Guidelines for the validation of qualitative screening methods for the detection of residues of veterinary drugs in milk and milk products

This document describes general workflows and protocols for the validation and the verification of qualitative screening tests for the detection of residues of veterinary drugs in liquid milk (raw, pasteurized, UHT and reconstituted milk powders and whey protein extracts) including biological methods. This guideline does not cover the validation of residue analysis by HPLC, UHPLC or LC-MS/MS. This document is intended to be useful for manufacturers of screening test kits, laboratories validating screening methods or tests, competent authorities and dairies or end users of reagents or tests for the detection of veterinary drug residues in milk products. This document facilitates and improves the validation and verification of screening methods. The goals of this document are a harmonization in validation of methods or test kits in order for all stakeholders to have full trust in the result of residue screening and to limit the overlap and multiplication of validation work in different laboratories by sharing the validation results generated by an independent laboratory. Furthermore, a harmonized validation and verification procedure allows for comparison of the performance of different screening methods. This document does not imply that all end users are bound to perform all verification work proposed. The verification of the correct use of reagents/kits for the detection of antimicrobials is not part of the scope of this document.

Lignes directrices pour la validation des méthodes qualitatives de dépistage des résidus de médicaments vétérinaires dans le lait et les produits laitiers

Le présent document spécifie des processus et protocoles généraux pour la validation et la vérification des essais qualitatifs de dépistage des résidus de médicaments vétérinaires dans le lait à l’état liquide (lait cru, lait pasteurisé, lait UHT et lait en poudre reconstitué et concentrés de protéine de lactosérum) incluant des méthodes biologiques. Ces lignes directrices ne couvrent pas la validation de l’analyse des résidus par CLHP, CLUHP ou CL-SM/SM. Le présent document vise à apporter une aide aux fabricants de kits d’essai de dépistage, aux laboratoires validant des méthodes de dépistage ou des essais, aux autorités compétentes et aux laiteries ou aux utilisateurs finaux de réactifs ou d’essais dans le cadre du dépistage de résidus de médicaments vétérinaires dans les produits laitiers. Le présent document facilite et améliore la validation et la vérification de méthodes de dépistage. Le présent document vise d’une part à harmoniser la validation des méthodes ou des kits d’essai afin que l’ensemble des parties prenantes aient une totale confiance dans le résultat d’un dépistage de résidus, et d’autre part à limiter le chevauchement et la multiplication des activités de validation menées par différents laboratoires en partageant les résultats de validation produits par un laboratoire indépendant. Une procédure harmonisée de validation et de vérification permet en outre de comparer les performances de différentes méthodes de dépistage. Le présent document ne sous-entend pas que tous les utilisateurs finaux soient liés pour réaliser l’ensemble des activités de vérification proposées. La vérification de l’usage correct des réactifs/kits de dépistage des antimicrobiens n’est pas couverte par le domaine d’application du présent document.

General Information

Status
Published
Publication Date
03-Aug-2021
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
04-Aug-2021
Due Date
18-Dec-2021
Completion Date
04-Aug-2021
Ref Project

Relations

Effective Date
06-Jun-2022

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Technical specification
ISO/TS 23758:2021 - Guidelines for the validation of qualitative screening methods for the detection of residues of veterinary drugs in milk and milk products
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Standards Content (Sample)

TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 23758
IDF/RM 251
First edition
2021-08
Guidelines for the validation of
qualitative screening methods for the
detection of residues of veterinary
drugs in milk and milk products
Lignes directrices pour la validation des méthodes qualitatives de
dépistage des résidus de médicaments vétérinaires dans le lait et les
produits laitiers
Reference numbers
ISO/TS 23758:2021(E)
IDF /RM 251:2021(E)
©
ISO and IDF 2021

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IDF /RM 251:2021(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO and IDF 2021
All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may
be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting
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Published in Switzerland
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IDF /RM 251:2021(E)
Contents Page
Forewords .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 4
5 General requirements for the test/kit . 5
6 Reagents . 5
6.1 Standard blank matrix . 5
6.2 Antibiotics . 6
6.3 Standard stock solution . 6
6.4 Working stock solutions . 6
6.5 Spiked sample . 6
7 Apparatus . 7
8 Sample Preparation. 7
8.1 Stock solution preparation . 7
8.2 Working stock solution preparation . 8
8.3 Blank matrix sample selection . 8
8.4 Spiked sample creation . 8
9 Procedure. 8
9.1 Validation . 8
9.1.1 General. 8
9.1.2 Detection capability (CCβ). 9
9.1.3 Test selectivity/specificity .13
9.1.4 Robustness testing .14
9.1.5 Reader and test repeatability .18
9.1.6 Participation in a(n) (inter)national ring trial .20
9.2 V erification testing of a transferred screening method .20
9.2.1 General.20
9.2.2 Detection capability .21
9.2.3 Test selectivity/specificity .21
9.2.4 Robustness testing .21
9.2.5 Reader and test repeatability .21
9.2.6 Participation in a(n) (inter)national ring trial .23
Annex A (informative) European legislation on veterinary drugs in cow milk .24
Annex B (informative) USA legislation on animal drug residues in milk .28
Annex C (informative) List of problematic compounds in the preparation of stock solutions .29
Annex D (informative) Summary of the stability of antibiotics in solution and in matrix .30
Bibliography .33
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ISO/TS 23758:2021(E)
IDF /RM 251:2021(E)
Forewords
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national
standards bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally
carried out through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which
a technical committee has been established has the right to be represented on that committee.
International organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part
in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all
matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso .org/
iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5,
Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF), in collaboration with the European
Committee for Standardization (CEN) Technical Committee CEN/TC 302, Milk and milk products —
Methods of sampling and analysis, in accordance with the Agreement on technical cooperation between
ISO and CEN (Vienna Agreement). It is being published jointly by ISO and IDF.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
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ISO/TS 23758:2021(E)
IDF /RM 251:2021(E)
IDF (the International Dairy Federation) is a non-profit private sector organization representing the
interests of various stakeholders in dairying at the global level. IDF members are organized in National
Committees, which are national associations composed of representatives of dairy-related national
interest groups including dairy farmers, dairy processing industry, dairy suppliers, academics and
governments/food control authorities.
ISO and IDF collaborate closely on all matters of standardization relating to methods of analysis
and sampling for milk and milk products. Since 2001, ISO and IDF jointly publish their International
Standards using the logos and reference numbers of both organizations.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
This document was prepared by the IDF Standing Committee on Analytical Methods for Additives and
Contaminants and ISO Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and
milk products, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 302, Milk and milk products — Methods of sampling and analysis, in accordance
with the Agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement). It is being
published jointly by ISO and IDF.
This IDF Reviewed method is equal to an ISO Publicly Available Specification (ISO/PAS) or an ISO
Technical Specification (ISO/TS) and is therefore published jointly under ISO conditions.
The work was carried out by the IDF-ISO Action Team on A10 of the Standing Committee on Analytical
Methods for Additives and Contaminants under the aegis of its project leader Dr W. Reybroeck (BE).
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ISO/TS 23758:2021(E)
TECHNICAL SPECIFICATION
IDF /RM 251:2021(E)
Guidelines for the validation of qualitative screening
methods for the detection of residues of veterinary drugs
in milk and milk products
1 Scope
This document describes general workflows and protocols for the validation and the verification
of qualitative screening tests for the detection of residues of veterinary drugs in liquid milk (raw,
pasteurized, UHT and reconstituted milk powders and whey protein extracts) including biological
methods. This guideline does not cover the validation of residue analysis by HPLC, UHPLC or LC-MS/MS.
This document is intended to be useful for manufacturers of screening test kits, laboratories validating
screening methods or tests, competent authorities and dairies or end users of reagents or tests for the
detection of veterinary drug residues in milk products. This document facilitates and improves the
validation and verification of screening methods. The goals of this document are a harmonization in
validation of methods or test kits in order for all stakeholders to have full trust in the result of residue
screening and to limit the overlap and multiplication of validation work in different laboratories by
sharing the validation results generated by an independent laboratory. Furthermore, a harmonized
validation and verification procedure allows for comparison of the performance of different screening
methods.
This document does not imply that all end users are bound to perform all verification work proposed.
The verification of the correct use of reagents/kits for the detection of antimicrobials is not part of the
scope of this document.
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
biological method
method that is used to detect cellular responses to analytes
EXAMPLE Inhibition of bacterial growth, immunological test, and receptor test.
3.2
qualitative method
method that gives a yes/no response, with no indication of the concentration of the putative analyte
EXAMPLE 1 Bacterial growth inhibition tests which give a result of either “no zone” or “zone of inhibition”.
EXAMPLE 2 Inhibition tests which give a colour change of growth medium.
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IDF /RM 251:2021(E)
EXAMPLE 3 Immunochemical/ligand binding tests, where a response is considered as “above” or “below” a
cut-off level; or where analytes with different cross-reactivities are included within the method scope.
EXAMPLE 4 Biosensors.
3.3
matrix
non-analyte portion of the sample
Note 1 to entry: Matrices are included in the scope.
3.4
detection capability
CCβ
smallest content of the analyte that can be detected, identified and/or quantified in a sample with an
error probability of β
Note 1 to entry: The β error is the probability that the tested sample is truly non-conformant even though a
conformant measurement has been obtained.
3.5
cut-off level
response or signal from a screening test which indicates that a sample contains an analyte at or above
the screening target concentration
3.6
blank matrix sample
negative control sample
sample from animals with known history of treatment which have not been exposed to the substance
in question
Note 1 to entry: If samples from such animals are not available, samples which have been previously confirmed
as conformant and not containing residues of the substance of interest by suitably sensitive physicochemical
tests can also be acceptable.
Note 2 to entry: See Table 1.
3.7
positive control sample
control sample that is spiked with the test analyte at the screening target concentration
Note 1 to entry: This can, however also be an incurred-positive sample (i.e. sample taken from animals which
have been treated with the substance in question) or Certified Reference Material.
3.8
screening target concentration
concentration at which a screening test categorizes the sample as “screen positive” (potentially non-
conformant)
Note 1 to entry: This should always be lower than the regulatory limit.
3.9
validation
confirmation, through the provision of objective evidence, that the requirements for a specific intended
use or application, such as a test or measurement method, have been fulfilled
EXAMPLE Procedure applied in the originator laboratory (manufacturer’s laboratory) or in an independent
laboratory.
Note 1 to entry: Validation often determines the fitness for purpose of a method.
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IDF /RM 251:2021(E)
3.10
verification
procedure applied to a method which has been previously validated in the case of a transfer validation
Note 1 to entry: The verification procedure is applied by a receptor laboratory for the same matrix as initially
validated, to demonstrate that the method will work reliably in that laboratory with locally sourced milk and is
fit for purpose.
3.11
originator laboratory
laboratory that has performed the complete validation of the method
Note 1 to entry: This is by preference an ISO/IEC 17025 accredited independent laboratory and preferably not the
laboratory that developed the method. The laboratory should have experience in residue testing and in validation
of screening tests for the detection of residues of veterinary drugs in milk.
3.12
receptor laboratory
laboratory that will perform the verification of the method
Note 1 to entry: This could be any laboratory interested in using the method.
3.13
spectrum
range of substances that a test can detect
Note 1 to entry: Some tests detect several classes of antibiotics and a large number of substances, whereas others
are more specific.
3.14
regulatory limit
level defined by food legislation for residues in food
Note 1 to entry: Regulatory limits can be MRL (see 3.15), MRPL (see 3.16), RPA (see 3.17).
3.15
maximum residue limit for veterinary drugs
MRL
maximum concentration of residue resulting from the use of veterinary drugs that is recommended by
the Codex Alimentarius Commission to be legally permitted or recognized as acceptable in food
Note 1 to entry: Antibiotics are used to treat and prevent diseases in animal husbandry and as a result, low
residues of antibiotics can be present in food. MRLs are set for pharmacologically active substances used or
intended to be used in veterinary medicinal products placed on the market. In the EU the MRLs are set by EMA
(European Medicines Agency).
3.16
minimum required performance limit
MRPL
minimum content of an analyte in a sample, which at least has to be detected and confirmed
Note 1 to entry: MRPL is intended to harmonize the analytical performance of methods for substances for which
no permitted limit has been established.
3.17
reference point for action
RPA
level of a residue of a pharmacologically active substance established for control reasons in the case
of certain substances for which a maximum residue limit has not been laid down following certain EU
regulations
Note 1 to entry: EU Regulation 470/2009 is applicable for maximum residue limits.
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IDF /RM 251:2021(E)
Note 2 to entry: RPAs are currently based on analytical considerations (i.e. the lowest concentration that can
be quantified using a validated analytical method). The aim is “to define an analytical concentration for a non-
allowed pharmacologically active substance that can be determined by official control laboratories and that is
[19]
low enough to adequately protect the consumers of food commodities which contain that substance” .
3.18
positive / negative result
result of the test after interpretation of the reading of the test taking into account the (pre-set) cut-off
level
Note 1 to entry: Positive result: presence of antimicrobial residues (microbial inhibitor test) or presence of
residues of veterinary drugs.
Note 2 to entry: Negative result: absence of antimicrobial residues (microbial inhibitor test) or absence of
residues of veterinary drugs. Since only screening tests are involved, no judgement about ‘conformant’ or ‘non-
conformant’ can be made.
3.19
repeatability limit
value less than or equal to which the absolute difference between two measurement results obtained
under repeatability conditions is expected with a probability of 95 %
3.20
probability of detection
POD
proportion of positive analytical outcomes for a qualitative method for a given matrix at a given analyte
level or concentration
[7]
Note 1 to entry: POD is concentration dependent (AOAC, 2014 ).
4 Principle
Samples of matrix spiked with known levels of analyte are run on the test under validation or
verification to determine the detection capability, sensitivity and robustness of the test. Evaluation of
the test results determines the tests' suitability for routine use in screening milk for the presence of
veterinary residues.
NOTE Annex B provides information on FDA tolerances and/or safe levels of animal drug residues in milk.
The key requirement for a screening method is its ability to reliably detect the analyte in question at the
chosen screening target concentration. The screening target concentration should be chosen to avoid
false-negative results, i.e. low enough to ensure that if the analyte in question is present in the sample
at the Regulatory Limit, the sample will be classified as 'Screened Positive'.
Both validation and verification should provide the objective evidence that this key requirement is met.
Validation should cover the entire matrix/species/analyte combinations claimed within the scope of
the method standard operating procedure (SOP). Validation should be as broad as possible to cover the
scope of all end users.
Verification should cover the matrix/species/analyte combinations included in the scope of the
implementing (receptor) laboratory. The extent of validation required is variable, depending on whether
it is a validation or a verification of a transferred method.
The verification does not need to cover the entire spectrum if the implementing laboratory is to be
applicable to only a limited scope (e.g. some species and not others, some residues more relevant than
others, raw but not UHT [Ultra-High temperature] milk, etc.).
If a receptor laboratory wants to use the method for screening in a different matrix (IDF 2014) not tested
by the originator laboratory, the receptor laboratory should test all necessary validation parameters to
prove that the method functions for that specific matrix.
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ISO/TS 23758:2021(E)
IDF /RM 251:2021(E)
5 General requirements for the test/kit
The developer or the manufacturer should provide information regarding methodology, test reagents,
additional chemicals not necessarily included in the kit, operating requirements (information about
the reading system, cut-off level), test specifications and documentation (extracted from ISO 18330
and ISO 13969). Additionally, the target country(ies) and its/their specific regulatory limits should be
known, in order for the test to be evaluated against the appropriate regulatory limits.
Elements of information to be provided by the manufacturer/distributor/lab manager (in case of an in-
house developed method) before starting the validation are as follows:
— Test principle, principle of reading and interpretation of the test (including cut-off level or calculation
of cut-off level).
— Test formats, if relevant (e.g. ampoules/plates).
— Scope of the test:
— Matrices suitable to be tested: matrices in the scope of the document (see Clause 1).
— Animal species producing the milk.
— Matrices with potential impact (interference) on the result.
— Potential impact of the use of sample preservatives.
— Spectrum of the test: list of veterinary drugs and expected detection capabilities (so far known).
— List with the current regulatory limits (RL) for the detectable veterinary drugs in the matrix(ces) of
concern in the country(ies) of concern.
— Detailed protocol in a language understood by laboratory staff: if minor modifications need to be
made to the method according to the matrix/species, they should be announced in the test protocol
(kit manual).
6 Reagents
6.1 Standard blank matrix
— The raw milk used is commingled milk coming from at least 4 animals not treated with veterinary
drugs within the last 2 months, in mid lactation, and delivering milk with a low to moderate number
−1
of somatic cells (e.g. < 150 000 ml for bovine milk). The raw milk is collected in sterile containers
and kept below 4 °C. The maximum period for the cold storage of the fresh raw milk should be in line
with the definition of fresh raw milk as fixed locally.
— The milk used should be in line with the normal milk produced in the country or area of concern.
This means that the composition and quality of the milk should approach the average composition
of the milk of the country/region.
— Table 1 gives examples of parameters to consider for ‘normal’ milk. Actual figures are likely to vary
depending on country and region.
— Milk of at least 4 animals is commingled and is considered as a sample of standard blank matrix.
At least four such samples should be used for the determination of the detection capability when
testing 20 replicates. If 40 or 60 replicates need to be tested to determine the detection capability,
eight or twelve different blank milk samples should be used, respectively. At least four different
commingled milks should be sourced and used in the verification work (20 replicates).
— The use of thawed or reconstituted lyophilized milk could also be authorized, but strictly on
condition. The pre-requisite condition to work with these alternative solutions, is to demonstrate
© ISO and IDF 2021 – All rights reserved 5

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IDF /RM 251:2021(E)
previously the equivalence of results between raw milk and thawed or reconstituted lyophilized
milk, after the analysis of negative and positive milk samples.
Table 1 — Examples of reference data for the composition and quality of normal milk of
different animal species
b
TBC pH Antibiotics Lactating period
a d e
SCC FC PC
Species c
cfu per
cells per ml g/l g/l
ml
6,7 to
Target value < 150 000 < 30 000 40 33
Between 60 and
6,8
Cow Absence 200 days after
Acceptable 35 to 6,6 to
calving
< 400 000 < 100 000 30 to 36
range 45 6,9
6,7 to
Target value < 2 000 000 < 60 000 38 34
Between 20 and
6,8
Goat Absence 150 days after
Acceptable 30 to 6,6 to
kidding
 28 to 40
range 50 6,9
6,7 to
Target value < 2 000 000 < 60 000 70 55
Between 20 and
6,8
Ewe Absence 150 days after
Acceptable 50 to 6,6 to
lambing
 40 to 70
range 90 6,9
a
Somatic cell count.
b
Total bacterial count.
c
Colony forming units.
d
Fat content.
e
Protein content.
6.2 Antibiotics
Only use analytical grade or certified reference material for validation or verification purposes.
6.3 Standard stock solution
— Standard stock solutions of the antibiotic at 100 mg/l are made in water or a suitable solvent and
[14]
kept below 4 °C (refer to 8.1) . The shelf life depends on the stability of the molecule.
— In the preparation of the stock solution, correction for impurity and water content is performed.
— For each substance a single stock solution is prepared, but by preference for certain problematic
compounds (for example solubility problem, stability), at least two stock solutions should be
prepared to determine the detection capability. A list of problematic compounds is given in Annex C.
— If only one stock solution is used it should be either prepared fr
...

SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 23758
FIL/MR 251
Première édition
2021-08
Lignes directrices pour la validation
des méthodes qualitatives de
dépistage des résidus de médicaments
vétérinaires dans le lait et les produits
laitiers
Guidelines for the validation of qualitative screening methods for the
detection of residues of veterinary drugs in milk and milk products
Numéros de référence
ISO/TS 23758:2021(F)
FIL/MR 251:2021(F)
© ISO et FIL 2021

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ISO/TS 23758:2021(F)
FIL/MR 251:2021(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO et FIL 2021
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
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Publié en Suisse
ii
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ISO/TS 23758:2021(F)
FIL/MR 251:2021(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 4
5 Exigences générales applicables à l’essai/au kit d’essai . 5
6 Réactifs . 6
6.1 Matrice blanche normalisée . 6
6.2 Antibiotiques . 6
6.3 Solution mère d’étalon . 7
6.4 Solutions mères de travail . 7
6.5 Échantillon dopé . 7
7 Appareillage . 7
8 Préparation des échantillons . 8
8.1 Préparation de la solution mère . 8
8.2 Préparation de la solution mère de travail . 8
8.3 Choix de l’échantillon de matrice blanche . 8
8.4 Préparation de l’échantillon dopé . 9
9 Procédure .9
9.1 Validation . 9
9.1.1 Généralités . 9
9.1.2 Capacité de détection (CCβ). 10
9.1.3 Sélectivité/spécificité de l’essai . 13
9.1.4 Essais de robustesse . 15
9.1.5 Répétabilité du dispositif de lecture et de l’essai . 20
9.1.6 Participation à une étude collaborative (inter)nationale . 21
9.2 Essais de vérification d’une méthode de dépistage ayant été transférée . 21
9.2.1 Généralités . 21
9.2.2 Capacité de détection . 22
9.2.3 Sélectivité/spécificité de l’essai . 23
9.2.4 Essais de robustesse . 23
9.2.5 Répétabilité du dispositif de lecture et de l’essai . 23
9.2.6 Participation à une étude collaborative (inter)nationale . 25
Annexe A (informative) Législation européenne en vigueur concernant les médicaments
vétérinaires présents dans le lait de vache .26
Annexe B (informative) Législation américaine en vigueur concernant les résidus de
médicaments vétérinaires dans le lait .31
Annexe C (informative) Liste de composés problématiques pour la préparation des
solutions mères .33
Annexe D (informative) Récapitulatif de la stabilité des antibiotiques en solution et dans la
matrice.34
Bibliographie .36
iii
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ISO/TS 23758:2021(F)
FIL/MR 251:2021(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document
a été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www.iso.org/iso/fr/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération internationale de laiterie (FIL), en collaboration
avec le Comité européen de normalisation (CEN), comité technique CEN/TC 302, Lait et produits
laitiers — Méthodes d’échantillonnage et d’analyse, conformément à l’accord de coopération technique
entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne). Il est publié conjointement par l’ISO et la FIL.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iv
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ISO/TS 23758:2021(F)
FIL/MR 251:2021(F)
La FIL (Fédération internationale de laiterie) est une organisation privée à but non lucratif qui
représente les intérêts des divers acteurs de la filière laitière au niveau international. Les membres
de la FIL sont organisés en comités nationaux, qui sont des associations nationales composées de
représentants de groupes d’intérêt nationaux dans le secteur des produits laitiers, incluant des
producteurs laitiers, des acteurs de l’industrie de transformation des produits laitiers, des fournisseurs
de produits laitiers, des universitaires et des représentants des gouvernements/autorités chargées du
contrôle des aliments.
L’ISO et la FIL travaillent en étroite collaboration sur tous les sujets de normalisation relatifs aux
méthodes d’analyse et d’échantillonnage du lait et des produits laitiers. Depuis 2001, l’ISO et la FIL
publient conjointement leurs Normes internationales en utilisant les logos et numéros de référence des
deux organisations.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Le présent document a été élaboré par le Comité permanent chargé des Méthodes d’analyse des additifs et
contaminants de la FIL et l’ISO, comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 5, Lait
et produits laitiers, en collaboration avec le Comité européen de normalisation (CEN), comité technique
CEN/TC 302, Lait et produits laitiers — Méthodes d’échantillonnage et d’analyse, conformément à l’accord
de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne). Il est publié conjointement par l’ISO
et la FIL.
La présente Méthode révisée (RM) de la FIL équivaut à une Spécification accessible au public de
l’ISO (ISO/PAS) ou à une Spécification technique de l’ISO (ISO/TS) et est donc publiée conjointement
sous les conditions de l’ISO.
Le travail a été confié à l’Équipe d’action FIL-ISO A10 du Comité permanent chargé des Méthodes d’analyse
des additifs et contaminants, sous la conduite de son chef de projet, Dr W. Reybroeck (BE).
v
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ISO/TS 23758:2021(F)
SPÉCIFICATION TECHNIQUE
FIL/MR 251:2021(F)
Lignes directrices pour la validation des méthodes
qualitatives de dépistage des résidus de médicaments
vétérinaires dans le lait et les produits laitiers
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie des processus et protocoles généraux pour la validation et la vérification
des essais qualitatifs de dépistage des résidus de médicaments vétérinaires dans le lait à l’état liquide
(lait cru, lait pasteurisé, lait UHT et lait en poudre reconstitué et concentrés de protéine de lactosérum)
incluant des méthodes biologiques. Ces lignes directrices ne couvrent pas la validation de l’analyse des
résidus par CLHP, CLUHP ou CL-SM/SM.
Le présent document vise à apporter une aide aux fabricants de kits d’essai de dépistage, aux laboratoires
validant des méthodes de dépistage ou des essais, aux autorités compétentes et aux laiteries ou aux
utilisateurs finaux de réactifs ou d’essais dans le cadre du dépistage de résidus de médicaments
vétérinaires dans les produits laitiers. Le présent document facilite et améliore la validation et la
vérification de méthodes de dépistage. Le présent document vise d’une part à harmoniser la validation
des méthodes ou des kits d’essai afin que l’ensemble des parties prenantes aient une totale confiance
dans le résultat d’un dépistage de résidus, et d’autre part à limiter le chevauchement et la multiplication
des activités de validation menées par différents laboratoires en partageant les résultats de validation
produits par un laboratoire indépendant. Une procédure harmonisée de validation et de vérification
permet en outre de comparer les performances de différentes méthodes de dépistage.
Le présent document ne sous-entend pas que tous les utilisateurs finaux soient liés pour réaliser
l’ensemble des activités de vérification proposées.
La vérification de l’usage correct des réactifs/kits de dépistage des antimicrobiens n’est pas couverte
par le domaine d’application du présent document.
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
méthode biologique
méthode qui est utilisée pour détecter des réponses cellulaires aux analytes
EXEMPLE Inhibition d’une croissance bactérienne, essai immunologique et essai récepteur.
1
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ISO/TS 23758:2021(F)
FIL/MR 251:2021(F)
3.2
méthode qualitative
méthode dont le résultat est oui ou non, ne donnant aucune indication sur la concentration de l’analyte
supposé
EXEMPLE 1 Essais d’inhibition de croissance bactérienne dont le résultat est soit «absence de zone
d’inhibition», soit «présence d’une zone d’inhibition».
EXEMPLE 2 Essais d’inhibition aboutissant à un changement de couleur du milieu de culture.
EXEMPLE 3 Essais immunochimiques/de liaison à un ligand, dont le résultat s’exprime par la mention
«supérieur» ou «inférieur» à un seuil de détection; ou pour lesquels des analytes présentant différentes
réactivités croisées sont inclus dans le domaine d’application de la méthode.
EXEMPLE 4 Biocapteurs.
3.3
matrice
partie de l’échantillon autre que l’analyte
Note 1 à l'article: Les matrices sont couvertes par le domaine d’application.
3.4
capacité de détection
CCβ
plus faible teneur en analyte pouvant être détectée, identifiée et/ou quantifiée dans un échantillon avec
une probabilité d’erreur de β
Note 1 à l'article: L’erreur β est la probabilité qu’un échantillon soumis à essai identifié comme conforme soit en
réalité non conforme.
3.5
seuil de détection
réponse ou signal d’un essai de dépistage qui indique qu’un échantillon contient un analyte à une teneur
supérieure ou égale à la concentration cible de dépistage
3.6
échantillon de matrice blanche
échantillon de contrôle négatif
échantillon issu d’animaux ayant fait l’objet d’un suivi sanitaire par rapport aux médicaments
vétérinaires et qui n’ont pas été exposés à la substance en question
Note 1 à l'article: En cas d’indisponibilité d’échantillons d’animaux répondant à ces critères, des échantillons dont
la conformité et l’absence de résidus de la substance étudiée ont été précédemment confirmées par des essais
physicochimiques de sensibilité appropriée peuvent également être acceptés.
Note 2 à l'article: Voir Tableau 1.
3.7
échantillon de contrôle positif
échantillon de contrôle qui est dopé en analyte d’essai de sorte à obtenir la concentration cible de
dépistage
Note 1 à l'article: Il peut toutefois également s’agir d’un échantillon naturellement positif (c’est-à-dire un
échantillon issu d’animaux qui se sont vus administrer la substance en question) ou d’un matériau de référence
certifié.
3.8
concentration cible de dépistage
concentration à laquelle un essai de dépistage identifie l’échantillon comme « positif au dépistage »
(potentiellement non conforme)
Note 1 à l'article: Il convient que cette concentration soit systématiquement inférieure à la limite réglementaire.
2
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ISO/TS 23758:2021(F)
FIL/MR 251:2021(F)
3.9
validation
confirmation par des preuves objectives que les exigences pour une utilisation spécifique ou une
application prévues, par exemple une méthode d’essai ou de mesure, ont été satisfaites
EXEMPLE Procédure appliquée par le laboratoire émetteur (laboratoire du fabricant) ou par un laboratoire
indépendant.
Note 1 à l'article: La validation sert souvent à évaluer l’adéquation de la méthode vis-à-vis de l’objectif.
3.10
vérification
procédure appliquée à une méthode qui a été validée auparavant dans le cas d’une validation de
transfert
Note 1 à l'article: La procédure de vérification est appliquée par un laboratoire receveur pour la même matrice
que celle initialement validée, afin de démontrer que la méthode donnera un résultat fiable dans ce laboratoire
sur du lait obtenu localement et qu’elle est adaptée à l’objectif.
3.11
laboratoire émetteur
laboratoire qui a mené une étude de validation complète de la méthode
Note 1 à l'article: Il s’agit de préférence d’un laboratoire indépendant accrédité ISO/IEC 17025 et de préférence
autre que le laboratoire ayant mis au point la méthode. Il convient que le laboratoire ait de l’expérience en matière
d’essais de résidus et de validation des essais de dépistage des résidus de médicaments vétérinaires dans le lait.
3.12
laboratoire receveur
laboratoire qui réalisera la vérification de la méthode
Note 1 à l'article: Il pourrait s’agir de tout laboratoire intéressé par l’application de la méthode.
3.13
spectre
éventail de substances qu’un essai peut détecter
Note 1 à l'article: Certains essais détectent plusieurs classes d’antibiotiques et un grand nombre de substances,
tandis que d’autres sont plus spécifiques.
3.14
limite réglementaire
seuil défini par la législation alimentaire en ce qui concerne les résidus dans les aliments
Note 1 à l'article: Les limites réglementaires peuvent être une LMR (voir 3.15), une LPMR (voir 3.16), une VR
(voir 3.17).
3.15
limite maximale de résidus de médicaments vétérinaires
LMR
concentration maximale de résidu résultant de l’emploi d’un médicament vétérinaire et recommandée
par la Commission du Codex Alimentarius comme légalement permise ou estimée acceptable dans un
aliment
Note 1 à l'article: Des antibiotiques sont utilisés pour traiter et prévenir des maladies chez les animaux d’élevage
et de faibles teneurs de résidus d’antibiotiques peuvent donc être présentes dans les aliments. Les LMR sont fixées
pour les substances pharmacologiquement actives utilisées ou destinées à être utilisées dans les médicaments
vétérinaires commercialisés. Au sein de l’Union européenne, les LMR sont fixées par l’Agence européenne des
médicaments (EMA).
3
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FIL/MR 251:2021(F)
3.16
limite de performance minimale requise
LPMR
teneur minimale en analyte dans un échantillon qui doit être au moins détectée et confirmée
Note 1 à l'article: La LPMR vise à harmoniser les performances analytiques des méthodes applicables aux
substances pour lesquelles aucune limite autorisée n’a été fixée.
3.17
valeur de référence
VR
niveau d’un résidu d’une substance pharmacologiquement active, défini à des fins de contrôle, dans le
cas de certaines substances pour lesquelles il n’a pas été fixé de limite maximale de résidus, par certains
Règlements UE
Note 1 à l'article: Le Règlement UE 470/2009 est applicable pour établir des limites maximales de résidus.
Note 2 à l'article: Les VR sont actuellement définies sur la base de considérations analytiques (c’est-à-dire la plus
faible concentration pouvant être quantifiée à l’aide d’une méthode d’analyse validée). L’objectif est de «définir
une concentration analytique pour une substance pharmacologiquement active non autorisée qui peut être
déterminée par des laboratoires officiels de contrôle et qui est suffisamment faible pour protéger convenablement
[19]
les personnes amenées à consommer des denrées alimentaires qui contiennent ladite substance » .
3.18
résultat positif/négatif
résultat de l’essai après interprétation de la mesure de l’essai réalisée par rapport au seuil de détection
(préétabli)
Note 1 à l'article: Résultat positif: présence de résidus antimicrobiens (essai de dépistage d’inhibiteurs
microbiens) ou présence de résidus de médicaments vétérinaires.
Note 2 à l'article: Résultat négatif: absence de résidus antimicrobiens (essai de dépistage d’inhibiteurs
microbiens) ou absence de résidus de médicaments vétérinaires. Dans la mesure où seuls des essais de dépistage
sont impliqués, aucune décision sur la conformité ou la non-conformité ne peut être prise.
3.19
limite de répétabilité
valeur inférieure ou égale à laquelle la différence absolue entre deux résultats de mesurage obtenus
dans des conditions de répétabilité est attendue avec une probabilité de 95 %
3.20
probabilité de détection
POD
proportion de résultats d’analyse positifs obtenus à l’aide d’une méthode qualitative pour une matrice
donnée à une teneur ou concentration donnée en analyte
[7]
Note 1 à l'article: La POD dépend de la concentration (AOAC, 2014 ).
4 Principe
Des échantillons de matrice dopés à des teneurs connues en analyte sont soumis à l’essai faisant l’objet
d’une validation ou d’une vérification afin de déterminer la capacité de détection, la sensibilité et la
robustesse de l’essai. L’évaluation des résultats d’essai établit l’adéquation de l’essai à un usage de
routine pour le dépistage de résidus de médicaments vétérinaires dans le lait.
NOTE L’Annexe B fournit des informations sur les seuils de tolérance et/ou les seuils d’innocuité des résidus
de médicaments vétérinaires dans le lait fixés par la FDA (Administration américaine des denrées alimentaires
et des médicaments).
L’exigence clé applicable à une méthode de dépistage est sa capacité à détecter de manière fiable l’analyte
en question à la concentration cible de dépistage choisie. Il convient de choisir la concentration cible
4
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ISO/TS 23758:2021(F)
FIL/MR 251:2021(F)
de dépistage de sorte à éviter des résultats faux négatifs, c’est-à-dire une concentration suffisamment
faible pour garantir que si l’analyte en question est présent dans l’échantillon à la limite réglementaire,
l’échantillon sera classé comme étant «positif au dépistage».
Il convient que la validation et la vérification apportent des preuves objectives que cette exigence clé
est satisfaite. Il convient que la validation couvre toutes les combinaisons matrice/espèce/analyte
déclarées dans le domaine d’application de la procédure d’utilisation normalisée (SOP) de la méthode. Il
convient que la validation soit la plus large possible de sorte à couvrir le domaine d’application de tous
les utilisateurs finaux.
Il convient que la vérification couvre toutes les combinaisons matrice/espèce/analyte couvertes par le
domaine d’application du laboratoire (receveur) qui utilisera l’essai. La portée exigée de la validation
est variable selon qu’il s’agit d’une validation ou d’une vérification d’une méthode ayant été transférée.
Il n’est pas nécessaire que la vérification couvre l’ensemble du spectre si le laboratoire qui utilisera
l’essai prévoit de n’appliquer la méthode qu’à un domaine limité (par exemple, à certaines espèces et
pas à d’autres, à certains résidus plus pertinents que d’autres, au lait cru mais pas au lait stérilisé à ultra
haute température [UHT], etc.).
Si un laboratoire receveur souhaite utiliser une méthode de dépistage sur différentes matrices
(FIL 2014) qui n’ont pas été soumises à essai par le laboratoire émetteur, il convient que le laboratoire
receveur soumette à essai tous les paramètres de validation nécessaires afin de démontrer que la
méthode est adaptée à la matrice en question.
5 Exigences générales applicables à l’essai/au kit d’essai
Il convient que le développeur ou le fabricant fournisse des informations sur la méthodologie, les réactifs
d’essai, les produits chimiques supplémentaires non nécessairement inclus dans le kit d’essai, les
exigences opératoires (informations sur le système de lecture, le seuil de détection), les spécifications
d’essai et la documentation (tirée de l’ISO 18330 et de l’ISO 13969). Par ailleurs, il convient que le ou les
pays cibles et ses/leurs limites réglementaires spécifiques soient connus, de sorte à évaluer l’essai par
rapport aux limites réglementaires adéquates.
Les éléments d’informations que le fabricant/distributeur/responsable de laboratoire (dans le cas d’une
méthode mise au point en interne) est tenu de fournir avant la validation sont les suivants:
— le principe de l’essai, ainsi que le principe de lecture et d’interprétation de l’essai (notamment le
seuil de détection ou la méthode de calcul du seuil de détection);
— les formats d’essai, le cas échéant (par exemple, ampoules/plaques);
— le domaine d’application de l’essai:
— les matrices adaptées à l’essai: matrices couvertes par le domaine d’application du présent
document (voir Article 1);
— les espèces animales produisant du lait;
— les matrices susceptibles d’avoir un i
...

TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 23758
IDF/RM 251
First edition
Guidelines for the validation of
qualitative screening methods for the
detection of residues of veterinary
drugs in milk and milk products
Lignes directrices pour la validation des méthodes qualitatives de
dépistage des résidus de médicaments vétérinaires dans le lait et les
produits laitiers
PROOF/ÉPREUVE
Reference numbers
ISO/TS 23758:2021(E)
IDF /RM 251:2021(E)
©
ISO and IDF 2021

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ISO/TS 23758:2021(E)
IDF /RM 251:2021(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
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All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may
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Fax: +32 2 325 67 41
Email: copyright@iso.org Email: info@fil-idf.org
Website: www.iso.org Website: www.fil-idf.org
Published in Switzerland
ii PROOF/ÉPREUVE © ISO and IDF 2021 – All rights reserved

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IDF /RM 251:2021(E)
Contents Page
Forewords .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 4
5 General requirements for the test/kit . 5
6 Reagents . 5
6.1 Standard blank matrix . 5
6.2 Antibiotics . 6
6.3 Standard stock solution . 6
6.4 Working stock solutions . 6
6.5 Spiked sample . 6
7 Apparatus . 7
8 Sample Preparation. 7
8.1 Stock solution preparation . 7
8.2 Working stock solution preparation . 8
8.3 Blank matrix sample selection . 8
8.4 Spiked sample creation . 8
9 Procedure. 8
9.1 Validation . 8
9.1.1 General. 8
9.1.2 Detection capability (CCβ). 9
9.1.3 Test selectivity/specificity .13
9.1.4 Robustness testing .14
9.1.5 Reader and test repeatability .18
9.1.6 Participation in a(n) (inter)national ring trial .20
9.2 V erification testing of a transferred screening method .20
9.2.1 General.20
9.2.2 Detection capability .21
9.2.3 Test selectivity/specificity .21
9.2.4 Robustness testing .21
9.2.5 Reader and test repeatability .21
9.2.6 Participation in a(n) (inter)national ring trial .23
Annex A (informative) European legislation on veterinary drugs in bovine milk .24
Annex B (informative) USA legislation on animal drug residues in milk .28
Annex C (informative) List of problematic compounds in the preparation of stock solutions .29
Annex D (informative) Summary of the stability of antibiotics in solution and in matrix .30
Bibliography .32
© ISO and IDF 2021 – All rights reserved PROOF/ÉPREUVE iii

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ISO/TS 23758:2021(E)
IDF /RM 251:2021(E)
Forewords
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national
standards bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally
carried out through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which
a technical committee has been established has the right to be represented on that committee.
International organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part
in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all
matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso .org/
iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5,
Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF), in collaboration with the European
Committee for Standardization (CEN) Technical Committee CEN/TC 302, Milk and milk products —
Methods of sampling and analysis, in accordance with the Agreement on technical cooperation between
ISO and CEN (Vienna Agreement). It is being published jointly by ISO and IDF.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
iv PROOF/ÉPREUVE © ISO and IDF 2021 – All rights reserved

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ISO/TS 23758:2021(E)
IDF /RM 251:2021(E)
IDF (the International Dairy Federation) is a non-profit private sector organization representing the
interests of various stakeholders in dairying at the global level. IDF members are organized in National
Committees, which are national associations composed of representatives of dairy-related national
interest groups including dairy farmers, dairy processing industry, dairy suppliers, academics and
governments/food control authorities.
ISO and IDF collaborate closely on all matters of standardization relating to methods of analysis
and sampling for milk and milk products. Since 2001, ISO and IDF jointly publish their International
Standards using the logos and reference numbers of both organizations.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
This document was prepared by the IDF Standing Committee on Analytical Methods for Additives and
Contaminants and ISO Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and
milk products, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 302, Milk and milk products — Methods of sampling and analysis, in accordance
with the Agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement). It is being
published jointly by ISO and IDF.
This IDF Reviewed method is equal to an ISO Publicly Available Specification (ISO/PAS) or an ISO
Technical Specification (ISO/TS) and is therefore published jointly under ISO conditions.
The work was carried out by the IDF-ISO Action Team on A10 of the Standing Committee on Analytical
Methods for Additives and Contaminants under the aegis of its project leader Dr W. Reybroeck (BE).
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ISO/TS 23758:2021(E)
TECHNICAL SPECIFICATION
IDF /RM 251:2021(E)
Guidelines for the validation of qualitative screening
methods for the detection of residues of veterinary drugs
in milk and milk products
1 Scope
This document describes general workflows and protocols for the validation and the verification
of qualitative screening tests for the detection of residues of veterinary drugs in liquid milk (raw,
pasteurized, UHT and reconstituted milk powders and whey protein extracts) including biological
methods. This guideline does not cover the validation of residue analysis by HPLC, UHPLC or LC-MS/MS.
This document is intended to be useful for manufacturers of screening test kits, laboratories validating
screening methods or tests, competent authorities and dairies or end users of reagents or tests for the
detection of veterinary drug residues in milk products. This document facilitates and improves the
validation and verification of screening methods. The goals of this document are a harmonization in
validation of methods or tests kits in order for all stakeholders to have full trust in the result of residue
screening and to limit the overlap and multiplication of validation work in different laboratories by
sharing the validation results generated by an independent laboratory. Furthermore, a harmonized
validation and verification procedure allows for comparison of the performance of different screening
methods.
This document does not imply that all end users are bound to perform all verification work proposed.
The verification of the correct use of reagents/kits for the detection of antimicrobials is not part of the
scope of this document.
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
biological method
method that detects cellular responses to analytes
EXAMPLE Inhibition of bacterial growth, immunological test, and receptor test.
3.2
qualitative method
method that gives a yes/no response, with no indication of the concentration of the putative analyte
Note 1 to entry: Bacterial growth inhibition tests which give a result of either “no zone” or “zone of inhibition”.
EXAMPLE 2 Inhibition tests which give a colour change of growth medium.
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EXAMPLE 3 Immunochemical/ligand binding tests, where a response is considered as “above” or “below” a
cut-off level; or where analytes with different cross-reactivities are included within the method scope.
EXAMPLE 4 Biosensors.
3.3
matrix
non-analyte portion of the sample Note 1 to entry: Matrices are included in the Scope.
3.4
detection capability
CCβ
smallest content of the analyte that can be detected, identified and/or quantified in a sample with an
error probability of β
Note 1 to entry: The β error is the probability that the tested sample is truly non-conformant even though a
conformant measurement has been obtained.
3.5
cut-off level
response or signal from a screening test which indicates that a sample contains an analyte at or above
the screening target concentration
3.6
blank matrix sample
negative control sample
sample from animals with known history of treatment which have not been exposed to the substance
in question
Note 1 to entry: If samples from such animals are not available, samples which have been previously confirmed
as conformant and not containing residues of the substance of interest by suitably sensitive physicochemical
tests can also be acceptable.
Note 2 to entry: See Table 1.
3.7
positive control sample
control sample that is spiked with the test analyte at the screening target concentration
Note 1 to entry: This may, however also be an incurred-positive sample (i.e. sample taken from animals which
have been treated with the substance in question) or Certified Reference Material.
3.8
screening target concentration
concentration at which a screening test categorizes the sample as “screen positive” (potentially non-
conformant)
Note 1 to entry: This should always be lower than the regulatory limit.
3.9
validation
confirmation, through the provision of objective evidence, that the requirements for a specific intended
use or application, such as a test or measurement method, have been fulfilled
Note 1 to entry: Procedure applied in the originator laboratory (manufacturer’s laboratory) or in an independent
laboratory.
Note 2 to entry: Validation often determines the fitness for purpose of a method.
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3.10
verification
procedure applied to a method which has been previously validated in the case of a transfer validation
Note 1 to entry: The verification procedure is applied by a receptor laboratory for the same matrix as initially
validated, to demonstrate that the method will work reliably in that laboratory with locally sourced milk and is
fit for purpose.
3.11
originator laboratory
laboratory that has performed the complete validation of the method
Note 1 to entry: This is by preference an IEC/ISO 17025 accredited independent laboratory and preferably not
the laboratory that developed the method. The laboratory should have experience in residue testing and in
validation of screening tests for the detection of residues of veterinary drugs in milk.
3.12
receptor laboratory
laboratory that will perform the verification of the method
Note 1 to entry: This could be any laboratory interested in using the method.
3.13
spectrum
range of substances that a test can detect
Note 1 to entry: Some tests detect several classes of antibiotics and a large number of substances, whereas others
are more specific.
3.14
regulatory limit
level defined by food legislation for residues in food
Note 1 to entry: Regulatory limits can be MRL, MRPL, RPA.
3.15
maximum residue limit for veterinary drugs
MRL
maximum concentration of residue resulting from the use of veterinary drugs that is recommended by
the Codex Alimentarius Commission to be legally permitted or recognized as acceptable in food
Note 1 to entry: Antibiotics are used to treat and prevent diseases in animal husbandry and as a result, low
residues of antibiotics can be present in food. MRLs are set for pharmacologically active substances used or
intended to be used in veterinary medicinal products placed on the market. In the EU the MRLs are set by EMA
(European Medicines Agency).
3.16
minimum required performance limit
MRPL
minimum content of an analyte in a sample, which at least has to be detected and confirmed
Note 1 to entry: MRPL is intended to harmonize the analytical performance of methods for substances for which
no permitted limit has been established.
3.17
reference point for action
RPA
level of a residue of a pharmacologically active substance established for control reasons in the case
of certain substances for which a maximum residue limit has not been laid down following certain EU
regulations
Note 1 to entry: EU Regulation 470/2009 is applicable for maximum residue limits.
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Note 2 to entry: RPAs are currently based on analytical considerations (i.e. the lowest concentration that can
be quantified using a validated analytical method). The aim is “to define an analytical concentration for a non-
allowed pharmacologically active substance that can be determined by official control laboratories and that is
[19]
low enough to adequately protect the consumers of food commodities which contain that substance” .
3.18
positive / negative result
result of the test after interpretation of the reading of the test taking into account the (pre-set) cut-off
Note 1 to entry: Positive result: presence of antimicrobial residues (microbial inhibitor test) or presence of
residues of veterinary drugs.
Note 2 to entry: Negative result: absence of antimicrobial residues (microbial inhibitor test) or absence of
residues of veterinary drugs. Since only screening tests are involved, no judgement about ‘conformant’ or ‘non-
conformant’ can be made.
3.19
repeatability limit
value less than or equal to which the absolute difference between two measurement results obtained
under repeatability conditions is expected with a probability of 95 %
3.20
probability of detection
POD
proportion of positive analytical outcomes for a qualitative method for a given matrix at a given analyte
level or concentration
[7]
Note 1 to entry: POD is concentration dependent (AOAC, 2014 ).
4 Principle
Samples of matrix spiked with known levels of analyte are run on the test under validation or
verification to determine the detection capability, sensitivity and robustness of the test. Evaluation of
the test results determines the tests' suitability for routine use in screening milk for the presence of
veterinary residues.
The key requirement for a screening method is its ability to reliably detect the analyte in question at the
chosen screening target concentration. The screening target concentration should be chosen to avoid
false-negative results, i.e. low enough to ensure that if the analyte in question is present in the sample
at the Regulatory Limit, the sample will be classified as 'Screened Positive'.
Both validation and verification should provide the objective evidence that this key requirement is met.
Validation should cover the entire matrix/species/analyte combinations claimed within the scope of
the method standard operating procedure (SOP). Validation should be as broad as possible to cover the
scope of all end users.
Verification should cover the matrix/species/analyte combinations included in the scope of the
implementing (receptor) laboratory. The extent of validation required is variable, depending on whether
it is a validation or a verification of a transferred method.
The verification does not need to cover the entire spectrum if the implementing laboratory is to be
applicable to only a limited scope (e.g. some species and not others, some residues more relevant than
others, raw but not UHT [Ultra-High temperature] milk, etc.).
If a receptor laboratory wants to use the method for screening in a different matrix (IDF 2014) not tested
by the originator laboratory, the receptor laboratory should test all necessary validation parameters to
prove that the method functions for that specific matrix.
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5 General requirements for the test/kit
The developer or the manufacturer should provide information regarding methodology, test reagents,
additional chemicals not necessarily included in the kit, operating requirements (information about
the reading system, cut-off value), test specifications and documentation (extracted from ISO 18330
and ISO 13969). Additionally, the target country(ies) and its/their specific regulatory limits should be
known, in order for the test to be evaluated against the appropriate regulatory limits.
Elements of information to be provided by the manufacturer/distributor/lab manager (in case of an in-
house developed method) before starting the validation are as follows:
— Test principle, principle of reading and interpretation of the test (including cut-off level or calculation
of cut-off).
— Test formats, if relevant (e.g. ampoules/plates).
— Scope of the test:
— Matrices suitable to be tested: matrices in the scope of the document (see Clause 1).
— Animal species producing the milk.
— Matrices with potential impact (interference) on the result.
— Potential impact of the use of sample preservatives.
— Spectrum of the test: list of veterinary drugs and expected detection capabilities (so far known).
— List with the actual regulatory limits (RL) for the detectable veterinary drugs in the matrix(ces) of
concern in the country(ies) of concern.
— Detailed protocol in a language understood by laboratory staff: if minor modifications need to be
made to the method according to the matrix/species, they should be announced in the test protocol
(kit manual).
6 Reagents
6.1 Standard blank matrix
— The raw milk used is commingled milk coming from at least 4 animals not treated with veterinary
drugs within the last 2 months, in mid lactation, and delivering milk with a low to moderate number
−1
of somatic cells (e.g. < 150 000 ml for bovine milk). The raw milk is collected in sterile containers
and kept below 4 °C. The maximum period for the cold storage of the fresh raw milk should be in line
with the definition of fresh raw milk as fixed locally.
— The milk used should be in line with the normal milk produced in the country or area of concern.
This means that the composition and quality of the milk should approach the average composition
of the milk of the country/region.
— Table 1 gives examples of parameters to consider for ‘normal’ milk. Actual figures are likely to vary
depending on country and region.
— Milk of at least 4 animals is commingled and is considered as a sample of standard blank matrix. At
least four (4) such samples should be used for the determination of the detection capability when
testing 20 replicates. If 40 or 60 replicates need to be tested to determine the detection capability,
eight (8) or twelve (12) different blank milk samples should be used, respectively. At least four (4)
different commingled milks should be sourced and used in the verification work (20 replicates).
— The use of thawed or reconstituted lyophilized milk could also be authorized, but strictly on
condition. The pre-requisite condition to work with these alternative solutions, is to demonstrate
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previously the equivalence of results between raw milk and thawed or reconstituted lyophilized
milk, after the analysis of negative and positive milk samples.
Table 1 — Examples of reference data for the composition and quality of normal milk of
different animal species
b
TBC pH Antibiotics Lactating period
a d e
SCC FC PC
Species c
cfu per
cells per ml g/l g/l
ml
6,7 to
Target value < 150 000 < 30 000 40 33
Between 60 and
6,8
Cow Absence 200 days after
Acceptable
calving
< 400 000 < 100 000 35 to 45 30 to 36 6,6 to 6,9
range
6,7 to
Target value < 2 000 000 < 60 000 38 34
Between 20 and
6,8
Goat Absence 150 days after
Acceptable 30 to
kidding
 28 to 40 6,6 to 6,9
range 50
6,7 to
Target value < 2 000 000 < 60 000 70 55
Between 20 and
6,8
Ewe Absence 150 days after
Acceptable 50 to
lambing
 40 to 70 6,6 to 6,9
range 90
a
Somatic cell count.
b
Total bacterial count.
c
Colony forming units.
d
Fat content.
e
Protein content.
6.2 Antibiotics
Only use analytical grade or certified reference material for validation or verification purposes.
6.3 Standard stock solution
— Standard stock solutions of the antibiotic at 100 mg/l are made in water or a suitable solvent and
[14]
kept below 4 °C (refer to 8.1) . The shelf life depends on the stability of the molecule.
— In the preparation of the stock solution, correction for impurity and water content is performed.
— For each substance a single stock solution is prepared, but by preference for certain problematic
compounds (for example solubility problem, stability), at least two stock solutions should be
prepared to determine the detection capability. A list of problematic compounds is given in Annex C.
— If only one stock solution is used it should be either prepared from certifi
...

Questions, Comments and Discussion

Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.