ISO/FDIS 6888-1
(Main)Microbiology of the food chain -- Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species)
Microbiology of the food chain -- Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species)
Microbiologie de la chaîne alimentaire -- Méthode horizontale pour le dénombrement des staphylocoques à coagulase positive (Staphylococcus aureus et autres espèces)
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FINAL
INTERNATIONAL ISO/FDIS
DRAFT
STANDARD 6888-1
ISO/TC 34/SC 9
Microbiology of the food chain —
Secretariat: AFNOR
Horizontal method for the
Voting begins on:
2021-01-29 enumeration of coagulase-positive
staphylococci (Staphylococcus aureus
Voting terminates on:
2021-03-26
and other species) —
Part 1:
Method using Baird-Parker agar
medium
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale
pour le dénombrement des staphylocoques à coagulase positive
(Staphylococcus aureus et autres espèces) —
Partie 1: Méthode utilisant le milieu gélosé de Baird-Parker
ISO/CEN PARALLEL PROCESSING
RECIPIENTS OF THIS DRAFT ARE INVITED TO
SUBMIT, WITH THEIR COMMENTS, NOTIFICATION
OF ANY RELEVANT PATENT RIGHTS OF WHICH
THEY ARE AWARE AND TO PROVIDE SUPPOR TING
DOCUMENTATION.
IN ADDITION TO THEIR EVALUATION AS
Reference number
BEING ACCEPTABLE FOR INDUSTRIAL, TECHNO-
ISO/FDIS 6888-1:2021(E)
LOGICAL, COMMERCIAL AND USER PURPOSES,
DRAFT INTERNATIONAL STANDARDS MAY ON
OCCASION HAVE TO BE CONSIDERED IN THE
LIGHT OF THEIR POTENTIAL TO BECOME STAN-
DARDS TO WHICH REFERENCE MAY BE MADE IN
NATIONAL REGULATIONS. ISO 2021
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ISO/FDIS 6888-1:2021(E)
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ii © ISO 2021 – All rights reserved
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ISO/FDIS 6888-1:2021(E)
Contents Page
Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv
Introduction ................................................................................................................................................................................................................................vi
1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1
2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1
3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 2
4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2
4.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 2
4.2 Incubation ................................................................................................................................................................................................... 2
4.3 Enumeration and confirmation ................................................................................................................................................ 2
5 Culture media and reagents ...................................................................................................................................................................... 3
6 Equipment and consumables .................................................................................................................................................................. 3
7 Sampling ........................................................................................................................................................................................................................ 4
8 Preparation of the test sample ............................................................................................................................................................... 4
9 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 4
9.1 Test portion, initial suspension and dilutions .............................................................................................................. 4
9.2 Inoculation and incubation .......................................................................................................................................................... 4
9.3 Counting of colonies ........................................................................................................................................................................... 5
9.3.1 General description of colonies growing on BPA medium .......................................................... 5
9.3.2 Colonies counting procedure ................................................................................................................................ 5
9.4 Confirmation ............................................................................................................................................................................................. 6
9.4.1 General...................................................................................................................................................................................... 6
9.4.2 Tube testp .............................................................................................................................................................................. 6
9.4.3 Plate test using RPFA medium ............................................................................................................................. 7
10 Expression of results ........................................................................................................................................................................................ 7
11 Performance characteristics of the method ............................................................................................................................. 7
11.1 Interlaboratory study ........................................................................................................................................................................ 7
11.2 Repeatability limit ................................................................................................................................................................................ 7
11.3 Reproducibility limit .......................................................................................................................................................................... 8
12 Test report ................................................................................................................................................................................................................... 9
13 Quality assurance ................................................................................................................................................................................................ 9
Annex A (normative) Flow diagram of the procedure .....................................................................................................................10
Annex B (normative) Culture media and reagents .............................................................................................................................11
Annex C (informative) Results of the interlaboratory study .....................................................................................................18
Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................20
© ISO 2021 – All rights reserved iii---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO/FDIS 6888-1:2021(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www .iso .org/
iso/ foreword .html.This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 463, Microbiology of the food chain, in accordance with the Agreement on technical
cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 6888-1:1999), which has been technically
revised. It also incorporates the amendments ISO 6888-1:1999/Amd 1:2003 and ISO 6888-1:1999/
Amd 2:2018. The main changes compared with the previous edition are as follows:— the title has been changed to relate to the “Food chain”;
— the status of this document and ISO 6888-2 has been clarified;
— the document has been aligned with ISO 7218:2007, i.e. pour molten agar medium at 44 °C to 47 °C;
— all occurrences, when appropriate, have been changed from “35 °C or 37 °C” to “34 °C to 38 °C”;
— all occurrences of incubation time, when appropriate, have been changed from “18 h to 24 h” to
“24 h ± 2 h”;— requirements have been added to use ISO 11133;
— all available standards related to sampling techniques have been updated;
— a description of typical and atypical colonies on Baird-Parker agar (BPA) medium has been updated;
— the rabbit plasma fibrinogen agar (RPFA) medium has been added as alternative to the coagulase
test for confirmation;— the flow diagram procedure in Annex A has been updated;
— the culture media and reagent with performance testing in Annex B has been added;
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ISO/FDIS 6888-1:2021(E)
— results of the interlaboratory study (from ISO 6888-1:1999/Amendement1: 2003, Precision data)
has been updated;— the Bibliography has been updated.
A list of all parts in the ISO 6888 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.© ISO 2021 – All rights reserved v
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ISO/FDIS 6888-1:2021(E)
Introduction
This document, ISO 6888-2 and ISO 6888-3 describes three horizontal methods for the detection
and enumeration of coagulase-positive staphylococci among which enterotoxinogenic strains are
encountered. It is mainly concerned with Staphylococcus aureus, but also with S. intermedius and certain
strains of S. hyicus.For the purposes of this document, the confirmation of typical and atypical colonies is based on a
positive coagulase reaction, but it is recognized that some strains of Staphylococcus aureus give weakly
positive coagulase reactions. These latter strains can be confused with other bacteria but they can be
distinguished from such other bacteria by the use of additional tests not included in this document,
such as the sensitivity to lysostaphin, the production of haemolysin, thermostable nuclease and acid
from mannitol (see ISO 7218 and Reference [15]).The main technical changes listed in the Foreword, introduced in this document compared with the
previous edition are considered as minor (see ISO 17468). They have a minor impact on the performance
characteristics of this method.Results of the interlaboratory study and tested samples are described in Annex C.
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FINAL DRAFT INTERNATIONAL STANDARD ISO/FDIS 6888-1:2021(E)
Microbiology of the food chain — Horizontal method
for the enumeration of coagulase-positive staphylococci
(Staphylococcus aureus and other species) —
Part 1:
Method using Baird-Parker agar medium
WARNING — In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that tests
for detecting staphylococci are only undertaken in properly equipped laboratories, under the
control of a skilled microbiologist, and that great care is taken in the disposal of all incubated
materials. Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.
This document does not purport to address all of the safety aspects, if any, associated with its
use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices.
1 ScopeThis document specifies a horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci
[10]by counting the colonies obtained on a solid medium (Baird-Parker medium) after aerobic incubation
at 34 °C to 38 °C and coagulase confirmation.This document is applicable to:
— products intended for human consumption;
— products intended for animal feeding;
— environmental samples in the area of food and feed production, handling, and
— samples from the primary production stage.
This horizontal method was originally developed for the examination of all samples belonging to the
food chain.Because of the large variety of products in the food chain, it is possible that this horizontal method is not
appropriate in every detail for all products. Nevertheless, it is expected that the required modifications
are minimized so that they do not result in a significant deviation from this horizontal method.
Based on the information available at the time of publication of this document, this method is not
considered to be (fully) suited to the examination of fermented products or other products containing
technological flora based on Staphylococcus spp (e.g. S. xylosus) (such as cheeses made from raw milk
and certain raw meat products) likely to be contaminated by:— staphylococci forming atypical colonies on a Baird-Parker agar medium;
— background flora that can obscure the colonies being sought.
Nevertheless, both this document and ISO 6888-2 are given equivalent status.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
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ISO/FDIS 6888-1:2021(E)
ISO 6887 (all parts), Microbiology of the food chain — Preparation of test samples, initial suspension and
decimal dilutions for microbiological examinationISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinationsISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and
performance testing of culture media3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
3.1
coagulase-positive staphylococci
bacteria that form either typical or atypical colonies, or both, on the surface of a selective culture
medium (Baird-Parker agar medium) and that show a positive coagulase reaction in a tube test or on
rabbit plasma fibrinogen agarNote 1 to entry: The typical and atypical colonies are described in 9.3.1.
3.2
enumeration of coagulase-positive staphylococci
determination of the number of coagulase-positive staphylococci (3.1) per gram, per millilitre, per square
centimetre or per sampling device/sampled areaNote 1 to entry: A sampled area is an area not defined by a numerical size, for example, a hot tap, a door handle.
4 Principle4.1 General
Inoculation of the surface of a solid selective culture medium, with a specified quantity of the test
sample if the product is liquid, or with a specified quantity of the initial suspension in the case of other
products.Inoculation, under the same conditions, using decimal dilutions of the test sample.
4.2 IncubationAerobic incubation of the plates at 34 °C to 38 °C and examination after both 24 h and 48 h.
4.3 Enumeration and confirmationCalculation of the number of coagulase-positive staphylococci per gram, per millilitre, per square
centimetre or per sampling device of sample from the number of either typical or atypical colonies, or
both, obtained on plates at dilution levels chosen to give a significant result, and confirmed by a positive
coagulase test result, within the counting limits of the method and in accordance with ISO 7218.
NOTE See Annex A for a flow diagram.2 © ISO 2021 – All rights reserved
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ISO/FDIS 6888-1:2021(E)
5 Culture media and reagents
Follow current laboratory practices in accordance with ISO 7218.
The composition of culture media and reagents and their preparation are specified in Annex B.
For performance testing of culture media and reagents, follow the procedures in accordance with either
Annex B or ISO 11133, or both.For the diluent(s), see the relevant part of the ISO 6887 series.
6 Equipment and consumables
Disposable equipment is an acceptable alternative to reusable glassware if it has suitable specifications.
Usual microbiological laboratory equipment (see ISO 7218) and, in particular, the following.
6.1 Apparatus for dry sterilization (oven) and wet sterilization (autoclave).See ISO 7218.
6.2 Incubator, capable for maintaining the inoculated media within the temperature range 34 °C
to 38 °C.NOTE The range 34 °C to 38 °C for incubation of media includes the use of incubators set at 35 °C ± 1 °C,
36 °C ± 2 °C or 37 °C ± 1 °C.6.3 Water bath, or similar apparatus, capable of being maintained at 44 °C to 47 °C.
6.4 Sterile tubes, bottles or flasks with caps, of appropriate capacity. Bottles or flasks with non-toxic
metallic or plastic screw-caps may be used.6.5 Sterile Petri dishes, with a diameter of approximately 90 mm and (optional) large size (diameter
approximately 140 mm), made of glass or plastic.6.6 Straight wire (see ISO 7218) or Pasteur pipette.
Loops (of diameter approximately 3 mm) and wires, made of platinum/iridium or nickel/chromium, or
glass rods, or equivalent sterile disposable loops or inoculating needles.6.7 Sterile graduated pipettes or automatic pipettes of nominal capacities of 1 ml, 2 ml and 10 ml,
graduated in 0,1 ml, 0,1 ml and 0,5 ml divisions, respectively. See ISO 7218.Graduated pipettes and pipettor tips should be fitted with a non-absorbent cotton wool plug to prevent
contamination when used to manipulate microbial cultures.6.8 Spreaders, sterile, made of glass or plastic.
6.9 pH-meter, it shall be capable of being read to the nearest 0,01 pH unit, enabling measurements
to be made with a tolerance of ±0,1 pH unit. The pH meter shall be equipped with either manual or
automatic temperature compensation. See ISO 7218.6.10 Refrigerator, capable of operating at 5 °C ± 3 °C.
6.11 Membranes, with a 0,2 µm pore size.
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ISO/FDIS 6888-1:2021(E)
7 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this document. Follow the specific International
Standard dealing with the product concerned. If there is no specific International Standard dealing
with the sampling of the product concerned, the parties concerned should come to an agreement on this
subject.Recommended sampling techniques are given in the following documents:
— ISO/TS 17728 for food and animal feed;
— ISO 707 for milk and milk products;
— ISO 6887-3 for fish and fishery products;
— ISO 13307 for the primary production stage;
— ISO 17604 for carcasses;
— ISO 18593 for surfaces.
It is important that the laboratory receives a sample that is representative. The sample should not have
been damaged or changed during transport or storage.8 Preparation of the test sample
Prepare the test sample from the laboratory sample in accordance with the specific International
Standard dealing with the product concerned: follow the procedures specified in the ISO 6887 series
and, if necessary, ISO 18593. If there is no specific International Standard available, the parties
concerned should come to an agreement on this subject.9 Procedure
9.1 Test portion, initial suspension and dilutions
Refer to the relevant part of the ISO 6887 series.
9.2 Inoculation and incubation
Transfer, by means of a sterile pipette (6.7), 0,1 ml of the test sample if liquid, or 0,1 ml of the initial
suspension (10 dilution) in the case of other products, to a Baird-Parker agar (BPA) plate (see B.2).
For enumeration techniques in microbiology of the food chain, the number of Petri dishes to be used
according tested dilutions is stated into ISO 7218. Repeat the procedure for further decimal dilutions if
necessary.If, for certain products, it is desirable to count low numbers of coagulase-positive staphylococci, the
level of detection can be raised by a factor of 10 by inoculating 1,0 ml of the test sample liquid, or 1,0 ml
of the initial suspension for other products, either on the surface of one plate (Ø 140 mm) or on the
surface of three small agar plates (Ø 90 mm). The number of Petri dishes to be used according to the
tested dilutions is stated in ISO 7218.Carefully spread the inoculum as quickly as possible over the surface of the agar plate, trying not to
touch the sides of the Petri dish, using the spreader (6.8). Allow the plates to dry with their lids on for
about 15 min at laboratory temperature.NOTE For inoculation using a spiral plater, see ISO 7218.
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ISO/FDIS 6888-1:2021(E)
Invert the dishes prepared above and place them for 24 h ± 2 h in the incubator (6.2) set at 34 °C to
38 °C. Then re-incubate for a total of 48 h ± 4 h.NOTE Colonies with typical appearance after 24 h ± 2 h incubation can lose their typical appearance
after 48 h ± 4 h incubation, due to overgrowth with enlargement of the clear zone during the second phase of
incubation. Counting only at 48h ± 4h can lead to too low counts or no counts.9.3 Counting of colonies
9.3.1 General description of colonies growing on BPA medium
9.3.1.1 Colonies presumed to be coagulase-positive staphylococci
Typical colonies are black or grey, shining and convex (1 mm to 1,5 mm in diameter after incubation
for 24 h ± 2 h, and 1,5 mm to 2,5 mm in diameter after incubation for 48 h ± 4 h) and are surrounded
by a clear zone, which can be partially opaque. After incubation for at least 24 h, an opalescent ring
immediately in contact with the colonies can appear in this clear zone.Atypical colonies have the same size as typical colonies and can present one of the following
morphologies:— shining black colonies with or without a narrow white edge; the clear zone is absent or barely visible
and the opalescent ring is absent or hardly visible;— grey colonies free of clear zone.
Atypical colonies are formed mainly by strains of coagulase-positive staphylococci contaminating,
for example, dairy products, shrimps and giblets. They are less often formed by strains of coagulase-
positive staphylococci contaminating other products.9.3.1.2 Colonies not presumed to be coagulase-positive staphylococci
Other colonies are all the remaining colonies possibly present on the plates that do not show the typical
or atypical appearance described in 9.3.1.1 and are considered as the background flora.
NOTE Bacteria belonging to genera other than staphylococci can give colonies with an appearance similar to
staphylococci. Microscopic examination of Gram stain, before confirmation, will enable the distinction of other
genera from staphylococci.9.3.2 Colonies counting procedure
After incubation for 24 h ± 2 h, mark on the bottom of the plates the positions of any typical colonies
present.Re-incubate all plates at 34 °C to 38 °C for a further 24 h ± 2 h and mark any new typical colonies. Also
mark any atypical colonies present.For the enumeration, only retain plates containing a maximum of 300 colonies in total (typical, atypical,
background flora), and including a maximum of either 150 typical or atypical colonies, or both, at two
successive dilutions.EXAMPLE 0 typical colony, 150 atypical colonies and 150 of background flora.
150 typical colonies, 0 atypical colony and 150 of background flora
150 typical colonies, 150 atypical colonies and 0 of background flora
One of the plates shall contain at least 10 colonies (of either typical or atypical colonies, or both). Select
for confirmation (see 9.4) a given number A (in general five typical colonies if there are only typical
colonies, or five atypical colonies if there are only atypical colonies, or five typical and five atypical
colonies if both types are present, from each plate).© ISO 2021 – All rights reserved 5
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ISO/FDIS 6888-1:2021(E)
If there are less than either 10 typical or atypical colonies, or both, present on plates inoculated with
undiluted liquid product or the lowest dilution of other products, it is possible to make an estimated
count as described in 9.2 and ISO 7218.If a 1,0 ml inoculum was spread over three plates (see 9.2), treat these plates as one in all subsequent
counting and confirmation procedures.To make an estimated count of lower numbers of coagulase-positive staphylococci, retain all plates that
contain any typical and atypical colonies. Select all such colonies for confirmation within the limits set
out above.9.4 Confirmation
9.4.1 General
The confirmation of coagulase-positive staphylococci is undertaken by a tube test (see 9.4.2).
Alternatively, it can be undertaken by a plate test using Rabbit plasma fibrinogen agar (RPFA) medium
(see 9.4.3 and References [11], [13] and [14]).NOTE An alternative procedure can be used to confirm isolates as coagulase-positive staphylococci,
providing the suitability of the relevant procedure is verified (see ISO 7218).9.4.2 Tube testp
From the surface of each selected colony (see 9.3.1), remove an inoculum with a sterile wire (6.6) and
transfer it to a tube or bottle of brain-heart infusion broth (see B.3). With the same wire, spread the
suspension on a non-selective medium (blood agar or nutrient agar) and incubate at 34 °C to 38 °C for
24 h ± 2 h to check the purity of the selected colony (homogeneous morphology).Incubate the brain-heart infusion broth, preferably in a water bath, at 34 °C to 38 °C for 24 h ± 2 h.
Aseptically add 0,1 ml of each culture to 0,3 ml of the rabbit plasma (see B.4) (unless other amounts are
specified by the manufacturer) in sterile haemolysis tubes or bottles (6.4), and incubate at 34 °C to 38 °C.
By tilting the tube, examine for clotting of the plasma after 5 h ± 1 h of incubation and, if the test is
negative, re-examine after 24 h ± 2 h of incubation, or examine at the incubation times specified by the
manufacturer.Consider the coagulase test to be positive if the c
...
PROJET
NORME ISO/FDIS
FINAL
INTERNATIONALE 6888-1
ISO/TC 34/SC 9
Microbiologie de la chaîne
Secrétariat: AFNOR
alimentaire — Méthode horizontale
Début de vote:
2021-01-29 pour le dénombrement des
staphylocoques à coagulase positive
Vote clos le:
2021-03-26
(Staphylococcus aureus et autres
espèces) —
Partie 1:
Méthode utilisant le milieu gélosé de
Baird-Parker
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the
enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus
aureus and other species) —
Part 1: Method using Baird-Parker agar medium
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET
SONT INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS
OBSERVATIONS, NOTIFICATION DES DROITS
TRAITEMENT PARALLÈLE ISO/CEN
DE PROPRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT
ÉVENTUELLEMENT CONNAISSANCE ET À
FOURNIR UNE DOCUMENTATION EXPLICATIVE.
OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR
ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES FINS
INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET COM-
Numéro de référence
MERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE
ISO/FDIS 6888-1:2021(F)
DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE
CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR POSSI-
BILITÉ DE DEVENIR DES NORMES POUVANT
SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA
RÉGLEMENTATION NATIONALE. ISO 2021
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ISO/FDIS 6888-1:2021(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
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Publié en Suisse
ii © ISO 2021 – Tous droits réservés
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ISO/FDIS 6888-1:2021(F)
Sommaire Page
Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv
Introduction ................................................................................................................................................................................................................................vi
1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1
2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 2
3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 2
4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2
4.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 2
4.2 Incubation ................................................................................................................................................................................................... 2
4.3 Dénombrement et confirmation .............................................................................................................................................. 3
5 Milieux de culture et réactifs ................................................................................................................................................................... 3
6 Équipement et consommables ............................................................................................................................................................... 3
7 Échantillonnage ..................................................................................................................................................................................................... 4
8 Préparation de l’échantillon pour essai ....................................................................................................................................... 4
9 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 4
9.1 Prise d’essai, suspension mère et dilutions ................................................................................................................... 4
9.2 Ensemencement et incubation .................................................................................................................................................. 4
9.3 Comptage des colonies ..................................................................................................................................................................... 5
9.3.1 Description générale des colonies cultivant sur un milieu BPA .............................................. 5
9.3.2 Mode opératoire de comptage des colonies ............................................................................................. 5
9.4 Confirmation ............................................................................................................................................................................................. 6
9.4.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 6
9.4.2 Essai en tube ........................................................................................................................................................................ 6
9.4.3 Essai sur boîte de milieu RPFA ............................................................................................................................ 7
10 Expression des résultats............................................................................................................................................................................... 7
11 Caractéristiques de performance de la méthode ............................................................................................................... 8
11.1 Étude interlaboratoires ................................................................................................................................................................... 8
11.2 Limite de répétabilité ........................................................................................................................................................................ 8
11.3 Limite de reproductibilité ............................................................................................................................................................. 8
12 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................... 9
13 Assurance qualité ................................................................................................................................................................................................ 9
Annexe A (normative) Logigramme du mode opératoire ............................................................................................................10
Annexe B (normative) Milieux de culture et réactifs ........................................................................................................................11
Annexe C (informative) Résultats de l’étude interlaboratoires .............................................................................................18
Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................21
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ISO/FDIS 6888-1:2021(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/ iso/ fr/ avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 9, Microbiologie, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 463, Microbiologie de la
chaîne alimentaire, du Comité européen de normalisation (CEN), conformément à l’Accord de coopération
technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).Cette seconde édition annule et remplace la première édition (ISO 6888-1:1999), qui a fait l’objet
d’une révision technique. Elle intègre également les amendements ISO 6888-1:1999/Amd 1:2003
et ISO 6888-1:1999/Amd 2:2018. Les principales modifications par rapport à l’édition précédente sont
les suivantes:— le titre a été modifié pour faire référence à la «chaîne alimentaire»;
— le statut du présent document et de l’ISO 6888-2 a été clarifié;
— le document a été aligné sur l’ISO 7218:2007, par exemple il indique de verser le milieu gélosé fondu
à une température comprise entre 44 °C et 47 °C;— toutes les occurrences de «35 °C ou 37 °C», le cas échéant, ont été remplacées par «entre 34 °C
et 38 °C»;— toutes les occurrences des durées d’incubation «18 h à 24 h», le cas échéant, ont été remplacées
par4«24 h ± 2 h»;— des exigences ont été ajoutées pour utiliser l’ISO 11133;
— toutes les normes disponibles concernant les techniques de prélèvement ont été mises à jour;
— la description des colonies caractéristiques et non caractéristiques sur un milieu gélosé de Baird-
Parker (BPA) a été mise à jour;iv © ISO 2021 – Tous droits réservés
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ISO/FDIS 6888-1:2021(F)
— le milieu gélosé au plasma de lapin et au fibrinogène (RPFA) a été ajouté afin d’offrir une alternative
à l’essai de coagulase pour confirmation;— le mode opératoire sous forme de logigramme à l’Annexe A a été mis à jour;
— les milieux de culture et réactifs avec essais de performance ont été ajoutés à l’Annexe B;
— les résultats de l’étude interlaboratoires (provenant des données de fidélité de l’ISO 6888-1:1999/
Amendement1: 2003) ont été mis à jour;— la Bibliographie a été mise à jour.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 6888 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.© ISO 2021 – Tous droits réservés v
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ISO/FDIS 6888-1:2021(F)
Introduction
Le présent document, l’ISO 6888-2 et l’ISO 6888-3 décrivent trois méthodes horizontales pour la
détection et le dénombrement de staphylocoques à coagulase positive parmi lesquels se rencontrent
les souches entérotoxinogènes. Il s’agit principalement de Staphylococcus aureus, mais également
de S. intermedius et de certaines souches de S. hyicus.Pour les besoins du présent document, la confirmation des colonies caractéristiques et non
caractéristiques repose sur une réaction positive à la coagulase, mais il est reconnu que certaines
souches de Staphylococcus aureus donnent une réaction faiblement positive à la coagulase. Ces dernières
souches peuvent être confondues avec d’autres bactéries, mais elles peuvent être distinguées de ces
autres bactéries en procédant à des essais complémentaires non inclus dans le présent document, tels
que la sensibilité à la lysostaphine, la production d’hémolysine, de nucléase thermostable et d’acide à
partir de mannitol (voir l’ISO 7218 et la Référence [15]).Les principales modifications techniques énumérées dans l’avant-propos qui ont été apportées au présent
document par rapport à la précédente édition sont considérées comme mineures (voir l’ISO 17468).
Elles ont un impact mineur sur les caractéristiques de performance de cette méthode.
Les résultats de l’étude interlaboratoires et les échantillons soumis à essai sont décrits à l’Annexe C.
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PROJET FINAL DE NORME INTERNATIONALE ISO/FDIS 6888-1:2021(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode
horizontale pour le dénombrement des staphylocoques
à coagulase positive (Staphylococcus aureus et autres
espèces) —
Partie 1:
Méthode utilisant le milieu gélosé de Baird-Parker
AVERTISSEMENT — Afin de préserver la santé du personnel de laboratoire, il est essentiel
que les essais de recherche de staphylocoques ne soient effectués que dans des laboratoires
correctement équipés, sous la surveillance d’un microbiologiste expérimenté, et qu’un grand
soin soit apporté à l’élimination de tous les matériaux incubés. Il convient que les utilisateurs
du présent document maîtrisent les pratiques courantes de laboratoire. Le présent document
ne prétend pas aborder la totalité des aspects liés à la sécurité qui pourraient découler de son
utilisation. Il incombe à l’utilisateur de ce document d’établir des pratiques appropriées en
matière d’hygiène et de sécurité.1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode horizontale de dénombrement des staphylocoques à
[10]coagulase positive par comptage des colonies obtenues en milieu solide (milieu de Baird-Parker)
après incubation en aérobiose entre 34 °C et 38 °C et confirmation par coagulase.
Le présent document s’applique aux:— produits destinés à la consommation humaine;
— produits destinés à l’alimentation des animaux;
— échantillons environnementaux prélevés dans les secteurs de la production et de la distribution des
aliments; et— échantillons prélevés au stade de production primaire.
Cette méthode horizontale a été élaborée à l’origine pour l’examen de tous les échantillons appartenant
à la chaîne alimentaire.En raison de la grande diversité des produits de la chaîne alimentaire, il est possible que cette méthode
horizontale ne soit pas appropriée dans ses moindres détails à tous les produits. Néanmoins, il est
attendu que les modifications requises soient réduites le plus possible afin de ne pas s’écarter de
manière significative de cette méthode horizontale.D’après les informations disponibles au moment de la publication du présent document, cette méthode
n’est pas considérée comme étant (parfaitement) adaptée à l’examen des produits fermentés ou d’autres
produits contenant une flore technologique fondée sur Staphylococcus spp (par exemple, S. xylosus)
(tels que les fromages à base de lait cru et certains produits à base de viande crue) susceptibles d’être
contaminés par:— des staphylocoques formant des colonies non caractéristiques sur un milieu gélosé de Baird-Parker;
— une flore annexe pouvant masquer les colonies recherchées.Néanmoins, le présent document et l’ISO 6888-2 bénéficient d’un statut équivalent.
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ISO/FDIS 6888-1:2021(F)
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les
éventuels amendements).ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie de la chaîne alimentaire — Préparation des échantillons, de la
suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologiqueISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l'eau — Préparation, production,
stockage et essais de performance des milieux de culture3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp;
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/ .3.1
staphylocoques à coagulase positive
bactéries formant des colonies soit caractéristiques soit non caractéristiques, ou les deux, à la surface
d’un milieu de culture sélectif (milieu gélosé de Baird-Parker) et donnant une réaction positive à la
coagulase lors d’un essai de coagulase en tube ou sur une gélose au plasma de lapin et au fibrinogène
Note 1 à l'article: Les colonies caractéristiques et non caractéristiques sont décrites en 9.3.1.
3.2dénombrement des staphylocoques à coagulase positive
détermination du nombre de staphylocoques à coagulase positive (3.1) trouvés par gramme, millilitre,
centimètre carré ou dispositif de prélèvement/zone de prélèvementNote 1 à l'article: Une zone de prélèvement est une zone qui n’est pas définie par une taille numérique, par exemple
un robinet d’eau chaude ou une poignée de porte.4 Principe
4.1 Généralités
Ensemencement en surface d’un milieu gélosé sélectif, avec une quantité déterminée de l’échantillon
pour essai si le produit est liquide, ou avec une quantité déterminée de la suspension mère dans le cas
d’autres produits.Dans les mêmes conditions, ensemencement des dilutions décimales obtenues à partir de l’échantillon
pour essai.4.2 Incubation
Incubation de ces boîtes entre 34 °C et 38 °C en aérobiose et examen après 24 h et 48 h.
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ISO/FDIS 6888-1:2021(F)
4.3 Dénombrement et confirmation
Calcul du nombre de staphylocoques à coagulase positive trouvés par gramme, millilitre, centimètre
carré ou dispositif de prélèvement à partir du nombre de colonies caractéristiques ou non
caractéristiques, ou les deux, obtenues dans les boîtes retenues aux niveaux de dilution donnant un
résultat significatif, et confirmées par un essai de coagulase positif, dans les limites de comptage de la
méthode et conformément à l’ISO 7218.NOTE Voir l’Annexe A relative au logigramme.
5 Milieux de culture et réactifs
Suivre les pratiques courantes de laboratoire conformément à l’ISO 7218.
La composition des milieux de culture et des réactifs et leur préparation sont décrites à l’Annexe B.
Pour les essais de performance des milieux de culture et des réactifs, suivre les modes opératoires
conformément à l’Annexe B ou à l’ISO 11133, ou aux deux.Pour les diluants, voir la partie correspondante de la série de normes ISO 6887.
6 Équipement et consommables
Le matériel à usage unique est acceptable au même titre que la verrerie réutilisable, à condition que ses
spécifications soient convenables.Matériel courant de laboratoire de microbiologie (voir l’ISO 7218) et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Appareil pour la stérilisation en chaleur sèche (four) et en chaleur humide (autoclave).
Voir l’ISO 7218.6.2 Étuve permettant de maintenir les milieux ensemencés à l’intérieur d’une plage de température
comprise entre 34 °C et 38 °C.NOTE La plage de température comprise entre 34 °C et 38 °C pour l’incubation de milieux inclut l’utilisation
d’étuves réglées à 35 °C ± 1 °C, à 36 °C ± 2 °C ou à 37 °C ± 1 °C.6.3 Bain d’eau, ou dispositif similaire, pouvant être maintenu à une température entre 44 °C et 47 °C.
6.4 Tubes à essai, flacons ou fioles avec bouchons, de capacités appropriées. Des flacons ou fioles
avec bouchons à vis métalliques ou plastiques non toxiques peuvent être utilisés.
6.5 Boîtes de Petri stériles, d’environ 90 mm de diamètre et (facultatif) de grandes dimensions
(environ 140 mm de diamètre), en verre ou en matière plastique.6.6 Fil droit (voir l’ISO 7218) ou pipette Pasteur.
Anses bouclées/œse (d’un diamètre d’environ 3 mm) et fils droits, en platine/iridium ou nickel/chrome,
ou tiges en verre, ou aiguilles d’ensemencement ou anses stériles jetables équivalentes.
6.7 Pipettes graduées ou pipettes automatiques stériles, d’une capacité nominale de 1 ml, 2 ml et
10 ml, graduées respectivement en 0,1 ml, 0,1 ml et 0,5 ml. Voir l’ISO 7218.Il convient que les pipettes graduées et les embouts des pipettes soient munis d’un bouchon en coton
non absorbant pour empêcher la contamination lors de la manipulation de cultures microbiennes.
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6.8 Étaleurs, stériles, en verre ou en matière plastique.
6.9 pH-mètre ayant une précision de lecture de ± 0,01 unité pH, permettant de réaliser des mesures
précises à ± 0,1 unité pH. Le pH-mètre doit être équipé d’un système de compensation de température
soit manuel, soit automatique. Voir l’ISO 7218.6.10 Réfrigérateur, pouvant fonctionner à 5 °C ± 3 °C.
6.11 Membranes, d’une porosité de 0,2 µm.
7 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document. Suivre la Norme
internationale spécifique du produit concerné. S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique
traitant de l’échantillonnage du produit concerné, il convient que les parties concernées se mettent
d’accord à ce sujet.Des techniques d’échantillonnage recommandées sont décrites dans les documents suivants:
— ISO/TS 17728 pour les aliments et les aliments pour animaux;— ISO 707 pour le lait et les produits laitiers;
— ISO 6887-3 pour les produits de la pêche;
— ISO 13307 pour le stade de production primaire;
— ISO 17604 pour les carcasses;
— ISO 18593 pour les surfaces.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon représentatif. Il convient que l’échantillon n’ait
pas été endommagé ni modifié au cours du transport ou du stockage.8 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l’échantillon pour essai à partir de l’échantillon de laboratoire, conformément à la Norme
internationale spécifique du produit concerné: suivre les modes opératoires spécifiés dans la série de
normes ISO 6887 et, si nécessaire, dans l’ISO 18593. S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique,
il convient que les parties concernées se mettent d’accord à ce sujet.9 Mode opératoire
9.1 Prise d’essai, suspension mère et dilutions
Se reporter à la partie correspondante de la série de normes ISO 6887.
9.2 Ensemencement et incubation
Transférer, à l’aide d’une pipette stérile (6.7), 0,1 ml de l’échantillon pour essai s’il est liquide ou 0,1 ml
de la suspension mère (dilution 10 ) pour les autres produits, dans une boîte de milieu gélosé de Baird-
Parker (BPA) (voir B.2). Dans le cadre des techniques de dénombrement en microbiologie de la chaîne
alimentaire, le nombre de boîtes de Petri à utiliser en fonction des dilutions soumises à essai est indiqué
dans l’ISO 7218. Répéter le mode opératoire pour les dilutions décimales suivantes si nécessaire.
S’il est nécessaire, pour certains produits, de procéder au comptage de petits nombres de
staphylocoques à coagulase positive, le niveau de détection peut être augmenté d’une puissance de 10
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en ensemençant 1,0 ml de l’échantillon pour essai s’il est liquide ou 1,0 ml de la suspension mère pour
les autres produits, soit à la surface d’une grande boîte (140 mm de diamètre), soit à la surface de
trois petites boîtes (90 mm de diamètre) de milieu gélosé. Le nombre de boîtes de Petri à utiliser en
fonction des dilutions soumises à essai est indiqué dans l’ISO 7218.Étaler soigneusement l’inoculum le plus rapidement possible à la surface de la boîte de milieu gélosé, en
évitant de toucher les bords de la boîte de Petri, à l’aide de l’étaleur (6.8). Laisser sécher les boîtes, avec
leur couvercle en place, pendant environ 15 min à température ambiante.NOTE Pour l’ensemencement en mode Spiral, voir l’ISO 7218.
Retourner les boîtes préparées selon les instructions ci-dessus et les placer dans l’étuve (6.2) réglée
à une température comprise entre 34 °C et 38 °C pendant 24 h ± 2 h. Puis incuber à nouveau pour
atteindre une durée totale de 48 h ± 4 h.NOTE Les colonies d’apparence caractéristique après 24 h ± 2 h d’incubation peuvent perdre leur aspect
caractéristique au bout de 48 h ± 4 h d’incubation, en raison d’une croissance secondaire avec élargissement
du halo d’éclaircissement lors de la seconde phase d’incubation. Un seul comptage au bout de 48 h ± 4 h peut
entraîner des dénombrements trop faibles ou l’absence totale de dénombrement.9.3 Comptage des colonies
9.3.1 Description générale des colonies cultivant sur un milieu BPA
9.3.1.1 Colonies présumées être des staphylocoques à coagulase positive
Les colonies caractéristiques sont noires ou grises, brillantes et convexes (de 1 mm à 1,5 mm de
diamètre après 24 h ± 2 h d’incubation, et de 1,5 mm à 2,5 mm de diamètre après 48 h ± 4 h d’incubation)
et sont entourées d’un halo d’éclaircissement qui peut être partiellement opaque. Après au moins 24 h
d’incubation, peut apparaître dans ce halo d’éclaircissement un anneau opalescent immédiatement au
contact des colonies.Les colonies non caractéristiques ont la même taille que les colonies caractéristiques et peuvent
présenter l’une des morphologies suivantes:— colonies noires et brillantes avec ou sans bord blanc étroit; le halo d’éclaircissement est absent ou à
peine visible et l’anneau opalescent est absent ou à peine visible;— colonies grises dépourvues de halo d’éclaircissement.
Les colonies non caractéristiques sont surtout formées par des souches de staphylocoques à coagulase
positive contaminant, par exemple, les produits laitiers, les crevettes et les abats. Elles sont moins
souvent produites par les souches de staphylocoques à coagulase positive qui contaminent les autres
produits.9.3.1.2 Colonies non présumées être des staphylocoques à coagulase positive
Les autres colonies sont celles éventuellement présentes sur les boîtes et qui n’ont pas l’apparence de
colonies caractéristiques ou non caractéristiques décrite en 9.3.1.1 et sont considérées comme faisant
partie de la flore annexe.NOTE Des bactéries appartenant à d’autres genres que les staphylocoques peuvent former des colonies
d’aspect similaire à celui des staphylocoques. L’examen microscopique d’une coloration de Gram, avant
confirmation, permettra de faire la distinction entre ces autres genres et les staphylocoques.
9.3.2 Mode opératoire de comptage des coloniesAprès 24 h ± 2 h d’incubation, marquer sur le fond des boîtes les emplacements des colonies
caractéristiques éventuellement présentes.© ISO 2021 – Tous droits réservés 5
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ISO/FDIS 6888-1:2021(F)
Incuber à nouveau toutes les boîtes entre 34 °C et 38 °C pendant 2
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.