ISO 17601:2016

Soil quality — Estimation of abundance of selected microbial gene sequences by quantitative PCR from DNA directly extracted from soil

ISO 17601:2016 specifies the crucial steps of a quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) method to measure the abundance of selected microbial gene sequences from soil DNA extract which provides an estimation of selected microbial groups. It is noteworthy that the number of genes is not necessarily directly linked to the number of organisms that are measured. For example, the number of ribosomal operon is ranging from one copy to 20 copies in different bacterial phyla. Therefore, the number of 16S rRNA sequences quantified from soil DNA extracts does not give an exact estimate of the number of soil bacteria. Furthermore, the number of sequences is not necessarily linked to living microorganisms and can comprise sequences amplified from dead microorganisms.

Qualité du sol — Estimation de l'abondance de séquences de gènes microbiens par amplification par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) quantitative à partir d'ADN directement extrait du sol

ISO 17601:2016 spécifie les étapes principales d'une méthode d'amplification par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) quantitative (qPCR) permettant de mesurer l'abondance de séquences spécifiques de gènes microbiens à partir d'un extrait d'ADN du sol qui fournit une estimation de l'abondance de groupes microbiens spécifiques. Il convient de noter que le nombre de gènes n'est pas nécessairement lié directement au nombre de micro-organismes mesurés. Par exemple, le nombre d'opérons ribosomiques est compris entre une et 20 copies dans différents phyla bactériens. Par conséquent, le nombre de séquences d'ARNr 16S quantifiées dans des extraits d'ADN du sol ne donne pas une estimation exacte du nombre de bactéries contenues dans le sol. Par ailleurs, le nombre de séquences n'est pas nécessairement lié à des micro-organismes vivants et peut comprendre des séquences amplifiées à partir de l'ADN extrait de micro-organismes morts.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 11-Jan-2016
• ICS: 13.080.30 - Biological properties of soils
• Technical Committee: ISO/TC 190/SC 4 - Biological characterization
• Drafting Committee: ISO/TC 190/SC 4/WG 4 - Effects on soil micro-organisms
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Completion Date: 07-Jul-2021

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 17601
First edition
2016-01-15
Soil quality — Estimation of
abundance of selected microbial gene
sequences by quantitative PCR from
DNA directly extracted from soil
Qualité du sol — Estimation de l’abondance de séquences de gènes
microbiens par amplification par réaction de polymérisation en
chaîne (PCR) quantitative à partir d’ADN directement extrait du sol
Reference number
ISO 17601:2016(E)
©
ISO 2016

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ISO 17601:2016(E)

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ISO 17601:2016(E)

Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Test materials . 4
5.1 DNA . 4
5.2 Bacteria . 4
5.3 Plasmid . 4
5.4 Enzyme . 4
5.5 Chemicals . 4
5.6 Product for bacterial culture medium . 5
5.7 Buffer and reagents . 5
6 Apparatus . 6
7 Procedure. 6
7.1 qPCR standard preparation and calibration of qPCR assay (task 1) . 6
7.1.1 General. 6
7.1.2 Amplicon design (task 1, step 1) . 6
7.1.3 qPCR standard preparation (task 1, step 2) . 7
7.1.4 Isolate DNA, environmental DNA, artificial DNA . 7
7.1.5 Calibration of the qPCR (task 1, step 3) . 9
7.2 Preparation of soil DNA template and inhibition test (task 2) .10
7.2.1 General.10
7.2.2 Soil DNA preparation (task 2, step 4) .10
7.2.3 Inhibition test (task 2, step 5) .10
7.2.4 Dilution of DNA template .12
7.3 qPCR assay (task 3) .12
7.3.1 General.12
7.3.2 qPCR .12
7.4 Validation and analysis of qPCR assay (task 4) .12
7.4.1 General.12
7.4.2 Validation of the qPCR assay .12
7.4.3 Calculation of the copy number of the gene of interest in the soil DNA extract.13
8 Examination of the critical steps of the qPCR assay .14
9 Expression of the results of the qPCR assay .14
10 International ring test .14
11 Test report .14
®
Annex A (informative) Description of principal steps of TaqMan qPCR assay .15
Annex B (informative) International ring-test for evaluating qPCR to quantify the
abundance of selected microbial gene sequences from DNA directly extracted from soil .17
Bibliography .30
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ISO 17601:2016(E)

Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical
Barriers to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,
Biological methods.
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ISO 17601:2016(E)

Introduction
DNA (DNAs) is a major component of any living organisms coding for enzymes responsible for
their biological activities. The study of DNA sequences from DNA sources extracted from different
environmental matrices, by means of numerous molecular approaches, provides molecular markers that
can be used to sharply distinguish and identify different organisms (bacteria, archaea, and eucaryotes).
Up to now, most of the studies aiming to develop microbial quality indicators applicable to complex
environment such as soil were biased by the poor culturability of many microorganisms under
laboratory conditions and the lack of sensitivity of traditional microbiological methods. The recent
development of a large set of molecular biology methods based on amplification of soil-extracted
nucleic acids have provided a pertinent alternative to classical culture-based microbiological methods
[2]
providing unique insight into the composition, richness, and structure of microbial communities.
[3] [4] [5] [6]
  DNA-based approaches are now well established in soil ecology and serve as genotypic
markers for determining microbial diversity. The results of molecular analyzes of soil microbial
communities and/or populations rely on two main parameters: a) the extraction of DNA representative
of the indigenous bacterial community composition and b) PCR bias such as the choice of primers, the
[7] [4] [8] [9]
concentration of amplified DNA, errors in the PCR, or even the method chosen for analysis.
Numerous studies have investigated new methods to improve extraction, purification, amplification,
[10]
and quantification of DNA from soils. Recently, ISO 11063 reporting “a method to extract nucleic
acids directly from soil samples“ derived from Reference [10] is opening a new window for developing
[11]
standardized molecular approaches to estimate soil quality.
The aim of this International Standard is to describe the procedure used to set up and perform
quantitative PCR to quantify the abundance of soil microbial phyla, as well as functional groups from
DNA directly extracted from soil samples. The quantification of soil microbial phyla, as well as functional
groups by qPCR assays can contribute to the development of routine tools to monitor soil quality.
The repeatability and the reproducibility of the procedure of the quantitative PCR were assessed in
an international ring test study (see Annex B). The repeatability of this procedure was successfully
evaluated for both 16S rRNA genes, as well as genes coding a functional marker of denitrifiers (the
nitrite reductase gene nirK). The reproducibility of this procedure revealed a laboratory effect which
can be overcome by interpreting the results of the quantification of the abundance of the microbial
groups by comparison, either by using an external reference (DNA extracted from a control strain) in
the assay or by calculating a percentage of variations between treatments to normalize the data.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 17601:2016(E)
Soil quality — Estimation of abundance of selected
microbial gene sequences by quantitative PCR from DNA
directly extracted from soil
1 Scope
This International Standard specifies the crucial steps of a quantitative real-time polymerase chain
reaction (qPCR) method to measure the abundance of selected microbial gene sequences from soil DNA
extract which provides an estimation of selected microbial groups.
It is noteworthy that the number of genes is not necessarily directly linked to the number of organisms
that are measured. For example, the number of ribosomal operon is ranging from one copy to 20 copies
in different bacterial phyla. Therefore, the number of 16S rRNA sequences quantified from soil DNA
extracts does not give an exact estimate of the number of soil bacteria. Furthermore, the number of
sequences is not necessarily linked to living microorganisms and can comprise sequences amplified
from dead microorganisms.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 10381-6, Soil quality — Sampling — Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil under
aerobic conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory
ISO 11063, Soil quality — Method to directly extract DNA from soil samples
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
soil DNA
DNA extracted from soil of living and dead biota
EXAMPLE Microorganisms, plants, animals.
3.2
polymerase chain reaction
PCR
method allowing the amplification of a specific DNA sequence using a specific pair of oligonucleotide
primers
3.3
quantitative polymerase chain reaction
qPCR
method allowing the quantification in a DNA template (3.4) of the number of a specific DNA sequence
using a specific pair of oligonucleotide primers
3.4
template
DNA sample used to perform PCR (3.2) to amplify a specific DNA sequence
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ISO 17601:2016(E)

3.5
amplicon
PCR product obtained by PCR (3.2) from a template (3.4)
3.6
cloning vector
circular DNA molecule in which the amplicon (3.5) is inserted by ligation used to transform competent
Escherichia coli for cloning the amplicon
3.7
qPCR standard
cloned DNA target used as template (3.4) for qPCR reaction to establish the standard curve relating the
abundance of target sequence as a function of cycle threshold values (Ct)
3.8
non-template control
NTC
control, usually molecular grade water, that is used as negative control in qPCR assay to check for the
absence of contaminant in the qPCR mix
3.9
cycle threshold
Ct
number of qPCR cycles required for the fluorescent signal to cross the threshold (i.e. exceeds
background level)
Note 1 to entry: The Ct value is inversely proportional to the abundance of the target sequence.
4 Principle
This International Standard describes qPCR assay using fluorescent DNA binding dye as reporter.
This qPCR assay has been validated by an international ring test conducted with the SYBR Green, a
commonly used fluorescent DNA binding dye which binds all double–stranded DNA and can be detected
by measuring the increase in fluorescence throughout the cycle.
The method aims to measure the abundance of selected microbial gene sequences from soil DNA
extract. The method comprises four tasks and eight steps as summarized in Figure 1. According to
Reference [1], the three critical steps to be validated for each qPCR assay are as shown in Figure 1.
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ISO 17601:2016(E)

Validation
Validation
Figure 1 — Main tasks and critical steps to estimate the abundance of selected microbial gene
sequences by qPCR assay
This International Standard describes qPCR assay based on the use of fluorescent DNA binding dye
®1)
which has been validated by an international ring test using SYBR Green qPCR. In Annex A,

1) SYBR Green is a registered trademark of Molecular Probes. This information is given for the convenience of
users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent products
may be used if they can be shown to lead to the same results.
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ISO 17601:2016(E)

2)
®
information about TaqMan qPCR assay not tested in the international ring test are given. The
first task is made of three steps describing the design of optimal amplicon for qPCR (step one), the
preparation of qPCR standards (step two), and the procedure to calibrate the qPCR assay (step three).
The second task includes two additional steps describing the procedures to prepare soil DNA samples
(step four) and to test for the presence of qPCR inhibitors in soil DNA samples (step five). The third
task is constituted of a single step describing the protocol to perform qPCR assay (step six). Finally, the
fourth task is made of two steps, one describing the procedure to validate qPCR assays (step 7) to check
the quality of qPCR assay and another one describing the different options to calculate the number of
sequences of the gene of interest copy from cycle threshold (Ct) obtained from the analysis of qPCR
amplification plots (step 8).
5 Test materials
5.1 DNA
5.1.1 DNA, extracted from pure bacterial and fungal isolates using classical extraction procedures or
by using commercial kit to extract genomic DNA.
5.1.2 Soil DNA, extracted from aliquots of soil according to ISO 11063.
5.2 Bacteria
5.2.1 Escherichia coli strain, usually used for cloning of PCR product.
5.3 Plasmid
5.3.1 Cloning vector, usually used for cloning of PCR product in competent Escherichia coli.
5.4 Enzyme
5.4.1 Taq polymerase.
5.4.2 T4 DNA ligase.
5.4.3 T4 gene T32.
5.4.4 Bovine serum albumin (CAS No. 9048-46-8).
5.5 Chemicals
5.5.1 Ampicilline sodium, C H N NaO S (CAS No. 69-52-3).
16 18 3 4
5.5.2 Boric acid, BH O (CAS No. 10043-35-3).
3 3
5.5.3 Deoxynucleotide solution, dNTPs.
®
5.5.4 SYBR Safe DNA gel stain.

2) TaqMan is a trademark of Roche Molecular Systems, Inc. This information is given for the convenience of
users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent products
may be used if they can be shown to lead to the same results.
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ISO 17601:2016(E)

5.5.5 Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA), C H N O Na·2 H O
10 14 2 8 2 2
(CAS No. 6381-92 6).
5.5.6 Glucose, C H O (CAS No. 50-99-7).
6 12 6
5.5.7 Chlorhydric acid, HCl (CAS No. 7647-01-0).
5.5.8 IPTG, Isopropyl-Beta-D-Thiogalactopyranoside, (CAS No. 367-93-1).
5.5.9 Magnesium chloride, MgCl (CAS No. 7786-30-3).
2
5.5.10 Magnesium sulfate, MgSO (CAS No. 7487-88-9).
4
5.5.11 Molecular-biology-grade water, H O.
2
5.5.12 Potassium chloride, KCl (CAS No. 7447-40-7).
5.5.13 Sodium chloride, NaCl (CAS No. 7647-14-5).
5.5.14 Tris[hydroxymethyl]aminomethane, C H NO (CAS No. 77-86-1).
4 11 3
5.5.15 X-Gal, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside, (CAS No. 7240-90-6).
5.6 Product for bacterial culture medium
®3)
5.6.1 Bacto tryptone , enzymatic digest of casein.
5.6.2 Yeast extract powder (CAS No. 8013-01-2).
5.7 Buffer and reagents
5.7.1 Ampicilline solution, 2 g of ampicilline sodium in 4 ml of 0,22 µm filter sterilized H O. Adjust to
2
20 ml with sterilized H O, prepare 1 ml aliquots, and store at -20 °C.
2
-1 -1
5.7.2 EDTA, 0,5 mol·l , 186,10 g of EDTA in 1 000 ml of H O adjusting with NaOH (10 mol·l ) to pH 8,0.
2
5.7.3 SYBR Safe™ DNA gel stain, dilute 10,000X SYBR Safe™ gel stain in TBE buffer × 1.
5.7.4 IPTG stock solution, 1 g of IPTG in 8 ml of H O. After careful mixing, the solution is adjusted to
2
10 ml and sterilized under security microbiology post. Prepare 1 ml aliquot of IPTG and store at -20 °C.
®
5.7.5 Solid LB medium, 10 g of Bacto tryptone , 5 g of yeast extract, 5 g of sodium chloride, and 15 g
of agar in 1 000 ml of H O. After autoclaving for 20 min at 120 °C, 1 ml of ampicilline stock solution at
2
-1
100 mg·ml is added to LB medium and plated in Petri dishes (20 ml) under a security microbiology
post. 100 µl of IPTG solution are plated on solid LB-ampicilline medium. When IPTG solution is entered
in LB-ampicilline medium, 20 µl of X-Gal solution is plated on solid LB-ampicilline medium. Solid LB
medium is stored at 4 °C until its use.

3) Bacto tryptone is the trademark of a product supplied by Difco Laboratories. This information is given for
the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product named.
Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
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ISO 17601:2016(E)

®
5.7.6 SOC medium, 20 g of Bacto tryptone , 5 g of yeast extract, 0,58 g of NaCl, 0,95 g of MgCl , 2,46 g
2
of MgSO , and 3,60 g of glucose in 1 l H O. Sterilize by 20 min autoclaving at 120 °C. Prepare 950 ml
4 2
aliquots and store at -20 °C.
-1 -1
5.7.7 Tris-HCl, 1 mol·l , 121,14 g of Tris in 1 000 ml of H O adjusting with 4 mol·l HCl to pH 8,0.
2
-1
TBE buffer × 10, pH 8,0, 108 g of Tris base, 55 g of boric acid, and 40 ml of 0,5 mol·l EDTA (pH 8,0) in
1 000 ml of H O.
2
5.7.8 TBE buffer × 1, 100 ml of TBE buffer × 10 in 900 ml of H O.
2
-1 -1
5.7.9 TE buffer × 10, pH 8,0, 100 ml of 1 mol·l Tris-HCl pH 8,0, 20 ml of 50 mmol·l EDTA pH 8,0 in
880 ml of molecular grade water.
5.7.10 TE buffer × 1, 100 ml of TE buffer × 10 in 900 ml of H O.
2
5.7.11 X-gal solution, 250 mg of X-Gal in 5 ml of dimethylformamide 5 ml. After careful mixing, prepare
0,5 ml aliquot and store at -20 °C.
6 Apparatus
Use standard laboratory equipment including pipettes, a centrifuge, fume hood cabinet, horizontal
electrophoresis system and the following.
6.1 Quantitative PCR, allowing the real-time quantification of amplicons from various DNA templates
with a theoretical detection limit of one copy of a sequence target per sample analyzed.
6.2 Spectro-photometer, allowing the quantification of double-strand DNA at 260 nm.
6.3 Spectro-fluorimeter, allowing the quantification of double-strand DNA.
NOTE Only one of these two apparatus is required to estimate DNA concentration.
7 Procedure
7.1 qPCR standard preparation and calibration of qPCR assay (task 1)
7.1.1 General
qPCR assay is based on the quantification of the amplicons at the end of each PCR cycle by using a DNA
dye which fluoresces when intercalated in the double strand amplicons. The purpose of this task is to
describe the definition of appropriate amplicon to settle down a qPCR assay (step one), the preparation
of qPCR standard (step two), and the calibration of the qPCR assay (step three).
7.1.2 Amplicon design (task 1, step 1)
7.1.2.1 General
The first step aims at designing oligonucleotide primer pair; it can be designed in silico using different
programs using the sequence of the microbial gene of interest to be quantified by qPCR from soil
DNA extracts. The specificity of the primers shall be checked in silico by comparing their sequences
to known sequences available in the Genbank database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).
Only primers specific for the gene target shall be considered. The main parameters to be considered to
design oligonucleotide primer pair for establishing qPCR assay are listed thereafter.
6 © ISO 2016 – All rights reserved

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ISO 17601:2016(E)

7.1.2.2 qPCR
— Optimal amplicon length ranges between 100 bp to 250 bp.
— Optimal primer length ranges between 18 bp and 25 bp with a GC content of 50 % and melting
temperature between 58 °C and 65 °C.
— The five nucleotides at the 3” end of each primer should have no more than two G and/or C bases.
— Avoid succession of identical nucleotide, especially true for guanine.
— 3” self-complementarity of the primer taken as a measure of its tendency to form a primer-dimer
with itself should be checked and avoided.
— Avoid design of primers with more than four mismatches because too high degeneracy of the primer
contributes to fluctuation of qPCR results.
7.1.3 qPCR standard preparation (task 1, step 2)
Step 2 of task 1 describes the procedure used to generate qPCR standards targeting a sequence of the
microbial gene of interest from different DNA templates (pure bacterial or fungal isolate, environmental
DNA, or artificial DNA). It also reports the procedure used to insert the qPCR standard in a cloning
vector, transform Escherichia coli, and purify recombinant plasmids harboring qPCR standard for
further use for qPCR assays.
7.1.4 Isolate DNA, environmental DNA, artificial DNA
7.1.4.1 General
The first step of qPCR standard preparation relies on the extraction of DNA templates known to harbour
the microbial gene of interest. This can be done starting from different materials such as the following:
a) pure cultures of microorganisms;
DNA is extracted from cells harvested from a fresh culture of microorganisms by using conventional
genomic DNA extraction protocols.
b) artificial DNA.
If no biological samples are available or known to harbour the gene of interest, artificial DNA made of
the sequence of the gene of interest can be synthesized.
In all cases, the quality of DNA template used for amplifying the qPCR standard by PCR shall be verified
by electrophoresis on 1 % agarose gel in TBE buffer stained with appropriate staining (e.g. SYBR Safe™
staining). The concentration of DNA is measured by spectro-photometry at 260 nm. DNA template is
-1
diluted to 10 ng·µl in a final volume of 20 µl and stored at -20 °C.
The qPCR standard sequence is amplified by PCR using a specific primer pair designed according to
recommendations described in task 1 of block 1. The amplification reaction is carried out in a final
-1 -1
25 µl volume containing 2,5 µl of 10 × Taq polymerase buffer, 200 µmol·l of each dNTP, 1,5 mmol·l
-1
of MgCl , 0,5 µmol·l of each primer and 0,625 U of Taq polymerase. A volume of 2,5 µl of DNA (e.g.
2
25 ng of DNA) is used as template for the PCR reactions. PCR is performed in a thermocycler according
to the following program: one cycle of 4 min at 94 °C; 39 cycles of 1 min at 94 °C, 1 min at annealing
temperature specific for the qPCR standard amplicon, 1,5 min at 72 °C, and a final extension step at
72 °C for 5 min. The expected size of the qPCR standard amplicon is verified by electrophoresis on 2 %
agarose gel in TBE buffer stained with appropriate staining (e.g. SYBR Safe™ staining). Amplicons are
purified either from the gel using appropriate methods or by using exclusion chromatography columns
to remove primers. Purified amplicons are then quantified by spectro-photometry at 260 nm or by
spectrofluorimetry.
© ISO 2016 – All rights reserved 7

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ISO 17601:2016(E)

7.1.4.2 Cloning, dilution preparation of qPCR standard
7.1.4.2.1 Ligation of amplicon of qPCR standard
For an optimal ligation of an amplicon into a cloning vector should a 3:1 molar ratio the mass of PCR
product (Q in ng of DNA) to be used for ligation can be calculated (see Formula 1):
mn
plasmid DNAi× n
...

DRAFT INTERNATIONAL STANDARD
ISO/DIS 17601
ISO/TC 190/SC 4 Secretariat: AFNOR
Voting begins on: Voting terminates on:
2013-09-26 2013-12-26
Soil quality — Estimation of abundance of selected
microbial gene sequences by quantitative realtime PCR
from DNA directly extracted from soil
Qualité du sol — Estimation de l’abondance de séquences spécifiques de gènes microbiens par
amplification en chaîne par polymerase (PCR) quantitative en temps réel à partir d’ADN directement
extrait du sol
ICS: 13.080.30
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FOR COMMENT AND APPROVAL. IT IS
THEREFORE SUBJECT TO CHANGE AND MAY
NOT BE REFERRED TO AS AN INTERNATIONAL
STANDARD UNTIL PUBLISHED AS SUCH.
IN ADDITION TO THEIR EVALUATION AS
BEING ACCEPTABLE FOR INDUSTRIAL,
TECHNOLOGICAL, COMMERCIAL AND
USER PURPOSES, DRAFT INTERNATIONAL
STANDARDS MAY ON OCCASION HAVE TO
BE CONSIDERED IN THE LIGHT OF THEIR
POTENTIAL TO BECOME STANDARDS TO
WHICH REFERENCE MAY BE MADE IN
Reference number
NATIONAL REGULATIONS.
ISO/DIS 17601:2013(E)
RECIPIENTS OF THIS DRAFT ARE INVITED
TO SUBMIT, WITH THEIR COMMENTS,
NOTIFICATION OF ANY RELEVANT PATENT
RIGHTS OF WHICH THEY ARE AWARE AND TO
©
PROVIDE SUPPORTING DOCUMENTATION. ISO 2013

---------------------- Page: 1 ----------------------
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ISO/DIS 17601
Contents Page
Foreword . iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Scope . 1
3 Normative references . 1
4 Terms and definitions . 1
5 Principle. 2
6 Test materials . 3
6.1 DNA . 3
6.2 Bacteria. 3
6.3 Plasmid . 3
6.4 Enzymes and proteins . 3
6.5 Chemicals . 3
6.6 Product for bacterial culture medium . 4
6.7 Buffer and reagents . 4
7 Apparatus . 5
7.1 Quantitative PCR, allowing the real time quantification of amplicons from various DNA
templates with detection limit of one copy of a sequence target per sample analysed. . 5
7.2 Spectro-photometer , allowing the quantification of double-strand DNA at 260 nm. . 5
4)
7.3 Spectro-fluorimeter , allowing the quantification of double-strand DNA. . 5
8 Procedure . 5
8.1 qPCR standard preparation and calibration of qPCR assay (task 1) . 5
8.2 Preparation of soil DNA template and inhibition test (task 2) . 11
8.3 qPCR assay (task 3) . 13
8.4 Validation and analysis of qPCR assay (task 4) . 13
9 Validation of the qPCR assay . 15
10 Expression of the results of the qPCR assay . 15
11 Test report . 15
Annex A (informative) International ring test for evaluating quantification of the abundance of
microbial groups by qPCR . 16
Annex B (informative)  SYBR Green qPCR based assay . 17
A.1 SYBR Green qPCR standard preparation and calibration of SYBR Green16) qPCR assay . 17
A.2 Preparation of soil DNA template and inhibition test . 17
A.3 SYBR Green qPCR assay . 17
A.4 Validation and analysis of SYBR Green qPCR assay . 17
Annex B (informative) Taqman qPCR based assay . 18
B.1 TaqMan qPCR standard preparation and calibration of TaqMan qPCR assay . 18
B.2 Preparation of soil DNA template and inhibition test . 18
B.3 TaqMan qPCR assay . 18
B.4 Validation and analysis of TaqMan qPCR assay . 18
Bibliography . 19


© ISO 2013 – All rights reserved iii

---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO/DIS 17601
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 17601 was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4, Biological
methods.
This second/third/. edition cancels and replaces the first/second/. edition (), [clause(s) / subclause(s) /
table(s) / figure(s) / annex(es)] of which [has / have] been technically revised.
iv © ISO 2013 – All rights reserved

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ISO/DIS 17601
Introduction
DNA (deoxyribonucleic acids) is a major component of any living organisms coding for enzymes responsible
for their biological activities. The study of DNA sequences from DNA sources extracted from different
environmental matrixes, by means of numerous molecular approaches, provides molecular markers that can
be used to sharply distinguish and identify different organisms (bacteria, archaea and eucaryotes).
Up to now, most of the studies aiming to develop microbial soil quality indicators applicable to complex
environment, such as soil, were biased by the unculturability of many microorganisms and the lack of
sensitivity of traditional microbiological methods [1]. The recent development of numerous molecular biology
methods based primarily on amplification of soil-extracted nucleic acids have provided a pertinent alternative
to classical culture-based microbiological methods, providing unique insight into the composition, richness,
and structure of microbial communities [2], [3], [4], [5], [6]. DNA-based approaches are now well established in
soil ecology and serve as genotypic (= molecular genetic) markers for determining microbial diversity. The
results of molecular analyses of soil microbial communities and/or populations rely on two main parameters:
(i) the extraction of DNA representative of the indigenous bacterial community composition and (ii) PCR bias,
such as the choice of primers, the concentration of amplified DNA, errors in the PCR, or even the method
chosen for analysis [7], [4], [8], [9].
Numerous studies have investigated new methods to improve extraction, purification, amplification, and
quantification of DNA from soils [10]. Recently ISO 11063 reporting “ a method to extract nucleic acids directly
from soil samples„ derived from [10] is opening a new window for developing standardized molecular
approaches to estimate soil quality [11].
The aim of this International Standard is to describe the procedure used to set-up and perform quantitative
PCR to quantify the abundance of soil microbial phyla as well as functional groups from DNA directly
extracted from soil samples. The quantification of soil microbial phyla as well as functional groups by qPCR
assays can contribute to the development of routine tools to monitor soil quality. At the demand of ISO, the
reproducibility of the quantification of the abundance of selected microbial gene sequences by quantitative
realtime PCR from DNA directly extracted from soil was assessed in an International ring test study (Annex
A).

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DRAFT INTERNATIONAL STANDARD ISO/DIS 17601

Soil quality — Estimation of abundance of selected microbial
gene sequences by quantitative realtime PCR from DNA directly
extracted from soil
1 Scope
2 Scope
This International Standard specifies the crucial steps of a quantitative real-time polymerase chain reaction
(qPCR) method to measure the abundance of selected microbial gene sequences from soil DNA extract which
provides an estimation of selected microbial groups.
It is noteworthy that the number of genes is not necessarily directly linked to the number of organisms that are
measured. For example, the number of ribosomal operon is ranging from one copy to 20 copies in different
bacterial phyla. Therefore the number of 16S rRNA sequences quantified from soil DNA extracts does not give
an exact estimate of the number of soil bacteria. Furthermore the number of sequences is not necessarily
linked to living microorganisms and can comprise sequences amplified from dead microorganisms.
3 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 10381-6, Soil quality — Sampling — Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil
under aerobic conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the
laboratory
ISO 11063, Soil quality — Method to directly extract DNA from soil samples
4 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
soil DNA
DNA extracted from soil of living and dead biota
EXAMPLE Microorganisms plants, animals.
3.2
polymerase chain reaction
PCR
method allowing the amplification of a specific DNA sequence using a specific pair of oligonucleotide primers
3.3
quantitative realtime polymerase chain reaction
qPCR
method allowing the quantification in a template of the number of a specific DNA sequence using a specific
pair of oligonucleotide primers
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1

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ISO/DIS 17601
3.4.
template
DNA sample used to perform PCR to amplify a specific DNA sequence
3.5
amplicon
PCR product obtained by PCR from a template
3.6
cloning vector
circular DNA molecule in which the amplicon is inserted by ligation used to transform competent Escherichia
coli for cloning the amplicon
5 Principle
The method aims to measure the abundance of selected microbial gene sequences from soil DNA extract.
The method comprised four tasks and eight steps as shown in Figure 1.
Task 2Preparation of soil DNA
Task1 qPCR standard preparation
template and inhibition test
and calibration of qPCR assay
Step 1
Step 4
Amplicon design Preparation of soil DNA
Step 2
Step 5
qPCR standard preparation
Inhibition test
Step 3
Calibration of the qPCR
Task 3 qPCR assay
Step 6
qPCR assay
Task 4 Validation and analysis of qPCR assay
Step 7 Step 8
Calculation of the copy
Validation of the qPCR assay
number of the gene of
interest in the soil DNA
extract

Figure 1 — Main tasks to estimate the abundance of selected microbial gene sequences by qPCR
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2

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ISO/DIS 17601
The first task is made of three steps describing the design of optimal amplicon for qPCR (step one), the
preparation of qPCR standards (step two) and the procedure to calibrate the qPCR assay (step three). The
second task includes two additional steps describing the procedures to prepare soil DNA samples (step four)
and to test for the presence of qPCR inhibitors in soil DNA samples (step five). The third task is constituted of
1) 2)
a single step describing the protocol to perform SYBR® Green and TaqMan® qPCR assays (step six).
Finally, the fourth task is made of two steps, one describing the procedure to validate qPCR assays (step 7) to
check for the quality of qPCR assay and another one describing the different options to calculate the number
of sequences of the gene of interest copy from cycle threshold (Ct) obtained from the analysis of qPCR
amplification plots (step 8).
6 Test materials
6.1 DNA
5.1.1 DNA is extracted from pure bacterial and fungal isolates using classical extraction procedures or by
using commercial kit to extract genomic DNA.
5.1.2 Soil DNA is extracted from aliquots of soil according to ISO 11063.
6.2 Bacteria
5.2.1 Escherichia coli strain, usually used for cloning of PCR product.
6.3 Plasmid
5.3.1 Cloning vector, usually used for cloning of PCR product in competent Escherichia coli, having SP6
and T7 universal primers on both site of the polylinker.
6.4 Enzymes and proteins
5.4.1 Taq polymerase.
5.4.1 T4 DNA ligase.
5.4.3 T4 gene T32 protein.
5.4.4 Bovine serum albumin (CAS No. 9048-46-8).
6.5 Chemicals
5.5.1 Amipicilline sodium, C H N NaO S (CAS No. 69-52-3).
16 18 3 4
5.5.2 Boric acid, BH O (CAS No. 10043-35-3).

3 3
5.5.3 Deoxynucleotide solution, dNTPs.
5.5.4 Ethidium bromide (CAS No. 1239-45-8).

1) SYBR Green is a registered trademark of Molecular Probes. This information is given for the convenience of users of this document
and does not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to
the same results.
2) TaqMan is a trademark of Roche Molecular Systems, Inc. This information is given for the convenience of users of this document
and does not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to
the same results.
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3

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ISO/DIS 17601
5.5.5 Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA), C H N O Na ·2 H O
10 14 2 8 2 2
(CAS No. 6381-92 6).
5.5.6 Glucose, C H O (CAS No. 50-99-7).
6 12 6
5.5.7 Chlorhydric acid, HCl (CAS No. 7647-01-0).
5.5.8 IPTG, Isopropyl-Beta-D-Thiogalactopyranoside (CAS No. 367-93-1).
5.5.9 Magnesium chloride, MgCl (CAS No. 7786-30-3).
2
5.5.10 Magnesium sulfate, MgSO (CAS No. 7487-88-9.
4
5.5.11 Molecular-biology-grade water, H O.
2
5.5.12 Potassium chloride, KCl (CAS No. 7447-40-7).
5.5.13 Sodium chloride, NaCl (CAS No. 7647-14-5).
5.5.14 Tris[hydroxymethyl]aminomethane, C H NO (CAS No. 77-86-1).
4 11 3
5.5.15 X-Gal, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (CAS No. 7240-90-6).
6.6 Product for bacterial culture medium
5.6.1 Bacto®3) tryptone, enzymatic digest of casein.
5.6.2 Yeast extract powder (CAS No. 8013-01-2).
5.6.3 Agar
6.7 Buffer and reagents
5.7.1 Ampicilline solution, 2 g of ampicilline sodium in 4 ml of 0,22 µm filter sterilized H O. Adjust to 20 ml
2
with sterilized H O, prepare 1 ml aliquots and store at - 20 °C.
2
5.7.2 EDTA, 0,5 mol/l, 186,10 g of EDTA in 1 000 ml of H O, adjusting with NaOH (10 mol/l) to pH 8,0.
2
5.7.3 Ethidium bromide, 5 mg of ethidium bromide in 1 000 ml of H O.
2
5.7.4 IPTG stock solution, 1 g of IPTG in 8 ml of H O. After careful mixing, the solution is adjusted to
2
10 ml and sterilized under security microbiology post. Prepare 1 ml aliquot of IPTG and store at - 20 °C.
TM 3)
5.7.5 Solid LB medium, 10 g of bacto -tryptone, 5 g of yeast extract, 5 g of sodium chloride, 15 g of
agar, in 1 000 ml of H O. After autoclaving for 20 min at 120 °C, LB medium is poured in sterile Petri dishes
2
(20 ml) under a security microbiology post. When solidified, Petri dishes containing LB medium are stored at
4 °C until their use.
5.7.6 Solid LB/Amp medium, is prepared following the recipe of solid LB medium except that after
-1
autoclaving for 20 min at 120 °C, 1 ml of ampicilline stock solution at 100 mg·ml is added to LB medium.

3) Bacto tryptone is the trademark of a product supplied by Difco Laboratories. This information is given for the convenience of users of
this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent products may be used if they can be
shown to lead to the same results.”
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4

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ISO/DIS 17601
5.5.7 Solid LB/Amp/X-Gal/IPTG medium is prepared following the recipe of solid LB/Amp medium. Under
a security microbiology post, 100 µl of IPTG solution are plated on solid LB-amp medium. When evaporated,
20 µl of X-Gal solution are plated on solid medium. This solid medium is stored as previously described.
TM 3)
5.7.8 Liquid LB medium, 10 g of bacto -tryptone, 5 g of yeast extract, 5 g of sodium chloride, in
1 000 ml of H O, autoclaved for 20 min at 120°C.
2
5.7.9 Liquid LB/Amp medium is prepared following the recipe of liquid LB medium except that after
-1
autoclaving for 20 min at 120 °C, 0,2 ml of ampicilline stock solution at 100 mg·ml is added to LB medium.
TM 3)
5.7.10 SOC medium, 20 g of bacto -tryptone , 5 g of yeast extract, 0,58 g of NaCl, 0,95 g of MgCl ,
2
2,46 g of MgSO , 3,60 g of glucose in 1 l H O. Sterilize by 20 min autoclaving at 120 °C. Prepare 950 ml
4 2
aliquots and store at - 20 °C.
5.7.11 Tris-HCl, 1 mol/l, 121,14 g of tris in 1 000 ml of H O, adjusting with 4 mol/l HCl to pH 8,0.
2
5.7.12 TBE buffer × 10, pH 8,0, 108 g of tris base, 55 g of boric acid, 40 ml of 0,5 mol/l EDTA (pH 8,0) in
1 000 ml of H O.
2
5.7.13 TBE buffer × 1, 100 ml of TBE buffer × 10 in 900 ml of H O.
2
5.7.14 TE buffer × 10, pH 8,0, 100 ml of 1 mol/l Tris-HCl pH 8,0, 20 ml of 50 mmol/l EDTA pH 8,0 in 880 ml
of H O.
2
5.7.15 TE buffer × 1, 100 ml of TE buffer × 10 in 900 ml of H O.
2
5.7.16 X-gal solution, 250 mg of X-Gal in 5 ml of dimethylformamide 5 ml. After careful mixing, prepare
0,5 ml aliquot and store at - 20 °C
7 Apparatus
Use standard laboratory equipment including pipettes, a centrifuge, fume hood cabinet, horizontal
electrophoresis system and the following.
7.1  Quantitative PCR, allowing the real time quantification of amplicons from various DNA
templates with detection limit of one copy of a sequence target per sample analysed.
7.2  Spectro-photometer , allowing the quantification of double-strand DNA at 260 nm.
Note: Only one of these two apparatus is required to estimate DNA concentration.
4)
7.3 Spectro-fluorimeter , allowing the quantification of double-strand DNA.
8 Procedure
8.1 qPCR standard preparation and calibration of qPCR assay (task 1)
7.1.1 General
The purpose of this task is to describe the definition of appropriate amplicon to settle down a qPCR assay
(step one), the preparation of qPCR standard (step two) and the calibration of the qPCR assay (step three).
For the first step of task 1, the design of amplicon for SYBR Green and TaqMan qPCR assay is considered
separately for technical reasons. Indeed, these two qPCR assays notably differ by the method used for
realtime quantification of amplicons; (i) for the first method, amplicons are quantified at the end of each PCR
cycle by using SYBR Green which fluoresces when intercalated in the double helix of the amplicon, (ii) for the
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5

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ISO/DIS 17601
second, the release of a fluorescent dye following the hydrolysis of an internal probe as a result of the 5´–3´
exonuclease activity of Taq polymerase is estimated at the end of each PCR cycle. For these reasons,
technical specifications to settle down these two different methods are slightly diverging.
7.1.2 Amplicon design (task 1, step 1)
7.1.2.1 General
The first step aims at designing oligonucleotide primer pair to amplify an appropriate amplicon optimizing the
qPCR assay. Primer pair design can be done in silico using different programs using the sequence of the
microbial gene of interest to be quantified by qPCR from soil DNA extracts. The specificity of the primers shall
be checked in silico by comparing their sequences to known sequences available in the Genbank database
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Only primers specific for the gene target shall be considered. The
main parameters to be considered to design oligonucleotide primer pair for establishing a SYBRGreen or
TaqMan qPCR assays are listed thereafter.
7.1.2.2 SYBR Green qPCR
 optimal amplicon length ranges between 100 bp to 250 bp,
 optimal primer length ranges between 18 bp and 25 bp, with a GC content of 50 %, and melting
temperature between 58 °C and 65 °C,
 the five nucleotides at the 3´ end of each primer should have no more than two G and/or C bases,
 avoid succession of identical nucleotide, especially true for guanine,
 3' self-complementarity of the primer, taken as a measure of its tendency to form a primer-dimer with
itself, should be checked and avoided.
7.1.2.3 TaqMan qPCR
First, the TaqMan probe shall be designed and then the primers chosen to surround as close as possible to
the probe without overlapping. The main parameters to be considered to design the internal probe are listed
thereafter:
 GC content shall be kept in the 20 % to 80 % range,
 the melting temperature (T ) should be between 58 °C and 65 °C (similar to that of the primer pair used
m
in the TaqMan assay),
 avoid succession of identical nucleotide, especially true for guanine,
 do not put a G on the 5´ end of the TaqMan probe,
 select the strand with more Cs than Gs.
The recommendations listed for qPCR to choose the primer pair shall also be fulfilled to design primers for
TaqMan qPCR. However, users shall keep in mind that the shortest amplicon length is the best but without
overlap with TaqMan probe.
7.1.3 qPCR Standard preparation (task 1, step 2)
Step 2 of task 1 describes the procedure used to generate qPCR standards targeting a sequence of the
microbial gene of interest from different DNA templates (pure bacterial or fungal isolate, environmental DNA or
artificial DNA). It also reports the procedure used to insert the qPCR standard in a cloning vector, transform
Escherichia coli and purify recombinant plasmids harboring qPCR standard for further use for qPCR assays.
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6

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7.1.4 Isolate DNA, environmental DNA, artifical DNA
7.1.4.1 General
The first step of qPCR standard preparation relies on the extraction of DNA templates known to harbour the
microbial gene of interest. This can be done starting from different biological materials:
1) pure bacterial or fungal cultures;
2) environmental samples or 3) artificial DNA:
i) DNA is extracted from bacterial or fungal cells harvested from a fresh culture by using
conventional genomic DNA extraction protocols,
ii) DNA is extracted from environment matrices following different protocols. When soil samples are
considered, DNA is extracted according to ISO 11063 describing a method to directly extract
nucleic acids from soil,
3) Alternatively, if no biological samples are available or known to harbour the gene of interest, artificial
DNA made of the sequence of the gene of interest can be synthesized.
In all cases the quality of DNA template used for amplifying the qPCR standard by PCR shall be verified by
electrophoresis on 1 % agarose gel in TBE buffer stained with appropriate staining (e.g. ethidium bromide,
5 mg/l). The concentration of DNA is measured by spectro-photometry at 260 nm. DNA template is diluted to
10 ng/µl in a final volume of 20 µl and stored at - 20 °C.
qPCR standard sequence is amplified by PCR using specific primer pair designed according to
recommendations described in task 1 of block 1. The amplification reaction is carried out in a final 25 µl
volume containing 2,5 µl of 10 × Taq polymerase buffer, 200 µmol/l of each dNTP, 1,5 mmol/l of MgCl ,
2
0,5 µmol/l of each primer and 0,625 U of Taq polymerase. A volume of 2,5 µl of DNA (e.g. 25 ng of DNA) is
used as template for the PCR reactions. PCR is performed in a thermocycler according to the following
program: one cycle of 4 min at 94 °C; 39 cycles of 1 min at 94 °C, 1 min at annealing temperature specific for
the qPCR standard amplicon, 1,5 min at 72 °C and a final extension step at 72 °C for 5 min. The expected
size of the qPCR standard amplicon is verified by electrophoresis on 2 % agarose gel in TBE buffer stained
with appropriate staining (e.g. ethidium bromide, 5 mg/l). Amplicons are purified to remove primers, salt and
remaining enzymes. Among appropriate methods to purify amplicons one could recommend the use of (i)
exclusion or affinity chromatography applied directly on PCR products or (ii) purification of the amplicons after
their separation by electrophoresis on agarose as described in [12] . Purified amplicons are then quantified by
spectro-photometry at 260 nm or by spectrofluorimetry. At least 100 ng of amplicon is required for cloning.
7.1.4.2 Cloning, dilution preparation of qPCR standard
7.1.4.2.1 Ligation of amplicon of qPCR standard
Keeping in mind that optimal ligation of amplicon into cloning vector should a 3:1 (amplicon:cloning vector)
molar ratio, the amount of amplicon (Q in ng of DNA) to be used for ligation can be calculated as follows (see
Eq
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 17601
Première édition
2016-01-15
Qualité du sol — Estimation de
l’abondance de séquences de gènes
microbiens par amplification par
réaction de polymérisation en chaîne
(PCR) quantitative à partir d’ADN
directement extrait du sol
Soil quality — Estimation of abundance of selected microbial gene
sequences by quantitative PCR from DNA directly extracted from soil
Numéro de référence
ISO 17601:2016(F)
©
ISO 2016

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ISO 17601:2016(F)

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sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Ch. de Blandonnet 8 • CP 401
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ii © ISO 2016 – Tous droits réservés

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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Matériel d’essai . 4
5.1 ADN . 4
5.2 Bactéries . 4
5.3 Plasmide . 4
5.4 Enzymes . 4
5.5 Produits chimiques . 4
5.6 Produit pour le milieu de culture bactérienne . 5
5.7 Tampon et réactifs . 5
6 Appareillage . 6
7 Mode opératoire. 6
7.1 Préparation des étalons de qPCR et étalonnage de l’essai de qPCR (tâche 1) . 6
7.1.1 Généralités . 6
7.1.2 Création de l’amplicon (tâche 1, étape 1) . 7
7.1.3 Préparation des étalons de qPCR (tâche 1, étape 2) . 7
7.1.4 ADN d’isolat, ADN environnemental, ADN artificiel . 7
7.1.5 Étalonnage de la qPCR (tâche 1, étape 3) .10
7.2 Préparation d’une matrice d’ADN du sol et test d’inhibition (tâche 2) .11
7.2.1 Généralités .11
7.2.2 Préparation de l’ADN du sol (tâche 2, étape 4) .11
7.2.3 Test d’inhibition (tâche 2, étape 5) .11
7.2.4 Dilution de la matrice d’ADN .12
7.3 Essai de qPCR (tâche 3) .13
7.3.1 Généralités .13
7.3.2 qPCR .13
7.4 Validation et examen de l’essai de qPCR (tâche 4) .13
7.4.1 Généralités .13
7.4.2 Validation de l’essai de qPCR .13
7.4.3 Calcul du nombre de copies du gène d’intérêt dans l’extrait d’ADN du sol .14
8 Examen des étapes critiques de l’essai de qPCR .14
9 Expression des résultats de l’essai de qPCR .15
10 Étude interlaboratoires internationale .15
11 Rapport d’essai .15
®
Annexe A (informative) Description des principales étapes d’un essai de qPCR TaqMan .16
Annexe B (informative) Étude interlaboratoires internationale relative à l’évaluation de la
qPCR pour quantifier l’abondance de séquences spécifiques de gènes microbiens à
partir d’ADN extrait directement du sol .18
Bibliographie .31
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ISO 17601:2016(F)

Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO, participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer
un engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à
l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes
de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 190, Qualité du sol, sous–comité
SC 4, Méthodes biologiques.
iv © ISO 2016 – Tous droits réservés

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ISO 17601:2016(F)

Introduction
L’ADN (acide désoxyribonucléique) est un constituant majeur de tous les organismes vivants codant
pour les enzymes responsables de leurs activités biologiques. L’étude des séquences d’ADN extrait
de différentes matrices environnementales, à l’aide d’approches moléculaires, permet de fournir des
marqueurs moléculaires qui peuvent être utilisés pour différencier et identifier clairement différents
organismes (bactéries, archées et eucaryotes).
Jusqu’à présent, la plupart des études visant à développer des indicateurs microbiens de la qualité du
sol et applicables aux milieux complexes, tels que le sol, étaient biaisées par la nature incultivable de
nombreux micro-organismes dans des conditions de laboratoire et par le manque de sensibilité des
méthodes de microbiologie classiques. Le développement récent de nombreuses méthodes de biologie
moléculaire reposant sur l’amplification des acides nucléiques extraits du sol a permis de proposer une
alternative pertinente à la microbiologie pasteurienne permettant de décrire en détail la composition,
[2] [3] [4] [5] [6]
la richesse et la structure des communautés microbiennes.   Les approches reposant sur
l’extraction de l’ADN à partir d’échantillons environnementaux sont désormais bien établies dans le
domaine de l’écologie des sols et servent de marqueurs génétiques permettant d’évaluer la diversité
microbienne. Les résultats d’analyses moléculaires des communautés et/ou populations microbiennes
du sol reposent sur deux paramètres principaux: a) l’extraction d’ADN représentatif de la composition
de la communauté microbienne indigène et b) les biais introduits par la PCR, notamment le choix des
amorces oligonucléotidiques, la concentration de l’ADN utilisé comme matrice, les erreurs de PCR ou
[7] [4] [8] [9]
encore la méthode d’analyse post-PCR choisie.
De nombreuses études ont été menées avec ces nouvelles méthodes permettant d’améliorer l’extraction,
[10]
la purification, l’amplification et la quantification de l’ADN des sols. Récemment, l’ISO 11063
décrivant «une méthode pour extraire directement les acides nucléiques d’échantillons de sol», dérivée
de la Référence [10], a ouvert de nouvelles perspectives de développement d’approches moléculaires
[11]
normalisées pour estimer la qualité du sol.
La présente Norme internationale a pour objectif de décrire le mode opératoire utilisé pour mettre en
place et réaliser une PCR quantitative afin de quantifier l’abondance de groupes microbiens du sol ainsi
que celle de groupes fonctionnels à partir d’extrait d’ADN de sol. La quantification des phyla microbiens
du sol ainsi que des groupes fonctionnels par des essais de qPCR peut contribuer au développement
d’outils de routine permettant de surveiller la qualité du sol. La répétabilité et la reproductibilité de la
méthode d’amplification par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) quantitative ont été évaluées
lors d’une étude interlaboratoires internationale (voir Annexe B). La répétabilité de cette méthode a été
évaluée avec succès pour les essais de qPCR ciblant les gènes ARNr 16S ainsi que des gènes codant un
marqueur fonctionnel de bactéries dénitrifiantes (le gène nitrite réductase nirK). La reproductibilité de
cette méthode a révélé un effet de laboratoire qui peut être surmonté en interprétant les résultats de la
quantification de l’abondance de groupes microbiens par comparaison, soit en utilisant une référence
externe (ADN extrait d’une souche témoin) lors de l’essai de qPCR, soit en calculant un pourcentage de
variations entre traitements pour normaliser les données.
© ISO 2016 – Tous droits réservés v

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NORME INTERNATIONALE ISO 17601:2016(F)
Qualité du sol — Estimation de l’abondance de séquences
de gènes microbiens par amplification par réaction de
polymérisation en chaîne (PCR) quantitative à partir d’ADN
directement extrait du sol
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie les étapes principales d’une méthode d’amplification par
réaction de polymérisation en chaîne (PCR) quantitative (qPCR) permettant de mesurer l’abondance de
séquences spécifiques de gènes microbiens à partir d’un extrait d’ADN du sol qui fournit une estimation
de l’abondance de groupes microbiens spécifiques.
Il convient de noter que le nombre de gènes n’est pas nécessairement lié directement au nombre de
micro-organismes mesurés. Par exemple, le nombre d’opérons ribosomiques est compris entre une
et 20 copies dans différents phyla bactériens. Par conséquent, le nombre de séquences d’ARNr 16S
quantifiées dans des extraits d’ADN du sol ne donne pas une estimation exacte du nombre de bactéries
contenues dans le sol. Par ailleurs, le nombre de séquences n’est pas nécessairement lié à des micro-
organismes vivants et peut comprendre des séquences amplifiées à partir de l’ADN extrait de micro-
organismes morts.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 10381-6, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 6: Lignes directrices pour la collecte, la
manipulation et la conservation, dans des conditions aérobies, de sols destinés à l’évaluation en laboratoire
des processus, de la biomasse et de la diversité microbiens
ISO 11063, Qualité du sol — Méthode pour extraire directement l’ADN d’échantillons de sol
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
ADN du sol
ADN extrait du biote vivant et mort du sol
EXEMPLE Micro-organismes, plantes, animaux.
3.2
amplification par réaction de polymérisation en chaîne
PCR
méthode permettant l’amplification d’une séquence spécifique d’ADN en utilisant un jeu spécifique
d’amorces oligonucléotidiques
© ISO 2016 – Tous droits réservés 1

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ISO 17601:2016(F)

3.3
amplification par réaction de polymérisation en chaîne quantitative
qPCR
méthode permettant la quantification dans une matrice (3.4) d’ADN du nombre d’une séquence
spécifique d’ADN en utilisant un jeu spécifique d’amorces oligonucléotidiques
3.4
matrice
échantillon d’ADN utilisé pour réaliser une réaction de PCR (3.2) afin d’amplifier une séquence
spécifique d’ADN
3.5
amplicon
produit de PCR obtenu par PCR (3.2) à partir d’une matrice (3.4)
3.6
vecteur de clonage
molécule d’ADN circulaire dans laquelle l’amplicon (3.5) est inséré par réaction de ligation, utilisée pour
la transformation d’Escherichia coli compétente en vue du clonage de l’amplicon
3.7
étalon de qPCR
ADN cible cloné utilisé comme matrice (3.4) pour la réaction qPCR afin d’établir la courbe d’étalonnage
de l’abondance d’une séquence cible en fonction des valeurs du cycle seuil (Ct)
3.8
témoin négatif
NTC
témoin, généralement de l’eau de qualité biologie moléculaire, qui est utilisé comme témoin négatif dans
l’essai de qPCR pour vérifier l’absence de contaminant dans le mélange de qPCR
3.9
cycle seuil
Ct
nombre de cycles de qPCR requis pour que le signal fluorescent franchisse la valeur seuil (c’est-à-dire
dépasse le bruit de fond)
Note 1 à l’article: La valeur de Ct est inversement proportionnelle à l’abondance de la séquence cible.
4 Principe
La présente Norme internationale décrit l’essai de qPCR utilisant un colorant fluorescent se fixant à
l’ADN comme rapporteur. Cet essai de qPCR a été validé lors d’une étude interlaboratoires internationale
menée avec le SYBR Green, un colorant fluorescent se fixant à l’ADN double brin et pouvant être détecté
en mesurant l’augmentation de fluorescence au cours du cycle.
La méthode vise à mesurer l’abondance de séquences spécifiques de gènes microbiens à partir d’un
extrait d’ADN du sol. La méthode comprend quatre tâches et huit étapes, comme résumé à la Figure 1.
Selon la Référence [1], les trois étapes critiques devant être validées pour chaque essai de qPCR sont
telles qu’indiquées à la Figure 1.
2 © ISO 2016 – Tous droits réservés

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ISO 17601:2016(F)

Figure 1 — Principales tâches et étapes critiques permettant d’estimer l’abondance de
séquences spécifiques de gènes microbiens par un essai de qPCR
La présente Norme internationale décrit l’essai de qPCR basé sur l’utilisation d’un colorant fluorescent
se fixant à l’ADN double brin qui a été validé par une étude interlaboratoires internationale utilisant le
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ISO 17601:2016(F)

1) 2)
® ®
qPCR SYBR Green . L’Annexe A fournit des informations sur l’essai de qPCR TaqMan qui n’a pas fait
l’objet d’une étude interlaboratoires internationale. La première tâche comporte trois étapes décrivant
la création d’un amplicon optimal pour la qPCR (étape une), la préparation d’étalons de qPCR (étape
deux) et le mode opératoire d’étalonnage de l’essai de qPCR (étape trois). La deuxième tâche comporte
deux étapes supplémentaires décrivant les modes opératoires de préparation des échantillons d’ADN
du sol (étape quatre) et d’essai pour détecter la présence d’inhibiteurs de qPCR dans les échantillons
d’ADN du sol (étape cinq). La troisième tâche comporte une seule étape décrivant le protocole pour
réaliser l’essai qPCR (étape six). Enfin, la quatrième tâche comporte deux étapes, l’une décrivant la
procédure de validation des essais de qPCR (étape sept) afin de vérifier la qualité de l’essai de qPCR,
et l’autre décrivant les différentes options permettant de calculer le nombre de copies de la séquence
du gène d’intérêt à partir du cycle seuil (Ct) obtenu par l’analyse des courbes d’amplification par qPCR
(étape huit).
5 Matériel d’essai
5.1 ADN
5.1.1 ADN, extrait d’isolats bactériens et fongiques purs en utilisant des modes opératoires d’extraction
classiques ou en utilisant un kit commercial pour extraire l’ADN génomique.
5.1.2 ADN du sol, extrait d’aliquotes de sol conformément à l’ISO 11063.
5.2 Bactéries
5.2.1 Souche d’Escherichia coli, habituellement utilisée pour le clonage d’un produit de PCR.
5.3 Plasmide
5.3.1 Vecteur de clonage, habituellement utilisé pour le clonage d’un produit de PCR dans une souche
d’Escherichia coli compétente.
5.4 Enzymes
5.4.1 Taq polymérase.
5.4.2 T4 ADN ligase.
5.4.3 Protéine T32 codée par le gène correspondant du phage T4.
5.4.4 Albumine de sérum de bovin (n° CAS 9048-46-8).
5.5 Produits chimiques
5.5.1 Ampicilline sodique, C H N NaO S (n° CAS 69-52-3).
16 18 3 4

1) SYBR Green est une marque déposée de Molecular Probes. Cette information est donnée à l’intention des
utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif du
produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est possible de démontrer qu’ils conduisent
aux mêmes résultats.

2) TaqMan est une marque déposée de Roche Molecular Systems, Inc. Cette information est donnée à l’intention des
utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif du
produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est possible de démontrer qu’ils conduisent
aux mêmes résultats.
4 © ISO 2016 – Tous droits réservés

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ISO 17601:2016(F)

5.5.2 Acide borique, BH O (n° CAS 10043-35-3).
3 3
5.5.3 Solution de désoxynucléotides, dNTPs.
®
5.5.4 Agent intercalent SYBR Safe permettant de visualiser l’ADN sur gel.
5.5.5 Sel disodique de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), C H N O Na ·2 H O
10 14 2 8 2 2
(n° CAS 6381-92 6).
5.5.6 Glucose, C H O (n° CAS 50-99-7).
6 12 6
5.5.7 Acide chlorhydrique, HCl (n° CAS 7647-01-0).
5.5.8 IPTG, Isopropyl-bêta-D-Thiogalactopyranoside (n° CAS 367-93-1).
5.5.9 Chlorure de magnésium, MgCl (n° CAS 7786-30-3).
2
5.5.10 Sulfate de magnésium, MgSO (n° CAS 7487-88-9).
4
5.5.11 Eau de qualité biologie moléculaire, H O.
2
5.5.12 Chlorure de potassium, KCl (n° CAS 7447-40-7).
5.5.13 Chlorure de sodium, NaCl (n° CAS 7647-14-5).
5.5.14 Tris[hydroxyméthyl]aminométhane, C H NO (n° CAS 77-86-1).
4 11 3
5.5.15 X-Gal, bromo-5-chloro-4-indolyl-3-bêta-D-galactopyranoside (n° CAS 7240-90-6).
5.6 Produit pour le milieu de culture bactérienne
3)
®
5.6.1 Bacto tryptone , digestat enzymatique de caséine.
5.6.2 Extrait de levure en poudre (n° CAS 8013-01-2).
5.7 Tampon et réactifs
5.7.1 Solution d’ampicilline, 2 g d’ampicilline sodique dans 4 ml de H O stérilisée à l’aide d’un filtre
2
de 0,22 µm. Compléter à 20 ml avec H O stérilisée, préparer des aliquotes de 1 ml et conserver à - 20 °C.
2
-1
5.7.2 EDTA, 0,5 mol·l , 186,10 g d’EDTA dans 1 000 ml de H O, en ajustant le pH à 8,0 à l’aide de NaOH
2
-1
(10 mol·l ).
5.7.3 Agent intercalant SYBR Safe™ permettant de visualiser l’ADN sur gel, diluer 10 000X de SYBR
Safe™ dans un tampon TBE × 1.

3) Bacto tryptone est la marque déposée d’un produit fourni par Difco Laboratories. Cette information est donnée à
l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi
exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est possible de démontrer qu’ils
conduisent aux mêmes résultats.
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ISO 17601:2016(F)

5.7.4 Solution mère d’IPTG, 1 g d’IPTG dans 8 ml de H O. Après l’avoir mélangée soigneusement,
2
la solution est complétée à 10 ml et stérilisée dans un poste de sécurité microbiologique. Préparer une
aliquote de 1 ml d’IPTG et la conserver à - 20 °C.
®
5.7.5 Milieu LB solide, 10 g de Bacto tryptone , 5 g d’extrait de levure, 5 g de chlorure de sodium et
15 g de gélose, dans 1 000 ml de H O. Après autoclavage pendant 20 min à 120 °C, 1 ml d’une solution
2
-1
mère d’ampicilline à 100 mg·ml est ajouté au milieu LB et étalé dans des boîtes de Petri (20 ml) dans
un poste de sécurité microbiologique. 100 µl de solution d’IPTG sont étalés sur le milieu LB solide-
ampicilline. Lorsque la solution d’IPTG a pénétré le milieu LB-ampicilline, 20 µl de solution X-Gal sont
étalés sur le milieu LB solide-ampicilline. Le milieu LB solide est conservé à 4 °C jusqu’à son utilisation.
®
5.7.6 Milieu SOC, 20 g de Bacto tryptone , 5 g d’extrait de levure, 0,58 g de NaCl, 0,95 g de MgCl ,
2
2,46 g de MgSO et 3,60 g de glucose dans 1 l de H O. Stériliser à l’autoclave pendant 20 min à 120 °C.
4 2
Préparer des aliquotes de 950 ml et les conserver à - 20 °C.
-1
5.7.7 Tris-HCl, 1 mol·l , 121,14 g de Tris dans 1 000 ml de H O, en ajustant le pH à 8,0 avec du HCl
2
4 mol/l.
-1
Tampon TBE × 10, pH 8,0, 108 g de base Tris, 55 g d’acide borique et 40 ml d’EDTA 0,5 mol·l (pH 8,0)
dans 1 000 ml de H O.
2
5.7.8 Tampon TBE × 1, 100 ml de tampon TBE × 10 dans 900 ml de H O.
2
-1 -1
5.7.9 Tampon TE × 10, pH 8,0, 100 ml de Tris-HCl 1 mol·l à pH 8,0, 20 ml d’EDTA 50 mmol·l à pH 8,0
dans 880 ml d’eau de qualité biologie moléculaire.
5.7.10 Tampon TE × 1, 100 ml de tampon TE × 10 dans 900 ml de H O.
2
5.7.11 Solution X-gal, 250 mg de X-Gal dans 5 ml de diméthylformamide. Après homogénéisation,
préparer des aliquotes de 0,5 ml et les conserver à - 20 °C.
6 Appareillage
Utiliser un matériel de laboratoire courant, notamment pipettes, centrifugeuse, poste de sécurité
microbiologique, hotte chimique, système d’électrophorèse horizontale et les éléments suivants.
6.1 PCR quantitative, permettant de quantifier en temps réel des amplicons générés à partir de
diverses matrices d’ADN, avec une limite de détection théorique d’une copie d’une séquence d’ADN cible
dans la prise d’échantillon analysée.
6.2 Spectrophotomètre, permettant de quantifier l’ADN double brin à 260 nm.
6.3 Spectrofluorimètre, permettant de quantifier l’ADN double brin.
NOTE Un seul de ces deux appareils est requis pour estimer la concentration d’ADN.
7 Mode opératoire
7.1 Préparation des étalons de qPCR et étalonnage de l’essai de qPCR (tâche 1)
7.1.1 Généralités
L’essai de qPCR est basé sur la quantification des amplicons à la fin de chaque cycle de PCR en utilisant
un colorant d’ADN qui émet une fluorescence lorsqu’il est intercalé dans le double brin des amplicons.
6 © ISO 2016 – Tous droits réservés

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ISO 17601:2016(F)

Le but de cette tâche est de décrire la définition d’un amplicon approprié en vue d’un essai de qPCR
(étape une), de la préparation d’un étalon de qPCR (étape deux) et de l’étalonnage de l’essai de qPCR
(étape trois).
7.1.2 Création de l’amplicon (tâche 1, étape 1)
7.1.2.1 Généralités
La première étape vise à créer un jeu d’amorces oligonucléotidiques. Il peut être conçu in silico à l’aide
de différents programmes en utilisant la séquence du gène microbien d’intérêt devant être quantifiée
par qPCR à partir d’extraits d’ADN de sol. La spécificité des amorces doit être vérifiée in silico en
comparant leurs séquences à des séquences connues disponibles dans la base de données Genbank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Seules les amorces spécifiques pour le gène cible doivent
être prises en compte. Les principaux paramètres à considérer pour la conception d’un jeu d’amorces
oligonucléotidiques en vue d’un essai de qPCR sont indiqués ci-après.
7.1.2.2 qPCR
— La longueur optimale de l’amplicon est comprise entre 100 pb et 250 pb.
— La longueur optimale des amorces est comprise entre 18 pb et 25 pb, avec une teneur en GC de 50 %
et une température de fusion comprise entre 58 °C et 65 °C.
— Il convient que les cinq nucléotides au niveau de l’extrémité 3” de chaque amorce ne contiennent pas
plus de deux bases G et/ou C.
— Éviter la succession de nucléotides identiques, en particulier pour la guanine.
— Il convient de vérifier et d’éviter l’auto-complémentarité 3” de l’amorce, indiquant sa tendance à
former des dimères avec elle-même.
— Éviter la conception d’amorces comportant plus de quatre mésappariements car une dégénérescence
trop importante de l’amorce contribue à la fluctuation des résultats de qPCR.
7.1.3 Préparation des étalon
...

PROJET DE NORME INTERNATIONALE
ISO/DIS 17601
ISO/TC 190/SC 4 Secrétariat: AFNOR
Début de vote: Vote clos le:
2013-09-26 2013-12-26
Qualité du sol — Estimation de l’abondance de séquences
de gènes microbiens par amplification par réaction de
polymérisation en chaîne (PCR) quantitative en temps réel
à partir d’ADN directement extrait du sol
Soil quality — Estimation of abundance of selected microbial gene sequences by quantitative realtime PCR
from DNA directly extracted from soil
ICS: 13.080.30
CE DOCUMENT EST UN PROJET DIFFUSÉ POUR
OBSERVATIONS ET APPROBATION. IL EST DONC
SUSCEPTIBLE DE MODIFICATION ET NE PEUT
ÊTRE CITÉ COMME NORME INTERNATIONALE
AVANT SA PUBLICATION EN TANT QUE TELLE.
OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR
ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES
FINS INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET
COMMERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE
DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE
CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR
POSSIBILITÉ DE DEVENIR DES NORMES
POUVANT SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA
RÉGLEMENTATION NATIONALE.
Numéro de référence
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET
ISO/DIS 17601:2013(F)
SONT INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS
OBSERVATIONS, NOTIFICATION DES DROITS
DE PROPRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT
ÉVENTUELLEMENT CONNAISSANCE ET À
©
FOURNIR UNE DOCUMENTATION EXPLICATIVE. ISO 2013

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ISO/DIS 17601:2013(F)

Notice de droit d’auteur
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Les contrevenants pourront être poursuivis.
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ISO/DIS 17601
Sommaire Page
Avant-propos . 4
Introduction . 5
1  Domaine d'application . 1
2  Références normatives . 1
3  Termes et définitions . 1
4  Principe . 2
5  Matériel d’essai . 3
5.1  ADN . 3
5.2  Bactéries . 3
5.3  Plasmide

3
5.4  Enzymes et protéines . 3
5.5  Produits chimiques . 3
5.6  Produit pour le milieu de culture bactérienne . 4
5.7  Tampon et réactifs . 4
6  Appareillage . 5
7  Mode opératoire . 6
7.1  Préparation des étalons de qPCR et étalonnage de l'analyse par qPCR (tâche 1) . 6
7.2  Préparation d'une matrice d'ADN du sol et essai d'inhibition (tâche 2) . 12
7.3  Analyse par qPCR (tâche 3) . 14
7.4  Validation et examen de l'analyse par qPCR (tâche 4) . 15
8  Validation de l'analyse par qPCR . 16
9  Expression des résultats de l'analyse par qPCR . 16
10  Rapport d'essai . 17
Annexe A (informative) Étude interlaboratoires internationale relative à l'évaluation de la
quantification de l'abondance de groupes microbiens par qPCR . 18
Annexe B (informative) Analyse basée sur un essai qPCR SYBR Green . 19
B.1  Préparation de l'étalon de qPCR SYBR Green et étalonnage de l'analyse par qPCR SYBR
Green16) . 19
B.2  Préparation d'une matrice d'ADN du sol et essai d'inhibition . 19
B.3  Analyse par qPCR SYBR Green . 19
B.4  Validation et examen de l'analyse par qPCR SYBR Green . 19
Annexe C (informative) Analyse basée sur un essai qPCR TaqMan . 20
C.1  Préparation de l'étalon de qPCR TaqMan et étalonnage de l'analyse par qPCR TaqMan . 20
C.2  Préparation d'une matrice d'ADN du sol et essai d'inhibition . 20
C.3  Analyse par qPCR TaqMan . 20
C.4  Validation et examen de l'analyse par qPCR TaqMan . 20
Bibliographie . 21

iii © ISO 2013 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO/DIS 17601

Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 17601 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4, Méthodes
biologiques.
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ISO/DIS 17601
Introduction
L'ADN (acide désoxyribonucléique) est un constituant majeur de tout organisme vivant codant pour les
enzymes responsables de ses activités biologiques. L’étude des séquences d’ADN extrait de différentes
matrices environnementales, à l’aide d’approches moléculaires, permet de fournir des marqueurs
moléculaires qui peuvent être utilisés pour différencier et identifier clairement différents micro-organismes
(bactéries, archées et eucaryotes).
Jusqu’à présent, la plupart des études visant à développer des indicateurs microbiens de la qualité du sol et
applicables aux milieux complexes, tels que le sol, étaient biaisées par la nature incultivable de nombreux
micro-organismes et par le manque de sensibilité des méthodes microbiologiques classiques [1]. Le
développement récent de nombreuses méthodes de biologie moléculaire reposant principalement sur
l'amplification des acides nucléiques extraits du sol a permis de proposer une alternative pertinente à la
microbiologie pasteurienne permettant de connaître en détail la composition, la richesse et la structure des
communautés microbiennes [2], [3], [4], [5], [6]. Les approches reposant sur l’extraction de l’ADN à partir
d’échantillons environnementaux sont désormais bien établies dans le domaine de l’écologie des sols et
servent de marqueurs génétiques permettant d’évaluer la diversité microbienne. Les résultats d’analyses
moléculaires des communautés et/ou populations microbiennes du sol reposent sur deux paramètres
principaux : (i) l’extraction d’ADN représentatif de la composition de la communauté microbienne indigène et
(ii) les biais introduits par la PCR, notamment le choix des amorces oligo-nucléotidiques, la concentration de
l’ADN utilisé comme matrice pour la PCR, les erreurs de PCR ou encore la méthode d’analyse post-PCR
choisie [7], [4], [8], [9].
De nombreuses études ont été conduites avec ces nouvelles méthodes permettant d’améliorer l’extraction, la
purification, l’amplification et la quantification de l’ADN des sols [10]. Récemment, l'ISO 11063 décrivant « une
méthode pour extraire directement les acides nucléiques d'échantillons de sol », dérivée de [10], a ouvert de
nouvelles perspectives de développement d'approches moléculaires normalisées pour estimer la qualité du
sol [11].
La présente Norme internationale a pour objectif de décrire le mode opératoire utilisé pour mettre en place et
réaliser une PCR quantitative afin de quantifier l'abondance de groupes microbiens du sol ainsi que les
groupes fonctionnels à partir d’extrait d’ADN de sol. La quantification des phyla microbiens du sol ainsi que
des groupes fonctionnels par des analyses qPCR peut contribuer au développement d'outils de routine
permettant de surveiller la qualité du sol. A la demande de l'ISO, la reproductibilité de la quantification de
l'abondance de séquences spécifiques de gènes microbiens par amplification par réaction de polymérisation
en en chaîne par polymérase (PCR) quantitative en temps réel à partir d’ADN directement extrait du sol, a été
évaluée lors d'une étude interlaboratoires internationale (Annexe A).
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PROJET DE NORME INTERNATIONALE ISO/DIS 17601

Qualité du sol — Estimation de l’abondance de séquences de
gènes microbiens par amplification par réaction de
polymérisation en chaîne (PCR) quantitative en temps réel à
partir d’ADN directement extrait du sol
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie les étapes cruciales d'une méthode d'amplification par réaction de
polymérisation en chaîne (PCR) quantitative en temps réel (qPCR) permettant de mesurer l'abondance de
séquences spécifiques de gènes microbiens à partir d'un extrait d'ADN du sol qui fournit une estimation de
l’abondance de groupes microbiens spécifiques.
Il convient de noter que le nombre de gènes n'est pas nécessairement lié directement au nombre de micro-
organismes mesurés. Par exemple, le nombre d'opérons ribosomiques va d'une copie à 20 copies dans
différents phyla bactériens. Par conséquent, le nombre de séquences d'ARNr 16S quantifiées dans des
extraits d'ADN du sol ne donne pas une estimation exacte du nombre de bactéries du sol. Par ailleurs, le
nombre de séquences n'est pas nécessairement lié à des micro-organismes vivants et peut comprendre des
séquences amplifiées à partir de l’ADN extrait de micro-organismes morts.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 10381-6, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 6 : Lignes directrices pour la collecte, la
manipulation et la conservation, dans des conditions aérobies, de sols destinés à l'évaluation en laboratoire
des processus, de la biomasse et de la diversité microbiens.
ISO 11063, Qualité du sol — Méthode pour extraire directement l'ADN d'échantillons de sol.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
ADN du sol
ADN extrait du biote vivant et mort du sol
EXEMPLE Micro-organismes, plantes, animaux.
3.2
amplification par réaction de polymérisation en chaîne
PCR
méthode permettant l'amplification d'une séquence spécifique d'ADN en utilisant une paire spécifique
d'amorces oligonucléotidiques
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ISO/DIS 17601

3.3
amplification par réaction de polymérisation quantitative en temps réel
qPCR
méthode permettant la quantification dans une matrice d’ADN du nombre d'une séquence spécifique d'ADN
en utilisant une paire spécifique d'amorces oligonucléotidiques
3.4
matrice
échantillon d'ADN utilisé pour réaliser une réaction de PCR afin d'amplifier une séquence spécifique d'ADN
3.5
amplicon
produit de PCR obtenu par PCR à partir d'une matrice
3.6
vecteur de clonage
molécule d'ADN circulaire dans laquelle l'amplicon est inséré par réaction de ligation, utilisée pour la
transformation d'Escherichia coli compétente en vue du clonage de l'amplicon
4 Principe
La méthode vise à mesurer l'abondance de séquences spécifiques de gènes microbiens à partir d'un extrait
d'ADN du sol. La méthode comprend quatre tâches et huit étapes, comme illustré à la Figure 1.

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ISO/DIS 17601
Figure 1 — Principales tâches permettant d'estimer l'abondance de séquences spécifiques de gènes
microbiens par qPCR
La première tâche comporte trois étapes décrivant la conception d'un amplicon optimal pour la qPCR (étape
une), la préparation d'étalons de qPCR (étape deux) et le mode opératoire d'étalonnage de l'analyse par
qPCR (étape trois). La deuxième tâche comporte deux étapes supplémentaires décrivant les modes
opératoires de préparation des échantillons d'ADN du sol (étape quatre) et d'essai pour détecter la présence
d'inhibiteurs de qPCR dans les échantillons d'ADN du sol (étape cinq). La troisième tâche comporte une seule
1) 2)
étape décrivant le protocole pour réaliser les analyses par qPCR de SYBR® Green et TaqMan® (étape
six). Enfin, la quatrième tâche comporte deux étapes, l'une décrivant la procédure de validation des analyses
par qPCR (étape sept) afin de vérifier la qualité de l'analyse par qPCR, et l'autre décrivant les différentes
options permettant de calculer le nombre de séquences de la copie du gène d'intérêt à partir du cycle seuil
(Ct) obtenu par l'analyse de tracés d'amplification par qPCR (étape huit).
5 Matériel d’essai
5.1 ADN
5.1.1 L'ADN est extrait d'isolats bactériens et fongiques purs en utilisant des modes opératoires d'extraction
classiques ou en utilisant un kit du commerce pour extraire l'ADN génomique.
5.1.2 L'ADN du sol est extrait d'aliquotes de sol conformément à l'ISO 11063.
5.2 Bactéries
5.2.1 Souche d'Escherichia coli, habituellement utilisée pour le clonage de produit de PCR.
5.3 Plasmide
5.3.1 Vecteur de clonage, habituellement utilisé pour le clonage d'un produit de PCR dans une souche
d’Escherichia coli compétente, comportant les amorces oligonucléotidiques universelles SP6 et T7 situées de
part et d’autre du site d’insertion.
5.4 Enzymes et protéines
5.4.1 Taq polymérase.
5.4.1 T4 ADN ligase.
5.4.3 Protéine T32 codée par le gène correspondant du phage T4.
5.4.4 Albumine de sérum de bovin (n° CAS 9048-46-8).
5.5 Produits chimiques
5.5.1 Ampicilline sodique, C H N NaO S (n° CAS 69-52-3).
16 18 3 4
5.5.2 Acide borique, BH O (n° CAS 10043-35-3).

3 3

1)
SYBR Green est une marque déposée de Molecular Probes. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs du présent
document et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents
peuvent être utilisés s’il est possible de démontrer qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
2)
TaqMan est une marque déposée de Roche Molecular Systems, Inc. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs du
présent document et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits
équivalents peuvent être utilisés s’il est possible de démontrer qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
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5.5.3 Solution de désoxynucléotides, dNTPs.
5.5.4 Bromure d'éthidium (n° CAS 1239-45-8).
5.5.5 Sel disodique de l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), C H N O Na ·2 H O
10 14 2 8 2 2
(n° CAS 6381-92 6).
5.5.6 Glucose, C H O (n° CAS 50-99-7).
6 12 6
5.5.7 Acide chlorhydrique, HCl (n° CAS 7647-01-0).
5.5.8 IPTG, Isopropyl-bêta-D-Thiogalactopyranoside (n° CAS 367-93-1).
5.5.9 Chlorure de magnésium, MgCl (n° CAS 7786-30-3).
2
5.5.10 Sulfate de magnésium, MgSO (n° CAS 7487-88-9).
4
5.5.11 Eau de qualité biologie moléculaire, H O.
2
5.5.12 Chlorure de potassium, KCl (n° CAS 7447-40-7).
5.5.13 Chlorure de sodium, NaCl (n° CAS 7647-14-5).
5.5.14 Tris[hydroxyméthyl]aminométhane, C H NO (n° CAS 77-86-1).
4 11 3
5.5.15 X-Gal, bromo-5-chloro-4-indolyl-3-bêta-D-galactopyranoside (n° CAS 7240-90-6).
5.6 Produit pour le milieu de culture bactérienne
3)
5.6.1 Bacto® tryptone, digestat enzymatique de caséine.
5.6.2 Extrait de levure en poudre (n° CAS 8013-01-2).
5.6.3 Gélose
5.7 Tampon et réactifs
5.7.1 Solution d'ampicilline, 2 g d'ampicilline sodique dans 4 ml de H O stérilisée à l'aide d'un filtre de
2
0,22 µm. Compléter à 20 ml avec H O stérilisée, préparer des aliquotes de 1 ml et conserver à - 20 °C.
2
5.7.2 EDTA, 0,5 mol/l, 186,10 g d'EDTA dans 1 000 ml de H O, en ajustant le pH à 8,0 à l'aide de NaOH
2
(10 mol/l).
5.7.3 Bromure d'éthidium, 5 mg de bromure d'éthidium dans 1 000 ml de H O.
2
5.7.4 Solution mère d'IPTG, 1 g d'IPTG dans 8 ml de H O. Après l'avoir mélangée soigneusement, la
2
solution est complétée à 10 ml et stérilisée dans un poste de sécurité microbiologique. Préparer une aliquote
de 1 ml d'IPTG et la conserver à - 20 °C.

3)
Bacto tryptone est la marque déposée d'un produit fourni par Difco Laboratories. Cette information est donnée à l'intention des
utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du produit ainsi désigné.
Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est possible de démontrer qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
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ISO/DIS 17601
TM 3)
5.7.5 Milieu LB solide, 10 g de Bacto -tryptone, 5 g d'extrait de levure, 5 g de chlorure de sodium,
15 g de gélose, dans 1 000 ml de H O. Après passage à l'autoclave pendant 20 min à 120 °C, le milieu LB est
2
versé dans des boîtes de Petri stériles (20 ml) dans un poste de sécurité microbiologique. Après solidification,
les boîtes de Pétri contenant le milieu LB sont conservées à 4 °C jusqu'à leur utilisation.
5.7.6 Milieu LB/Amp solide, préparé selon la recette du milieu LB solide, excepté qu'après le passage à
-1
l'autoclave pendant 20 min à 120 °C, 1 ml d'une solution mère d'ampicilline à 100 mg·ml est ajouté au milieu
LB.
5.7.5 Milieu LB/Amp/X-Gal/IPTG solide, préparé selon la recette du milieu LB/Amp solide. Dans un poste
de sécurité microbiologique, 100 µl de solution d'IPTG sont appliqués sur le milieu LB/Amp solide. Après
évaporation, 20 µl de solution X-Gal sont plaqués sur le milieu solide. Ce milieu solide est conservé comme
décrit ci-dessus.
TM 3)
5.7.8 Milieu LB liquide, 10 g de Bacto -tryptone, 5 g d'extrait de levure, 5 g de chlorure de sodium,
dans 1 000 ml de H O, passés à l'autoclave pendant 20 min à 120 °C.
2
5.7.9 Milieu LB/Amp liquide, préparé selon la recette du milieu LB liquide, excepté qu'après le passage à
-1
l'autoclave pendant 20 min à 120 °C, 0,2 ml d'une solution mère d'ampicilline à 100 mg·ml est ajouté au
milieu LB.
TM 3)
5.7.10 Milieu SOC, 20 g de Bacto -tryptone, 5 g d'extrait de levure, 0,58 g de NaCl, 0,95 g de MgCl ,
2
2,46 g de MgSO , 3,60 g de glucose dans 1 l de H O. Stériliser à l'autoclave pendant 20 min à 120 °C.
4 2
Préparer des aliquotes de 950 ml et les conserver à - 20 °C.
5.7.11 Tris-HCl, 1 mol/l, 121,14 g de Tris dans 1 000 ml de H O, en ajustant le pH à 8,0 avec du HCl 4 mol/l.
2
5.7.12 Tampon TBE × 10, pH 8,0, 108 g de base Tris, 55 g d'acide borique, 40 ml d'EDTA 0,5 mol/l (pH 8,0)
dans 1 000 ml de H O.
2
5.7.13 Tampon TBE × 1, 100 ml de tampon TBE × 10 dans 900 ml de H O.
2
5.7.14 Tampon TE × 10, pH 8,0, 100 ml de Tris-HCl 1 mol/l à pH 8,0, 20 ml d'EDTA 50 mmol/l à pH 8,0
dans 880 ml de H O.
2
5.7.15 Tampon TE × 1, 100 ml de tampon TE × 10 dans 900 ml de H O.
2
5.7.16 Solution X-gal, 250 mg de X-Gal dans 5 ml de diméthylformamide 5 ml. Après homogénéisation,
préparer une aliquote de 0,5 ml et la conserver à - 20 °C.
6 Appareillage
Utiliser un matériel de laboratoire courant, notamment pipettes, centrifugeuse, poste de sécurité
microbiologique, hotte chimique, système d’électrophorèse horizontale et les éléments suivants.
6.1 PCR quantitative, permettant de quantifier en temps réel des amplicons à partir de diverses matrices
d'ADN, avec une limite de détection d'une copie d'une séquence d’ADN cible dans la prise d’échantillon
analysée.
6.2 Spectrophotomètre, permettant de quantifier l'ADN double brin à 260 nm.
NOTE Un seul de ces deux appareils est requis pour estimer la concentration d'ADN.
4)
6.3 Spectrofluorimètre , permettant de quantifier l'ADN double brin.
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7 Mode opératoire
7.1 Préparation des étalons de qPCR et étalonnage de l'analyse par qPCR (tâche 1)
7.1.1 Généralités
Le but de cette tâche est de décrire la définition d'un amplicon approprié en vue d'une analyse par qPCR
(étape une), de la préparation d'un étalon de qPCR (étape deux) et de l'étalonnage de l'analyse par qPCR
(étape trois). Pour la première étape de la tâche 1, la conception d'un amplicon en vue d'une analyse par
qPCR SYBR Green ou TaqMan est considérée séparément pour des raisons techniques. En effet, ces deux
analyses par qPCR diffèrent notamment par la méthode utilisée pour la quantification en temps réel des
amplicons : (i) pour la première méthode, les amplicons sont quantifiés à la fin de chaque cycle de PCR en
utilisant le SYBR Green qui émet une fluorescence lorsqu'il est intercalé dans la double hélice de l'amplicon,
(ii) pour la deuxième méthode, la libération d'un colorant fluorescent à la suite de l'hydrolyse d'une sonde
interne résultant de l'activité exonucléase 5´–3´ de la Taq polymérase est estimée à la fin de chaque cycle de
PCR. Pour ces raisons, les spécifications techniques relatives à la mise en œuvre de ces deux méthodes
différentes sont légèrement divergentes.
7.1.2 Conception de l'amplicon (tâche 1, étape 1)
7.1.2.1 Généralités
La première étape vise à concevoir une paire d'amorces oligonucléotidiques pour amplifier un amplicon
approprié optimisant l'analyse par qPCR. La conception de la paire d'amorces peut être effectuée in silico à
l'aide de différents programmes en utilisant la séquence du gène microbien d'intérêt devant être quantifiée par
qPCR à partir d'extraits d'ADN de sol. La spécificité des amorces doit être vérifiée in silico en comparant leurs
séquences à des séquences connues disponibles dans la base de données Genbank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Seuls les amorces spécifiques pour le gène cible doivent être prises
en compte. Les principaux paramètres à considérer pour la conception d'un jeu d'amorces oligonucléotidiques
en vue d'une analyse par qPCR SYBR Green ou TaqMan sont indiqués ci-après.
7.1.2.2 qPCR SYBR Green
 La longueur optimale de l'amplicon est comprise entre 100 pb et 250 pb ;
 la longueur optimale des amorces est comprise entre 18 pb et 25 pb, avec une teneur en GC de 50 % et
une température de fusion comprise entre 58 °C et 65 °C ;
 il convient que les cinq nucléotides au niveau de l'extrémité 3´ de chaque amorce ne contiennent pas
plus de deux bases G et/ou C ;
 éviter la succession de nucléotides identiques, en particulier pour la guanine ;
 il convient de vérifier et d'éviter l'auto-complémentarité 3' de l'amorce, prise comme mesure de sa
tendance à former des dimères avec elle-même.
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7.1.2.3 qPCR TaqMan
En premier lieu, la sonde TaqMan doit être conçue, puis les amorces choisies de part et d’autre de façon à
entourer aussi près que possible la sonde sans chevauchement. Les principaux paramètres à considérer pour
concevoir la sonde interne sont indiqués ci-après :
 la teneur en GC doit être maintenue dans la plage de 20 % à 80 % ;
 il convient que la température de fusion (T ) soit comprise entre 58 °C et 65 °C (similaire à celle du jeu
m
d'amorces utilisée dans l'analyse TaqMan) ;
 éviter la succession de nucléotides identiques, en particulier pour la guanine (G) ;
 ne pas placer de base G sur l'extrémité 5´ de la sonde TaqMan ;
 sélectionner le brin contenant plus de bases C que de bases G.
Les recommandations données pour la qPCR pour choisir la paire d'amorces doivent également être
respectées pour concevoir les amorces pour la qPCR TaqMan. Toutefois, les utilisateurs doivent garder à
l'esprit que plus la taille de l'amplicon est petite (mais sans chevauchement avec la sonde TaqMan), meilleure
l’amplification est la meilleure.
7.1.3 Préparation des étalons de qPCR (tâche 1, étape 2)
L'étape 2 de la tâche 1 décrit le mode opératoire utilisé pour générer des étalons de qPCR ciblant une
séquence du gène microbien d'intérêt à partir de différentes matrices d'ADN (isolat bactérien ou fongique pur,
ADN environnemental ou ADN artificiel). Elle indique également le mode opératoire utilisé pour insérer l'étalon
de qPCR dans un vecteur de clonage, transformer Escherichia coli et purifier les plasmides recombinants
abritant l'étalon de qPCR en vue de leur utilisation ultérieure pour des analyses par qPCR.
7.1.4 ADN d'isolat, ADN environnemental, ADN artificiel
7.1.4.1 Généralités
La première étape de la préparation d'étalons de qPCR repose sur l'extraction de matrices d'ADN connues
pour contenir le gène microbien d'intérêt. Elle peut être réalisée à partir de différentes matrices biologiques :
1) cultures bactériennes ou fongiques pures ;
2) échantillons environnementaux ou 3) ADN artificiel :
i) l'ADN est extrait de cellules bactériennes ou fongiques prélevées dans une culture fraîche en
utilisant des protocoles d'extraction d'ADN génomique classiques ;
ii) l'ADN est extrait des matrices environnementales selon différents protocoles. Lorsque des
échantillons de sol sont étudiés, l'ADN est extrait conformément à l'ISO 11063 qui décrit une
méthode permettant d'extraire directement les acides nucléiques du sol ;
3) en variante, si aucun échantillon biologique n'est disponible ou connu pour contenir le gène d'intérêt,
il est possible de synthétiser de l'ADN artificiel constitué de la séquence du gène d'intérêt.
Dans tous les cas, la quali
...