ISO 11268-3:1999

Soil quality — Effects of pollutants on earthworms — Part 3: Guidance on the determination of effects in field situations

Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre — Partie 3: Lignes directrices relatives à la détermination des effets sur site

General Information

• Status: Withdrawn
• Publication Date: 31-Mar-1999
• Withdrawal Date: 31-Mar-1999
• ICS: 13.080.30 - Biological properties of soils
• Technical Committee: ISO/TC 190/SC 4 - Biological characterization
• Drafting Committee: ISO/TC 190/SC 4/WG 2 - Effects on soil fauna
• Current Stage: 9599 - Withdrawal of International Standard
• Completion Date: 15-Oct-2014

Relations

• Revised: ISO 11268-3:2014 - Soil quality — Effects of pollutants on earthworms — Part 3: Guidance on the determination of effects in field situations
• Effective Date: 06-Nov-2010

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11268-3
First edition
1999-04-01
Soil quality — Effects of pollutants on
earthworms —
Part 3:
Guidance on the determination of effects
in field situations
Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre —
Partie 3: Lignes directrices relatives à la détermination des effets sur site
A
Reference number
ISO 11268-3:1999(E)

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ISO 11268-3:1999(E)
Contents
1 Scope .1
2 Normative references .1
3 Units.1
4 Principle.1
5 Sampling of earthworm populations .2
5.1 General.2
5.2 Formaldehyde extraction method.2
5.3 Mustard extraction method.2
5.4 Electrical extraction method.2
6 Preparation for the test .2
6.1 Test site .2
6.2 Check on efficiency of extraction method .4
7 Procedure .5
7.1 Application of the test substance .5
7.2 Sampling dates .5
7.3 Reference substance.5
8 Test evaluation.6
8.1 Identification of earthworm species .6
8.2 Weighing.6
9 Calculation and expression of results.6
10 Test report .6
Bibliography.8
©  ISO 1999
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means, electronic
or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
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Printed in Switzerland
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ISO 11268-3:1999(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
International Standard ISO 11268-3 was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee
SC 4, Biological methods.
ISO 11268 consists of the following parts, under the general title Soil quality — Effects of pollutants on earthworms
(Eisenia fetida):
 Part 1: Determination of acute toxicity using artificial soil substrate
 Part 2: Determination of effects on reproduction
 Part 3: Guidance on the determination of effects in field situations
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Introduction
This document provides guidance on the evaluation of the effects of substances on earthworm species under field
conditions. Due to the complex character of field tests, modifications will often be necessary depending on
conditions prevailing at specific sites.
These guidelines have been drawn up taking into consideration the results and recommendations of an international
workshop entitled "Ecotoxicology of Earthworms" held in Sheffield, UK, in April 1991 (see Bibliography).
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INTERNATIONAL STANDARD  © ISO ISO 11268-3:1999(E)
Soil quality — Effects of pollutants on earthworms —
Part 3:
Guidance on the determination of effects in field situations
1 Scope
This part of ISO 11268 describes techniques for determining the effects of substances on earthworms in the field,
and provides a basis for determining the effects of chemicals applied to, or incorporated into, soil.
2 Normative references
The following normative documents contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this part of ISO 11268. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, any of these publications
do not apply. However, parties to agreements based on this part of ISO 11268 are encouraged to investigate the
possibility of applying the most recent editions of the normative documents indicated below. For undated
references, the latest edition of the normative document referred to applies. Members of ISO and IEC maintain
registers of currently valid International Standards.
ISO 10390:1994, Soil quality — Determination of pH.
ISO 10694:1995, Soil quality — Determination of organic and total carbon after dry combustion (elemental
analysis).
ISO 11274:1998, Soil quality — Determination of the water-retention characteristic — Laboratory methods.
ISO 11277:1998, Soil quality — Determination of particle size distribution in mineral soil material — Method by
sieving and sedimentation.
3 Units
Rates of application of test substances are expressed as kilograms per hectare (kg/ha) or litres per hectare (l/ha) of
the substance applied. When this is a formulated material, then the application rate is expressed in terms of the
amount of active ingredient applied.
4 Principle
Species and numbers of earthworms collected by sampling plots treated with a test substance are compared with
those collected from treated control and reference plots. The duration of the study depends on the characteristics of
the test substance, but will normally be of one year's duration. Sampling dates are chosen to lie within the periods of
activity of the earthworms.
Sampling provides relative numbers of earthworms, and it is not necessary to attempt to define absolute numbers.
The test is of a completely randomized block design with four replicates. Statistical analysis of numbers of each
species collected at each sampling occasion is used to determine the effects of treatments.
NOTE The test will also generate samples of earthworms from treated plots for residue analysis where such information is
appropriate.
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5 Sampling of earthworm populations
5.1 General
Due to the need to take a large number of samples within the shortest period of time, mechanical extraction
methods such as hand selection, washing out or screen flotation are generally too labour intensive. Mechanical
extraction methods, however, allow samples to be taken when the worms are not active as a result of the weather.
For the purpose of the test described here, mainly formaldehyde extraction (Raw 1959) and the electrical extraction
or Oktett method (Thielemann 1986, Cuendet et al. 1991) may be used. These extraction methods can only be
used when the earthworms are active. To increase the effectiveness of the methods, they may be combined with
hand selection (Lee 1985).
The individual samples are taken in the form of a random distribution over the test plot.
5.2 Formaldehyde extraction method
2 2
A solution of formaldehyde (0,2 %) is applied uniformly at a rate of 5 litres/0,25 m to 10 litres/0,25 m . The
formaldehyde solution is poured onto the test site in 2 to 3 portions according to seepage capacity. The total
duration of extraction is 30 min.
All earthworms coming to the soil surface within the sampling area are collected and put into a preservation liquid
(5 % formol or 70 % alcohol) (see 8.1). After an extraction period of 30 min, the soil surface and the grass cover are
thoroughly searched in order to collect worms so far overlooked (usually small young worms and the slender
species Aporrectodea rosea).
5.3 Mustard extraction method
On the day before the extraction, 60 g of mustard powder are mixed with 1 litre of distilled water. Just before use,
this mustard emulsion is added to 9 litres of distilled water and applied in the same way as the formaldehyde
solution. The remaining procedure is similar to the formaldehyde extraction method described in 5.2.
5.4 Electrical extraction method
In general, electrodes are inserted into the soil at the corners of a test plot, and worms rise to the surface as the
current is applied. There are a number of different devices for electrical extraction, operating under different
conditions (direct current or alternating current, electrode penetration depth, segmentation of electrodes, etc.). The
specific equipment and conditions used should thus be reported. The total duration of the extraction is 30 min. After
the 30 min extraction period, the soil surface should be intensively searched for overlooked worms.
6 Preparation for the test
6.1 Test site
6.1.1 Selection and description
The test should be conducted on a site similar to that where the test substance would normally be applied, or where
a spillage or discharge could occur. The site should be on level ground and should have the same cropping and soil
characteristics throughout.
Grassland and orchards are generally better suited to field studies with earthworms than arable land as they
generally support higher earthworm populations. However, if information on effects on bare soils is required then
arable plots may be used providing that there are at least 20 earthworms per square metre and a reasonable
species diversity is evident.
A suitable grassland test area should have an earthworm density of a least 100 individuals per square metre. With
lower population densities, more samples should be taken than recommended in 6.1.3.
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The experimental plots should support a mixed population of organisms (Bouché 1977) which are generally
representative of the type of environment selected. In agricultural areas for example, important species such as
Lumbricus terrestris and Aporrectodea caliginosa should be present at a sufficiently high density (at least 10 % of
the population) that plots can be taken as representative. Care should be taken not to select plots where
uncharacteristic species predominate.
In order to satisfy these requirements, samples should be taken from prospective plots before the start of the study
for preliminary investigation of species distribution.
Extreme soil types, e.g. very sandy, clay or moory soils, should be avoided when selecting the test site.
A description of the test site should contain the following physico-chemical and biological information:
 soil profile;
 particle-size distribution (ISO 11277);
 organic-carbon content (ISO 10694:1995);
 pH-value (ISO 10390);
 field capacity (in the A-horizon);
 description of vegetation.
Determination of these characteristics should be made using standard methods.
Micro-climate measurements (soil and air temperature, soil moisture, rainfall quantity, sunshine duration) are
particularly important for the period of chemical application, and temperature and rainfall quantity should be
recorded over the year.
The history of the test site should be known (e.g. applications of pesticides, mineral fertilizers, sewage sludge, etc.).
NOTE When a specific chemical is being tested, the site should not have been exposed to a similar chemical during the
last 3 years.
6.1.2 Maintenance of test fields
Grassland fields should be mulched regularly (two to six times per year) in order to keep the grass cover short.
Mulching should be carried out one to two weeks before the application of the test substance to ensure that the
grass on the surface, which will act as a food source for some earthworms, has been in contact with the test
material. The last mulch before application of the test substance may only remain on the field provided it does not
create a coherent grass mat. In the case of mulching over the course of the year, the mulch should remain on the
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 11268-3
Première édition
1999-04-01
Qualité du sol — Effets des polluants
vis-à-vis des vers de terre —
Partie 3:
Lignes directrices relatives à la détermination
des effets sur site —
Soil quality — Effects of pollutants on earthworms —
Part 3: Guidance on determination of effects in field situations
A
Numéro de référence
ISO 11268-3:1999(F)

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ISO 11268-3:1999(F)
Sommaire
1 Domaine d’application .1
2 Références normatives .1
3 Unités.1
4 Principe.1
5 Échantillonnage des populations de vers de terre.2
5.1 Généralités .2
5.2 Méthode d’extraction au formaldéhyde.2
5.3 Méthode d’extraction à la moutarde .2
5.4 Méthode d’extraction électrique.2
6 Préparation de l'essai.3
6.1 Site d'essai .3
6.2 Contrôle de l'efficacité de la méthode d'extraction.5
7 Mode opératoire.5
7.1 Application de la substance d'essai .5
7.2 Dates d'échantillonnage.6
7.3 Substance de référence .6
8 Évaluation de l'essai.6
8.1 Identification des espèces de vers de terre .6
8.2 Pesage .7
9 Calcul et expression des résultats.7
10 Rapport d'essai .7
Bibliographie.8
©  ISO 1999
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque
forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit de l'éditeur.
Organisation internationale de normalisation
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Imprimé en Suisse
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ISO 11268-3:1999(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 3.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
La Norme internationale ISO 11268-3 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-
comité SC 4, Méthodes biologiques.
L’ISO 11268 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité du sol — Effets des polluants
vis-à-vis des vers de terre:
 Partie 1: Détermination de la toxicité aiguë en utilisant des substrats de sol artificiel
 Partie 2: Détermination des effets sur la reproduction
 Partie 3: Lignes directrices relatives à la détermination des effets sur site
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ISO 11268-3:1999(F)
Introduction
La présente partie de l’ISO 11268 donne des lignes directrices relatives à l'évaluation des effets de certaines
substances sur les espèces de vers de terre dans les conditions réelles sur le terrain. En raison du caractère
complexe des essais sur le terrain, il sera souvent nécessaire d'apporter des modifications en fonction des
conditions présentes sur des sites spécifiques.
Ces lignes directrices ont été établies en tenant compte des résultats et des recommandations d'un atelier
international sur l'«Écotoxicologie des vers de terre», qui s'est tenu à Sheffield (Royaume-Uni) en avril 1991 (voir la
bibliographie).
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NORME INTERNATIONALE  © ISO ISO 11268-3:1999(F)
Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre —
Partie 3:
Lignes directrices relatives à la détermination des effets sur site
1 Domaine d’application
La présente partie de l’ISO 11268 décrit des techniques utilisées pour étudier les effets de substances sur les vers
de terre sur le terrain et constitue une base pour la détermination des effets des produits chimiques appliqués ou
incorporés au sol.
2 Références normatives
Les documents normatifs suivants contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui y est faite,
constituent des dispositions valables pour la présente partie de l’ISO 11268. Pour les références datées, les
amendements ultérieurs ou les révisions de ces publications ne s'appliquent pas. Toutefois, les parties prenantes
aux accords fondés sur la présente partie de l’ISO 11268 sont invitées à rechercher la possibilité d’appliquer les
éditions les plus récentes des documents normatifs indiqués ci-après. Pour les références non datées, la dernière
édition du document normatif en référence s'applique. Les membres de l’ISO et de la CEI possèdent le registre des
Normes internationales en vigueur.
ISO 10390:1994, Qualité du sol — Détermination du pH.
ISO 10694:1995, Qualité du sol — Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche
(analyse élémentaire).
ISO 11274:1998, Qualité du sol — Détermination de la caractéristique de la rétention en eau — Méthodes de
laboratoire.
ISO 11277:1998, Qualité du sol — Détermination de la répartition granulométrique de la matière minérale des sols
— Méthode par tamisage et sédimentation.
3 Unités
Les taux d'application des substances d'essai sont exprimés en kilogrammes par hectare (kg/ha) ou en litres par
hectare (l/ha) de substance appliquée. Lorsqu'il s'agit d'un matériau composé, le taux d'application est exprimé en
fonction de la quantité de matière active appliquée.
4 Principe
Les espèces et le nombre de vers de terre recueillis par parcelle d'échantillonnage traitée avec la substance d'essai
sont comparés à ceux recueillis dans les parcelles témoins et dans les parcelles traitées de référence. La durée de
l'étude dépend des caractéristiques de la substance d'essai, mais elle est normalement fixée à 1 année. Les dates
d'échantillonnage sont choisies pour coïncider avec les périodes d'activité des vers de terre.
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L'échantillonnage donne le nombre relatif de vers de terre et il n'est pas nécessaire d'essayer de définir ce nombre
en valeur absolue. Cet essai est réalisé avec un plan d'expérience complet randomisé à quatre réplicats. L'analyse
statistique de la population de chaque espèce prélevée à chaque échantillonnage permet de déterminer les effets
des traitements.
NOTE L'essai comporte également des échantillons de vers de terre prélevés dans des parcelles traitées pour une
analyse des résidus, si celle-ci est appropriée.
5 Échantillonnage des populations de vers de terre
5.1 Généralités
Étant donné qu'il est nécessaire de prélever un grand nombre d'échantillons pendant une période de temps la plus
courte possible, les méthodes d'extraction mécanique, telles que la sélection manuelle, l’extraction par lavage ou le
tamisage, sont généralement trop contraignantes. Les méthodes d'extraction mécanique permettent cependant de
prélever les échantillons lorsque les vers de terre ne sont pas actifs en raison des conditions météorologiques.
Pour les besoins de l'essai décrit dans la présente partie de l’ISO 11268, il est possible d'utiliser principalement la
méthode d'extraction au formaldéhyde (Raw 1959) et celle de l'extraction électrique, ou méthode dite Oktett
(Thielemann 1986, Cuendet et al. 1991). Ces méthodes d'extraction peuvent uniquement être employées lorsque
les vers de terre sont actifs. Pour augmenter l'efficacité de ces méthodes, il est possible de les associer à la
sélection manuelle (Lee 1985).
Les échantillons individuels sont prélevés par une répartition aléatoire sur toute la parcelle d'essai.
5.2 Méthode d’extraction au formaldéhyde
2 2
Une solution de formaldéhyde (0,2 %) est appliquée uniformément à un taux de 5 litres/0,25 m à 10 litres/0,25 m .
Cette solution est répandue sur le site d'essai en 2 ou 3 fois en fonction de la capacité d'infiltration. La durée totale
d'extraction est de 30 min.
Tous les vers de terre venant à la surface du sol dans la zone d'échantillonnage sont recueillis et placés dans un
liquide de conservation (formol à 5 % ou alcool à 70 %) (voir 8.1). Après une période d'extraction de 30 min, la
surface du sol et l'herbe sont soigneusement examinées afin de recueillir les vers de terre qui seraient passés
inaperçus (en général, il s'agit de jeunes vers de terre de petite taille ainsi que ceux de l'espèce fusiforme
Aporrectodea rosea).
5.3 Méthode d’extraction à la moutarde
Le jour précédant l’extraction, 60 g de poudre de moutarde sont mélangés à 1 litre d’eau distillée. Juste avant
utilisation, cette émulsion de moutarde est ajoutée à 9 litres d’eau distillée et appliquée de la même manière que la
solution de formaldéhyde. Le mode opératoire est similaire à l’extraction au formaldéhyde décrite en 5.2.
5.4 Méthode d’extraction électrique
En règle générale, des électrodes sont insérées dans le sol aux coins de la parcelle d'essai et les vers montent à la
surface lorsque le courant est appliqué. Il existe plusieurs dispositifs d'extraction électrique, fonctionnant dans
différentes conditions (courant continu ou alternatif, profondeur de pénétration de l'électrode, segmentation des
électrodes, etc.). Il convient par conséquent de préciser l'équipement spécifique utilisé ainsi que les conditions de
réalisation de l'essai. La durée totale de l'extraction est de 30 min. Après cette période d'extraction, il convient
d’examiner minutieusement la surface du sol pour recueillir les vers de terre qui seraient passés inaperçus.
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6 Préparation de l'essai
6.1 Site d'essai
6.1.1 Sélection et description
Il convient de réaliser l'essai sur un site semblable à celui où la substance d'essai serait normalement appliquée, ou
à un endroit où un déversement ou un déchargement est susceptible de se produire. Il convient que ce site soit
situé sur un terrain plat et qu'il présente les mêmes caractéristiques de végétation et de composition du sol sur
toute sa surface.
Les prés et les vergers sont généralement mieux adaptés aux études de terrain avec des vers de terre que les
terres arables, car ils comportent généralement des populations de vers plus importantes. Toutefois, lorsqu'il est
nécessaire d'obtenir des informations relatives aux effets sur des sols nus, il est possible d'utiliser des parcelles
arables à condition qu'elles comportent au minimum 20 vers de terre par mètre carré, et qu'elles présentent de
toute évidence une diversité d'espèces assez importante.
Pour qu'une surface d'essai dans un pré soit acceptable, il convient qu'elle ait une densité en vers de terre d'au
moins 100 individus par mètre carré. Si la densité de population est inférieure, il convient de prélever un plus grand
nombre d'échantillons que celui recommandé en 6.1.3.
Il convient que les parcelles expérimentales comportent une population mixte d'organismes (Bouché 1977),
généralement représentatifs du type d'environnement choisi. Dans les régions agricoles, par exemple, il convient
que les principales espèces, telles que Lumbricus terrestris et Aporrectodea caliginosa soient présentes à une
densité suffisamment élevée (10 % de la population au moins) pour que les parcelles soient considérées comme
représentatives. Il convient de veiller à ne pas sélectionner de parcelles qui présentent essentiellement des
espèces non représentatives.
Afin de satisfaire à ces exigences, il convient de prélever des échantillons à partir de parcelles prospectives avant
le début de l'étude préliminaire sur la répartition des espèces.
Il convient d'éviter de sélectionner comme site d'essai des types de sols extrêmes, tels que les sols très
sablonneux, les terres argileuses et les landes.
Il convient que la description du site d'essai comprenne les données physico-chimiques et biologiques suivantes:
 le profil du sol;
 la répartition granulométrique des particules, conformément à l'ISO 11277;
 la teneur en carbone organique, conformément à l'ISO 10694;
 le pH, conformément à l'ISO 10390;
 la capacité de rétention au champ (dans l’horizon A);
 une description de la végétation.
Il convient de réaliser la détermination de ces caractéristiques à l'aide de méthodes types.
Les mesurages microclimatiques (température du sol et de l'air, humidité du sol, quantité de précipitation, durée
d'ensoleillement) sont particulièrement importants pour la période d'application des produits chimiques, et il convient
que la température et la quantité de précipitation soient enregistrées sur l'ensemble de l'année.
Il convient de connaître l'histoire du site d'essai (par exemple applications de pesticides, de fertilisants minéraux, de
boues d'assainissement, etc.).
NOTE Lorsqu'un produit chimique spécifique est soumis à l’essai, il convient que le site n'ait pas été exposé à un produit
chimique similaire au cours des trois dernières années.
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ISO 11268-3:1999(F)
6.1.2 Entretien des terrains d'essai
Il convient de pailler régulièrement les prés (de deux à six fois par an) afin que la couverture herbeuse reste courte.
Il convient que le paillage soit effectué une semaine ou deux avant l'application afin de s'assurer que l'herbe à la
surface, qui servira de nourriture à certains vers de terre, a bien été en contact avec le matériau d'essai. Le dernier
paillage avant l'application de la substance peut être laissé sur le terrain uniquement s'il ne constitue pas un tapis
herbeux compact. Dans le cas d'un paillage au cours de l'année, il convient de laisser la paille sur le terrain car elle
sert de nourriture à certaines espèces de vers de terre.
Si un essai est réalisé sur une terre arable, il convient d'utiliser la pratique agricole usuelle. Toutefois, il convient,
dans la mesu
...