ISO 22184:2021
(Main)Milk and milk products — Determination of the sugar contents — High performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection method (HPAEC-PAD)
Milk and milk products — Determination of the sugar contents — High performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection method (HPAEC-PAD)
This document specifies the quantitative liquid chromatographic determination of specific sugars (galactose, glucose, fructose, sucrose, lactose and maltose) in various milk and milk products, applying arabinose as an internal standard. The method is applicable to the following dairy matrices: milk, sweetened condensed milk, milk powder, cheese, whey powder, infant formula, milk dessert and yoghurt. The method does not apply to dairy products containing soy or to the determination of the lactose content in low-lactose milk products at levels below 1 mg/g. A high performance anion exchange chromatography method in combination with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD) method is applied[5][3][4]. With this method, thirteen different monosaccharides, disaccharides and trisaccharides can be separated: fucose, arabinose, galactose, glucose, fructose, sucrose, lactose, lactulose, maltose, melibiose, trehalose, isomaltulose and maltotriose. The method is applicable to labelling for the six most important sugars that can be present by nature or by addition in milk and milk products. The method does not apply to sugar contents less than 0,1 %.
Lait et produits laitiers — Détermination de la teneur en sucre — Chromatographie d’échange d’anions haute performance couplée à la détection par ampérométrie pulsée (HPAEC-PAD)
Le présent document spécifie la détermination quantitative par chromatographie en phase liquide de certains sucres (galactose, glucose, fructose, saccharose, lactose et maltose) dans divers laits et produits laitiers, en utilisant l'arabinose comme étalon interne. Cette méthode s'applique aux matrices laitières suivantes: lait, lait concentré sucré, lait en poudre, fromage, lactosérum en poudre, formule infantile, dessert lacté et yaourt. Cette méthode ne s'applique pas aux produits laitiers contenant du soja ni à la détermination de la teneur en lactose des produits laitiers à faible teneur en lactose inférieure à 0,1 mg/g. Cette méthode s'appuie sur la chromatographie d'échange d'anions à haute performance couplée à la détection par ampérométrie pulsée (HPAEC-PAD)[5][3][4]. Treize monosaccharides, disaccharides et trisaccharides différents peuvent être séparés par cette méthode: fucose, arabinose, galactose, glucose, fructose, saccharose, lactose, lactulose, maltose, mélibiose, tréhalose, isomaltulose et maltotriose. Cette méthode s'applique à l'étiquetage des six principaux sucres qui peuvent être présents naturellement ou ajoutés dans le lait et les produits laitiers. Cette méthode ne s'applique pas aux teneurs en sucre inférieures à 0,1 %.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 22184
IDF 244
First edition
2021-02
Milk and milk products —
Determination of the sugar contents
— High performance anion exchange
chromatography with pulsed
amperometric detection method
(HPAEC-PAD)
Lait et produits laitiers — Détermination de la teneur en sucre —
Chromatographie d’échange d’anions haute performance couplée à la
détection par ampérométrie pulsée (HPAEC-PAD)
Reference numbers
IDF 244:2021(E)
©
ISO and IDF 2021
IDF 244:2021(E)
© ISO and IDF 2021
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Published in Switzerland
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IDF 244:2021(E)
Contents Page
Foreword .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
5 Reagents . 2
6 Apparatus . 4
7 Sampling . 6
8 Preparation of the test sample . 6
8.1 General . 6
8.2 Sample preparation of sweetened condensed milk . 6
8.2.1 Samples of recently manufactured products in which no appreciable
separation of components can be expected . 6
8.2.2 Samples of older products and samples in which separation of
components can be expected . 6
9 Procedure. 7
9.1 Sample extraction and clean up . 7
9.1.1 General. 7
9.1.2 Sample extraction and clean-up . 7
9.2 Chromatographic analysis . 9
10 Calculation and expression of the results .10
11 Precision .11
11.1 General .11
11.2 Repeatability .11
11.3 Reproducibility .13
12 Test report .16
Annex A (informative) Precision data .17
Annex B (informative) Accuracy data .23
Bibliography .25
IDF 244:2021(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national
standards bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally
carried out through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which
a technical committee has been established has the right to be represented on that committee.
International organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part
in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all
matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
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constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www .iso .org/
iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC
5, Milk and milk products, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN)
Technical Committee CEN/TC 302, Milk and milk products — Methods of sampling and analysis, in
accordance with the Agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement),
and the International Dairy Federation (IDF). It is being published jointly by ISO and IDF.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
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IDF (the International Dairy Federation) is a non-profit private sector organization representing the
interests of various stakeholders in dairying at the global level. IDF members are organized in National
Committees, which are national associations composed of representatives of dairy-related national
interest groups including dairy farmers, dairy processing industry, dairy suppliers, academics and
governments/food control authorities.
ISO and IDF collaborate closely on all matters of standardization relating to methods of analysis
and sampling for milk and milk products. Since 2001, ISO and IDF jointly publish their International
Standards using the logos and reference numbers of both organizations.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
This document was prepared by the IDF Standing Committee on Analytical Methods for Composition and
ISO Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk products. It is
being published jointly by ISO and IDF.
The work was carried out by the IDF/ISO Action Team C22 of the Standing Committee on Analytical
Methods for Composition under the aegis of its project leader Mr H. Cruijsen (NL).
INTERNATIONAL STANDARD
IDF 244:2021(E)
Milk and milk products — Determination of the
sugar contents — High performance anion exchange
chromatography with pulsed amperometric detection
method (HPAEC-PAD)
1 Scope
This document specifies the quantitative liquid chromatographic determination of specific sugars
(galactose, glucose, fructose, sucrose, lactose and maltose) in various milk and milk products, applying
arabinose as an internal standard.
The method is applicable to the following dairy matrices: milk, sweetened condensed milk, milk powder,
cheese, whey powder, infant formula, milk dessert and yoghurt.
The method does not apply to dairy products containing soy or to the determination of the lactose
content in low-lactose milk products at levels below 1 mg/g.
A high performance anion exchange chromatography method in combination with pulsed amperometric
[5][3][4]
detection (HPAEC-PAD) method is applied . With this method, thirteen different monosaccharides,
disaccharides and trisaccharides can be separated: fucose, arabinose, galactose, glucose, fructose,
sucrose, lactose, lactulose, maltose, melibiose, trehalose, isomaltulose and maltotriose.
The method is applicable to labelling for the six most important sugars that can be present by nature
or by addition in milk and milk products. The method does not apply to sugar contents less than 0,1 %.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
3 Terms and definitions
No terms and definitions are listed in this document.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
4 Principle
The sugars present in the sample are extracted with an aqueous ethanol buffer solution in order to
inhibit potential probiotic activities. The obtained extract is deproteinized with a Carrez clarification.
After clarification, the solution is diluted and the sugars present are separated and quantified by
HPAEC. HPAE allows carbohydrates separation at high pH. In order to improve sensitivity and stability,
post-column sodium hydroxide solution is added to the HPAEC-PAD. GOS (galacto-oligosaccharides) and
[5]
fructans do not interfere with the analysis of the sugars . Arabinose is applied as an internal standard
for the quantification of the sugars.
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5 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade and water in accordance with ISO 3696, unless
otherwise specified.
5.1 Water, conforming to ISO 3696, grade 3 and grade 1.
5.2 Sodium hydroxide (NaOH) pellets.
5.3 Aqueous sodium hydroxide solution, substance concentration c = 1 mol/l.
Add to a 1 000 ml volumetric flask 40 g ± 1 g NaOH pellets (5.2), dissolve in about 500 ml of water and,
after cooling down, dilute with water to the mark and homogenize.
5.4 Sodium hydroxide solution, mass fraction w(NaOH) = 33 % in water.
5.5 Sodium hydroxide solution, mass fraction w(NaOH) = 50 % in water.
The amount of carbonate and mercury in the reagent should be minimized. Do not shake or stir the
solution before use. A suitable commercially available carbonate sodium hydroxide solution may also
be used.
5.6 Concentrated hydrochloric acid (HCl), mass fraction of 36 % to 38 % in water.
5.7 Aqueous hydrochloric acid solution, c = 1 mol/l.
Add to a 1 000 ml volumetric flask (6.2) 500 ml of water followed by 83 ml of concentrated HCl (5.6)
and, after cooling down, dilute with water to the mark and homogenize.
5.8 Acetonitrile (HPLC quality).
5.9 Acetonitrile in water, a volume fraction of 5 % in water.
Add to a 1 000 ml volumetric flask (6.2) 50 ml of acetonitrile (5.8), dilute with water grade 3 to the
mark and homogenize.
5.10 Anhydrous sodium acetate (CH COONa) (HPLC quality).
5.11 Eluent 1 (E1), aqueous solution of sodium acetate (CH COONa), c = 1,0 mol/l.
Add to a 1 000 ml volumetric flask (6.2) about 800 ml of degassed water grade 1 (eluent 3, 5.13) followed
by 82,0 g sodium acetate (5.10). Then dilute the aqueous solution with degassed water (eluent 3, 5.13)
to the mark and homogenize. Store the eluent under an inert atmosphere.
5.12 Eluent 2 (E2), aqueous solution of carbonate free sodium hydroxide (NaOH), c = 0,2 mol/l.
Add to a 1 000 ml volumetric flask (6.2) about 800 ml of degassed water grade 1 (eluent 3, 5.13) and
purge for 15 min with helium. Add 16,0 g of sodium hydroxide solution (5.5). Then quickly dilute the
aqueous solution with degassed water grade 1 (eluent 3, 5.13) to the mark, immediately close the bottle
and homogenize. Store the eluent under an inert atmosphere.
5.13 Eluent 3 (E3), degassed water grade 1, stored under an inert atmosphere.
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IDF 244:2021(E)
5.14 Eluent 4 (E4), aqueous solution of sodium acetate (CH COONa), c = 0,025 mol/l.
Add to a 1 000 ml volumetric flask (6.2) about 800 ml of degassed water grade 1 (eluent 3, 5.13) followed
by 2,05 g of sodium acetate (5.10). Then dilute the aqueous solution with degassed water (eluent 3,
5.13) to the mark and homogenize. Store the eluent under an inert atmosphere.
5.15 Post column reagent, aqueous solution of sodium hydroxide, c = 0,3 mol/l.
Add to a 1 000 ml volumetric flask (6.2) about 800 ml of degassed water grade 1 (eluent 3, 5.13). Purge
for 15 min with helium. Add 24,0 g of sodium hydroxide solution (5.5) and quickly fill up to the mark
with the degassed water grade 1 (eluent 3, 5.13). Immediately close the flask and homogenize. Store the
post column reagent under an inert atmosphere.
IMPORTANT — It is extremely important to remove dissolved carbon dioxide from the eluents
and post column reagent prior to use and during use to avoid fast reduction in detector
sensitivity. The eluents and post column reagent are maintained under an inert gas during use.
5.16 Mixture of a volume fraction of 95 % of ethanol (with a volume fraction of 96 % ethanol and
4 % of water) and a volume fraction of 5 % methanol.
5.17 Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate, K Fe(CN) ·3H O.
4 6 2
5.18 Zinc acetate dihydrate, Zn(CH COO) ·2H O.
3 2 2
5.19 Glacial acetic acid.
5.20 Carrez reagent I.
Weigh 106 g of K Fe(CN) ·3H O (5.17) in a 1 000 ml volumetric flask (6.2), dissolve in 800 ml of water
4 6 2
(5.1) and dilute with water grade 3 to the mark. Store the Carrez reagent I in the refrigerator.
5.21 Carrez reagent II.
Weigh 220 g of Zn(CH COO) ·2H O (5.18) in a 1 000 ml volumetric flask (6.2), dissolve in 800 ml water,
3 2 2
add 30 ml of glacial acetic acid (5.19) and dilute with water grade 3 to the mark. Store the Carrez reagent
II in the refrigerator.
IMPORTANT — Do not use Carrez reagent II with zinc sulfate.
5.22 Buffer solution of piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) (c = 1,5 mol/l and
pH = 6,9).
Add 22,5 g of the PIPES buffer solution to a 100 ml conical flask and add 20 ml of sodium hydroxide
solution (5.3). Adjust the pH to pH = 6,9 with NaOH 33 % (5.4) in water. Transfer the PIPES buffer
solution quantitatively into a 50 ml calibrated tube and fill up with water grade 3 till 50 ml. The pH of
the obtained buffer solution shall be within the range of 6,8 to 7,0.
5.23 Arabinose.
5.24 Galactose.
5.25 Glucose.
5.26 Fructose.
5.27 Sucrose.
IDF 244:2021(E)
5.28 Lactose.
5.29 Maltose.
5.30 Internal standard stock solution arabinose.
Weigh, to the nearest mg, approximately 7 g of arabinose (5.23) into a 50 ml volumetric flask (6.2). Add
about 30 ml of water grade 3 and dissolve the arabinose. Add 2,5 ml of acetonitrile (5.8), fill up to the
mark with water and homogenize the solution.
5.31 Sugar standard stock solution.
Weigh, to the nearest 0,1 mg, approximately 260 mg of the monosaccharides galactose (5.24), glucose
(5.25) and fructose (5.26), and approximately 400 mg of the disaccharide sucrose (5.27), lactose (5.28)
and maltose (5.29) into a 500 ml volumetric flask (6.2). Add about 200 ml of water grade 3 and dissolve
the sugars. Add 25 ml of acetonitrile (5.8), fill up to the mark with water grade 3 and homogenize the
solution.
5.32 Sugar standard solutions for calibration.
Prepare the different dilutions of the sugar calibration standards as specified in Table 1. Mix the
specified volumes of the internal standard stock solution arabinose (5.30) and sugar standard stock
solution (5.31) in a 200 ml volumetric flask, add about 50 ml of water grade 3 and homogenize. Add
10 ml of acetonitrile (5.8), fill up to the mark with water and homogenize.
Table 1 — Preparation of the sugar standard solutions for calibration
Volume of sugar standard Volume of arabinose internal
Sugar standard solution stock solution (5.31) standard stock solution (5.30)
ml ml
1 0,2 0,050
2 1,0 0,050
3 6,0 0,050
4 10,0 0,050
5 20,0 0,050
6 40,0 0,050
7 80,0 0,050
8 100,0 0,050
6 Apparatus
6.1 Analytical balance, capable of weighing to an accuracy of ±0,1 mg.
6.2 Volumetric flask, volume of 50 ml, 500 ml and 1 000 ml.
6.3 pH meter.
6.4 Black band filter paper.
6.5 Centrifugation tubes.
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IDF 244:2021(E)
1)
6.6 Homogenizer .
6.7 Vortex mixer.
6.8 Screw cap closed graduated tubes, 50 ml volume.
6.9 Positive displacement multipipette.
6.10 Dispensers, resistant to organic solvent and adjusted to 2,5 ml and 25 ml.
6.11 HPLC vials.
2)
6.12 Metal-free liquid chromatographic system, e.g. Thermo Dionex ICS 3000 , applicable for a
(quaternary) gradient elution.
6.13 Column oven, with a temperature stability of ±1 °C with an operating temperature of 20 °C to 35 °C.
3)
6.14 High performance anion exchange analytical column , filled with pellicular polystyrene-
divinylbenzene resin or filled with an anion exchanger resin enabling the required separation.
4)
6.15 High performance anion exchange guard column , filled with pellicular polystyrene-
divinylbenzene resin or filled with an anion exchanger resin enabling the required separation.
5)
6.16 Pulsed amperometric detector (PAD) with a stability of ±1 °C and an operating temperature
range of 20 °C to 35 °C.
Use pulsed amperometric detection and potential settings and waveforms recommended by the
instrument supplier. Example detector potential settings (versus Ag/AgCl reference) are given in
Table 2.
6)
6.17 Metal-free post column reagent pump .
1) An Ultra turrax with an appropriate probe is an example of a suitable homogenizer available commercially. This
information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO
or IDF of this product.
2) Thermo Dionex ICS 3000 is an example of a suitable homogenizer available commercially. This information is
given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of this
product.
3) A Thermo-Dionex Carbopac PA1 analytical column (2 mm × 250 mm) is an example of a suitable high
performance anion exchange column available commercially. This information is given for the convenience of users
of this document and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of this product.
4) A Dionex Carbopac PA1 guard column (2 mm × 50 mm) is an example of a suitable high performance anion
exchange column available commercially. This information is given for the convenience of users of this document
and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of this product.
5) A Thermo-Dionex model PAD is an example of a suitable PAD available commercially. This information is given
for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of this product.
6) A single piston Thermo Dionex Axp pump is an example of a suitable metal-free post column reagent pump
available commercially. This information is given for the convenience of users of this document and does not
constitute an endorsement by ISO or IDF of this product.
IDF 244:2021(E)
7)
6.18 Integrator chromatography data system .
Table 2 — Time programming of the detector potential settings of the gold working electrode
a
Time Potential gold electrode Integration detector
Step
s signal
1 0,00 0,10
2 0,20 0,10 Start
3 0,40 0,10 End
4 0,41 −2,00
5 0,42 −2,00
6 0,43 0,60
7 0,44 −0,10
8 0,50 −0,10
a
Potential versus Ag/AgCl reference electrode.
NOTE The integration window is 0,20 s to 0,40 s.
7 Sampling
It is important that the laboratory receives a sample that is truly representative and has not been
damaged or changed during transport and/or storage. Sampling is not a part of the method specified in
this document.
8 Preparation of the test sample
8.1 General
Prepare the sample in accordance with an appropriate sampling procedure. Sweetened condensed milk
requires a dedicated sample preparation, see ISO 2911 | IDF 35 and 8.2.
8.2 Sample preparation of sweetened condensed milk
8.2.1 Samples of recently manufactured products in which no appreciable separation of
components can be expected
Open the container, transfer all material adhering to the lid into the container and thoroughly mix by an
up-and-down movement of a spoon, in such a way that the top layers and contents of the lower corners
are moved and mixed. When the product is in a can, transfer the contents into a jar with a well-fitting
lid. When the product is in a collapsible tube, transfer as much as possible of the content to a jar with a
well-fitting lid, then cut open the tube, scrape out all material adhering to the interior and also transfer
this to the jar. Mix the contents of the jar as described above.
8.2.2 Samples of older products and samples in which separation of components can be
expected
Heat the sample in a water bath at about 40 °C until the sample has nearly reached this temperature.
Open the container and proceed as described in 8.2.1. When the product is in a can or tube, transfer
the contents to a jar, scrape out all material adhering to the walls (in the case of a collapsible tube, after
cutting open the tube) and continue the mixing until the whole mass is homogeneous, reducing the size
of any crystals by crushing with a glass rod. Close the jar with a well-fitting lid. Allow to cool.
7) A Thermo Dionex Chromeleon software package is an example of a suitable chromatographic integration
software package available commercially. This information is given for the convenience of users of this document
and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of this product.
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IDF 244:2021(E)
9 Procedure
9.1 Sample extraction and clean up
9.1.1 General
In cases where the integrator chromatography software package has the option “variable internal
8)
standard” (e.g. in Chromeleon™ ), apply the procedure given in 9.1.2. In these cases, just one sample
extraction and a clean-up procedure with two different dilutions have to be done. Adjust the integrator
settings in the variable internal standard option for the 50-fold dilution.
For low sugar contents, apply the procedure given in 9.1.2.2. For high sugar contents, apply the
procedure given in 9.1.2.3. The limits for low and high sugar contents are given in Table 3.
Table 3 — Limits for low and high sugar content
Low content High content
Sugar
g/100 g g/100 g
Galactose ≤ 12 > 12
Glucose ≤ 12 > 12
Fructose ≤ 12 > 12
Sucrose ≤ 18 > 18
Lactose ≤ 18 > 18
Maltose ≤ 18 > 18
In cases where the chromatographic integration software has no option for “variable internal standard”
and there is no prior knowledge about the sugar levels in the dairy sample to be investigated, it is
recommended to apply the procedure given in 9.1.2.2 for the low sugar levels. In cases where a sugar
peak is bigger than the corresponding sugar peak in the highest calibration standard, the procedure
given in 9.1.2.3 shall be applied for a correct quantitation of the sugar content.
9.1.2 Sample extraction and clean-up
9.1.2.1 General
Weigh, to the nearest 0,000 1 g, 1,0 g ± 0,1 g in a 50 ml calibrated tube (6.8).
Add 4 ml of the denatured ethanol (5.16), 0,125 ml of the arabinose internal standard solution (5.30)
and 0,5 ml of the PIPES buffer solution (5.22).
Mix well by vortexing (6.7) and let the sample suspension rest for 10 min at an ambient temperature.
Fill up the calibrated tube to the 25 ml mark with demineralized water grade 3 (5.1) with a temperature
of 40 °C ± 2 °C, followed by homogenization with a homogenizer (6.6) for 1 min.
NOTE Already well-dissolved samples can be homogenized by shaking.
Check the pH of the homogenized sample solution. The pH shall be within the values pH = 5,0 to pH = 7,0.
If necessary, adjust the pH with NaOH solution (5.3) or HCl solution (5.7).
Add 0,5 ml of the Carrez reagent I solution (5.20), mix and then add 0,5 ml of the Carrez reagent II
solution (5.21). Add 2,5 ml acetonitrile (5.8) and fill up with water (5.1) to the 50 ml mark. Close the
calibrated tube with the screw cap and mix well.
Filter the suspension over black band filter paper (6.4) and collect the filtrate.
8) This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement
by ISO or IDF of this product.
IDF 244:2021(E)
Prepare from each filtrate two different dilutions directly in the HPLC vials (6.11):
— 10-fold dilution: mix 100 μl of filtrate with 900 μl of water grade 3 (5.1);
— 50-fold dilution: mix 20 μl of filtrate with 980 μl of water grade 3 (5.1) and adjust the integrator
settings for these 50-fold diluted filtrates in the variable internal standard procedure.
Inject 5 μl of the diluted filtrates in the metal free liquid chromatographic system (6.12).
In cases where the measured sugar peak is outside the calibration graph in the 10-fold diluted sample,
use the results measured in the 50-fold diluted samples after properly adjusting the settings for the
variable internal standard option.
9.1.2.2 Sample extraction and clean-up for the low sugar contents (10-fold dilution)
Weigh, to the nearest 0,000 1 g, 1,0 g ± 0,1 g in a 50 ml calibrated tube (6.8).
Add 4 ml of the mixture of denatured ethanol (5.16), 0,125 ml of the arabinose internal standard
solution (5.30) and 0,5 ml of the PIPES buffer solution (5.22).
Mix well by vortexing (6.7) and let the sample suspension rest fo
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 22184
FIL 244
Première édition
2021-02
Lait et produits laitiers —
Détermination de la teneur en sucre
— Chromatographie d’échange
d’anions haute performance couplée à
la détection par ampérométrie pulsée
(HPAEC-PAD)
Milk and milk products — Determination of the sugar contents —
High performance anion exchange chromatography with pulsed
amperometric detection method (HPAEC-PAD)
Numéros de référence
FIL 244:2021(F)
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ISO et FIL 2021
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 1
5 Réactifs . 2
6 Appareillage . 4
7 Échantillonnage . 6
8 Préparation de l’échantillon pour essai . 6
8.1 Généralités . 6
8.2 Préparation des échantillons de lait concentré sucré . 6
8.2.1 Échantillons de produits fabriqués récemment dans lesquels aucune
séparation appréciable des constituants ne peut être attendue . 6
8.2.2 Échantillons de produits plus anciens et échantillons dans lesquels une
séparation des constituants peut être attendue . 7
9 Mode opératoire. 7
9.1 Extraction et nettoyage de l’échantillon . 7
9.1.1 Généralités . 7
9.1.2 Extraction et nettoyage de l’échantillon . 7
9.2 Analyse chromatographique . 9
10 Calcul et expression des résultats .10
11 Fidélité .12
11.1 Généralités .12
11.2 Répétabilité .12
11.3 Reproductibilité .14
12 Rapport d’essai .17
Annexe A (informative) Données de fidélité .18
Annexe B (informative) Données de précision.23
Bibliographie .25
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Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/ avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires,
sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 302, Lait et
produits laitiers — Méthodes d’échantillonnage et d’analyse, du Comité européen de normalisation (CEN)
conformément à l’Accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne). Il est publié
conjointement par l’ISO et la FIL.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
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La FIL (Fédération internationale du lait) est une organisation privée à but non lucratif qui représente
les intérêts des divers acteurs de la filière laitière au niveau international. Les membres de la FIL sont
organisés en comités nationaux, qui sont des associations nationales composées de représentants de
groupes d’intérêt nationaux dans le secteur des produits laitiers, incluant des producteurs laitiers, des
acteurs de l’industrie de transformation des produits laitiers, des fournisseurs de produits laitiers, des
universitaires et des représentants des gouvernements/autorités chargées du contrôle des aliments.
L’ISO et la FIL collaborent étroitement à toutes les activités de normalisation concernant les méthodes
d’analyse et d’échantillonnage du lait et des produits laitiers. Depuis 2001, l’ISO et la FIL publient
conjointement leurs Normes internationales en utilisant les logos et les numéros de référence des
deux organisations.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Le présent document a été élaboré par le Comité permanent des méthodes d’analyse de la composition de
la FIL et le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers.
Il est publié conjointement par l’ISO et la FIL.
Ce travail a été accompli par le groupe de projet mixte FIL/ISO C22 du Comité permanent des méthodes
d’analyse de la composition sous la conduite de son chef de projet, M. H. Cruijsen (NL).
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NORME INTERNATIONALE
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Lait et produits laitiers — Détermination de la teneur
en sucre — Chromatographie d’échange d’anions haute
performance couplée à la détection par ampérométrie
pulsée (HPAEC-PAD)
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie la détermination quantitative par chromatographie en phase liquide
de certains sucres (galactose, glucose, fructose, saccharose, lactose et maltose) dans divers laits et
produits laitiers, en utilisant l’arabinose comme étalon interne.
Cette méthode s’applique aux matrices laitières suivantes: lait, lait concentré sucré, lait en poudre,
fromage, lactosérum en poudre, formule infantile, dessert lacté et yaourt.
Cette méthode ne s’applique pas aux produits laitiers contenant du soja ni à la détermination de la
teneur en lactose des produits laitiers à faible teneur en lactose inférieure à 0,1 mg/g.
Cette méthode s’appuie sur la chromatographie d’échange d’anions à haute performance couplée à la
[5][3][4]
détection par ampérométrie pulsée (HPAEC-PAD) . Treize monosaccharides, disaccharides et
trisaccharides différents peuvent être séparés par cette méthode: fucose, arabinose, galactose, glucose,
fructose, saccharose, lactose, lactulose, maltose, mélibiose, tréhalose, isomaltulose et maltotriose.
Cette méthode s’applique à l’étiquetage des six principaux sucres qui peuvent être présents
naturellement ou ajoutés dans le lait et les produits laitiers. Cette méthode ne s’applique pas aux teneurs
en sucre inférieures à 0,1 %.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai
3 Termes et définitions
Aucun terme n’est défini dans le présent document.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/
4 Principe
Les sucres présents dans l’échantillon sont extraits à l’aide d’une solution tampon aqueuse contenant de
l’éthanol afin d’inhiber d’éventuelles activités probiotiques. L’extrait ainsi obtenu est déprotéinisé par
clarification de Carrez. Après clarification, la solution est diluée et les sucres présents sont séparés et
quantifiés par HPAEC. HPAE permet la séparation des glucides à pH élevé. Afin d’améliorer la sensibilité
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et la stabilité, une solution d’hydroxyde de sodium est ajoutée en post-colonne de l’HPAEC. Les GOS
[5]
(galacto-oligosaccharide) et les fructanes n’interfèrent pas avec l’analyse des sucres . L’arabinose est
utilisé comme étalon interne pour la quantification des sucres.
5 Réactifs
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l’eau conformément à l’ISO 3696,
sauf indication contraire.
5.1 Eau, conformément à l’ISO 3696, grade 3 et grade 1.
5.2 Pastilles d’hydroxyde de sodium (NaOH).
5.3 Solution aqueuse d’hydroxyde de sodium, de concentration c = 1 mol/l.
Introduire 40 g ± 1 g de pastilles de NaOH (5.2) dans une fiole jaugée de 1 000 ml, les dissoudre dans
environ 500 ml d’eau et, après refroidissement, diluer avec de l’eau jusqu’au repère et homogénéiser.
5.4 Solution d’hydroxyde de sodium, de fraction massique w(NaOH) = 33 % dans l’eau.
5.5 Solution d’hydroxyde de sodium, de fraction massique w(NaOH) = 50 % dans l’eau.
Il convient que le réactif contienne le moins possible de carbonate et de mercure. Ne pas agiter
ou mélanger la solution avant utilisation. Une solution d’hydroxycarbonate de sodium appropriée
disponible dans le commerce peut également être utilisée.
5.6 Acide chlorhydrique concentré (HCl), fraction massique de 36 % à 38 % dans l’eau.
5.7 Solution aqueuse d’acide chlorhydrique, c = 1 mol/l.
Introduire 500 ml d’eau et 83 ml d’HCl concentré (5.6) dans une fiole jaugée de 1 000 ml (6.2) et, après
refroidissement, diluer avec de l’eau jusqu’au repère et homogénéiser.
5.8 Acétonitrile (qualité HPLC).
5.9 Acétonitrile dans l’eau, à une fraction volumique de 5 % dans l’eau.
Introduire 50 ml d’acétonitrile (5.8) dans une fiole jaugée de 1 000 ml (6.2), diluer avec de l’eau de
grade 3 jusqu’au repère et homogénéiser.
5.10 Acétate de sodium anhydre (CH COONa) (qualité HPLC).
5.11 Éluant 1 (E1), solution aqueuse d’acétate de sodium (CH COONa), c = 1,0 mol/l.
Introduire environ 800 ml d’eau dégazée de grade 1 (éluant 3, 5.13) et 82,0 g d’acétate de sodium
(5.10) dans une fiole jaugée de 1 000 ml (6.2). Diluer ensuite la solution aqueuse à l’aide d’eau dégazée
(éluant 3, 5.13) jusqu’au repère et homogénéiser. Conserver l’éluant sous atmosphère inerte.
5.12 Éluant 2 (E2), solution aqueuse d’hydroxyde de sodium exempte de carbonate (NaOH),
c = 0,2 mol/l.
Introduire environ 800 ml d’eau dégazée de grade 1 (éluant 3, 5.13) dans une fiole jaugée de 1 000 ml (6.2)
et purger avec de l’hélium pendant 15 min. Ajouter 16,0 g de solution d’hydroxyde de sodium (5.5).
Diluer ensuite rapidement la solution aqueuse à l’aide d’eau dégazée de grade 1 (éluant 3, 5.13) jusqu’au
repère, fermer immédiatement la fiole et homogénéiser. Conserver l’éluant sous atmosphère inerte.
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5.13 Éluant 3 (E3), eau dégazée de grade 1, conservée sous atmosphère inerte.
5.14 Éluant 4 (E4), solution aqueuse d’acétate de sodium (CH COONa), c = 0,025 mol/l.
Introduire environ 800 ml d’eau dégazée de grade 1 (éluant 3, 5.13) et 2,05 g d’acétate de sodium
(5.10) dans une fiole jaugée de 1 000 ml (6.2). Diluer ensuite la solution aqueuse à l’aide d’eau dégazée
(éluant 3, 5.13) jusqu’au repère et homogénéiser. Conserver l’éluant sous atmosphère inerte.
5.15 Réactif post-colonne, solution aqueuse d’hydroxyde de sodium, c = 0,3 mol/l.
Introduire environ 800 ml d’eau dégazée de grade 1 (éluant 3, 5.13) dans une fiole jaugée de 1 000 ml (6.2).
Purger avec de l’hélium pendant 15 min. Ajouter 24,0 g de solution d’hydroxyde de sodium (5.5)
et compléter rapidement jusqu’au repère avec de l’eau dégazée de grade 1 (éluant 3, 5.13). Fermer
immédiatement la fiole et homogénéiser. Conserver le réactif post-colonne sous atmosphère inerte.
IMPORTANT — Il est extrêmement important d’éliminer le dioxyde de carbone dissous dans
les éluants et le réactif post-colonne avant et en cours d’utilisation pour éviter une réduction
rapide de la sensibilité du détecteur. Les éluants et le réactif post-colonne sont maintenus dans
un environnement de gaz inerte en cours d’utilisation.
5.16 Mélange d’une fraction volumique de 95 % d’éthanol (avec une fraction volumique de 96 %
d’éthanol et de 4 % d’eau) et d’une fraction volumique de 5 % de méthanol.
5.17 Hexacyanoferrate (II) de potassium trihydraté, K Fe(CN) ·3H O.
4 6 2
5.18 Acétate de zinc dihydraté, Zn(CH COO) ·2H O.
3 2 2
5.19 Acide acétique glacial.
5.20 Réactif de Carrez I.
Introduire 106 g de K Fe(CN) .3H O (5.17) dans une fiole jaugée de 1 000 ml (6.2), dissoudre à l’aide
4 6 2
de 800 ml d’eau (5.1) et diluer à l’eau de grade 3 jusqu’au repère. Conserver le réactif de Carrez I au
réfrigérateur.
5.21 Réactif de Carrez II.
Introduire 220 g de Zn(CH COO) .2H O (5.18) dans une fiole jaugée de 1 000 ml (6.2), dissoudre à l’aide
3 2 2
de 800 ml d’eau, ajouter 30 ml d’acide acétique glacial (5.19), et diluer à l’eau de grade 3 jusqu’au repère.
Conserver le réactif de Carrez II au réfrigérateur.
IMPORTANT — Ne pas utiliser le réactif de Carrez II en présence de sulfate de zinc.
5.22 Solution tampon d’acide pipérazine-N,N′-bis(2-éthanesulfonique) (PIPES) (c = 1,5 mol/l
et pH = 6,9).
Introduire 22,5 g de solution tampon de PIPES dans une fiole conique de 100 ml et ajouter 20 ml de
solution d’hydroxyde de sodium (5.3). Ajuster le pH à pH = 6,9 à l’aide de NaOH à 33 % (5.4) dans l’eau.
Transférer quantitativement la solution tampon de PIPES dans un tube étalonné de 50 ml et compléter
avec de l’eau de grade 3 jusqu’à atteindre 50 ml. Le pH de la solution tampon ainsi obtenue doit être
compris entre 6,8 et 7,0.
5.23 Arabinose.
5.24 Galactose.
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5.25 Glucose.
5.26 Fructose.
5.25 Saccharose.
5.28 Lactose.
5.29 Maltose.
5.30 Solution mère d’étalon interne d’arabinose.
Peser, au mg près, environ 7 g d’arabinose (5.23) dans une fiole jaugée de 50 ml (6.2). Ajouter
environ 30 ml d’eau de grade 3 et dissoudre l’arabinose. Ajouter 2,5 ml d’acétonitrile (5.8), compléter
jusqu’au repère avec de l’eau et homogénéiser la solution.
5.31 Solution mère d’étalon de sucre.
Peser, à 0,1 mg près, environ 260 mg des monosaccharides galactose (5.24), glucose (5.25) et
fructose (5.26) et environ 400 mg des disaccharides saccharose (5.27), lactose (5.28) et maltose (5.29)
dans une fiole jaugée de 500 ml (6.2). Ajouter environ 200 ml d’eau de grade 3 et dissoudre les sucres.
Ajouter 25 ml d’acétonitrile (5.8), compléter jusqu’au repère avec de l’eau de grade 3, et homogénéiser
la solution.
5.32 Solutions étalons de sucre pour l’étalonnage.
Préparer les différentes dilutions des solutions d’étalonnage de sucre indiquées dans le Tableau 1.
Mélanger les volumes indiqués de solution mère d’étalon interne d’arabinose (5.30) et de solution
mère d’étalon de sucre (5.31) dans une fiole jaugée de 200 ml, ajouter environ 50 ml d’eau de grade 3
et homogénéiser. Ajouter 10 ml d’acétonitrile (5.8), compléter jusqu’au repère avec de l’eau et
homogénéiser.
Tableau 1 — Préparation des solutions étalons de sucre en vue de l’étalonnage
Volume de solution mère d’étalon Volume de solution mère d’étalon interne
Solution étalon de sucre de sucre (5.31) d’arabinose (5.30)
ml ml
1 0,2 0,050
2 1,0 0,050
3 6,0 0,050
4 10,0 0,050
5 20,0 0,050
6 40,0 0,050
7 80,0 0,050
8 100,0 0,050
6 Appareillage
6.1 Balance analytique, d’une précision de ±0,1 mg.
6.2 Fioles jaugées, de 50 ml, 500 ml et 1 000 ml.
6.3 pH-mètre.
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6.4 Papier filtre à bande noire.
6.5 Tubes de centrifugation.
1)
6.6 Homogénéisateur .
6.7 Agitateur vortex.
6.8 Tubes gradués fermés par un bouchon à vis, d’un volume de 50 ml.
6.9 Multipipette à déplacement positif.
6.10 Distributeurs, résistants aux solvants organiques et réglés sur 2,5 ml et 25 ml.
6.11 Flacons HPLC.
6.12 Système chromatographique ne contenant aucun composant métallique, par exemple,
2)
un ICS 3000 de Thermo Dionex , pouvant être utilisé pour une élution avec un gradient quaternaire.
6.13 Four pour colonne, avec une stabilité de température de ±1 °C et une température de
fonctionnement de 20 °C à 35 °C.
3)
6.14 Colonne analytique d’échange d’anions à haute performance , garnie d’une résine de
polystyrène-divinylbenzène pelliculaire ou garnie d’une résine d’échange d’anions permettant la
séparation requise.
4)
6.15 Colonne de garde d’échange d’anions à haute performance , garnie d’une résine de
polystyrène-divinylbenzène pelliculaire ou garnie d’une résine d’échange d’anions permettant la
séparation requise.
5)
6.16 Détecteur par ampérométrie pulsée (PAD) avec une stabilité de ±1 °C et une plage de
température de fonctionnement de 20 °C à 35 °C.
Utiliser la détection par ampérométrie pulsée et les réglages de potentiel ainsi que les formes d’onde
recommandés par le fournisseur de l’instrument. Des exemples de réglages de potentiel du détecteur
(par rapport à la référence Ag/AgCl) sont présentés dans le Tableau 2.
1) Un Ultraturrax équipé d’une sonde adaptée est un exemple d’homégénéisateur approprié disponible sur le
marché. Cette information est donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et
ne saurait constituer un engagement de l’ISO ou de la FIL à l’égard de ce produit.
2) Cette information est donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et
ne saurait constituer un engagement de l’ISO ou de la FIL à l’égard de ce produit.
3) Une colonne analytique Carbopac PA1 (2 mm × 250 mm) de Thermo-Dionex est un exemple de colonne
d’échange d’anions à haute performance adaptée disponible sur le marché. Cette information est donnée par souci
de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de l’ISO ou
de la FIL à l’égard de ce produit.
4) Une colonne de garde Carbopac PA1 de Dionex (2 mm × 50 mm) est un exemple de colonne d’échange
d’anions à haute performance adaptée disponible sur le marché. Cette information est donnée par souci de
commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de l’ISO ou de
la FIL à l’égard de ce produit.
5) Un modèle de PAD de Thermo-Dionex est un exemple de PAD adapté disponible sur le marché. Cette
information est donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait
constituer un engagement de l’ISO ou de la FIL à l’égard de ce produit.
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6)
6.17 Pompe pour réactif post-colonne ne contenant aucun composant métallique .
7)
6.18 Système d’intégration de données chromatographiques .
Tableau 2 — Programmation horaire des réglages de potentiel du détecteur pour l’électrode de
travail en or
a
Temps Potentiel de l’électrode en or Intégration du signal du détecteur
Étape
s
1 0,00 0,10
2 0,20 0,10 Début
3 0,40 0,10 Fin
4 0,41 −2,00
5 0,42 −2,00
6 0,43 0,60
7 0,44 −0,10
8 0,50 −0,10
a
Potentiel par rapport à l’électrode de référence Ag/AgCl.
NOTE La fenêtre d’intégration va de 0,20 s à 0,40 s.
7 Échantillonnage
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou
modifié lors du transport et/ou du stockage. L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée
dans le présent document.
8 Préparation de l’échantillon pour essai
8.1 Généralités
Préparer l’échantillon conformément à un mode opératoire d’échantillonnage approprié. Le lait
concentré sucré implique une préparation de l’échantillon dédiée (voir l’ISO 2911 | FIL 35 et en 8.2).
8.2 Préparation des échantillons de lait concentré sucré
8.2.1 Échantillons de produits fabriqués récemment dans lesquels aucune séparation
appréciable des constituants ne peut être attendue
Ouvrir le récipient, transférer la totalité du produit adhérant au couvercle dans le récipient et bien
homogénéiser le tout en déplaçant verticalement une cuillère, de façon à déplacer et à mélanger les
couches supérieures ainsi que le contenu des coins inférieurs. Lorsque le produit se trouve dans un
récipient en métal, transférer son contenu dans un bocal muni d’un couvercle bien ajusté. Lorsque le
produit se trouve dans un tube souple, transférer le maximum de son contenu dans un bocal muni d’un
couvercle bien ajusté, et ouvrir le tube en le découpant, gratter l’ensemble du produit adhérant aux
parois internes et le transférer également dans le bocal. Mélanger le contenu du bocal comme indiqué
ci-dessus.
6) Une pompe mono-piston Axp de Thermo Dionex est un exemple de pompe pour réactif post-colonne ne
contenant aucun composant métallique adaptée et disponible sur le marché. Cette information est donnée par souci
de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de l’ISO ou
de la FIL à l’égard de ce produit.
7) Un progiciel Chromeleon de Thermo Dionex est un exemple de progiciel d’intégration chromatographique
adapté disponible sur le marché. Cette information est donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs
du présent document et ne saurait constituer un engagement de l’ISO ou de la FIL à l’égard de ce produit.
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8.2.2 Échantillons de produits plus anciens et échantillons dans lesquels une séparation des
constituants peut être attendue
Chauffer l’échantillon au bain-marie à environ 40 °C jusqu’à ce que l’échantillon ait quasiment atteint
cette température. Ouvrir le récipient et procéder comme indiqué en 8.2.1. Lorsque le produit se trouve
dans un récipient en métal ou dans un tube, transférer son contenu dans un bocal, gratter l’ensemble du
produit adhérant aux parois (dans le cas d’un tube souple, après avoir ouvert le tube en le découpant) et
continuer à mélanger jusqu’à ce que la masse soit entièrement homogène, en veillant à réduire la taille
d’éventuels cristaux en les écrasant avec une tige de verre. Fermer le bocal à l’aide d’un couvercle bien
ajusté. Laisser refroidir.
9 Mode opératoire
9.1 Extraction et nettoyage de l’échantillon
9.1.1 Généralités
Si le progiciel d’intégration chromatographique comporte l’option « étalon interne variable »
8)
(par exemple comme dans Chromeleon™ ), suivre le mode opératoire spécifié en 9.1.2. Dans ce cas,
il suffit de suivre une seule fois le mode opératoire d’extraction de l’échantillon et de nettoyage en
utilisant deux dilutions différentes. Régler les paramètres d’intégration de l’option « étalon interne
variable » pour une dilution par un facteur 50.
Pour une faible teneur en sucre, appliquer le mode opératoire spécifié en 9.1.2.2. Pour une forte teneur
en sucre, appliquer le mode opératoire spécifié en 9.1.2.3. Le Tableau 3 précise les limites correspondant
aux faible et forte teneurs en sucre.
Tableau 3 — Limites correspondant à une faible et une forte teneur en sucre
Faible teneur Forte teneur
Sucre
g/100 g g/100 g
Galactose ≤ 12 > 12
Glucose ≤ 12 > 12
Fructose ≤ 12 > 12
Saccharose ≤ 18 > 18
Lactose ≤ 18 > 18
Maltose ≤ 18 > 18
Si le logiciel d’intégration chromatographique ne comporte pas d’option « étalon interne variable »
et si les taux de sucre dans l’échantillon de produit laitier à l’étude ne sont a priori pas connus, il est
recommandé de commencer en suivant le mode opératoire donné en 9.1.2.2 destiné aux faibles niveaux
de sucre. Si un pic de sucre est plus grand que le pic de sucre correspondant de la solution d’étalonnage
présentant la concentration la plus élevée, le mode opératoire donné en 9.1.2.3 doit être appliqué pour
garantir une quantification correcte de la teneur en sucre.
9.1.2 Extraction et nettoyage de l’échantillon
9.1.2.1 Généralités
Peser, à 0,000 1 g près, 1,0 g ± 0,1 g dans un tube étalonné de 50 ml (6.8).
Ajouter 4 ml d’éthanol dénaturé (5.16), 0,125 ml de solution d’étalon interne d’arabinose (5.30) et 0,5 ml
de solution tampon de PIPES (5.22).
8) Cette information est donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et
ne saurait constituer un engagement de l’ISO ou de la FIL à l’égard de ce produit.
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Bien mélanger à l’aide d’un agitateur vortex (6.7) et laisser reposer la suspension de l’échantillon
pendant 10 min à température ambiante.
Compléter le tube étalonné jusqu’au repère correspondant à 25 ml avec de l’eau déminéralisée de
grade 3 (5.1) à une température de (40 ± 2) °C, et homogénéiser à l’aide d’un homogénéisateur (6.6)
pendant 1 min.
NOTE Les échantillons déjà bien dissous peuvent être homogénéisés par simple agitation.
Contrôler le pH de la solution d’échantillon homogénéisée. Le pH doit être compris entre pH = 5,0
et pH = 7,0. Si nécessaire, ajuster le pH avec une solution de NaOH (5.3) ou une solution de HCl (5.7).
Introduire 0,5 ml de solution de réactif de Carrez I (5.21), mélanger et introduire ensuite 0,5 ml de
solution de réactif de Carrez II (5.22). Introduire 2,5 ml d’acétonitrile (5.9) et compléter avec de
l’eau (5.1) jusqu’au repère correspondant à 50 ml. Fermer le tube étalonné avec le bouchon à vis et bien
mélanger.
Filtrer la suspension sur du papier filtre à bande noire (6.4) et récupérer le filtrat.
À partir de chaque filtrat, préparer deux dilutions différentes directement dans les flacons HPLC (6.11):
— dilution par un facteur 10: mélanger 100 μl de filtrat avec 900 μl d’eau de grade 3 (5.1);
— dilution par un facteur 50: mélanger 20 μl de filtrat avec 980 μl d’eau de grade 3 (5.1) et ajuster les
paramètres d’intégration pour ces filtrats dilués 50 fois dans le mode opératoire avec étalon interne
variable.
Injecter 5 µl des filtrats dilués dans le système chromatographique ne contenant aucun composant
métallique (6.12).
Si le pic de sucre mesuré dans l’échantillon dilué 10 fois se situe en dehors du graphique d’étalonnage,
utiliser les résultats mesurés sur les échantillons dilués 50 fois après avoir correctement ajusté les
paramètres de l’option « étalon interne variable ».
9.1.2.2 Extraction et nettoyage de l’échantillon pour les faibles teneurs en sucre (dilution par
un facteur 10)
Peser, à 0,000 1 g près, 1,0 g ± 0,1 g dans un tube étalonné de 50 ml (6.8).
Ajouter 4 ml du mélange d’éthanol dénaturé (5.16), 0,125 ml de solution d’étalon interne d’arabinose
(5.30) et 0,5 ml de solution tampon de PIPES (5.22).
Bien mélanger à l’aide d’un agitateur vortex (6.7) et laisser reposer la suspension de l’échantillon
pendant 10 min à température ambiante.
Compléter le tube étalonné jusqu’au repère correspondant à 25 ml avec de l’eau déminéralisée de
grade 3 (5.1) à une température de (40 ± 2) °C, et homogénéiser à l’aide d’un homogénéisateur (6.6)
pendant 1 min.
NOTE Les échantillons déjà bien dissous peuvent être homogénéisés par simple agitation.
Contrôler le pH de la solution d’échantillon homogénéisée. Le pH doit être compris entre pH = 5,0
et pH = 7,0. Si nécessaire, ajuster le pH avec une solution de NaOH (5.3) ou une solution de HCl (5.7).
Introduire 0,5 ml de solution de réactif de Carrez I (5.20), mélanger et introduire ensuite 0,5 ml de
solution de réactif de Carrez II (5.21). Introduire 2,5 ml d’acétonitrile (5.8) et compléter avec de
l’eau (5.1) jusqu’au repère correspondant à 50 ml. Fermer le tube étalonné avec le bouchon à vis et bien
mélanger.
Filtrer la suspension sur du papier filtre à bande noire (6.4), récupérer le filtrat et mélanger 100 μl de
filtrat avec 900 μl d’eau de grade 3 (5.1) dans un flacon HPLC (6.11).
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Injecter 5 µl des filtrats dilués dans le système chromatographique ne contenant aucun composant
métallique (6.12).
9.1.2.3 Extraction et nettoyage de l’échantillon pour les fortes teneurs en sucre (dilution par
un facteur 50)
Peser, à 0,000 1 g près, 1,0 g ± 0,1 g dans un tube étalonné de 50 ml (6.8).
Ajouter 4 ml du mélange d’éthanol dénaturé (5.16), 0,625 ml de solution d’étalon interne d’arabinose
(5.30) et 0,5 ml de solution tampon de PIPES (5.21).
Bien mélanger à l’aide d’un agitateur vortex (6.7) et laisser reposer la suspension de l’échantillon
pendant 10 min à température ambiante.
Compléter le tube étalonné jusqu’au repère correspondant à 25 ml avec de l’eau déminéralisée de
grade 3 (5.1) à une température de (40 ± 2) °C, et homogénéiser à l’aide d’un homogénéisateur (6.6)
pendant 1 min.
NOTE Les échantillons déjà bien dissous peuvent être homogénéisés par simple agitation.
Contrôler le pH de la solution d’échantillon homogénéisée. Le pH doit être compris entre pH = 5,0
et pH = 7,0. Si nécessaire, ajuster le pH avec une solution de NaOH (5.3) ou une solution de HCl (5.7).
Introduire 0,5 ml de solution de réactif de Carrez I (5.20), mélanger et introduire ensuite 0,5 ml de
solution de réactif de Carrez II (5.21). Introduire 2,5 ml d’acétonitrile (5.8) et compléter avec de
l’eau (5.1) jusqu’au repère correspondant à 50 ml. Fermer le tube étalonné avec le bouchon à vis et bien
mélanger.
Filtrer la suspension sur du papier filtre à bande noire (6.4), récupérer le filtrat et mélanger 20 μl de
filtrat avec 980 μl d’eau de grade 3 (5.1) dans un flacon HPLC (6.11).
Injecter 5 µl des filtrats dilués dans le système chromatographique ne contenant aucun composant
métallique (6.12).
9.2 Analyse chromatographique
Installer le système chromatographique (6.12) avec le four pour colonne (6.13), la colonne de garde
pour échange d’anions à haute performance (6.15) et la colonne analytique (6.14), la pompe pour réactif
post-colonne (6.17), le détecteur (6.16) et l’intégrateur (6.18). Programmer le profil d’élution à gradient
linéaire comme indiqué dans le Tableau 4.
Laisser le système chromatographique s’équilibrer pendant au moins 15 min, puis procéder à une triple
injection d’étalon d’essai afin de stabiliser le système chromatographique dans les conditions précisées
dans les Tableaux 2, 3 et 4.
Étalonner ensuite le système chromatographique en injectant 5 μl des 8 solutions étalons de sucre
(5.32) dans les conditions indiquées dans les Tableaux 2, 3 et 4.
Analyser les filtrats préparés en injectant 5 μl des échantillons de filtrat (9.1) dans le système
chromatographique dans les conditions présentées dans les Tableaux 2, 3 et 4 (l’élution du gradient est
donnée à titre d’exemple pour un paramétrage d’instrument spécifique).
Injecter une série de 4 solutions étalons de sucre (5.32) après chaque série de 8 échantillons de
filtrat (9.1) afin de prendre en compte les légères variations de temps de rétention et/ou de sensibilité
du détecteur. Utiliser en alternance les 4 solutions étalons numérotées 1, 3, 5 et 7 et les 4 solutions
étalons numérotées 2, 4, 6 et 8.
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Tableau 4 — Exemple typique de profil d’élution à gradient approprié pour la séparation
chromatographique des sucres
Pourcentage E1 Pourcentage E2 Pourcentage E3 Pourcentage E4
Temps
CH COONa, NaOH, H O CH COONa,
3 2 3
min
c = 1 mol/l c = 0,2 mol/l c = 0,025 mol/l
Initial 0 5 88 7
Injection de l’échantillon
0 0 5 88 7 et début de l’acquisition
des données
10 0 5 88 7
15 0 17 76 7
25 0 93 0 7
Arrêt de l’acquisition
28,1 20 73 0 7 des données et début du
lavage de la colonne
Fin du lavage de la
32,0 20 73 0 7
colonne
Début de l’équilibrage de
32,1 0 5 88 7
la colonne
Fin de l’équilibrage de la
52 0 5 88 7
colonne et fin du cycle
Le profil du gradient est spécifique au système chromatographique employé. Il est fortement conseillé
de vérifier le profil du gradient. Les résolutions chromatographiques exigées sont répertoriées dans
le Tableau 5. Lorsque les résolutions entre le glucose et le saccharose et entre le saccharose et le
fructose sont inférieures au seuil exigé de 1,5, il est conseillé d’augmenter légèrement (de 5 % à 5,5 %)
le pourcentage de l’éluant E2 (NaOH, 0,2 mol/l) et de diminuer de la même quantité le pourcentage de
l’éluant E3 (eau dégazée).
Tableau 5 — Résolution chromatographique nécessaire
Sucres Résolution minimale exigée
Arabinose-galactose > 1,5
Galactose-glucose > 1,5
Glucose-saccharose > 1,5
Saccharose-fructose > 1,5
Fructose-mélibiose > 1,5
10 Calcul et expression des résultats
Identifier les sucres dans les solutions d’échantillon en comparant les résultats aux temps de rétention
des pics correspondants des solutions étalons de sucre. Étalonner le système chromatographique à
l’aide des deux séries de solutions étalons de sucre (5.32) qui sont analysées avant et après chaque série
de 8 échantillons de filtrat (9.1).
Calculer la concentration massique du sucre dans la solution étalon (5.31), ρ en mg/ml, à l’aide
st,
la Formule (1):
()mP× /100
ρ = (1)
st
où
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m est la masse de l’étalon de sucre, en mg;
P est la pureté de l’étalon de sucre, en %;
100 est un facteur de conversion;
500 est le volume de la solution étalon, en ml.
Calculer la concentration massique du sucre dans la solution étalon (5.32), ρ en mg/ml, à l’aide
cal,
la Formule (2):
V ×ρ
()
st st
ρ = (2)
cal
où
V est le volume de la solution étalon de sucre, en ml;
st
ρ est la concentration massique du sucre dans la solution étalon (5.31), en mg/ml;
st
200 est le volume de la solution étalon de sucre, en ml.
Pour les graphiques d’étalonnage, utiliser le logiciel de l’instrument pour chaque sucre analyte afin de
tracer une courbe étalon à 8 points du rapport entre la réponse de l’instrument pour l’analyte et celle de
l’arabinose utilisé comme étalon interne vis-à-vis de la concentration de l’analyte. Ajuster les données
selon une courbe quadratique (y = ax + bx + c) sans forcer l’ordonnée par zéro, où y est la concentration
de sucre en mg/ml dans les solutions étalons de 5 µl et x est l’aire de pic relative définie par le rapport
de la concentration du sucre et de la concentration de l’arabinose comme étalon interne.
Calculer la concentration massique du sucre dans les 5 µl introduits de la solution d’échantillon
préparée, ρ , en mg/ml, à l’aide de la Formule (3):
inj
ρ =+ax bx+c (3)
inj
où
a, b, c sont des valeurs obtenues à partir de l’insertion quadratique;
x est l’aire de pic relative (rapport de la concentration du sucre et de la concentration de l’ara-
binose comme étalon interne).
Calculer la fraction massique du sucre dans l’échantillon d’essai, w , en mg/kg, à l’aide de la Formule (4):
s
ρ
inj
w =×D××50 1 000 (4)
s
m
où
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ρ est la concentration massique du sucre dans les 5 µl introduits dans la solution d’échantillon
inj
préparée, en mg/ml;
m est la masse de l’échantillon d’essai, en g;
D est le facteur de dilution pour l’échantillon filtré; D = 10 appliquant une dilution par un facteur
de 10 de l’échantillon injecté filtré et D = 50 appliquant une dilution par un facteur de 50 de
l’échantillon injecté filtré;
50 est un facteur de conversion, ml;
1 000 est le facteur de conversion, de g à kg.
Quantifier les glucides présents dans les échantillons en effectuant les étalonnages.
11 Fidélité
11.1 Généralités
Les détails de l’essai interlaboratoires relatif à la fidélité de la méthode sont résumés dans les Annexes A
et B. Les valeurs dérivées de cet essai peuvent ne pas être applicables aux plages de concentrations de
l’analyte et/ou aux matrices autres que celles données dans les Annexes A et B.
11.2 Répétabilité
La différence absolue entre deux résultats d’essai individuels obtenus sur un produit d’essai identique
par un opérateur utilisant le même appareillage pendant le laps de temps le plus court possible ne doit
pas dépasser la limite de répétabilité r dans plus de 5 % des cas.
Les valeurs de galactose, glucose, fructose, saccharose, lactose et maltose sont indiquées dans
les Tableaux 6 à 11, respectivement.
Tableau 6 — Valeurs pour le galactose
Valeur moyenne Limite de répétabilité Matériau d’essai
x = 0,70 g/100 g r = 0,03 g/100 g Yaourt à boire sucré
x = 0,10 g/100 g
r = 0,02 g/100 g Formule infantile du commerce
x = 2,14 g/100 g
r = 0,07 g/100 g Lait UHT à faible teneur en lactose (échantillon de référence MUVA)
x = nd r = nd Formule infantile (échantillon de référence MUVA)
x = 0,40 g/100 g r = 0,03 g/100 g Fromage à la crème (échantillon de référence MUVA)
x = 0,60 g/100 g r = 0,02 g/100 g Lactosérum en poudre (échantillon de référence MUVA)
x = 0,24 g/100 g r = 0,02 g/100 g Fromage fondu (échantillon de référence MUVA)
x = nd
r = nd Lait concentré sucré
x = nd
r = nd Formule infantile (matériau de référence certifi
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.
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