ISO 17601:2016

Soil quality — Estimation of abundance of selected microbial gene sequences by quantitative PCR from DNA directly extracted from soil

ISO 17601:2016 specifies the crucial steps of a quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) method to measure the abundance of selected microbial gene sequences from soil DNA extract which provides an estimation of selected microbial groups. It is noteworthy that the number of genes is not necessarily directly linked to the number of organisms that are measured. For example, the number of ribosomal operon is ranging from one copy to 20 copies in different bacterial phyla. Therefore, the number of 16S rRNA sequences quantified from soil DNA extracts does not give an exact estimate of the number of soil bacteria. Furthermore, the number of sequences is not necessarily linked to living microorganisms and can comprise sequences amplified from dead microorganisms.

Qualité du sol — Estimation de l'abondance de séquences de gènes microbiens par amplification par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) quantitative à partir d'ADN directement extrait du sol

ISO 17601:2016 spécifie les étapes principales d'une méthode d'amplification par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) quantitative (qPCR) permettant de mesurer l'abondance de séquences spécifiques de gènes microbiens à partir d'un extrait d'ADN du sol qui fournit une estimation de l'abondance de groupes microbiens spécifiques. Il convient de noter que le nombre de gènes n'est pas nécessairement lié directement au nombre de micro-organismes mesurés. Par exemple, le nombre d'opérons ribosomiques est compris entre une et 20 copies dans différents phyla bactériens. Par conséquent, le nombre de séquences d'ARNr 16S quantifiées dans des extraits d'ADN du sol ne donne pas une estimation exacte du nombre de bactéries contenues dans le sol. Par ailleurs, le nombre de séquences n'est pas nécessairement lié à des micro-organismes vivants et peut comprendre des séquences amplifiées à partir de l'ADN extrait de micro-organismes morts.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 11-Jan-2016
• ICS: 13.080.30 - Biological properties of soils
• Technical Committee: ISO/TC 190/SC 4 - Biological characterization
• Drafting Committee: ISO/TC 190/SC 4/WG 4 - Effects on soil micro-organisms

Standards Content (Sample)

DRAFT INTERNATIONAL STANDARD
ISO/DIS 17601
ISO/TC 190/SC 4 Secretariat: AFNOR
Voting begins on: Voting terminates on:
2013-09-26 2013-12-26
Soil quality — Estimation of abundance of selected
microbial gene sequences by quantitative realtime PCR
from DNA directly extracted from soil
Qualité du sol — Estimation de l’abondance de séquences spécifiques de gènes microbiens par
amplification en chaîne par polymerase (PCR) quantitative en temps réel à partir d’ADN directement
extrait du sol
ICS: 13.080.30
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THEREFORE SUBJECT TO CHANGE AND MAY
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IN ADDITION TO THEIR EVALUATION AS
BEING ACCEPTABLE FOR INDUSTRIAL,
TECHNOLOGICAL, COMMERCIAL AND
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STANDARDS MAY ON OCCASION HAVE TO
BE CONSIDERED IN THE LIGHT OF THEIR
POTENTIAL TO BECOME STANDARDS TO
WHICH REFERENCE MAY BE MADE IN
Reference number
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ISO/DIS 17601:2013(E)
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TO SUBMIT, WITH THEIR COMMENTS,
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RIGHTS OF WHICH THEY ARE AWARE AND TO
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ISO/DIS 17601:2013(E)
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ii © ISO 2013 – All rights reserved

ISO/DIS 17601
Contents Page
Foreword . iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Scope . 1
3 Normative references . 1
4 Terms and definitions . 1
5 Principle. 2
6 Test materials . 3
6.1 DNA . 3
6.2 Bacteria. 3
6.3 Plasmid . 3
6.4 Enzymes and proteins . 3
6.5 Chemicals . 3
6.6 Product for bacterial culture medium . 4
6.7 Buffer and reagents . 4
7 Apparatus . 5
7.1 Quantitative PCR, allowing the real time quantification of amplicons from various DNA
templates with detection limit of one copy of a sequence target per sample analysed. . 5
7.2 Spectro-photometer , allowing the quantification of double-strand DNA at 260 nm. . 5
4)
7.3 Spectro-fluorimeter , allowing the quantification of double-strand DNA. . 5
8 Procedure . 5
8.1 qPCR standard preparation and calibration of qPCR assay (task 1) . 5
8.2 Preparation of soil DNA template and inhibition test (task 2) . 11
8.3 qPCR assay (task 3) . 13
8.4 Validation and analysis of qPCR assay (task 4) . 13
9 Validation of the qPCR assay . 15
10 Expression of the results of the qPCR assay . 15
11 Test report . 15
Annex A (informative) International ring test for evaluating quantification of the abundance of
microbial groups by qPCR . 16
Annex B (informative)  SYBR Green qPCR based assay . 17
A.1 SYBR Green qPCR standard preparation and calibration of SYBR Green16) qPCR assay . 17
A.2 Preparation of soil DNA template and inhibition test . 17
A.3 SYBR Green qPCR assay . 17
A.4 Validation and analysis of SYBR Green qPCR assay . 17
Annex B (informative) Taqman qPCR based assay . 18
B.1 TaqMan qPCR standard preparation and calibration of TaqMan qPCR assay . 18
B.2 Preparation of soil DNA template and inhibition test . 18
B.3 TaqMan qPCR assay . 18
B.4 Validation and analysis of TaqMan qPCR assay . 18
Bibliography . 19

ISO/DIS 17601
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 17601 was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4, Biological
methods.
This second/third/. edition cancels and replaces the first/second/. edition (), [clause(s) / subclause(s) /
table(s) / figure(s) / annex(es)] of which [has / have] been technically revised.
iv © ISO 2013 – All rights reserved

ISO/DIS 17601
Introduction
DNA (deoxyribonucleic acids) is a major component of any living organisms coding for enzymes responsible
for their biological activities. The study of DNA sequences from DNA sources extracted from different
environmental matrixes, by means of numerous molecular approaches, provides molecular markers that can
be used to sharply distinguish and identify different organisms (bacteria, archaea and eucaryotes).
Up to now, most of the studies aiming to develop microbial soil quality indicators applicable to complex
environment, such as soil, were biased by the unculturability of many microorganisms and the lack of
sensitivity of traditional microbiological methods [1]. The recent development of numerous molecular biology
methods based primarily on amplification of soil-extracted nucleic acids have provided a pertinent alternative
to classical culture-based microbiological methods, providing unique insight into the composition, richness,
and structure of microbial communities [2], [3], [4], [5], [6]. DNA-based approaches are now well established in
soil ecology and serve as genotypic (= molecular genetic) markers for determining microbial diversity. The
results of molecular analyses of soil microbial communities and/or populations rely on two main parameters:
(i) the extraction of DNA representative of the indigenous bacterial community composition and (ii) PCR bias,
such as the choice of primers, the concentration of amplified DNA, errors in the PCR, or even the method
chosen for analysis [7], [4], [8], [9].
Numerous studies have investigated new methods to improve extraction, purification, amplification, and
quantification of DNA from soils [10]. Recently ISO 11063 reporting “ a method to extract nucleic acids directly
from soil samples„ derived from [10] is opening a new window for developing standardized molecular
approaches to estimate soil quality [11].
The aim of this International Standard is to describe the procedure used to set-up and perform quantitative
PCR to quantify the abundance of soil microbial phyla as well as functional groups from DNA directly
extracted from soil samples. The quantification of soil microbial phyla as well as functional groups by qPCR
assays can contribute to the development of routine tools to monitor soil quality. At the demand of ISO, the
reproducibility of the quantification of the abundance of selected microbial gene sequences by quantitative
realtime PCR from DNA directly extracted from soil was assessed in an International ring test study (Annex
A).
DRAFT INTERNATIONAL STANDARD ISO/DIS 17601

Soil quality — Estimation of abundance of selected microbial
gene sequences by quantitative realtime PCR from DNA directly
extracted from soil
1 Scope
2 Scope
This International Standard specifies the crucial steps of a quantitative real-time polymerase chain reaction
(qPCR) method to measure the abundance of selected microbial gene sequences from soil DNA extract which
provides an estimation of selected microbial groups.
It is noteworthy that the number of genes is not necessarily directly linked to the number of organisms that are
measured. For example, the number of ribosomal operon is ranging from one copy to 20 copies in different
bacterial phyla. Therefore the number of 16S rRNA sequences quantified from soil DNA extracts does not give
an exact estimate of the number of soil bacteria. Furthermore the number of sequences is not necessarily
linked to living microorganisms and can comprise sequences amplified from dead microorganisms.
3 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 10381-6, Soil quality — Sampling — Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil
under aerobic conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the
laboratory
ISO 11063, Soil quality — Method to directly extract DNA from soil samples
4 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
soil DNA
DNA extracted from soil of living and dead biota
EXAMPLE Microorganisms plants, animals.
3.2
polymerase chain reaction
PCR
method allowing the amplification of a specific DNA sequence using a specific pair of oligonucleotide primers
3.3
quantitative realtime polymerase chain reaction
qPCR
method allowing the quantification in a template of the number of a specific DNA sequence using a specific
pair of oligonucleotide primers
ISO/DIS 17601
3.4.
template
DNA sample used to perform PCR to amplify a specific DNA sequence
3.5
amplicon
PCR product obtained by PCR from a template
3.6
cloning vector
circular DNA molecule in which the amplicon is inserted by ligation used to t
...

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 17601
First edition
2016-01-15
Soil quality — Estimation of
abundance of selected microbial gene
sequences by quantitative PCR from
DNA directly extracted from soil
Qualité du sol — Estimation de l’abondance de séquences de gènes
microbiens par amplification par réaction de polymérisation en
chaîne (PCR) quantitative à partir d’ADN directement extrait du sol
Reference number
©
ISO 2016
© ISO 2016, Published in Switzerland
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form
or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
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ii © ISO 2016 – All rights reserved

Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Test materials . 4
5.1 DNA . 4
5.2 Bacteria . 4
5.3 Plasmid . 4
5.4 Enzyme . 4
5.5 Chemicals . 4
5.6 Product for bacterial culture medium . 5
5.7 Buffer and reagents . 5
6 Apparatus . 6
7 Procedure. 6
7.1 qPCR standard preparation and calibration of qPCR assay (task 1) . 6
7.1.1 General. 6
7.1.2 Amplicon design (task 1, step 1) . 6
7.1.3 qPCR standard preparation (task 1, step 2) . 7
7.1.4 Isolate DNA, environmental DNA, artificial DNA . 7
7.1.5 Calibration of the qPCR (task 1, step 3) . 9
7.2 Preparation of soil DNA template and inhibition test (task 2) .10
7.2.1 General.10
7.2.2 Soil DNA preparation (task 2, step 4) .10
7.2.3 Inhibition test (task 2, step 5) .10
7.2.4 Dilution of DNA template .12
7.3 qPCR assay (task 3) .12
7.3.1 General.12
7.3.2 qPCR .12
7.4 Validation and analysis of qPCR assay (task 4) .12
7.4.1 General.12
7.4.2 Validation of the qPCR assay .12
7.4.3 Calculation of the copy number of the gene of interest in the soil DNA extract.13
8 Examination of the critical steps of the qPCR assay .14
9 Expression of the results of the qPCR assay .14
10 International ring test .14
11 Test report .14 ®
Annex A (informative) Description of principal steps of TaqMan qPCR assay .15
Annex B (informative) International ring-test for evaluating qPCR to quantify the
abundance of selected microbial gene sequences from DNA directly extracted from soil .17
Bibliography .30
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical
Barriers to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,
Biological methods.
iv © ISO 2016 – All rights reserved

Introduction
DNA (DNAs) is a major component of any living organisms coding for enzymes responsible for
their biological activities. The study of DNA sequences from DNA sources extracted from different
environmental matrices, by means of numerous molecular approaches, provides molecular markers that
can be used to sharply distinguish and identify different organisms (bacteria, archaea, and eucaryotes).
Up to now, most of the studies aiming to develop microbial quality indicators applicable to complex
environment such as soil were biased by the poor culturability of many microorganisms under
laboratory conditions and the lack of sensitivity of traditional microbiological methods. The recent
development of a large set of molecular biology methods based on amplification of soil-extracted
nucleic acids have provided a pertinent alternative to classical culture-based microbiological methods
[2]
providing unique insight into the composition, richness, and structure of microbial communities.
[3] [4] [5] [6]
DNA-based approaches are now well established in soil ecology and serve as genotypic
markers for determining microbial diversity. The results of molecular analyzes of soil microbial
communities and/or populations rely on two main parameters: a) the extraction of DNA representative
of the indigenous bacterial community composition and b) PCR bias such as the choice of primers, the
[7] [4] [8] [9]
concentration of amplified DNA, errors in the PCR, or even the method chosen for analysis.
Numerous studies have investigated new methods to improve extraction, purification, amplification,
[10]
and quantification of DNA from soils. Recently, ISO 11063 reporting “a method to extract nucleic
acids directly from soil samples“ derived from Reference [10] is opening a new window for developing
[11]
standardized molecular approaches to estimate soil quality.
The aim of this International Standard is to describe the procedure used to set up and perform
quantitative PCR to quantify the abundance of soil microbial phyla, as well as functional groups from
DNA directly extracted from soil samples. The quantification of soil microbial phyla, as well as functional
groups by qPCR assays can contribute to the development of routine tools to monitor soil quality.
The repeatability and the reproducibility of the procedure of the quantitative PCR were assessed in
an international ring test study (see Annex B). The repeatability of this procedure was successfully
evaluated for both 16S rRNA genes, as well as genes coding a functional marker of denitrifiers (the
nitrite reductase gene nirK). The reproducibility of this procedure revealed a laboratory effect which
can be overcome by interpreting the results of the quantification of the abundance of the microbial
groups by comparison, either by using an external reference (DNA extracted from a control strain) in
the assay or by calculating a percentage of variations between treatments to normalize the data.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 17601:2016(E)
Soil quality — Estimation of abundance of selected
microbial gene sequences by quantitative PCR from DNA
directly extracted from soil
1 Scope
This International Standard specifies the crucial steps of a quantitative real-time polymerase chain
reaction (qPCR) method to measure the abundance of selected microbial gene sequences from soil DNA
extract which provides an estimation of selected microbial groups.
It is noteworthy that the number of genes is not necessarily directly linked to the number of organisms
that are measured. For example, the number of ribosomal operon is ranging from one copy to 20 copies
in different bacterial phyla. Therefore, the numbe
...

PROJET DE NORME INTERNATIONALE
ISO/DIS 17601
ISO/TC 190/SC 4 Secrétariat: AFNOR
Début de vote: Vote clos le:
2013-09-26 2013-12-26
Qualité du sol — Estimation de l’abondance de séquences
de gènes microbiens par amplification par réaction de
polymérisation en chaîne (PCR) quantitative en temps réel
à partir d’ADN directement extrait du sol
Soil quality — Estimation of abundance of selected microbial gene sequences by quantitative realtime PCR
from DNA directly extracted from soil
ICS: 13.080.30
CE DOCUMENT EST UN PROJET DIFFUSÉ POUR
OBSERVATIONS ET APPROBATION. IL EST DONC
SUSCEPTIBLE DE MODIFICATION ET NE PEUT
ÊTRE CITÉ COMME NORME INTERNATIONALE
AVANT SA PUBLICATION EN TANT QUE TELLE.
OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR
ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES
FINS INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET
COMMERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE
DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE
CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR
POSSIBILITÉ DE DEVENIR DES NORMES
POUVANT SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA
RÉGLEMENTATION NATIONALE.
Numéro de référence
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET
ISO/DIS 17601:2013(F)
SONT INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS
OBSERVATIONS, NOTIFICATION DES DROITS
DE PROPRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT
ÉVENTUELLEMENT CONNAISSANCE ET À
©
FOURNIR UNE DOCUMENTATION EXPLICATIVE. ISO 2013

ISO/DIS 17601:2013(F)
Notice de droit d’auteur
Ce document de l’ISO est un projet de Norme internationale qui est protégé par les droits d’auteur
de l’ISO. Sauf autorisé par les lois en matière de droits d’auteur du pays utilisateur, aucune partie de
ce projet ISO ne peut être reproduite, enregistrée dans un système d’extraction ou transmise sous
quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie,
les enregistrements ou autres, sans autorisation écrite préalable.
Les demandes d’autorisation de reproduction doivent être envoyées à l’ISO à l’adresse ci-après ou au
comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
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Toute reproduction est soumise au paiement de droits ou à un contrat de licence.
Les contrevenants pourront être poursuivis.
ii © ISO 2013 – Tous droits réservés

ISO/DIS 17601
Sommaire Page
Avant-propos . 4
Introduction . 5
1  Domaine d'application . 1
2  Références normatives . 1
3  Termes et définitions . 1
4  Principe . 2
5  Matériel d’essai . 3
5.1  ADN . 3
5.2  Bactéries . 3
5.3  Plasmide
5.4  Enzymes et protéines . 3
5.5  Produits chimiques . 3
5.6  Produit pour le milieu de culture bactérienne . 4
5.7  Tampon et réactifs . 4
6  Appareillage . 5
7  Mode opératoire . 6
7.1  Préparation des étalons de qPCR et étalonnage de l'analyse par qPCR (tâche 1) . 6
7.2  Préparation d'une matrice d'ADN du sol et essai d'inhibition (tâche 2) . 12
7.3  Analyse par qPCR (tâche 3) . 14
7.4  Validation et examen de l'analyse par qPCR (tâche 4) . 15
8  Validation de l'analyse par qPCR . 16
9  Expression des résultats de l'analyse par qPCR . 16
10  Rapport d'essai . 17
Annexe A (informative) Étude interlaboratoires internationale relative à l'évaluation de la
quantification de l'abondance de groupes microbiens par qPCR . 18
Annexe B (informative) Analyse basée sur un essai qPCR SYBR Green . 19
B.1  Préparation de l'étalon de qPCR SYBR Green et étalonnage de l'analyse par qPCR SYBR
Green16) . 19
B.2  Préparation d'une matrice d'ADN du sol et essai d'inhibition . 19
B.3  Analyse par qPCR SYBR Green . 19
B.4  Validation et examen de l'analyse par qPCR SYBR Green . 19
Annexe C (informative) Analyse basée sur un essai qPCR TaqMan . 20
C.1  Préparation de l'étalon de qPCR TaqMan et étalonnage de l'analyse par qPCR TaqMan . 20
C.2  Préparation d'une matrice d'ADN du sol et essai d'inhibition . 20
C.3  Analyse par qPCR TaqMan . 20
C.4  Validation et examen de l'analyse par qPCR TaqMan . 20
Bibliographie . 21

iii © ISO 2013 – Tous droits réservés

ISO/DIS 17601
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 17601 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4, Méthodes
biologiques.
ISO/DIS 17601
Introduction
L'ADN (acide désoxyribonucléique) est un constituant majeur de tout organisme vivant codant pour les
enzymes responsables de ses activités biologiques. L’étude des séquences d’ADN extrait de différentes
matrices environnementales, à l’aide d’approches moléculaires, permet de fournir des marqueurs
moléculaires qui peuvent être utilisés pour différencier et identifier clairement différents micro-organismes
(bactéries, archées et eucaryotes).
Jusqu’à présent, la plupart des études visant à développer des indicateurs microbiens de la qualité du sol et
applicables aux milieux complexes, tels que le sol, étaient biaisées par la nature incultivable de nombreux
micro-organismes et par le manque de sensibilité des méthodes microbiologiques classiques [1]. Le
développement récent de nombreuses méthodes de biologie moléculaire reposant principalement sur
l'amplification des acides nucléiques extraits du sol a permis de proposer une alternative pertinente à la
microbiologie pasteurienne permettant de connaître en détail la composition, la richesse et la structure des
communautés microbiennes [2], [3], [4], [5], [6]. Les approches reposant sur l’extraction de l’ADN à partir
d’échantillons environnementaux sont désormais bien établies dans le domaine de l’écologie des sols et
servent de marqueurs génétiques permettant d’évaluer la diversité microbienne. Les résultats d’analyses
moléculaires des communautés et/ou populations microbiennes du sol reposent sur deux paramètres
principaux : (i) l’extraction d’ADN représentatif de la composition de la communauté microbienne indigène et
(ii) les biais introduits par la PCR, notamment le choix des amorces oligo-nucléotidiques, la concentration de
l’ADN utilisé comme matrice pour la PCR, les erreurs de PCR ou encore la méthode d’analyse post-PCR
choisie [7], [4], [8], [9].
De nombreuses études ont été conduites avec ces nouvelles méthodes permettant d’améliorer l’extraction, la
purification, l’amplification et la quantification de l’ADN des sols [10]. Récemment, l'ISO 11063 décrivant « une
méthode pour extraire directement les acides nucléiques d'échantillons de sol », dérivée de [10], a ouvert de
nouvelles perspectives de développement d'approches moléculaires normalisées pour estimer la qualité du
sol [11].
La présente Norme internationale a pour objectif de décrire le mode opératoire utilisé pour mettre en place et
réaliser une PCR quantitative afin de quantifier l'abondance de groupes microbiens du sol ainsi que les
groupes fonctionnels à partir d’extrait d’ADN de sol. La quantification des phyla microbiens du sol ainsi que
des groupes fonctionnels par des analyses qPCR peut contribuer au développement d'outils de routine
permettant de surveiller la qualité du sol. A la demande de l'ISO, la reproductibilité de la quantification de
l'abondance de séquences spécifiques de gènes microbiens par amplification par réaction de polymérisation
en en chaîne par polymérase (PCR) quantitative en temps réel à partir d’ADN directement extrait du sol, a été
évaluée lors d'une étude interlaboratoires internationale (Annexe A).
v © ISO 2013 – Tous droits réservés

PROJET DE NORME INTERNATIONALE ISO/DIS 17601

Qualité du sol — Estimation de l’abondance de séquences de
gènes microbiens par amplification par réaction de
polymérisation en chaîne (PCR) quantitative en temps réel à
partir d’ADN directement extrait du sol
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie les étapes cruciales d'une méthode d'amplification par réaction de
polymérisation en chaîne (PCR) quantitative en temps réel (qPCR) permettant de mesurer l'abondance de
séquences spécifiques de gènes microbiens à partir d'un extrait d'ADN du sol qui fournit une estimation de
l’abondance de groupes microbiens spécifiques.
Il convient de noter que le nombre de gènes n'est pas nécessairement lié directement au nombre de micro-
organismes mesurés. Par exemple, le nombre d'opérons ribosomiques va d'une copie à 20 copies dans
différents phyla bactériens. Par conséquent, le nombre de séquences d'ARNr 16S quantifiées dans des
extraits d'ADN du sol ne donne pas une estimation exacte du nombre de bactéries du sol. Par ailleurs, le
nombre de séquences n'est pas nécessairement lié à des micro-organismes vivants et peut comprendre des
séquences amplifiées à partir de l’ADN extrait de micro-organismes morts.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 10381-6, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 6 : Lignes directrices pour la collecte, la
manipulation et la conservation, dans des conditions aérobies, de sols destinés à l'évaluation en laboratoire
des processus, de la biomasse et de la diversité microbiens.
ISO 11063, Qualité du sol — Méthode pour extraire directement l'ADN d'échantillons de sol.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
ADN du sol
ADN extrait du biote vivant et mort du sol
EXEMPLE Micro-organismes, plantes, animaux.
3.2
amplification par réaction de polymérisation en chaîne
PCR
méthode permettant l'amplification d'une séquence spécifique d'ADN en utilisant une paire spécifique
d'amorces oligonucléotidiques
ISO/DIS 17601
3.3
amp
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 17601
Première édition
2016-01-15
Qualité du sol — Estimation de
l’abondance de séquences de gènes
microbiens par amplification par
réaction de polymérisation en chaîne
(PCR) quantitative à partir d’ADN
directement extrait du sol
Soil quality — Estimation of abundance of selected microbial gene
sequences by quantitative PCR from DNA directly extracted from soil
Numéro de référence
©
ISO 2016
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sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Ch. de Blandonnet 8 • CP 401
CH-1214 Vernier, Geneva, Switzerland
Tel. [phone]
Fax [phone]
[e-mail]
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Matériel d’essai . 4
5.1 ADN . 4
5.2 Bactéries . 4
5.3 Plasmide . 4
5.4 Enzymes . 4
5.5 Produits chimiques . 4
5.6 Produit pour le milieu de culture bactérienne . 5
5.7 Tampon et réactifs . 5
6 Appareillage . 6
7 Mode opératoire. 6
7.1 Préparation des étalons de qPCR et étalonnage de l’essai de qPCR (tâche 1) . 6
7.1.1 Généralités . 6
7.1.2 Création de l’amplicon (tâche 1, étape 1) . 7
7.1.3 Préparation des étalons de qPCR (tâche 1, étape 2) . 7
7.1.4 ADN d’isolat, ADN environnemental, ADN artificiel . 7
7.1.5 Étalonnage de la qPCR (tâche 1, étape 3) .10
7.2 Préparation d’une matrice d’ADN du sol et test d’inhibition (tâche 2) .11
7.2.1 Généralités .11
7.2.2 Préparation de l’ADN du sol (tâche 2, étape 4) .11
7.2.3 Test d’inhibition (tâche 2, étape 5) .11
7.2.4 Dilution de la matrice d’ADN .12
7.3 Essai de qPCR (tâche 3) .13
7.3.1 Généralités .13
7.3.2 qPCR .13
7.4 Validation et examen de l’essai de qPCR (tâche 4) .13
7.4.1 Généralités .13
7.4.2 Validation de l’essai de qPCR .13
7.4.3 Calcul du nombre de copies du gène d’intérêt dans l’extrait d’ADN du sol .14
8 Examen des étapes critiques de l’essai de qPCR .14
9 Expression des résultats de l’essai de qPCR .15
10 Étude interlaboratoires internationale .15
11 Rapport d’essai .15 ®
Annexe A (informative) Description des principales étapes d’un essai de qPCR TaqMan .16
Annexe B (informative) Étude interlaboratoires internationale relative à l’évaluation de la
qPCR pour quantifier l’abondance de séquences spécifiques de gènes microbiens à
partir d’ADN extrait directement du sol .18
Bibliographie .31
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO, participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer
un engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à
l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes
de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 190, Qualité du sol, sous–comité
SC 4, Méthodes biologiques.
iv © ISO 2016 – Tous droits réservés

Introduction
L’ADN (acide désoxyribonucléique) est un constituant majeur de tous les organismes vivants codant
pour les enzymes responsables de leurs activités biologiques. L’étude des séquences d’ADN extrait
de différentes matrices environnementales, à l’aide d’approches moléculaires, permet de fournir des
marqueurs moléculaires qui peuvent être utilisés pour différencier et identifier clairement différents
organismes (bactéries, archées et eucaryotes).
Jusqu’à présent, la plupart des études visant à développer des indicateurs microbiens de la qualité du
sol et applicables aux milieux complexes, tels que le sol, étaient biaisées par la nature incultivable de
nombreux micro-organismes dans des conditions de laboratoire et par le manque de sensibilité des
méthodes de microbiologie classiques. Le développement récent de nombreuses méthodes de biologie
moléculaire reposant sur l’amplification des acides nucléiques extraits du sol a permis de proposer une
alternative pertinente à la microbiologie pasteurienne permettant de décrire en détail la composition,
[2] [3] [4] [5] [6]
la richesse et la structure des communautés microbiennes.   Les approches reposant sur
l’extraction de l’ADN à partir d’échantillons environnementaux sont désormais bien établies dans le
domaine de l’écologie des sols et servent de marqueurs génétiques permettant d’évaluer la diversité
microbienne. Les résultats d’analyses moléculaires des communautés et/ou populations microbiennes
du sol reposent sur deux paramètres principaux: a) l’extraction d’ADN représentatif de la composition
de la communauté microbienne indigène et b) les biais introduits par la PCR, notamment le choix des
amorces oligonucléotidiques, la concentration de l’ADN utilisé comme matrice, les erreurs de PCR ou
[7] [4] [8] [9]
encore la méthode d’analyse post-PCR choisie.
De nombreuses études ont été menées avec ces nouvelles méthodes permettant d’améliorer l’extraction,
[10]
la purification, l’amplification et la quantification de l’ADN des sols. Récemment, l’ISO 11063
décrivant «une méthode pour extraire directement les acides nucléiques d’échantillons de sol», dérivée
de la Référence [10], a ouvert de nouvelles perspectives de développement d’approches moléculaires
[11]
normalisées pour estimer la qualité du sol.
La présente Norme internationale a pour objectif de décrire le mode opératoire utilisé pour mettre en
place et réaliser une PCR quantitative afin de quantifier l’abondance de groupes microbiens du sol ainsi
que celle de groupes fonctionnels à partir d’extrait d’ADN de sol. La quantification des phyla microbiens
du sol ainsi que des groupes fonctionnels par des essais de qPCR peut contribuer au développement
d’outils de routine permettant de surveiller la qualité du sol. La répétabilité et la reproductibilité de la
méthode d’amplification par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) quantitative ont été évaluées
lors d’une étude interlaboratoires internationale (voir Annexe B). La répétabilité de cette méthode a été
évaluée avec succès pour les essais de qPCR ciblant les gènes ARNr 16S ainsi que des gènes codant un
marqueur fonctionnel de bactéries dénitrifiantes (le gène nitrite réductase nirK). La reproductibilité de
cette méthode a révélé un effet de laboratoire qui peut être surmonté en interprétant les résultats de la
quantification de l’abondance de groupes microbiens par comparais
...