ISO 2963:1997
(Main)Cheese and processed cheese products — Determination of citric acid content — Enzymatic method
Cheese and processed cheese products — Determination of citric acid content — Enzymatic method
Fromages et fromages fondus — Détermination de la teneur en acide citrique — Méthode enzymatique
La présente Norme internationale prescrit une méthode enzymatique pour la détermination de la teneur en acide citrique des fromages et des fromages fondus. ATTENTION - Des résultats reproductibles ne seront obtenus que si de bonnes pratiques de laboratoire (BPL) pour l'analyse enzymatique sont strictement appliquées. Ces règles BPL sont donnée en annexe A.
General Information
Relations
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Standards Content (Sample)
Is0
INTERNATIONAL
2963
STANDARD
Second edition
1997-03-l 5
Cheese and processed cheese products -
Determination of citric acid content -
Enzymatic method
DBtermina tion de la teneur en acide
Fromages et fromages fondus -
citrique - Mkthode enzymatique
Reference number
IS0 2963: 1997(E)
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0 IS0
IS0 2963: 1997(E)
Foreword
IS0 (the international Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (IS0
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through IS0 technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. IS0 collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft Intern ational Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voti
w
Publication as an I nternational Standard requi res approval by at least 75 % of the me mber bodies casting a vote.
International Standard IS0 2963 was prepared by Technical Committee lSO/TC 34, Agricultural food products,
Subcommittee SC 5, Milk and milk products, in collaboration with the International Dairy Federation (IDF) and the
AOAC INTERNATIONAL, and will also be published by these organizations.
This second edition cancels and replaces the first edition (IS0 2963:1974), which has been technically revised.
Annex A forms an integral part of this International Standard. Annexes B and C are for information only.
0 IS0 1997
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and
microfilm, without permission in writing from the publisher.
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Printed in Switzerland
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INTERNATIONAL STANDARD o IS0
Cheese and processed cheese products - Determination of citric
- Enzymatic method
acid content
1 Scope
This International Standard specifies an enzymatic method for the determination of the citric acid content of cheese
and processed cheese products.
CAUTION - Reliable results will only be obtained if the Good Laboratory Practice (GLP) rules for enzymatic
analyses are applied strictly. These GLP rules are given in annex A.
2 Definition
For the purposes of this International Standard, the following definition applies.
2.1 citric acid content: Mass fraction of substances, determined by the procedure specified in this International
Standard. It is expressed as a percentage by mass.
3 Principle
Treatment of an extract of the sample with the following enzymes and biochemical substances:
- citrate lyase (CL) to convert citric acid to oxaloacetate and acetate;
- malate dehydrogenase (MDH) and lactate dehydrogenase (LDH) in the presence of reduced nicotinamide-
adenine dinucleotide (NADH) to catalyse the reduction of oxaloacetate and its decarboxylation product, pyruvate, to
L-malate and L-lactate, respectively, with subsequent conversion of NADH to this oxidized form (NAD+).
Determination of the decrease in concentration of NADH by measurement of the absorbance of the test solution at
340 nm. The citric acid content is proportional to the decrease in NADH concentration.
4 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and (glass-) distilled or demineralized
water or water of equivalent purity. Use double (glass-) distilled water for the preparation of the enzyme solutions.
4.1 Trichloroacetic acid solution
Dissolve 200 g of trichloroacetic acid (CCICOOH) in water, and dilute with water to 1 000 ml. Mix the solution.
4.2 Sodium hydroxide solution A, c(NaOH) = 50 mol/l.
Dissolve 200,O g of sodium hydroxide in water in a 1 000 ml volumetric flask (5.5), and dilute to 1 000 ml with water.
Mix the solution.
4.3 Sodium hydroxide solution B, c(NaOH) = I,0 mol/l.
Dissolve 40,O g of sodium hydroxide in water in a 1 000 ml volumetric flask (5.5), and dilute to 1 000 ml with water.
Mix the solution.
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4.4 Sodium hydroxide solution C, c(NaOH) = 0,l mol/l.
Dissolve 4,0 g of sodium hydroxide in water in a 1 000 ml volumetric flask (5.5), and dilute to 1 000 ml with water.
Mix the solution.
4.5 Zinc chloride solution (ZnClJ
Dissolve 0,80 g of zinc chloride in water in a 1 000 ml volumetric flask (5.5), and dilute to 1 000 ml with water. Mix
the solution.
4.6 Buffer solution, pH = 7,8.
Dissolve 71,3 g of glycylglycine (H,NCH,CONHCH,CO,H) in about 700 ml of water in a 1 000 ml volumetric flask
(5.5). Adjust the pH to 7,8 with sodium hydroxide solution A (4.2). Add 100 ml of the zinc chloride solution (4.5) and
dilute to 1 000 ml with water. Mix the solution.
If stored in a refrigerator at between 0 “C and + 8 “C, the solution can be kept for 4 weeks.
4.7 Sodium hydrogen carbonate (NaHCO,)
Dissolve 4,0 g of sodium hydrogen carbonate in water in a 1 000 ml volumetric flask (5.5), and dilute to 1 000 ml
with water. Mix the solution.
4.8 Reduced nicotinamide-adenine dinucleotide solution
Dissolve 50 mg of reduced nicotinamide-adenine dinucleotide disodium salt (C,,H,,N,O,,P,Na,) and 100 mg of
sodium hydrogen carbonate (4.7) in IO ml of water.
If stored in a refrigerator at between 0 “C and + 8 “C, the solution can be kept for 4 weeks.
4.9 Ammonium sulfate solution, c[(NH,),SO,] = 3,2 mol/l.
Dissolve 422,4 g of ammonium sulfate in water in a 1 000 ml volumetric flask (5.5), and dilute to 1 000 ml with
water. Mix the solution.
4.10 Malate dehydrogenase/lactate dehydrogenase suspension
Mix sufficient malate dehydrogenase [(MDH) from pig heart; suspension in ammonium sulfate solution (4.9); pH
about 6; EC 1.1.1.37] ‘) and lactate dehydrogenase [(LDH) from rabbit muscle; suspension in ammonium sulfate
solution (4.9); pH about 7; EC 1 .I .I .27]” and dilute with the ammonium sulfate solution so as to obtain a suspension
containing about 600 units ’) of MDH per millilitre and 1 400 units of LDH per millilitre.
If stored in a refrigerator at 0 “C to + 8 “C, the suspension can be kept for 1 year.
4.11 Citrate lyase solution
Dissolve sufficient citrate lyase [Lyophilisate (CL) from Aerobacter aerogenes; EC 4.1.3.61 in ice-cold water, so as to
obtain a solution containing 40 units of CL per millilitre.
If stored in a refrigerator, the solution can be kept for 1 week at between 0 “C and + 8 “C. If stored at - 20 OC, the
solution can be kept for 4 weeks.
l) The EC number refers to the Enzyme Classification Number as given in reference [I].
*) Unit (often called International or Standard Unit) is defined as the amount of enzyme which will catalyse the
transformation of 1 pmol of substrate per minute under standard conditions.
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4.12 Citric acid standard solution
Dissolve 1,600 g of citric acid monohydrate (C,H,O,eH,O) in water in a 1 000 ml volumetric flask (5.5), and dilute
with water to 1 000 ml. Mix the solution.
It is important to take account of the production and expiry dates of the reagents given by the manufacturer.
NOTES
applied with other than the specified activity, the volume of the suspension as
1 If an enzyme suspension is
pipetting scheme (8.5.1) should be increased or decreased proportionally.
2 The reagents as described in 4.5 to 4.12 inclusive may be obtained commercially as a test combination.
5 Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the following.
5.1 Analytical balance, capable of weighing to within 0,l mg.
5.2 pH-meter, accurate to within t 0,l pH unit at 25 “C.
5.3 Glass beakers, of capacity 50 ml.
54 . Macerator, with suitable beaker (Ultra Turax3) or equivalent is suitable).
5.5 One-mark volumetric flasks, of capacity 1 000 ml and 100 ml.
5.6 Pipettes, to deliver 25 ml, IO ml, 5 ml, 2 ml, 1 ml, 0,l ml and 0,02 ml, respectively.
5.7 Graduated pipettes, to deliver IO ml, graduated in 0,l ml divisions.
5.8 Measuring cylinder, of capacity 50 ml.
5.9 Filter funnel, of diameter about 7 cm.
5.10 Filter paper, medium grade, of diameter about 15 cm.
5.11 Spectrometer, capable of measuring at a wavelength of 340 nm, equipped with plastic, glass or quartz cells
of optical path length 1 cm.
5.12 Plastic paddles, capable of mixing the test sample/enzyme mixture in the spectrometer cell.
5.13 Water bath, capable of being maintained at between 20 “C and 25 “C, with rack suitable for holding the
spectrometer cell (5.11) during the incubation period (optional; see 8.5.1).
NOTE 3 Incubation of the cells in the water bath is only necessary if the room temperature is below 20 “C.
6 Sampling
It is important that the laboratory receive a sample which is truly representative and has not been damaged or
changed during transport or storage.
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling method is
given in IS0 707 ’* ‘.
3, Ultra-Turax is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the
convenience of users of this International Standard and does not constitute an endorsement by IS0 of this product.
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7 Preparation of test sample
7.1 Prepare an homogeneous test sample taking care to avoid loss of moisture, using one of the following
procedures.
Cheese
a)
Remove the rind or mouldy surface layer of the cheese in such a way as to provide a sample representative of
the cheese as it is usually consumed. Grind or grate the sample by means of an appropriate device. Mix the
ground or grated mass quickly and, if possible, grind or grate a second time and again mix thoroughly by
intensive stirring and kneading.
Processed cheese
b)
Remove a sample representative of the product. Mix the sample mass quickly and grind it, if necessary, by
means of an appropriate device. Mix thoroughly by intensive stirring and kneading.
Processed cheese containing pieces of other foods (e.g. ham, fruit, nuts, herbs)
C)
Determine whether the objective of the analysis is to determine the citric acid content of the processed cheese
only or of the entire product. Proceed with the entire product as for processed cheese, b). In the former case,
separate the pieces of other food and then proceed as for processed cheese, b).
7.2 Transfer the test sample to a container provided with an airtight lid, for storage prior to analysis. Close the
container immediately. Analysis s.hould be carried out as soon as possible after preparation of the test sample.
8 Procedure
NOTE 4 If it is required to check whether the repeatability is met, carry out two single determinations in accordance with 8.2,
8.4 and 8.5 under repeatability conditions.
8.1 Check test
8.1.1 Carry out the following test to check the recovery of citric acid whenever a new batch of reagents (4.5 to
4.12) is brought into use, or when such reagents have been kept in a refrigerator without being used for more than
2 weeks, or when restarting analytical work after a period of analytical inactivity, or whenever conditions may justify
such a test.
8.1.2 Pipette into each of two 100 ml volumetric flasks (5.5), 5,0 ml and IO,0 ml of the citric acid standard solution
(4.12) respectively. Add to each flask IO ml of the trichloroacetic acid solution (4.1). Dilute the contents of each to
100 ml and swirl to mix. Determine the citric acid content of both solutions as described in 8.4.3 to 8.5.3 inclusive.
The test shall be repeated until satisfactory results are obtained.
8.2 Test portion
Weigh 1 g or more of the prepared test sample (clause 7), to the nearest 0,l mg, into the macerator beaker (5.4).
8.3 Blank test
Carry out a blank test in duplicate, proceeding as specified in 8.4 and 8.5, using all reagents but omitting the test
portion.
8.4 Preparation of suspension and deproteination
8.4.1 Suspend the test portion in about 50 ml of warm water (40 “C to 50 “C) using the macerator (5.4). Transfer
the contents of the beaker quantitatively into a 100 ml volumetric flask (5.5). Cool the contents of the flask to about
20 “C.
8.4.2 Add to the suspension 10 ml of the trichloroacetic acid (4.1). Dilute to the mark with water, mix thoroughly
and let the mixture stand for 30 min. Do not remix the contents of the volumetric flask prior to filtration.
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8.4.3 Filter the supernatant liquid through a filter paper (5.10), discarding the first few millilitres of the filtrate.
8.4.4 Pipette 25 ml of the filtrate into a beaker (5.3) and adjust the pH to approximately 4 by addition of the sodium
hydroxide solution B (4.3) and subsequently to approximately 8 by addition of the sodium hydroxide solution C (4.4),
using the pH-meter (5.2).
Transfer the contents of the beaker quantitatively to a 100 ml volumetric flask (5.5). Dilute to the mark with water
and mix.
8.4.5 Filter through a filter paper (5.10), discarding the first few millilitres of the filtrate.
8.5 Determination
8.5.1 Carry out the determination according to the following scheme, taking care to bring the buffer solution (4.6)
and the water to be used to room temperature just before use.
Pipette into the spectrometer cells:
a)
For determination For blank test
of test portion or
for check test
Buffer sollution (4.6) I,00 ml I,00 ml
NADH solution (4.8) OJO ml OJO ml
MDH/LDH suspension 0,02 ml 0,02 ml
(4.10)
-
Test or check-test filtrate 2,00 ml
Blank-test filtrate 2,00 ml
b) Mix the contents of the cells, using the plastic paddles (5.12) and incubate the solutions in the water bath (5.13)
for 5 min at a temperature between 20 “C and 25 “C. Measure the absorbance 4 of the solution in each cell,
against air, using the spectrometer (5.11) at a wavelength of 340 nm.
Add 0,02 ml citrate lyase (4.7) for the determination of the test portion or for the check test or the blank test.
c)
d) Mix the contents of the cells and incubate the solutions in the water bath (5.13) for IO min at a temperature
between 20 “C and 25 “C.
Measure the absorbance A,, of the solution in each c
...
NORME SO
INTERNATIONALE
2963
Deuxième édition
1997-03-I 5
Fromages et fromages fondus -
Détermination de la teneur en acide
Méthode enzymatique
citrique -
Cheese and processed cheese products - Determination of citric acid
content - Enzymatic method
Numéro de référence
ISO 2963: 1997(F)
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ISO 2963: 1997(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
La Norme internationale ISO 2963 a été élaborée par le comité technique ISOTTC 34, Produits agricoles
alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers, en collaboration avec la Fédération internationale de laiterie
(FIL) et I’AOAC INTERNATIONAL et sera également publiée par ces organismes.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 2963:1974), dont elle constitue une révision
technique.
intégrante Norme internationale. Les annexes B et C sont données uniquement
L’annexe A fait partie de la présente
à titre d’information.
0 ISO 1997
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
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Imprimé en Suisse
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NORME INTERNATIONALE o 1% ISO 2963: 1997(F)
Fromage et fromages fondus - Détermination de la teneur en
acide citrique - Méthode enzymatique
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale prescrit une méthode enzymatique pour la détermination de la teneur en acide
citrique des fromages et des fromages fondus.
ATTENTION - Des résultats reproductibles ne seront obtenus que si de bonnes pratiques de laboratoire (BPL)
pour l’analyse enzymatique sont strictement appliquées. Ces règles BPL sont donnée en annexe A.
2 Définition
Pour les besoins de la présente Norme internationale, la définition suivante s’applique.
2.1 teneur en acide citrique: Fraction massique des substances, déterminée par la méthode prescrite dans la
présente Norme internationale. Elle est exprimée en pourcentage en masse.
3 Principe
Traitement d’un extrait d’échantillon par les enzymes et les substances biochimique suivantes:
-
citrate lyase (CL) pour convertir l’acide citrique en oxaloacétate et acétate;
-
malate déshydrogénase (MDH) et lactate déshydrogénase (LDH) en présence de nicotinamide-adénine-
dinucléotide réduit (NADH) pour catalyser la réduction de I’oxaloacétate et de son produit de décarboxylation, le
pyruvate, en L-malate et L-lactate respectivement avec la conversion simultanée de NADH en sa forme oxydée
(NAD+).
Détermination de la diminution de concentration de NADH en mesurant I’absorbance de la solution d’essai à
340 mm. La teneur en acide citrique est proportionnelle à cette diminution de concentration de NADH.
4 Réactifs
Sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue, et de l’eau distillée dans le
verre ou déminéralisée ou de pureté équivalente. Utiliser de l’eau bidistillée dans le verre pour la préparation des
solutions enzymatiques.
4.1 Acide trichloroacétique, solution.
Dissoudre 200 g d’acide trichloroacétique (CCIJOOH) dans l’eau et compléter à 1 000 ml avec de l’eau. Mélanger
la solution.
4.2 Hydroxyde de sodium, solution A, c(NaOH) = 5,O mol/l.
Dissoudre 200,O g d’hydroxyde de sodium dans l’eau dans une fiole jaugée de 1 000 ml (5.5) et compléter à
1 000 ml avec de l’eau. Mélanger la solution.
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4.3 Hydroxyde de sodium, solution B, c(NaOH) = 1,0 mol/l.
Dissoudre 40,O g d’hydroxyde de sodium dans l’eau dans une fiole jaugée de 1 000 ml (5.5) et compléter à 1 000 ml
avec de l’eau. Mélanger la solution.
4.4 Hydroxyde de sodium, solution C, c(NaOH) = 0,l mol/l.
Dissoudre 4,0 g d’hydroxyde de sodium dans l’eau dans une fiole jaugée de 1 000 ml (5.5) et compléter à 1 000 ml
avec de l’eau. Mélanger la solution.
4.5 Chlorure de zinc, solution
Dissoudre 0,80 g de chlorure de zinc (ZnCI,) dans l’eau dans une fiole jaugée de 1 000 ml (5.5) et compléter à
1 000 ml avec de l’eau. Mélanger la solution.
4.6 Solution tampon, de pH = 7,8.
Dissoudre 71,3 g de glycylglycine (H,NCH,CONHCH,CO,H) dans environ 700 ml d’eau dans une fiole jaugée de
1 000 ml (5.5). Ajuster à pH 7,8 avec la solution A d’hydroxyde de sodium (4.2). Ajouter 100 ml de solution de
chlorure de zinc (4.5) et compléter à 1 000 ml avec de l’eau. Mélanger la solution.
Cette solution peut être conservée pendant 4 semaines si elle est conservée au réfrigérateur entre 0 OC et +- 8 OC.
4.7 Hydrogénocarbonate de sodium, solution
Dissoudre 4,0 g d’hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO,) dans l’eau dans une fiole jaugée de 1 000 ml (5.5) et
compléter à 1 000 ml avec de l’eau. Mélanger la solution.
4.8 Solution de nicotinamide-adénine-dinucléotide réduit (NADH)
Dissoudre 50 mg de sel disodique de nicotinamide-adénine-dinucléotide réduit (C,,H,,N,O,,P,Na,) et 100 mg
d’hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO,) dans 10 ml d’eau.
Cette solution peut être conservée pendant 4 semaines si elle est conservée au réfrigérateur entre 0 OC et + 8 OC.
4.9 Sulfate d’ammonium, solution, c[ (NH& SCd] = 3,2 mol/l.
Dissoudre 422,4 g de sulfate d’ammonium dans l’eau dans une fiole jaugée de 1 000 ml (5.5) et compléter à
1 000 ml avec de l’eau. Mélanger la solution.
4.10 Suspension de malate déshydrogénase/lactate déshydrogénase (MDH/LDH)
Mélanger des quantités équivalentes de malate déshydrogénase [MDH extraite de cœur de porc; suspension dans
une solution de sulfate d’ammonium (4.9); pH d’environ 6; EC 1 .1.1.37]‘) et de lactate déshydrogénase [LDH de
muscle de lapin; suspension dans une solution de sulfate d’ammonium (4.9); pH d’environ 7; EC 1 .l .1.27]” et diluer
avec la solution de sulfate d’ammonium de manière à obtenir une suspension contenant environ 600 unités’) de
MDH par millilitre et 1 400 unités de LDH par millilitre.
Cette suspension peut être conservée pendant un an si elle est conservée au réfrigérateur entre 0 “C et + 8 OC.
‘) Le nombre EC renvoie au nombre de la Classification des Enzymes, tel qu’il figure dans la publication [Il.
*) Cette unité (appelée fréquemment unité internationale ou unité standard) équivaut à la quantité d’enzymes
nécessaire pour catalyser la transformation de 1 pmol de substrat par minute dans des conditions normalisées.
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4.11 Citrate lyase, solution
Dissoudre suffisamment de citrate lyase [lyophilisat (CL) provenant d’Ae&acfer aerogenes; EC 4.1.3.61 dans de
l’eau glacée, de manière à obtenir une solution contenant 40 unités de CL par millilitre.
Cette solution peut être conservée pendant une semaine entre 0 “C et + 8 “C et pendant 4 semaines à - 20 “C.
4.12 Acide citrique, solution étalon
Dissoudre 1,600 g d’acide citrique monohydraté (C,H,O,,H,O) dans de l’eau dans une fiole jaugée de 1 000 ml (5.5)
et compléter à 1 000 ml avec de l’eau. Mélanger la solution.
II est important de tenir compte des dates de fabrication et de péremption des réactifs données par le fabricant.
NOTES
une activité différente de celle prescrite, il convient que le volume
1 Si une suspension e nzymatique est utilisée à
enté ou diminué proportionnellement.
suspe Insion indiqué dans le schéma 8.51 soit augm
2 Les réactifs tels que décrits en 4.5 à 4.12 inclus peuvent être obtenus dans le commerce sous forme d’un ensemble pour
essais.
5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
51 . Balance analytique, précise à t 0,l mg.
. pH-mètre, précis à _ + 0 , 1 unité de pH à 25 OC.
52
5.3 Béchers en verre, de 50 ml de capacité.
54 . Homogénéisateur, avec bécher adapté (I’UItra-Turax”) ou un équivalent convient).
55 . Fioles jaugées à un trait, de 1 000 ml et 100 ml de capacité.
. Pipettes, de 25 ml, 10 ml, 5 ml, 2 ml, 1 ml, 0,l ml et 0,02 ml de capacité.
56
57 . Pipettes graduées, de 10 ml de capacité, graduées en 0,l ml.
58 . Éprouvette graduée, de 50 ml de capacité.
5.9 Entonnoir à filtre, d’environ 7 cm de diamètre.
5.10 Papier filtre, de porosité moyenne, d’environ 15 cm de diamètre.
5.11 Spectromètre, capable d’effectuer des mesures à 340 nm et équipé de cellules en verre ou en quartz de
1 cm de parcours optique.
5.12 Spatules en plastique, destinées à agiter le mélange échantillon pour essai/enzyme dans la cellule du
spectromètre.
3, Ultra-Turax est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à
l’intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que I’ISO approuve ou
recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné.
3
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5.13 Bain d’eau, réglable entre 20 OC et 25 OC, équipé d’un support adéquat pour maintenir la cellule du
spectromètre (5.11) durant la période d’incubation (facultatif; voir 8.5.1).
NOTE 3 L’incubation des cellules dans le bain d’eau n’est nécessaire que si la température de la pièce est en dessous de
20 “C.
6 Échantillonnage
II est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou modifié lors
du transport et de l’entreposage.
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode prescrite dans la présente Norme internationale. Une méthode
d’échantillonnage recommandée est donnée dans I’ISO 707’21.
7 Préparation de l’échantillon pour essai
7.1 Préparer un échantillon pour essai homogène, en évitant des pertes d’humidité, en utilisant l’une des méthodes
suivantes.
a) Fromage
Enlever la croûte ou la surface moisie du fromage de manière à obtenir un échantillon représentatif du fromage
tel qu’il est ordinairement consommé. Moudre ou râper l’échantillon avec un instrument approprié. Mélanger
rapidement la masse moulue ou râpée et, si possible, moudre ou râper une seconde fois et mélanger bien à
nouveau en agitant et en malaxant énergiquement.
b) Fromage fondu
Prélever un échantillon représentatif du produit. Mélanger rapidement la masse de l’échantillon et le moudre, si
nécessaire, avec un instrument approprié. Mélanger bien en malaxant énergiquement.
c) Fromage fondu contenant des morceaux d’autres aliments (par exemple jambon, fruits, noix, fines herbes)
Constater si l’objectif de l’analyse est de doser l’acide citrique dans le fromage fondu proprement dit ou dans le
produit entier. Procéder avec le produit entier comme dans le cas du fromage fondu, b). Dans le premier cas,
séparer les morceaux de l’autre aliment et procéder comme dans le cas du fromage fondu, b).
7.2 Placer l’échantillon dans un récipient pourvu d’un couvercle parfaitement étanche à l’air, pour le conserver
avant l’analyse. Fermer le récipient immédiatement. II convient d’effectuer l’analyse le plus vite possible après la
préparation de l’échantillon.
8 Mode opératoire
NOTE 4 S’il y a lieu de vérifier si l’expérience de répétabilité est satisfaite, effectuer deux déterminations séparées
conformément à 8.2, 8.4 et 8.5 dans les conditions de répétabilité.
8.1 Essai de contrôle
8.1 .l Lorsqu’un nouveau lot de réactifs (4.5 à 4.12) est utilisé, ou lorsque ces réactifs ont été conservés au
réfrigérateur sans utilisation pendant plus de 2 semaines, ou lorsque les analyses sont reprises après une période
d’inactivité, ou chaque fois que les conditions peuvent le justifier, procéder à un essai de contrôle de l’acide citrique
de la façon suivante.
8.1.2 Introduire, au moyen d’une pipette, dans chacune des deux fioles jaugées de 100 ml (5.5), respectivement
5,0 ml et 10,O ml de la solution étalon d’acide citrique (4.12). Ajouter dans chaque fiole 10 ml de solution d’acide
trichloroacétique (4.1). Compléter le contenu de chaque fiole à 100 ml avec de l’eau et mélanger. Déterminer la
teneur en acide citrique de chacune des deux solutions comme décrit en 8.4.3 à 8.5.3 inclus.
L’essai doit être répéter jusqu’à obtenir des résultats satisfaisants.
4
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8.2 Prise d’essai
Peser, à 0,l mg près, 1 g ou plus de l’échantillon pour essai préparé (article 7) dans le bécher de I’homogénéisateur
.
(5.4).
8.3 Essai à blanc
Effectuer un essai à blanc en double, en procédant comme décrit en 8.4 et 8.5, en utilisant tous les réactifs, mais
sans la prise d’essai.
8.4 Préparation de la suspension et défécation
8.4.1 Mettre en suspension la prise d’essai dans environ 50 ml d’eau chaude (40 “C à 50 “C) en utilisant
I’homogénéisateur (5.4). Transférer quantitativement le contenu du bécher dans une fiole jaugée de 100 ml (5.5).
Refroidir le contenu de la fiole jusqu’à environ 20 “C.
8.4.2 Ajouter à la suspension 10 ml d’acide trichloroacétique (4.1). Compléter au volume avec de l’eau, mélanger
vigoureusement et laisser la préparation reposer pendant 30 min. Ne pas remélanger le contenu de la fiole avant la
filtration.
8.4.3 Filtrer le liquide surnageant à travers un papier filtre (5.10), en rejetant les premiers millilitres du filtrat.
8.4.4 Prélever, à la pipette, 25 ml de filtrat dans un bécher (5.3) et ajuster le pH à environ 4 par addition de la
solution B d’hydroxyde de sodium (4.3) et ensuite ajuster le pH à environ 8 par addition de la solution C d’hydroxyde
de sodium (4.4) en utilisant le pH-mètre (5.2).
Transférer quantitativement le contenu du bécher dans une fiole jaugée de 100 ml (5.5). Compléter au volume avec
de l’eau et mélanger.
8.4.5 Filtrer à travers un papier filtre (5.10), en rejetant les premiers millilitres de filtrat.
8.5 Détermination
8.5.1 Effectuer la détermination selon le schéma ci-dessous, en ayant soin d’amener la solution tampon (4.6) et
l’eau à la température ambiante juste avant d’être utilisés.
Pipeter dans les cellules du spectromètre
a)
Pour l’essai à blanc
Pour la détermination de
la prise d’essai ou
pour l’essai de contrôle
Solution tampon (4.6) 1,00 ml 1,00 ml
Solution de NADH (4.8) 0,lO ml 0,lO ml
Suspension de MDH/LDH 0,02 ml 0,02 ml
(4.10)
-
Filtrat de la prise d’essai ou 2,00 ml
de l’essai de contrôle
-
Filtrat de l’essai à blanc 2,00 ml
b) Mélanger le contenu des cellules en utilisant les spatules en plastique (5.12) et incuber les solutions dans le
bain d’eau (5.13) pendant 5 min à une température comprise entre 20 “C et 25 “C. Mesurer I’absorbance ~~ de
la solution dans chaque cellule par rapport à l’air à l’aide du spectromètre (5.11) à une longueur d’onde de
340 nm.
5
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0 os0
ISO 2963: 1997(F)
Ajouter 0,02 ml de solution de citrate lyase (4.11) pour la détermination de la prise d’essai ou de l’essai de
C)
contrôle ou de l’essai à blanc.
d) Mélanger le contenu des cellules et incuber les solutions pendant 10 min à une température comprise entre
20 OC et 25 OC.
Mesurer I’absorbance A,, de la solution dans chaque cellule par rapport à l’air.
e)
8.5.2 Calculer l’absorbante A du contenu de chaque cellule, valeur nécessaire pour le calcul de la teneur en
acide citrique (9.1) au moyen de l’équation (1).
. . .
A = A,--A,,
(1)
Où
est I’absorbance mesurée avant addition de citrate lyase;
AO
A,o e
...
NORME SO
INTERNATIONALE
2963
Deuxième édition
1997-03-I 5
Fromages et fromages fondus -
Détermination de la teneur en acide
Méthode enzymatique
citrique -
Cheese and processed cheese products - Determination of citric acid
content - Enzymatic method
Numéro de référence
ISO 2963: 1997(F)
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ISO 2963: 1997(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
L’ISO collabore étroitement avec la Commission
liaison avec I’ISO participent également aux travaux.
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
La Norme internationale ISO 2963 a été élaborée par le comité technique ISOTTC 34, Produits agricoles
alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers, en collaboration avec la Fédération internationale de laiterie
(FIL) et I’AOAC INTERNATIONAL et sera également publiée par ces organismes.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 2963:1974), dont elle constitue une révision
technique.
L’annexe A fait partie intégrante de la présente Norme internationale. Les annexes B et C sont données uniquement
à titre d’information.
0 ISO 1997
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 l CH-121 1 Genève 20 l Suisse
Internet central @ iso.ch
x.400 c=ch; a=40Onet; p=iso; o=isocs; s=central
Imprimé en Suisse
ii
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NORME INTERNATIONALE o 1% ISO 2963: 1997(F)
Fromage et fromages fondus - Détermination de la teneur en
acide citrique - Méthode enzymatique
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale prescrit une méthode enzymatique pour la détermination de la teneur en acide
citrique des fromages et des fromages fondus.
ATTENTION - Des résultats reproductibles ne seront obtenus que si de bonnes pratiques de laboratoire (BPL)
pour l’analyse enzymatique sont strictement appliquées. Ces règles BPL sont donnée en annexe A.
2 Définition
Pour les besoins de la présente Norme internationale, la définition suivante s’applique.
2.1 teneur en acide citrique: Fraction massique des substances, déterminée par la méthode prescrite dans la
présente Norme internationale. Elle est exprimée en pourcentage en masse.
3 Principe
Traitement d’un extrait d’échantillon par les enzymes et les substances biochimique suivantes:
-
citrate lyase (CL) pour convertir l’acide citrique en oxaloacétate et acétate;
-
malate déshydrogénase (MDH) et lactate déshydrogénase (LDH) en présence de nicotinamide-adénine-
dinucléotide réduit (NADH) pour catalyser la réduction de I’oxaloacétate et de son produit de décarboxylation, le
pyruvate, en L-malate et L-lactate respectivement avec la conversion simultanée de NADH en sa forme oxydée
(NAD+).
Détermination de la diminution de concentration de NADH en mesurant I’absorbance de la solution d’essai à
340 mm. La teneur en acide citrique est proportionnelle à cette diminution de concentration de NADH.
4 Réactifs
Sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue, et de l’eau distillée dans le
verre ou déminéralisée ou de pureté équivalente. Utiliser de l’eau bidistillée dans le verre pour la préparation des
solutions enzymatiques.
4.1 Acide trichloroacétique, solution.
Dissoudre 200 g d’acide trichloroacétique (CCIJOOH) dans l’eau et compléter à 1 000 ml avec de l’eau. Mélanger
la solution.
4.2 Hydroxyde de sodium, solution A, c(NaOH) = 5,O mol/l.
Dissoudre 200,O g d’hydroxyde de sodium dans l’eau dans une fiole jaugée de 1 000 ml (5.5) et compléter à
1 000 ml avec de l’eau. Mélanger la solution.
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0 ISO
ISO 2963: 1997(F)
4.3 Hydroxyde de sodium, solution B, c(NaOH) = 1,0 mol/l.
Dissoudre 40,O g d’hydroxyde de sodium dans l’eau dans une fiole jaugée de 1 000 ml (5.5) et compléter à 1 000 ml
avec de l’eau. Mélanger la solution.
4.4 Hydroxyde de sodium, solution C, c(NaOH) = 0,l mol/l.
Dissoudre 4,0 g d’hydroxyde de sodium dans l’eau dans une fiole jaugée de 1 000 ml (5.5) et compléter à 1 000 ml
avec de l’eau. Mélanger la solution.
4.5 Chlorure de zinc, solution
Dissoudre 0,80 g de chlorure de zinc (ZnCI,) dans l’eau dans une fiole jaugée de 1 000 ml (5.5) et compléter à
1 000 ml avec de l’eau. Mélanger la solution.
4.6 Solution tampon, de pH = 7,8.
Dissoudre 71,3 g de glycylglycine (H,NCH,CONHCH,CO,H) dans environ 700 ml d’eau dans une fiole jaugée de
1 000 ml (5.5). Ajuster à pH 7,8 avec la solution A d’hydroxyde de sodium (4.2). Ajouter 100 ml de solution de
chlorure de zinc (4.5) et compléter à 1 000 ml avec de l’eau. Mélanger la solution
Cette solution peut être conservée pendant 4 semaines si elle est conservée au réfrigérateur entre 0 OC et +- 8 OC.
4.7 Hydrogénocarbonate de sodium, solution
Dissoudre 4,0 g d’hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO,) dans l’eau dans une fiole jaugée de 1 000 ml (5.5) et
compléter à 1 000 ml avec de l’eau. Mélanger la solution.
4.8 Solution de nicotinamide-adénine-dinucléotide réduit (NADH)
Dissoudre 50 mg de sel disodique de nicotinamide-adénine-dinucléotide réduit (C,,H,,N,O,,P,Na,) et 100 mg
d’hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO,) dans 10 ml d’eau.
Cette solution peut être conservée pendant 4 semaines si elle est conservée au réfrigérateur entre 0 “C et + 8 OC.
4.9 Sulfate d’ammonium, solution, #(NH& SO,] = 3,2 mol/l.
Dissoudre 422,4 g de sulfate d’ammonium dans l’eau dans une fiole jaugée de 1 000 ml (5.5) et compléter à
1 000 ml avec de l’eau. Mélanger la solution.
4.10 Suspension de malate déshydrogénase/lactate déshydrogénase (MDH/LDH)
Mélanger des quantités équivalentes de malate déshydrogénase [MDH extraite de cœur de porc; suspension dans
une solution de sulfate d’ammonium (4.9); pH d’environ 6; EC 1 .l .1.37]‘) et de lactate déshydrogénase [LDH de
muscle de lapin; suspension dans une solution de sulfate d’ammonium (4.9); pH d’environ 7; EC 1 .l .1.27]” et diluer
avec la solution de sulfate d’ammonium de manière à obtenir une suspension contenant environ 600 unités”) de
MDH par millilitre et 1 400 unités de LDH par millilitre.
Cette suspension peut être conservée pendant un an si elle est conservée au réfrigérateur entre 0 “C et + 8 “C.
‘) Le nombre EC renvoie au nombre de la Classification des Enzymes, tel qu’il figure dans la publication [Il.
*) Cette unité (appelée fréquemment unité internationale ou unité standard) équivaut à la quantité d’enzymes
nécessaire pour catalyser la transformation de 1 kmol de substrat par minute dans des conditions normalisées.
2
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ISO 2963: 1997(F)
4.11 Citrate lyase, solution
.
Dissoudre suffisamment de citrate lyase [lyophilisat (CL) provenant d’Ae&acfer aerogenes; EC 4.1.3.61 dans de
l’eau glacée, de manière à obtenir une solution contenant 40 unités de CL par millilitre.
Cette solution peut être conservée pendant une semaine entre 0 “C et + 8 “C et pendant 4 semaines à - 20 “C.
4.12 Acide citrique, solution étalon
Dissoudre 1,600 g d’acide citrique monohydraté (C,H,O,,H,O) dans de l’eau dans une fiole jaugée de 1 000 ml (5.5)
et compléter à 1 000 ml avec de l’eau. Mélanger la solution.
II est important de tenir compte des dates de fabrication et de péremption des réactifs données par le fabricant.
NOTES
1 Si une suspension enzymatique est utilisée à une activité différente de celle prescrite, il convient que le volume de
suspension indiqué dans le schéma 8.51 soit augmenté ou diminué proportionnellement.
2 Les réactifs tels que décrits en 4.5 à 4.12 inclus peuvent être obtenus dans le commerce sous forme d’un ensemble pour
essais.
5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
51 . Balance analytique, précise à t 0,l mg.
. pH-mètre, précis à _ + 0 , 1 unité de pH à 25 OC.
52
5.3 Béchers en verre, de 50 ml de capacité.
54 . Homogénéisateur, avec bécher adapté (I’UItra-Turax”) ou un équivalent convient).
55 . Fioles jaugées à un trait, de 1 000 ml et 100 ml de capacité.
. Pipettes, de 25 ml, 10 ml, 5 ml, 2 ml, 1 ml, 0,l ml et 0,02 ml de capacité.
56
57 . Pipettes graduées, de 10 ml de capacité, graduées en 0,l ml.
58 . Éprouvette graduée, de 50 ml de capacité.
5.9 Entonnoir à filtre, d’environ 7 cm de diamètre.
5.10 Papier filtre, de porosité moyenne, d’environ 15 cm de diamètre.
5.11 Spectromètre, capable d’effectuer des mesures à 340 nm et équipé de cellules en verre ou en quartz de
1 cm de parcours optique.
5.12 Spatules en plastique, destinées à agiter le mélange échantillon pour essai/enzyme dans la cellule du
spectromètre.
3, Ultra-Turax est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à
l’intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que I’ISO approuve ou
recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné.
3
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5.13 Bain d’eau, réglable entre 20 OC et 25 OC, équipé d’un support adéquat pour maintenir la cellule du
spectromètre (5.11) durant la période d’incubation (facultatif; voir 8.5.1).
NOTE 3 L’incubation des cellules dans le bain d’eau n’est nécessaire que si la température de la pièce est en dessous de
20 “C.
6 Échantillonnage
II est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou modifié lors
du transport et de l’entreposage.
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode prescrite dans la présente Norme internationale. Une méthode
d’échantillonnage recommandée est donnée dans I’ISO 707’21.
7 Préparation de l’échantillon pour essai
7.1 Préparer un échantillon pour essai homogène, en évitant des pertes d’humidité, en utilisant l’une des méthodes
suivantes.
a) Fromage
Enlever la croûte ou la surface moisie du fromage de manière à obtenir un échantillon représentatif du fromage
tel qu’il est ordinairement consommé. Moudre ou râper l’échantillon avec un instrument approprié. Mélanger
rapidement la masse moulue ou râpée et, si possible, moudre ou râper une seconde fois et mélanger bien à
nouveau en agitant et en malaxant énergiquement.
b) Fromage fondu
Prélever un échantillon représentatif du produit. Mélanger rapidement la masse de l’échantillon et le moudre, si
nécessaire, avec un instrument approprié. Mélanger bien en malaxant énergiquement.
c) Fromage fondu contenant des morceaux d’autres aliments (par exemple jambon, fruits, noix, fines herbes)
Constater si l’objectif de l’analyse est de doser l’acide citrique dans le fromage fondu proprement dit ou dans le
produit entier. Procéder avec le produit entier comme dans le cas du fromage fondu, b). Dans le premier cas,
séparer les morceaux de l’autre aliment et procéder comme dans le cas du fromage fondu, b).
7.2 Placer l’échantillon dans un récipient pourvu d’un couvercle parfaitement étanche à l’air, pour le conserver
avant l’analyse. Fermer le récipient immédiatement. II convient d’effectuer l’analyse le plus vite possible après la
préparation de l’échantillon.
8 Mode opératoire
NOTE 4 S’il y a lieu de vérifier si l’expérience de répétabilité est satisfaite, effectuer deux déterminations séparées
conformément à 8.2, 8.4 et 8.5 dans les conditions de répétabilité.
8.1 Essai de contrôle
8.1 .l Lorsqu’un nouveau lot de réactifs (4.5 à 4.12) est utilisé, ou lorsque ces réactifs ont été conservés au
réfrigérateur sans utilisation pendant plus de 2 semaines, ou lorsque les analyses sont reprises après une période
d’inactivité, ou chaque fois que les conditions peuvent le justifier, procéder à un essai de contrôle de l’acide citrique
de la façon suivante.
8.1.2 Introduire, au moyen d’une pipette, dans chacune des deux fioles jaugées de 100 ml (5.5), respectivement
5,0 ml et 10,O ml de la solution étalon d’acide citrique (4.12). Ajouter dans chaque fiole 10 ml de solution d’acide
trichloroacétique (4.1). Compléter le contenu de chaque fiole à 100 ml avec de l’eau et mélanger. Déterminer la
teneur en acide citrique de chacune des deux solutions comme décrit en 8.4.3 à 8.5.3 inclus.
L’essai doit être répéter jusqu’à obtenir des résultats satisfaisants.
4
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8.2 Prise d’essai
Peser, à 0,l mg près, 1 g ou plus de l’échantillon pour essai préparé (article 7) dans le bécher de I’homogénéisateur
.
(5.4).
8.3 Essai à blanc
Effectuer un essai à blanc en double, en procédant comme décrit en 8.4 et 8.5, en utilisant tous les réactifs, mais
sans la prise d’essai.
8.4 Préparation de la suspension et défécation
8.4.1 Mettre en suspension la prise d’essai dans environ 50 ml d’eau chaude (40 “C à 50 “C) en utilisant
I’homogénéisateur (5.4). Transférer quantitativement le contenu du bécher dans une fiole jaugée de 100 ml (5.5).
Refroidir le contenu de la fiole jusqu’à environ 20 “C.
8.4.2 Ajouter à la suspension 10 ml d’acide trichloroacétique (4.1). Compléter au volume avec de l’eau, mélanger
vigoureusement et laisser la préparation reposer pendant 30 min. Ne pas remélanger le contenu de la fiole avant la
filtration.
8.4.3 Filtrer le liquide surnageant à travers un papier filtre (5.10), en rejetant les premiers millilitres du filtrat.
8.4.4 Prélever, à la pipette, 25 ml de filtrat dans un bécher (5.3) et ajuster le pH à environ 4 par addition de la
solution B d’hydroxyde de sodium (4.3) et ensuite ajuster le pH à environ 8 par addition de la solution C d’hydroxyde
de sodium (4.4) en utilisant le pH-mètre (5.2).
Transférer quantitativement le contenu du bécher dans une fiole jaugée de 100 ml (5.5). Compléter au volume avec
de l’eau et mélanger.
8.4.5 Filtrer à travers un papier filtre (5.10), en rejetant les premiers millilitres de filtrat.
8.5 Détermination
8.5.1 Effectuer la détermination selon le schéma ci-dessous, en ayant soin d’amener la solution tampon (4.6) et
l’eau à la température ambiante juste avant d’être utilisés.
Pipeter dans les cellules du spectromètre
a)
Pour l’essai à blanc
Pour la détermination de
la prise d’essai ou
pour l’essai de contrôle
Solution tampon (4.6) 1,00 ml 1,00 ml
Solution de NADH (4.8) 0,lO ml 0,lO ml
Suspension de MDH/LDH 0,02 ml 0,02 ml
(4.10)
-
Filtrat de la prise d’essai ou 2,00 ml
de l’essai de contrôle
-
Filtrat de l’essai à blanc 2,00 ml
b) Mélanger le contenu des cellules en utilisant les spatules en plastique (5.12) et incuber les solutions dans le
bain d’eau (5.13) pendant 5 min à une température comprise entre 20 “C et 25 “C. Mesurer I’absorbance ~~ de
la solution dans chaque cellule par rapport à l’air à l’aide du spectromètre (5.11) à une longueur d’onde de
340 nm.
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c) Ajouter 0,02 ml de solution de citrate lyase (4.11) pour la détermination de la prise d’essai ou de l’essai de
contrôle ou de l’essai à blanc.
d) Mélanger le contenu des cellules et incuber les solutions pendant 10 min à une température comprise entre
20 OC et 25 OC.
e) Mesurer I’absorbance A,, de la solution dans chaque cellule par rapport à l’air.
8.5.2 Calculer l’absorbante A du contenu de chaque cellule, valeur nécessaire pour le calcul de la teneur en
acide citrique (9.1) au moyen de l’équation (1).
A = A,--A,, . . .
(1)
Où
A, est I’absorbance mesurée avant addition de citrate lyase;
A,o est I’absorbance mesurée après
...
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