treatment and prognosis to be made
[SOURCE: ISO 20166-1:2018, 3.7]
3.13
DNA
deoxyribonucleic acid
polymer of deoxyribonucleotides occurring in a double-stranded (dsDNA) or single-stranded
(ssDNA) form
[SOURCE: ISO 22174:2005, 3.1.2]
3.14
epitope
antibody (3.3) binding site on a biomolecule (3.6) that is an antigen (3.4)
3.15
examination
analytical test
set of operations with the objective of determining the value or characteristics of a property
Note 1 to entry: Processes that start with the in situ detection (3.27) using antibodies (3.3), nucleic acid probes
or dyes and include all kinds of parameter testing or chemical manipulation for quantitative or qualitative
examination.
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.7, modified — Notes to entry 1 to 3 have been removed, Note 1 to entry has
been added and “analytical test” has been added as a preferred term.]
3.16
examination manufacturer
analytical test manufacturer
entity that manufactures and/or produces the specific analytical test (3.15)
3.17
FFPE tissue
formalin-fixed, paraffin-embedded tissue
tissue specimens (3.36)/samples (3.42) having undergone fixation in formalin (3.18, 3.19), tissue
processing (3.47), and paraffin embedding (3.33) in a tissue cassette
3.18
formalin
saturated aqueous formaldehyde solution which at 100 % contains 37 % formaldehyde by mass
(corresponding to 40 % by volume)
[SOURCE: ISO 20166-1:2018, 3.11]
3.19
formalin fixation
treatment of a sample (3.42) with standard buffered formalin solution (3.45) for stabilization
[SOURCE: ISO 20166-1:2018, 3.12]
© ISO 2021 – All rights reserved 3
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ISO/FDIS 20166-4:2021(E)
3.20
formalin pigment
acid formalin haematin pigment acid
hematin
black to brown amorphous to microcrystalline granules representing an artefact in histologic sections
prepared from tissues fixed in formalin (3.18, 3.19) having an increased formic acid concentration,
which is produced by acid acting upon haemoglobin
3.21
grossing
gross examination
inspection of pathology specimens with the bare eye to obtain diagnostic information, while being
processed for further microscopic examination (3.15)
[SOURCE: ISO 20166-1:2018, 3.13]
3.22
histochemical technique(s)
in situ detection (3.27) technique(s) for the visualization and characterization of biomolecules (3.6) that
involves chemical reactions with specific groups, radicals, or chemical bonds in biomolecules (3.6) and
provide(s) information on the biomolecules’ (3.6) in situ localization in tissue sections (3.49)
Note 1 to entry: The examples of biomolecules (3.6) are carbohydrates, lipids, other metabolites, proteins (3.37),
amino acids, nucleic acids, pigments, or enzymes etc.
3.23
histological staining
in situ detection (3.27) technique undertaken to prepare tissue sections (3.49) by using histological
stains (e.g. Haematoxylin-Eosin (HE), Chromotrop-Anilinblue (CAB)) to highlight features of the tissue
section (3.49) and enhance tissue section (3.49) contrast
3.24
homogeneous
uniform in structure and composition
[SOURCE: ISO 20166-1:2018, 3.31]
3.25
immunohistochemistry
IHC
in situ detection (3.27) technique that uses the principle of antibodies (3.3) binding specifically to
antigens (3.4) / epitopes (3.14) in biological tissues or cells to visualize antigens (3.4) (e.g. proteins
(3.37)) using brightfield microscopy
3.26
impregnation
impregnation with paraffin
process step in tissue processing (3.47) for replacement of clearing agent and infiltration of tissue with
molten paraffin (3.32)
3.27
in situ detection
technique that allows for precise localization of a specific biomolecule (3.6) within a slide-mounted section
EXAMPLE Immunohistochemistry (3.25) for protein (3.37) detection, in situ hybridization (3.30) for nucleic
acid detection, histological staining (3.23), histochemical techniques (3.22), MALDI imaging mass spectrometry,
imaging mass cytometry, in situ Raman spectroscopy.
4 © ISO 2021 – All rights reserved
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ISO/FDIS 20166-4:2021(E)
3.28
in situ detection system
detection system
set of reagents used to visualize the binding of molecules to their target in situ within a tissue
section (3.49)
Note 1 to entry: Examples of molecules are antibody (3.3), affinity binder (3.1), and nucleic acid.
Note 2 to entry: Most common for in situ detection (3.27) are enzyme- and fluorophore-based detection systems.
3.29
in situ examination
analytical in situ test
examination (3.15) based on in situ detection (3.27)
3.30
in situ hybridization
ISH
in situ detection (3.27) technique that uses the principle of complementary nucleic acid probes binding
specifically to segments of RNA (3.38) or DNA (3.13) in biological tissues or cells to visualize nucleic
acids (e.g. DNA (3.13) or RNA (3.38)) using brightfield or fluorescence microscope
3.31
nonconformity
nonfulfillment of a requirement
[SOURCE: ISO 9000:2015, 3.6.9 modified — Note 1 removed.]
3.32
paraffin
paraffin wax
product obtained from distillates, consisting essentially of a mixture of saturated hydrocarbons, solid
at room temperatures (3.41) used for paraffin embedding (3.33) of formalin-fixed tissue specimens
(3.36)/samples (3.42)
3.33
paraffin embedding
embedding in paraffin
process following tissue processing (3.47) in which a tissue sample (3.42), is placed in melted paraffin
(3.32) to achieve a hard surrounding matrix so that thin microscopic sections can be cut
3.34
post-translational modification
modifications on a protein (3.37), catalysed by enzymes, after its translation by ribosomes is complete
that can be the addition of a functional group covalently to a protein (3.37) such as phosphorylation
and neddylation, the proteolytic processing and/or folding processes necessary for a protein (3.37) to
mature functionally
© ISO 2021 – All rights reserved 5
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ISO/FDIS 20166-4:2021(E)
3.35
pre-examination process
pre-analytical workflow
pre-analytical phase
pre-examination phase
process that starts, in chronological order, from the clinician’s request and includes the examination
(3.15) request, preparation and identification of the patient, collection of the primary sample(s) (3.36),
transportation to and within the medical laboratory, evaluation, tissue processing (3.47), embedding,
FFPE block storage (3.46) and retrieval, sectioning (including mounting onto glass slides and drying),
storage (3.46) of unstained slide-mounted tissue sections (3.49) (if applicable), and pre-treatment steps
for in situ detection (3.27) techniques, and ends when the analytical examination (3.15) begins
Note 1 to entry: The pre-examination phase for in situ detection (3.27) includes preparative processes, e.g.
antigen/epitope retrieval (3.5) and pre-hybridization procedures, which influence the outcome of the intended
examination (3.15).
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.15, modified — An additional term was added, and more details were
included.]
3.36
protein
type of biological biomolecules (3.6) composed of one or more chains with a defined sequence of amino
acids connected through peptide bonds
[SOURCE: ISO 20166-2:2018, 3.14, modified – The terms "biological macromolecules" were replaced
with "biological biomolecules"]
3.37
RNA
ribonucleic acid
polymer of ribonucleotides occurring in a double-stranded or single-stranded form
[SOURCE: ISO 20166-1:2018, 3.20]
3.38
RNA profile
amounts of the individual RNA (3.38) molecules that are present in a sample (3.42) and that can be
measured in the absence of any losses, inhibition and interference
[SOURCE: ISO 20166-1:2018, 3.19]
3.39
RNase
ribonuclease
enzyme that catalyzes the degradation of RNA (3.38) into smaller components
[SOURCE: ISO 20166-1:2018, 3.21]
3.40
room temperature
for the purpose of this document, temperature in the range of 18 °C to 25 °C
Note 1 to entry: Local or national regulations can have different definitions.
[SOURCE: ISO 20166-1:2018, 3.22]
3.41
sample
one or more parts taken from a primary sample (3.36)
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.24, modified — EXAMPLE has been removed.]
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ISO/FDIS 20166-4:2021(E)
3.42
specimen
primary sample
discrete portion of a body fluid, breath, hair or tissue taken for examination (3.15), study or analysis of
one or more quantities or properties assumed to apply for the whole
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.16, modified — The term and definition is used here without the
original notes.]
3.43
specimen container
container into which the tissue specimen (3.36) is transferred after its collection for further pre-
analytical workflow (3.35) steps (e.g. transport and/or fixation)
3.44
stability
ability of a sample (3.42) material, when stored under specified conditions, to maintain a stated
proper
...
FINAL
INTERNATIONAL ISO/FDIS
DRAFT
STANDARD 20166-4
ISO/TC 212
Molecular in vitro diagnostic
Secretariat: ANSI
examinations — Specifications
Voting begins on:
2021-02-22 for preexamination processes for
formalin-fixed and paraffin-embedded
Voting terminates on:
2021-04-19
(FFPE) tissue —
Part 4:
In situ detection techniques
Analyses de diagnostic moléculaire in vitro — Spécifications relatives
aux processus préanalytiques pour les tissus fixés au formol et inclus
en paraffine (FFPE) —
Partie 4: Techniques de détection in situ
ISO/CEN PARALLEL PROCESSING
RECIPIENTS OF THIS DRAFT ARE INVITED TO
SUBMIT, WITH THEIR COMMENTS, NOTIFICATION
OF ANY RELEVANT PATENT RIGHTS OF WHICH
THEY ARE AWARE AND TO PROVIDE SUPPOR TING
DOCUMENTATION.
IN ADDITION TO THEIR EVALUATION AS
Reference number
BEING ACCEPTABLE FOR INDUSTRIAL, TECHNO-
ISO/FDIS 20166-4:2021(E)
LOGICAL, COMMERCIAL AND USER PURPOSES,
DRAFT INTERNATIONAL STANDARDS MAY ON
OCCASION HAVE TO BE CONSIDERED IN THE
LIGHT OF THEIR POTENTIAL TO BECOME STAN-
DARDS TO WHICH REFERENCE MAY BE MADE IN
©
NATIONAL REGULATIONS. ISO 2021
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ISO/FDIS 20166-4:2021(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2021
All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may
be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting
on the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address
below or ISO’s member body in the country of the requester.
ISO copyright office
CP 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Geneva
Phone: +41 22 749 01 11
Email: copyright@iso.org
Website: www.iso.org
Published in Switzerland
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ISO/FDIS 20166-4:2021(E)
Contents Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Considérations générales . 9
5 Activité en dehors du laboratoire .11
5.1 Recueil des prélèvements .11
5.1.1 Généralités .11
5.1.2 Informations relatives au patient/donneur .11
5.1.3 Informations relatives au prélèvement .11
5.1.4 Traitement du prélèvement, stockage intermédiaire et préparation au
transport .12
5.2 Transport .13
6 Dans le laboratoire .13
6.1 Réception des prélèvements .13
6.2 Fixation au formol du prélèvement ou de l’échantillon ou des échantillons .13
6.3 Évaluation de la pathologie du prélèvement et sélection de l’échantillon ou des
échantillons .15
6.3.1 Généralités .15
6.3.2 Examen macroscopique .15
6.3.3 Sélection de l’échantillon ou des échantillons .15
6.4 Post-fixation d’échantillons congelés d’un examen peropératoire .16
6.5 Décalcification/ramollissement des échantillons .16
6.6 Préparation du tissu et inclusion en paraffine .17
6.6.1 Généralités .17
6.6.2 Déshydratation et nettoyage .18
6.6.3 Imprégnation à la paraffine et inclusion en paraffine .18
6.7 Stockage des blocs de tissu FFPE .19
6.8 Découpage des blocs de tissu FFPE et stockage des coupes montées sur lame .19
6.9 Déparaffinage et réhydratation des coupes montées sur lame .21
6.10 Prétraitement des coupes montées sur lame pour les techniques de détection in situ.21
6.10.1 Généralités .21
6.10.2 Prétraitement pour les techniques de détection in situ basées sur des
anticorps ou d’autres ligands d’affinité .21
6.10.3 Prétraitement pour les techniques de détection in situ reposant sur une
hybridation .22
6.10.4 Prétraitement pour les autres techniques de détection in situ .22
6.11 Évaluation qualitative de la phase préanalytique de la détection in situ .22
Annexe A (informative) Recommandations relatives à la vérification et à la validation des
analyses de détection in situ développées par le laboratoire .23
Annexe B (informative) Exemple de protocole de préparation du tissu .24
Bibliographie .25
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ISO/FDIS 20166-4:2021(E)
Avant-propos
L’ISO (Organization internationale de normalization) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalization (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalization électrotechnique.
Les procédures utilizées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilizateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organization mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant : www .iso .org/ iso/ fr/ avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 212, Laboratoires d'analyses de
biologie médicale et systèmes de diagnostic in vitro.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 20166 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilizateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalization de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
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ISO/FDIS 20166-4:2021(E)
Introduction
Le diagnostic moléculaire in vitro, y compris la pathologie moléculaire, a permis de faire considérablement
progresser la médecine. D’autres avancées sont attendues avec les nouvelles technologies d’analyse de
la morphologie tissulaire et des biomolécules (telles que les protéines, l’ADN, l’ARN, par exemple) et/ou
des métabolites (par exemple, le glucose) dans les tissus humains et les fluides corporels.
En pathologie, la majorité des diagnostics s’établissent à partir d’une coloration in situ de coupes de tissu
fixé au formol et inclus en paraffine (FFPE). Dans le cadre de la médecine personnalisée, la coloration
histologique classique (par exemple, hématoxyline et éosine) à des fins d’examen morphologique est de
plus en plus souvent complétée par des techniques de détection in situ, telles que l’immunohistochimie
ou l’hybridation in situ, ainsi que par l’analyse moléculaire de biomolécules extraites. En oncologie
par exemple, de nombreux diagnostics compagnons homologués par des organismes réglementaires
s’appuient sur des techniques de détection in situ appliquées à des coupes de tissu FFPE. Les avancées
en médecine personnalisée et les nouvelles technologies, telles que l’immunocoloration à marqueurs
multiples et l’analyse informatique d’images numériques (par exemple, générées à l’aide d’un
scanner pour lames) imposent de nouvelles exigences concernant la normalization des procédures
préanalytiques afin d’obtenir des résultats qualitatifs et quantitatifs reproductibles.
Les profils et/ou l’intégrité des biomolécules in situ ainsi que leurs positions, quantités et accessibilités
pour une détection in situ dans des tissus peuvent varier considérablement au cours du processus
préanalytique englobant le prélèvement des échantillons primaires, la préparation du tissu, l’inclusion,
le transport, le stockage, la réalisation des coupes et le prétraitement en vue d’une détection in situ.
De ce fait, le résultat d’une détection in situ à des fins de diagnostic ou de recherche est peu fiable, voire
inexploitable, car l’analyse subséquente ne représentera pas l’état in vivo des molécules, mais un profil
ou une morphologie artificiel généré pendant le processus préanalytique.
Par conséquent, une normalization de l’ensemble du processus préanalytique des prélèvements de tissu
FFPE destinés à des analyses in situ de morphologie et de biomolécules sur des coupes de tissu FFPE à
l’aide de différentes techniques de détection in situ, est nécessaire.
Des preuves scientifiques démontrent que plusieurs facteurs de la phase préanalytique influencent le
résultat (c’est-à-dire la qualité ou le niveau de sélectivité ou de sensibilité) de la détection in situ et,
de ce fait, peuvent avoir un impact considérable sur les résultats de diagnostic.
Le présent document se fonde sur ces travaux pour organizer et normalizer les étapes des processus
dits de la phase préanalytique pour tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) au regard des
diverses techniques de détection in situ. Le présent document est applicable à la phase préanalytique
des techniques de détection in situ et couvre l’ensemble du spectre des techniques de détection in situ.
Celles-ci incluent notamment (liste non exhaustive) :
— la coloration histologique classique, par exemple la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) ;
— les techniques histochimiques, par exemple la coloration des lipides, la coloration PAS (de l’anglais
« Periodic Acid Schiff »), la coloration au bleu de Prusse ou coloration de Perls, la coloration de
Feulgen, l’histochimie enzymatique ;
— la coloration immunohistochimique (IHC) ou la coloration par immunofluorescence utilizant des
anticorps (anticorps polyclonaux, monoclonaux ou recombinés) ou d’autres ligands d’affinité ;
— les techniques reposant sur une hybridation, telles que les techniques d’hybridation in situ (HIS)
d’ADN ou d’ARN, par exemple l’hybridation in situ en fluorescence (FISH, de l’anglais « fluorescence
in situ hybridization »), l’hybridation in situ chromogène (CISH, de l’anglais « chromogenic in situ
hybridization »), ou l’hybridation in situ améliorée à l’argent (SISH, de l’anglais « silver enhanced
in situ hybridization ») ;
— l’analyse moléculaire de biomolécules extraites qui peuvent être reliées à une région définie d’une
coupe FFPE (par exemple, au moyen d’un séquençage in situ, d’une spectrométrie de masse à
imagerie).
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ISO/FDIS 20166-4:2021(E)
Dans le présent document, les formes verbales suivantes sont utilizées :
— « doit » indique une exigence ;
— « il convient de/que » indique une recommandation ;
— « peut/il est admis/permis » indique une autorisation ;
— « peut/il est possible » indique une possibilité ou une capacité.
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FINAL DRAFT INTERNATIONAL STANDARD ISO/FDIS 20166-4:2021(E)
Molecular in vitro diagnostic examinations —
Specifications for preexamination processes for formalin-
fixed and paraffin-embedded (FFPE tissue —
Part 4:
In situ detection techniques
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie des exigences et formule des recommandations concernant le
prélèvement, la manipulation, la documentation, le transport, le stockage et le traitement durant la
phase préanalytique de prélèvements de tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) destinés
à l’analyse in situ qualitative et/ou (semi-)quantitative de la morphologie et de biomolécules, telles que
des métabolites, des protéines, l’ADN et/ou l’ARN sur des coupes de tissu FFPE à l’aide de différentes
techniques de détection in situ.
Le présent document s’applique aux analyses de diagnostic in vitro, utilizant des techniques de détection
in situ. Celles-ci englobent les analyses développées en laboratoire réalisées par des laboratoires de
pathologie (laboratoires d’histopathologie) ainsi que par des laboratoires de pathologie moléculaire
et autres laboratoires de biologie médicale. Il est également destiné à être utilizé par des clients de
laboratoires, des développeurs et fabricants de l’industrie du diagnostic in vitro, des biobanques, ainsi
que par des institutions et des organismes commerciaux spécialisés en recherche biomédicale, de même
que des autorités de réglementation.
Le présent document ne s’applique pas à la phase préanalytique de l’analyse d’ARN, de protéines
et d’ADN extraits de tissus FFPE, ces biomolécules étant respectivement couvertes par les normes
ISO 20166-1, ISO 20166-2 et ISO 20166-3, Analyses de diagnostic moléculaire in vitro — Spécifications
relatives aux processus préanalytiques pour l’ARN extrait, les protéines extraites et l’ADN extrait.
Des mesures spéciales différentes sont prises pour les processus préanalytiques applicables aux
prélèvements de biopsie à l’aiguille fine (BAF). Les mesures applicables aux différents prélèvements
BAF (ARN cellulaire extrait, protéines extraites, et ADN génomique extrait) sont respectivement
traitées par les CEN WI 00140128, CEN WI 00140126, et CEN WI 00140129, Molecular in vitro diagnostic
examinations — Specifications for pre-examination processes for Fine Needle Aspirates (FNAs) isolated
cellular RNA, isolated proteins, and isolated genomic DNA (disponibles en anglais seulement).
NOTE Des réglementations ou exigences internationales, nationales ou régionales peuvent également
s’appliquer à des sujets spécifiques traités dans le présent document.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 15189, Laboratoires de biologie médicale — Exigences concernant la qualité et la compétence
ISO 15190, Laboratoires de biologie médicale — Exigences pour la sécurité
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ISO/FDIS 20166-4:2021(E)
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions de l'ISO 15189 ainsi que les suivants,
s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilizées en
normalization, consultables aux adresses suivantes :
— ISO Online browsing platform : disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp ;
— IEC Electropedia : disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/ .
3.1
ligand d’affinité
molécules englobant les afficorps, les peptides, les fragments d’anticorps (3.3) ou d’autres petites
molécules qui interagissent avec des biomolécules (3.6) et structures dans une cellule, et qui peuvent
être utilisées dans le cadre de techniques de détection in situ (3.27)
3.2
température ambiante
température non régulée de l’air environnant
[SOURCE: : ISO 20166-1:2018, 3.2]
3.3
anticorps
protéine (3.37) (immunoglobuline) produite et sécrétée par les lymphocytes B en réponse à une
molécule reconnue comme étrangère (antigène (3.4)), et qui est capable de se lier à cet antigène (3.4)
spécifique
[SOURCE : ISO 16577:2016, 3.10, modifiée — La Note 1 à l’article a été supprimée.]
3.4
antigène
substance qui stimule la production d’anticorps (3.3) et qui réagit à leur contact
[SOURCE: : ISO 15089:2000, 3.5]
3.5
récupération d’antigènes
récupération d’épitopes
procédure(s) permettant de démasquer des antigènes (3.4)/épitopes (3.14) et de restaurer leurs
propriétés de liaison aux anticorps (3.3) utilisées en immunohistochimie (3.25) en neutralisant les
modifications introduites par la fixation au formol (3.19), la préparation du tissu (3.47) et l’inclusion en
paraffine (3.33) du tissu
3.6
biomolécule
molécule organique produite chez les organismes vivants qui est impliquée dans les processus
métaboliques et de soutien des organismes
Note 1 to entry: Les protéines (3.37), les carbohydrates, les lipides, ou encore l’acide nucléique sont des exemples
de molécule organique.
3.7
nettoyage
étape de processus de la préparation du tissu (3.47) lors de laquelle un tissu fixé au formol est transféré
d’un réactif de déshydratation (3.10) vers un produit nettoyant (par exemple, xylène) afin de préparer le
tissu à l’imprégnation (3.26)
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ISO/FDIS 20166-4:2021(E)
3.8
ischémie froide
état d’un tissu suite à son prélèvement de l’organisme jusqu’à sa stabilisation ou sa fixation
[SOURCE: : ISO 20166-1:2018, 3.5]
3.9
décalcification
technique utilisant des produits chimiques permettant d’éliminer la fraction minérale (calcium
inorganique) d’un os ou d’un autre tissu calcifié de sorte à adapter les composants de tissu rigide à la
souplesse de la paraffine (3.32) pour la réalisation des coupes
3.10
déshydratation
étape de processus de la préparation du tissu (3.47) destinée à éliminer l’eau d’un tissu fixé au formol
en le plongeant dans une série de solutions de réactif de déshydratation de concentration croissante en
terminant par une solution exempte (à 100 %) d’eau
3.11
écart
écart par rapport à une instruction, une procédure et/ou une méthode approuvées ou à une norme établie
[SOURCE: : ISO 15378:2017, 3.7.5 modifiée — Le terme « procédure d’utilisation normalisée (SOP) (3.7.10)
approuvée (3.7.1) » a été remplacé par « une instruction, une procédure et/ou une méthode
approuvées ».]
3.12
diagnostic
identification d’un état de santé sain ou pathologique à partir de ses signes et/ou symptômes, dans
laquelle le processus de diagnostic peut impliquer des analyses (3.15) et essais pour la classification
de l’état d’un individu en catégories ou sous-classes distinctes, laquelle permet la prise de décisions
médicales concernant le traitement et le pronostic à établir
[SOURCE: : ISO 20166-1:2018, 3.7]
3.13
ADN
acide désoxyribonucléique
polymère de désoxyribonucléotides se présentant sous la forme de double brin (ADNdb) ou de simple
brin (ADNsb)
[SOURCE: : ISO 22174:2005, 3.1.2]
3.14
épitope
site de liaison d’anticorps (3.3) sur une biomolécule (3.6) qui est un antigène (3.4)
3.15
examen
analyse
ensemble des opérations destinées à déterminer la valeur ou les caractéristiques d’une propriété
Note 1 to entry: Processus qui débutent par la détection in situ (3.27) à l’aide d’anticorps (3.3), de sondes d’acide
nucléique ou de colorants et qui comprennent toutes sortes d’essais paramétriques ou de manipulations
chimiques en vue de réaliser l’analyse quantitative ou qualitative.
[SOURCE: : ISO 15189:2012, 3.7, modifiée — Les Notes à l’article 1 à 3 ont été supprimées, la Note 1 à
l’article a été ajoutée et « analyse » a été ajouté comme terme privilégié.]
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ISO/FDIS 20166-4:2021(E)
3.16
fabricant d’examen
fabricant d’analyse
entité qui fabrique et/ou produit l’analyse (3.15) donnée
3.17
tissu FFPE
tissu fixé au formol et inclus en paraffine
échantillons primaires (3.36)/échantillons (3.42) de tissu ayant subi une fixation au formol (3.18, 3.19),
une préparation du tissu (3.47), et une inclusion en paraffine (3.33) dans une cassette d’inclusion
3.18
formol
solution aqueuse saturée en formaldéhyde qui, à 100 %, contient 37 % de formaldéhyde en masse
(correspondant à 40 % en volume)
[SOURCE: : ISO 20166-1:2018, 3.11]
3.19
fixation au formol
traitement d’un échantillon (3.42) avec une solution de formol tamponnée standard (3.45) à des fins de
stabilisation
[SOURCE: : ISO 20166-1:2018, 3.12]
3.20
pigment formolique
pigment formolique d’hématine acide
hématine
granules amorphes à microcristallines noires à marron représentant un artéfact sur des coupes
histologiques préparées à partir de tissus fixés au formol (3.18, 3.19) ayant une concentration accrue en
acide formique, lequel est produit par la réaction d’acide avec l’hémoglobine
3.21
macroscopie
analyse macroscopique
contrôle de prélèvements pathologiques à l’œil nu, au cours de leur traitement à des fins d’analyse (3.15)
microscopique ultérieure, en vue d’obtenir des informations de diagnostic
[SOURCE: : ISO 20166-1:2018, 3.13]
3.22
technique(s) histochimique(s)
technique(s) de détection in situ (3.27) utilisée(s) pour visualiser et caractériser des biomolécules (3.6)
qui implique(nt) des réactions chimiques avec des groupements, radicaux ou liaisons chimiques donnés
des biomolécules (3.6) et fourni(ssen)t des informations sur la position in situ des biomolécules (3.6)
dans les coupes de tissu (3.49)
Note 1 to entry: Les carbohydrates, lipides, autres métabolites, protéines (3.37), acides aminés, acides nucléiques,
pigments, ou enzymes, etc., sont des exemples de biomolécules (3.6).
3.23
coloration histologique
technique de détection in situ (3.27) entreprise pour préparer des coupes de tissu (3.49) en utilisant des
colorants histologiques (par exemple, hématoxyline-éosine (HE), chromotrope-bleu d’aniline (CAB))
pour mettre en évidence des caractéristiques de la coupe de tissu (3.49) et améliorer le contraste de la
coupe de tissu (3.49)
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ISO/FDIS 20166-4:2021(E)
3.24
homogène
de structure et de composition uniformes
[SOURCE: : ISO 20166-1:2018, 3.31]
3.25
immunohistochimie
IHC
technique de détection in situ (3.27) qui utilise le principe de liaison sélective d’anticorps (3.3) à des
antigènes (3.4) / épitopes (3.14) dans des tissus biologiques ou des cellules pour visualiser des antigènes
(3.4) (par exemple, des protéines (3.37)) par microscopie en champ clair
3.26
imprégnation
imprégnation à la paraffine
étape de processus de la préparation du tissu (3.47) destinée à remplacer le produit nettoyant et à
infiltrer un tissu avec de la paraffine (3.32) fondue
3.27
détection in situ
technique qui permet de localiser précisément une biomolécule (3.6) donnée dans une coupe montée
sur lame
EXAMPLE Immunohistochimie (3.25) pour la détection de protéine (3.37), hybridation in situ (3.30) pour la
détection d’acide nucléique, coloration histologique (3.23), techniques histochimiques (3.22), spectrométrie de
masse à imagerie MALDI, cytométrie de masse à imagerie, spectroscopie Raman in situ.
3.28
système de détection in situ
système de détection
ensemble de réactifs utilisés pour visualiser la liaison de molécules à leur cible in situ dans une coupe de
tissu (3.49)
Note 1 to entry: Les anticorps (3.3), un ligand d’affinité (3.1), et l’acide nucléique sont des exemples de molécules.
Note 2 to entry: Les systèmes de détection les plus courants pour la détection in situ (3.27) sont ceux qui détectent
des enzymes et des fluorophores.
3.29
examen in situ
analyse in situ
analyse (3.15) reposant sur une détection in situ (3.27)
3.30
hybridation in situ
HIS ou ISH (de l’anglais « In situ Hybridization »)
technique de détection in situ (3.27) qui utilise le principe de liaison sélective de sondes d’acide nucléique
complémentaires à des fragments d’ARN (3.38) ou d’ADN (3.13) dans des tissus biologiques ou des
cellules pour visualiser des acides nucléiques (par exemple, ADN (3.13) ou ARN (3.38)) par microscopie
en champ clair ou de fluorescence
3.31
non-conformité
non-satisfaction d’une exigence
[SOURCE: : ISO 9000:2015, 3.6.9, modifiée — La Note 1 a été supprimée.]
© ISO 2021 – All rights reserved 5
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ISO/FDIS 20166-4:2021(E)
3.32
paraffine
cire de paraffine
produit obtenu à partir de distillats, constitué principalement d’un mélange d’hydrocarbures saturés,
solide aux températures de laboratoire (3.41) utilisé pour l’inclusion en paraffine (3.33) d’échantillons
primaires (3.36)/échantillons (3.42) de tissus fixés au formol
3.33
inclusion en paraffine
inclusion dans la paraffine
processus intervenant après la préparation du tissu
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.