ISO 20666:2008
(Main)Water quality — Determination of the chronic toxicity to Brachionus calyciflorus in 48 h
Water quality — Determination of the chronic toxicity to Brachionus calyciflorus in 48 h
ISO 20666:2008 specifies a method for the determination of the chronic toxicity to rotifer Brachionus calyciflorus, based on population growth inhibition in 48 h. The method is applicable to: a) chemical substances which are soluble or which can be maintained as stable suspensions or dispersions under the conditions of the test; b) industrial or sewage effluents, treated or untreated, if appropriate after decantation, filtration or centrifugation; c) fresh waters; d) aqueous extracts. ISO 20666:2008 is not applicable to the testing of unstable chemicals (hydrolysing, absorbing, etc.) in water unless exposure concentration is measured, nor to the testing of aquatic samples from the estuarine or marine environment.
Qualité de l'eau — Détermination de la toxicité chronique vis-à-vis de Brachionus calyciflorus en 48 h
L'ISO 20666:2008 spécifie une méthode de détermination de la toxicité chronique vis-à-vis du rotifère Brachionus calyciflorus, basée sur l'inhibition de la croissance de la population en 48 h. Cette méthode est applicable: a) aux substances chimiques solubles ou pouvant être maintenues en suspension ou en dispersion stable dans les conditions de l'essai; b) aux effluents industriels ou aux eaux usées, traités ou non, le cas échéant après décantation, filtration ou centrifugation; c) aux eaux douces; d) aux extraits aqueux. L'ISO 20666:2008 n'est applicable ni aux essais de produits chimiques instables dans l'eau (hydrolysables, susceptibles d'absorber, etc.), sauf si l'on mesure la concentration d'exposition, ni aux essais effectués sur des échantillons aquatiques provenant d'un milieu marin ou estuarien.
Kakovost vode - Določevanje kronične strupenosti z Brachionus calyciflorus v 48 urah
Ta mednarodni standard določa metodo določevanja kronične strupenosti z Brachionus calyciflorus, osnovano na zaviranju rasti populacije v 48 urah. Metoda se uporablja za:
a) kemične substance, ki so topne ali ki se lahko ohranijo kot stabilne suspenzije ali disperzije pod preskusnimi pogoji;
b) industrijske ali komunalne odplake, obdelane ali neobdelane, po potrebi po pretočitvi, filtraciji ali centrifugiranju;
c) sladke vode;
d) vodne ekstrakte.
Ta mednarodni standard ne velja za preskušanje nestabilnih kemikalij (hidroliziranje, absorbiranje itd.) v vodi, razen če se koncentracijo izpostavljenosti meri, niti za preskušanje vodnih vzorcev iz rečnega ustja ali morskega okolja.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 20666
First edition
2008-12-15
Water quality — Determination of the
chronic toxicity to Brachionus
calyciflorus in 48 h
Qualité de l'eau — Détermination de la toxicité chronique vis-à-vis de
Brachionus calyciflorus en 48 h
Reference number
ISO 20666:2008(E)
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ISO 2008
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the unlikely event that a problem relating to it is found, please inform the Central Secretariat at the address given below.
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ISO 20666:2008(E)
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 2
4 Principle. 2
5 Test environment. 3
6 Reagents, test organisms and media . 3
7 Apparatus . 4
8 Treatment and preparation of samples . 5
9 Procedure . 6
10 Expression of results . 9
11 Validity criteria . 10
12 Test report . 10
Annex A (informative) Preparation of the LC OLIGO medium. 12
Annex B (informative) Precision data. 14
Bibliography . 15
© ISO 2008 – All rights reserved iii
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ISO 20666:2008(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 20666 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5, Biological
methods.
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ISO 20666:2008(E)
Introduction
The evaluation of harmful effects on water quality has for several years involved the performance of biological
tests. Rotifera, and especially the species Brachionus calyciflorus, are of interest from the ecotoxicological
standpoint because they offer the advantage of breeding by parthenogenesis and of possessing a very short
generation time: a single mother maintained under favourable conditions over 48 h reproduces several times.
Brachionus calyciflorus is an organism of the zooplankton, which lives in fresh water. These animals are
primary consumers and serve as prey for a large number of fish larvae and invertebrates.
The test specified in this International Standard is carried out over 48 h and therefore involves at least three
reproductions from a single parent organism (see Reference [11]).
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 20666:2008(E)
Water quality — Determination of the chronic toxicity to
Brachionus calyciflorus in 48 h
WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory
practice. This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if any,
associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health
practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted according to this International Standard
be carried out by suitably trained staff.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of the chronic toxicity to rotifer
Brachionus calyciflorus, based on population growth inhibition in 48 h.
The method is applicable to:
a) chemical substances which are soluble or which can be maintained as stable suspensions or dispersions
under the conditions of the test;
b) industrial or sewage effluents, treated or untreated, if appropriate after decantation, filtration or
centrifugation;
c) fresh waters;
d) aqueous extracts.
This International Standard is not applicable to the testing of unstable chemicals (hydrolysing, absorbing, etc.)
in water unless exposure concentration is measured, nor to the testing of aquatic samples from the estuarine
or marine environment.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 5667-16:1998, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples
ISO 5814, Water quality — Determination of dissolved oxygen — Electrochemical probe method
ISO 10523, Water quality — Determination of pH
© ISO 2008 – All rights reserved 1
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ISO 20666:2008(E)
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
control batch
series of replicates containing control solution (3.2)
[ISO 20665:2008]
NOTE In this International Standard, eight replicates constitute the control batch.
3.2
control solution
mixture of test medium and of food without sample under test
[ISO 20665:2008]
3.3
effective concentration producing x % population growth inhibition
EC
x
estimated concentration of the sample giving rise to x % population growth inhibition (3.4) with respect to
the control batch (3.1)
3.4
population growth inhibition
comparison of the total number of females (offspring and mothers) at the end of the test between the control
batch (3.1) and the test batch (3.5)
3.5
test batch
series of replicates filled with the same test solution (3.6)
[ISO 20665:2008]
NOTE In this International Standard, eight replicates constitute a test batch.
3.6
test solution
mixture of test medium, of food and of sample under test
[ISO 20665:2008]
4 Principle
Female Brachionus calyciflorus, less than 2 h old at the beginning of the test, are exposed individually to a
range of concentrations of the sample under test for a period of 48 h. The test focuses on the population
growth of planktonic rotifers by parthenogenetic reproduction. At the end of the test, the number of female
rotifers is determined and, by comparison with the control, the population growth inhibition percentages are
determined for each concentration.
The data obtained allow, using a regression model, the calculation of the concentration which gives rise to x %
population growth inhibition, EC , e.g. EC , EC or EC .
x 10 20 50
2 © ISO 2008 – All rights reserved
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ISO 20666:2008(E)
5 Test environment
Carry out the test in the dark, in a thermostatically controlled room or chamber so as to obtain a temperature
of (25 ± 1) °C in the test containers.
Maintain the atmosphere free from toxic dusts or vapours. This is checked by producing control solutions.
6 Reagents, test organisms and media
Use only reagents of recognised analytical grade, unless otherwise specified.
6.1 Test organisms
Females of the species Brachionus calyciflorus (Monogonota, Rotifera) are obtained from a laboratory culture
1)
(see References [3], [12], [13]) or born from commercially available cysts . Sensitivity of the test for organisms
should be performed with copper sulfate pentahydrate or sodium pentachlorophenolate (NaPCP) (see 6.5).
If cysts are used, employ first generation Brachionus calyciflorus, obtained by hatching of cysts under the
following conditions.
Transfer the cysts to a container containing the test medium (6.3), e.g. 15 mg of cysts in approximately 10 ml
of test medium. Incubate the container at (25 ± 1) °C for 18 h to 24 h, under continuous lighting of intensity
1 000 lx to 4 000 lx (7.7).
A food supply is not necessary for the hatching of the cysts. A better multiplication rate of the rotifers is,
however, achieved by adding, just after the emergence of the first neonates, algae in identical quantity to that
1)
indicated in 6.4. Alternatively, 100 µg/l of the inert food ROTIRICH can be added as pre-feeding supplement
(Reference [18]).
The animals used for the test shall be less than 2 h old, the hatching should therefore be supervised as from
17 h of incubation, then every half hour.
The test is started when the number of young rotifers is considered sufficient to perform a complete test.
EXAMPLE For a test with five concentrations and one control (i.e. 48 rotifers), this condition is generally fulfilled
about 1 h after the first hatching has been observed. Hatching time is quite stable within one laboratory, allowing hatching
to be planned in advance to provide sufficient offspring during working hours.
2)
6.2 Pure water, having a conductivity below 10 µS/cm .
6.3 Test medium, prepared by dissolving the following mineral substances in 1 l of pure water (6.2):
NaHCO 96 mg
3
CaSO ·2HO 60 mg
4 2
MgSO 60 mg
4
KCl 4 mg
This test medium corresponds to a synthetic water, of moderate hardness, i.e. 80 mg CaCO to 100 mg
3
CaCO per litre (see Reference [14]). Thus prepared, the medium has a pH of 7,6 ± 0,3.
3
Store this solution in the dark at ambient temperature and use within 7 d of preparation.
1) Dehydrated rotifer cysts and ROTIRICH are examples of suitable products available commercially. This information is
given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of these products.
2) 1 mS/m.
© ISO 2008 – All rights reserved 3
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ISO 20666:2008(E)
Aerate the test medium until the dissolved oxygen concentration has reached the air saturation value and until
the pH has stabilised. If necessary, adjust the pH to 7,6 ± 0,3 using a sodium hydroxide or hydrochloric acid
solution. The concentration of the acid or base required shall be selected so that the volume to be admixed is
as small as possible. Bring the temperature of the test medium up to (25 ± 1) °C prior to use.
6.4 Food, composed of Chlorella vulgaris algae.
The algae are grown in any suitable medium (e.g. LC OLIGO, see Annex A). They are used when the culture
6 6
is in the exponential growth phase. The algal concentration in the test shall be between 2 × 10 and 3 × 10
cells per millilitre. To achieve this, previously adjust the concentration by centrifuging the culture (e.g. for
−2
20 min at 20 000 m s ) and resuspending the algae by shaking with a sufficient volume of test medium (6.3)
7 7
in order to obtain a suspension of around 2 × 10 cells per millilitre to 3 × 10 cells per millilitre. This
6 6
concentration allows the provision of 2 × 10 to 3 × 10 cells by using a volume of 0,1 ml.
The algae culture may be stored at (4 ± 3) °C, in darkness, for a maximum period of 10 d.
The food can also be composed of Pseudokirchneriella subcapitata (formerly known as Selenastrum
3)
capricornutum or Raphidocelis subcapitata) algae . The algal concentration in the test shall then be between
6 6
1 × 10 cells and 1,5 × 10 cells per millilitre.
4)
The use of algae immobilised in an inert matrix (gelose), in the form of algae beads is possible. In this case,
after dissolving the matrix, centrifuge the algae, discard the supernatant, and resuspend the algae by shaking
in the test medium (6.3). Repeat this operation a second time. The algal concentration in the test medium
shall be in the range specified above.
6.5 Reference substance
NaPCP (C Cl ONa) and/or copper sulfate pentahydrate (CuSO ·5H O) can be used.
6 5 4 2
CAUTION — If sodium pentachlorophenolate is used as a reference toxicant, the material safety data
sheet should be consulted prior to use by laboratory personnel due to the hazardous nature of this
substance.
7 Apparatus
Usual laboratory equipment and in particular the following.
7.1 Thermostatically controlled room or chamber.
7.2 Test containers; disposable microplates made from chemically inert material, comprising wells with a
capacity W1 ml, allowing a water level if possible below the depth of focus of the magnifying glass (7.5) to be
obtained. For example, 24 (4 × 6) well microplates with a well diameter of approximately 16 mm, are suitable.
Do not use round bottomed microplates. Alternatively, use single closed containers.
7.3 Device for measurement of algal concentration, for example, a microscope equipped with a
haemocytometer or particle counter. Indirect methods (e.g. spectrophotometer, turbidimeter, fluorimeter) can
be used if an acceptable correlation with the cellular concentration can be established.
3) The Freshwater Biological Association, Ambleside, UK, is an example of a supplier able to provide these algae
commercially. This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an
endorsement by ISO of this supplier.
4) MicroBioTests, Mariakerke (Gent), Belgium, is an example of a supplier able to provide suitable algal beads
commercially. This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an
endorsement by ISO of this supplier.
4 © ISO 2008 – All rights reserved
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ISO 20666:2008(E)
7.4 Pipette for sampling rotifers, with a sufficient diameter for capturing the animals while allowing
sampling of only a small volume of medium. For example, single use 1 ml capillary mini-pipettes are suitable.
7.5 Binocular magnifying glass, with a magnification of at least 8 times and, if possible, a continuous
magnification.
7.6 Image analysis system, to count and measure Brachionus calyciflorus.
7.7 Light source, providing a range of light intensity in the test containers (7.2) of 1 000 lx to 4 000 lx.
7.8 Sample collecting bottles, in accordance with ISO 5667-16:1998, 3.2.
7.9 Sieve, of nominal size of openings of nominal size of openings < 50 µm (a sifting cloth having a nominal
size of openings of 10 µm or 20 µm is suitable).
8 Treatment and preparation of samples
8.1 Special precautions for sampling, transportation, storage and treatment of water,
effluent, or aqueous extract samples to be tested
Sampling, transportation and storage of the samples should be performed in accordance with the general
procedures specified in ISO 5667-16.
Collect the samples in bottles made from chemically inert materials (7.8).
Carry out the toxicity test as soon as possible, ideally within 12 h of collection. If this time interval cannot be
met, cool the sample to 0 °C to 4 °C and test the sample within 24 h. If it is not possible to perform the test
within 72 h, the sample may be frozen and maintained below −18 °C for testing within 2 months of collection,
provided that characteristics are known to be unaffected by freezing. At the time of testing, homogenise the
sample to be analysed by shaking manually, and, if necessary, allow to settle for 2 h in a container, and
sample by drawing off (using a pipette) the required quantity of supernatant, maintaining the end of the pipette
in the centre of the section of the test tube and half way between the surface of the deposited substances and
the surface of the liquid.
If the raw sample or the decanted supernatant is likely to interfere with the test (due to the presence of
residual suspended matter, protozoa, microorganisms, etc.), filter or centrifuge the raw or decanted sample.
However, this sample manipulation should be avoided unless absolutely necessary since it may change
physicochemical characteristics and possibly remove some toxicant from the sample.
The sample obtained by either of these methods is the sample submitted to testing.
Measure the pH (as specified in ISO 10523) and the dissolved oxygen concentration (as specified in
ISO 5814) and record these values in the test report (Clause 12).
If the aim of the test is to assess the chronic toxicity without considering the pH effects, the test may also be
carried out after adjustment of the pH to 7,6 ± 0,3 with hydrochloric acid or sodium hydroxide solutions.
Proceed, if appropriate, as indicated above, for the separation of the suspended matter formed following the
adjustment of the pH. Mention any pH adjustment in the test report (Clause 12).
8.2 Preparation of the stock solutions of substances to be tested
Prepare the stock solution of the substance to be tested by dissolving a known quantity of substance in a
specified volume of test medium (6.3) at the time of use. However, if the stock solution of the substance is
stable under certain conditions, it may be prepared in advance and stored under these conditions.
For substances sparingly soluble in the test medium, refer to the sp
...
SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 20666:2010
01-september-2010
.DNRYRVWYRGH'RORþHYDQMHNURQLþQHVWUXSHQRVWL]%UDFKLRQXVFDO\FLIORUXVY
XUDK
Water quality - Determination of the chronic toxicity to Brachionus calyciflorus in 48 h
Qualité de l'eau - Détermination de la toxicité chronique vis-à-vis de Brachionus
calyciflorus en 48 h
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 20666:2008
ICS:
13.060.70 Preiskava bioloških lastnosti Examination of biological
vode properties of water
SIST ISO 20666:2010 en,fr
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.
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SIST ISO 20666:2010
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Water quality — Determination of the
chronic toxicity to Brachionus
calyciflorus in 48 h
Qualité de l'eau — Détermination de la toxicité chronique vis-à-vis de
Brachionus calyciflorus en 48 h
Reference number
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ISO 20666:2008(E)
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 2
4 Principle. 2
5 Test environment. 3
6 Reagents, test organisms and media . 3
7 Apparatus . 4
8 Treatment and preparation of samples . 5
9 Procedure . 6
10 Expression of results . 9
11 Validity criteria . 10
12 Test report . 10
Annex A (informative) Preparation of the LC OLIGO medium. 12
Annex B (informative) Precision data. 14
Bibliography . 15
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Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
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established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
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Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
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methods.
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ISO 20666:2008(E)
Introduction
The evaluation of harmful effects on water quality has for several years involved the performance of biological
tests. Rotifera, and especially the species Brachionus calyciflorus, are of interest from the ecotoxicological
standpoint because they offer the advantage of breeding by parthenogenesis and of possessing a very short
generation time: a single mother maintained under favourable conditions over 48 h reproduces several times.
Brachionus calyciflorus is an organism of the zooplankton, which lives in fresh water. These animals are
primary consumers and serve as prey for a large number of fish larvae and invertebrates.
The test specified in this International Standard is carried out over 48 h and therefore involves at least three
reproductions from a single parent organism (see Reference [11]).
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Water quality — Determination of the chronic toxicity to
Brachionus calyciflorus in 48 h
WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory
practice. This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if any,
associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health
practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted according to this International Standard
be carried out by suitably trained staff.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of the chronic toxicity to rotifer
Brachionus calyciflorus, based on population growth inhibition in 48 h.
The method is applicable to:
a) chemical substances which are soluble or which can be maintained as stable suspensions or dispersions
under the conditions of the test;
b) industrial or sewage effluents, treated or untreated, if appropriate after decantation, filtration or
centrifugation;
c) fresh waters;
d) aqueous extracts.
This International Standard is not applicable to the testing of unstable chemicals (hydrolysing, absorbing, etc.)
in water unless exposure concentration is measured, nor to the testing of aquatic samples from the estuarine
or marine environment.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 5667-16:1998, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples
ISO 5814, Water quality — Determination of dissolved oxygen — Electrochemical probe method
ISO 10523, Water quality — Determination of pH
© ISO 2008 – All rights reserved 1
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SIST ISO 20666:2010
ISO 20666:2008(E)
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
control batch
series of replicates containing control solution (3.2)
[ISO 20665:2008]
NOTE In this International Standard, eight replicates constitute the control batch.
3.2
control solution
mixture of test medium and of food without sample under test
[ISO 20665:2008]
3.3
effective concentration producing x % population growth inhibition
EC
x
estimated concentration of the sample giving rise to x % population growth inhibition (3.4) with respect to
the control batch (3.1)
3.4
population growth inhibition
comparison of the total number of females (offspring and mothers) at the end of the test between the control
batch (3.1) and the test batch (3.5)
3.5
test batch
series of replicates filled with the same test solution (3.6)
[ISO 20665:2008]
NOTE In this International Standard, eight replicates constitute a test batch.
3.6
test solution
mixture of test medium, of food and of sample under test
[ISO 20665:2008]
4 Principle
Female Brachionus calyciflorus, less than 2 h old at the beginning of the test, are exposed individually to a
range of concentrations of the sample under test for a period of 48 h. The test focuses on the population
growth of planktonic rotifers by parthenogenetic reproduction. At the end of the test, the number of female
rotifers is determined and, by comparison with the control, the population growth inhibition percentages are
determined for each concentration.
The data obtained allow, using a regression model, the calculation of the concentration which gives rise to x %
population growth inhibition, EC , e.g. EC , EC or EC .
x 10 20 50
2 © ISO 2008 – All rights reserved
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SIST ISO 20666:2010
ISO 20666:2008(E)
5 Test environment
Carry out the test in the dark, in a thermostatically controlled room or chamber so as to obtain a temperature
of (25 ± 1) °C in the test containers.
Maintain the atmosphere free from toxic dusts or vapours. This is checked by producing control solutions.
6 Reagents, test organisms and media
Use only reagents of recognised analytical grade, unless otherwise specified.
6.1 Test organisms
Females of the species Brachionus calyciflorus (Monogonota, Rotifera) are obtained from a laboratory culture
1)
(see References [3], [12], [13]) or born from commercially available cysts . Sensitivity of the test for organisms
should be performed with copper sulfate pentahydrate or sodium pentachlorophenolate (NaPCP) (see 6.5).
If cysts are used, employ first generation Brachionus calyciflorus, obtained by hatching of cysts under the
following conditions.
Transfer the cysts to a container containing the test medium (6.3), e.g. 15 mg of cysts in approximately 10 ml
of test medium. Incubate the container at (25 ± 1) °C for 18 h to 24 h, under continuous lighting of intensity
1 000 lx to 4 000 lx (7.7).
A food supply is not necessary for the hatching of the cysts. A better multiplication rate of the rotifers is,
however, achieved by adding, just after the emergence of the first neonates, algae in identical quantity to that
1)
indicated in 6.4. Alternatively, 100 µg/l of the inert food ROTIRICH can be added as pre-feeding supplement
(Reference [18]).
The animals used for the test shall be less than 2 h old, the hatching should therefore be supervised as from
17 h of incubation, then every half hour.
The test is started when the number of young rotifers is considered sufficient to perform a complete test.
EXAMPLE For a test with five concentrations and one control (i.e. 48 rotifers), this condition is generally fulfilled
about 1 h after the first hatching has been observed. Hatching time is quite stable within one laboratory, allowing hatching
to be planned in advance to provide sufficient offspring during working hours.
2)
6.2 Pure water, having a conductivity below 10 µS/cm .
6.3 Test medium, prepared by dissolving the following mineral substances in 1 l of pure water (6.2):
NaHCO 96 mg
3
CaSO ·2HO 60 mg
4 2
MgSO 60 mg
4
KCl 4 mg
This test medium corresponds to a synthetic water, of moderate hardness, i.e. 80 mg CaCO to 100 mg
3
CaCO per litre (see Reference [14]). Thus prepared, the medium has a pH of 7,6 ± 0,3.
3
Store this solution in the dark at ambient temperature and use within 7 d of preparation.
1) Dehydrated rotifer cysts and ROTIRICH are examples of suitable products available commercially. This information is
given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of these products.
2) 1 mS/m.
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SIST ISO 20666:2010
ISO 20666:2008(E)
Aerate the test medium until the dissolved oxygen concentration has reached the air saturation value and until
the pH has stabilised. If necessary, adjust the pH to 7,6 ± 0,3 using a sodium hydroxide or hydrochloric acid
solution. The concentration of the acid or base required shall be selected so that the volume to be admixed is
as small as possible. Bring the temperature of the test medium up to (25 ± 1) °C prior to use.
6.4 Food, composed of Chlorella vulgaris algae.
The algae are grown in any suitable medium (e.g. LC OLIGO, see Annex A). They are used when the culture
6 6
is in the exponential growth phase. The algal concentration in the test shall be between 2 × 10 and 3 × 10
cells per millilitre. To achieve this, previously adjust the concentration by centrifuging the culture (e.g. for
−2
20 min at 20 000 m s ) and resuspending the algae by shaking with a sufficient volume of test medium (6.3)
7 7
in order to obtain a suspension of around 2 × 10 cells per millilitre to 3 × 10 cells per millilitre. This
6 6
concentration allows the provision of 2 × 10 to 3 × 10 cells by using a volume of 0,1 ml.
The algae culture may be stored at (4 ± 3) °C, in darkness, for a maximum period of 10 d.
The food can also be composed of Pseudokirchneriella subcapitata (formerly known as Selenastrum
3)
capricornutum or Raphidocelis subcapitata) algae . The algal concentration in the test shall then be between
6 6
1 × 10 cells and 1,5 × 10 cells per millilitre.
4)
The use of algae immobilised in an inert matrix (gelose), in the form of algae beads is possible. In this case,
after dissolving the matrix, centrifuge the algae, discard the supernatant, and resuspend the algae by shaking
in the test medium (6.3). Repeat this operation a second time. The algal concentration in the test medium
shall be in the range specified above.
6.5 Reference substance
NaPCP (C Cl ONa) and/or copper sulfate pentahydrate (CuSO ·5H O) can be used.
6 5 4 2
CAUTION — If sodium pentachlorophenolate is used as a reference toxicant, the material safety data
sheet should be consulted prior to use by laboratory personnel due to the hazardous nature of this
substance.
7 Apparatus
Usual laboratory equipment and in particular the following.
7.1 Thermostatically controlled room or chamber.
7.2 Test containers; disposable microplates made from chemically inert material, comprising wells with a
capacity W1 ml, allowing a water level if possible below the depth of focus of the magnifying glass (7.5) to be
obtained. For example, 24 (4 × 6) well microplates with a well diameter of approximately 16 mm, are suitable.
Do not use round bottomed microplates. Alternatively, use single closed containers.
7.3 Device for measurement of algal concentration, for example, a microscope equipped with a
haemocytometer or particle counter. Indirect methods (e.g. spectrophotometer, turbidimeter, fluorimeter) can
be used if an acceptable correlation with the cellular concentration can be established.
3) The Freshwater Biological Association, Ambleside, UK, is an example of a supplier able to provide these algae
commercially. This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an
endorsement by ISO of this supplier.
4) MicroBioTests, Mariakerke (Gent), Belgium, is an example of a supplier able to provide suitable algal beads
commercially. This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an
endorsement by ISO of this supplier.
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SIST ISO 20666:2010
ISO 20666:2008(E)
7.4 Pipette for sampling rotifers, with a sufficient diameter for capturing the animals while allowing
sampling of only a small volume of medium. For example, single use 1 ml capillary mini-pipettes are suitable.
7.5 Binocular magnifying glass, with a magnification of at least 8 times and, if possible, a continuous
magnification.
7.6 Image analysis system, to count and measure Brachionus calyciflorus.
7.7 Light source, providing a range of light intensity in the test containers (7.2) of 1 000 lx to 4 000 lx.
7.8 Sample collecting bottles, in accordance with ISO 5667-16:1998, 3.2.
7.9 Sieve, of nominal size of openings of nominal size of openings < 50 µm (a sifting cloth having a nominal
size of openings of 10 µm or 20 µm is suitable).
8 Treatment and preparation of samples
8.1 Special precautions for sampling, transportation, storage and treatment of water,
effluent, or aqueous extract samples to be tested
Sampling, transportation and storage of the samples should be performed in accordance with the general
procedures specified in ISO 5667-16.
Collect the samples in bottles made from chemically inert materials (7.8).
Carry out the toxicity test as soon as possible, ideally within 12 h of collection. If this time interval cannot be
met, cool the sample to 0 °C to 4 °C and test the sample within 24 h. If it is not possible to perform the test
within 72 h, the sample may be frozen and maintained below −18 °C for testing within 2 months of collection,
provided that characteristics are known to be unaffected by freezing. At the time of testing, homogenise the
sample to be analysed by shaking manually, and, if necessary, allow to settle for 2 h in a container, and
sample by drawing off (using a pipette) the required quantity of supernatant, maintaining the end of the pipette
in the centre of the section of the test tube and half way between the surface of the deposited substances and
the surface of the liquid.
If the raw sample or the decanted supernatant is likely to interfere with the test (due to the presence of
residual suspended matter, protozoa, microorganisms, etc.), filter or centrifuge the raw or decanted sample.
However, this sample manipulation should be avoided unless absolutely necessary since it may change
physicochemical characteristics and possibly remove some toxicant from the sample.
The sample obtained by either of these methods is the sample submitted to testing.
Measure the pH (as specified in ISO 10523) and the dissolved oxygen concentration (as specified in
ISO 5814) and record these values in the test report (Clause 12).
If the aim of the test is to assess the chronic toxicity without considering the pH effects, the test may also be
carried out after adjustment of the pH to 7,6 ± 0,3 with hydrochloric acid or sodium hydroxide solutions.
Proceed, if appropriate, as indicated above, for the separation of the suspended matter formed following the
adjustment of the pH. Mention any pH adjustmen
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 20666
Première édition
2008-12-15
Qualité de l'eau — Détermination de la
toxicité chronique vis-à-vis de
Brachionus calyciflorus en 48 h
Water quality — Determination of the chronic toxicity to Brachionus
calyciflorus in 48 h
Numéro de référence
ISO 20666:2008(F)
©
ISO 2008
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ISO 20666:2008(F)
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Publié en Suisse
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ISO 20666:2008(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions. 2
4 Principe. 2
5 Environnement de l'essai. 3
6 Réactifs, organismes pour essai et milieux. 3
7 Appareillage . 4
8 Traitement et préparation des échantillons . 5
9 Mode opératoire . 6
10 Expression des résultats . 9
11 Critères de validité. 10
12 Rapport d'essai . 10
Annexe A (informative) Préparation du milieu LC OLIGO. 12
Annexe B (informative) Données relatives à la fidélité. 14
Bibliographie . 15
© ISO 2008 – Tous droits réservés iii
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ISO 20666:2008(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 20666 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité SC 5,
Méthodes biologiques.
iv © ISO 2008 – Tous droits réservés
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ISO 20666:2008(F)
Introduction
La mise en évidence d'effets néfastes pour la qualité de l'eau passe, depuis plusieurs années, par la
réalisation d'essais biologiques. Les rotifères, et en particulier l'espèce Brachionus calyciflorus, sont
intéressants du point de vue écotoxicologique car ils présentent l'avantage de se reproduire par
parthénogenèse et de posséder un très court temps de génération: une seule mère maintenue dans des
conditions favorables pendant 48 h produit plusieurs pontes. Brachionus calyciflorus est un organisme du
zooplancton qui vit dans les eaux douces. Ces animaux sont des consommateurs primaires et servent de
proie à un grand nombre d'invertébrés et de larves de poisson.
L'essai spécifié dans la présente Norme internationale se déroule sur 48 h et porte donc sur au moins trois
pontes d'un seul organisme mature (voir Référence [11]).
© ISO 2008 – Tous droits réservés v
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NORME INTERNATIONALE ISO 20666:2008(F)
Qualité de l'eau — Détermination de la toxicité chronique vis-à-
vis de Brachionus calyciflorus en 48 h
AVERTISSEMENT — Il convient que l'utilisateur de la présente Norme internationale connaisse bien
les pratiques courantes de laboratoire. La présente Norme internationale n'a pas pour but de traiter
tous les problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à l'utilisateur
d'établir des pratiques appropriées en matière d'hygiène et de sécurité et de s'assurer de la
conformité à la réglementation nationale en vigueur.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais conduits conformément à la présente
Norme internationale soient effectués par du personnel ayant reçu une formation adéquate.
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de détermination de la toxicité chronique vis-à-vis du
rotifère Brachionus calyciflorus, basée sur l'inhibition de la croissance de la population en 48 h.
Cette méthode est applicable:
a) aux substances chimiques solubles ou pouvant être maintenues en suspension ou en dispersion stable
dans les conditions de l'essai;
b) aux effluents industriels ou aux eaux usées, traités ou non, le cas échéant après décantation, filtration ou
centrifugation;
c) aux eaux douces;
d) aux extraits aqueux.
La présente Norme internationale n'est applicable ni aux essais de produits chimiques instables dans l'eau
(hydrolysables, susceptibles d'absorber, etc.), sauf si l'on mesure la concentration d'exposition, ni aux essais
effectués sur des échantillons aquatiques provenant d'un milieu marin ou estuarien.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 5667-16:1998, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 16: Lignes directrices pour les essais
biologiques des échantillons
ISO 5814, Qualité de l'eau — Dosage de l'oxygène dissous — Méthode électrochimique à la sonde
ISO 10523, Qualité de l'eau — Détermination du pH
© ISO 2008 – Tous droits réservés 1
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ISO 20666:2008(F)
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
lot témoin
série de répliques contenant la solution témoin (3.2)
[ISO 20665:2008]
NOTE Dans la présente Norme internationale, 8 répliques constituent le lot témoin.
3.2
solution témoin
mélange de milieu d'essai et de nourriture sans l'échantillon soumis à essai
[ISO 20665:2008]
3.3
concentration effective produisant x % d'inhibition de croissance de la population
CE
x
concentration estimée de l'échantillon produisant une augmentation à x % de l'inhibition de croissance de
la population (3.4) par rapport au lot témoin (3.1)
3.4
inhibition de croissance de la population
comparaison du nombre total de femelles (jeunes et mères) à la fin de l'essai, entre le lot d'essai (3.5) et le
lot témoin (3.1)
3.5
lot d'essai
série de répliques contenant la même solution d'essai (3.6)
[ISO 20665:2008]
NOTE Dans la présente Norme internationale, 8 répliques constituent un lot d'essai.
3.6
solution d'essai
mélange constitué du milieu d'essai, de nourriture et de l'échantillon soumis à essai
[ISO 20665:2008]
4 Principe
Des femelles Brachionus calyciflorus, âgées de moins de 2 h au début de l'essai, sont exposées
individuellement à une gamme de concentrations de l'échantillon soumis à essai pendant une période de 48 h.
L'essai porte sur la croissance de la population de rotifères planctoniques par reproduction parthénogénétique.
À la fin de l'essai, le nombre de rotifères femelles est déterminé et, par comparaison avec le témoin, les
pourcentages d'inhibition de croissance de la population sont déterminés pour chaque concentration.
Les données obtenues permettent, en utilisant un modèle de régression, de calculer la concentration qui
provoque x % d'inhibition de croissance de la population (CE ), par exemple CE , CE ou CE .
x 10 20 50
2 © ISO 2008 – Tous droits réservés
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ISO 20666:2008(F)
5 Environnement de l'essai
Réaliser l'essai à l'abri de la lumière dans une enceinte ou un local thermostaté de manière à obtenir une
température de (25 ± 1) °C dans les récipients pour essai.
Maintenir l'atmosphère exempte de vapeurs ou poussières toxiques. Cela est vérifié par la production de
solutions témoins.
6 Réactifs, organismes pour essai et milieux
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue, sauf spécification contraire.
6.1 Organismes pour essai
Les femelles de l'espèce Brachionus calyciflorus (Monogonota, Rotifera) sont obtenues à partir d'un élevage
1)
de laboratoire (voir Références [3], [12], [13]) ou provenant de sporocystes disponibles sur le marché . Il
convient de procéder à une vérification de la sensibilité des organismes à l'aide de sulfate de cuivre
pentahydraté ou de pentachlorophénolate de sodium (NaPCP) (voir 6.5).
Dans le cas où l'on utilise des sporocystes, employer la première génération de Brachionus calyciflorus,
obtenue en faisant éclore des sporocystes dans les conditions suivantes.
Transférer les sporocystes dans un récipient contenant le milieu d'essai (6.3), par exemple 15 mg de
sporocystes dans environ 10 ml de milieu d'essai. Incuber le récipient à (25 ± 1) °C pendant une durée de
18 h à 24 h, dans des conditions d'éclairage continu d'intensité comprise entre 1 000 lx et 4 000 lx (7.7).
Un apport de nourriture n'est pas nécessaire à l'éclosion des sporocystes. Cependant, il est possible
d'augmenter le taux de multiplication des rotifères en ajoutant des algues, juste après l'éclosion des premiers
nouveau-nés, en quantité identique à celle indiquée en 6.4. Comme alternative, il est possible
1)
d'ajouter 100 µg/l de nourriture inerte ROTIRICH comme supplément alimentaire pour élevage
(Référence [18]).
Dans la mesure où les animaux utilisés pour l'essai doivent être âgés de moins de 2 h, il convient de surveiller
l'éclosion à partir de 17 h d'incubation, puis toutes les demi-heures.
L'essai est démarré lorsque le nombre de jeunes rotifères est jugé suffisant pour effectuer un essai complet.
EXEMPLE Pour un essai avec cinq concentrations et un témoin (soit 48 rotifères), cette condition est généralement
remplie environ 1 h après que la première éclosion a été observée. Le temps de reproduction est relativement stable au
sein d'un même laboratoire, ce qui permet une planification de la reproduction de façon à disposer d'un nombre suffisant
de jeunes durant les heures de travail.
2)
6.2 Eau pure, de conductivité inférieure à 10 µS/cm .
6.3 Milieu d'essai, préparé par dissolution des substances minérales suivantes dans 1 l d'eau pure (6.2):
NaHCO 96 mg
3
CaSO , 2HO 60 mg
4 2
MgSO 60 mg
4
KCl 4 mg
1) Des sporocystes rotifères déshydratés et du ROTIRICH sont des exemples de produits appropriés disponibles sur le
marché. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie
nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif des produits ainsi désignés.
2) 1 mS/m.
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ISO 20666:2008(F)
Ce milieu d'essai correspond à une eau synthétique moyennement dure, c'est-à-dire à 80 mg CaCO par litre
3
à 100 mg CaCO par litre (voir Référence [14]). Ainsi préparé, le milieu a un pH de 7,6 ± 0,3.
3
Conserver cette solution à l'abri de la lumière à température ambiante et l'utiliser dans les 7 jours suivant sa
préparation.
Aérer le milieu d'essai jusqu'à ce que sa concentration en oxygène dissous ait atteint la valeur de saturation
dans l'air et jusqu'à stabilisation du pH. Si nécessaire, ajuster le pH à 7,6 ± 0,3 à l'aide d'une solution
d'hydroxyde de sodium ou d'acide chlorhydrique. La concentration de la base ou de l'acide requis doit être
choisie de manière que le volume à ajouter soit aussi faible que possible. Amener la température du milieu
d'essai à (25 ± 1) °C avant utilisation.
6.4 Nourriture, composée d'algues Chlorella vulgaris.
Les algues sont cultivées dans tout milieu approprié (par exemple LC OLIGO, voir Annexe A). Elles sont
utilisées lorsque la culture est en phase exponentielle de croissance. La concentration algale lors de l'essai
6 6
doit être comprise entre 2 × 10 et 3 × 10 cellules par millilitre. Pour cela, ajuster préalablement la
−2
concentration en centrifugeant la culture (par exemple durant 20 min à 20 000 m·s ) et remettre en
suspension les algues en agitant avec un volume suffisant de milieu d'essai (6.3) pour obtenir une suspension
7 7
d'environ 2 × 10 cellules par millilitre à 3 × 10 cellules par millilitre. Cette concentration permet d'apporter de
6 6
2 × 10 cellules à 3 × 10 cellules en utilisant un volume de 0,1 ml.
La culture d'algues peut être conservée à (4 ± 3) °C à l'abri de la lumière, pendant une durée maximale de
10 jours.
3)
La nourriture peut aussi être composée d'algues Pseudokirchneriella subcapitata (anciennement dénom-
mées Selenastrum capricornutum ou Raphidocelis subcapitata). La concentration algale lors de l'essai doit
6 6
être comprise entre 1 × 10 cellules par millilitre et 1,5 × 10 cellules par millilitre.
4)
L'utilisation d'algues immobilisées dans une matrice inerte (gélose), sous forme de billes d'algues est
possible. Dans ce cas, après dissolution de la matrice, centrifuger les algues, éliminer le surnageant et
remettre les algues en suspension en les agitant dans le milieu d'essai (6.3). Recommencer cette opération
une seconde fois. La concentration algale dans le milieu d'essai doit se situer dans la fourchette spécifiée ci-
dessus.
6.5 Substance de référence
Le NaPCP (C Cl ONa) et/ou le sulfate de cuivre pentahydraté (CuSO , 5H O) peuvent être utilisés.
6 5 4 2
ATTENTION — En cas d'utilisation du pentachlorophénate de sodium en tant que toxique de référence,
il convient de consulter sa fiche de données de sécurité avant tout usage par le personnel du
laboratoire, en raison de la nature dangereuse de cette substance.
7 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et en particulier ce qui suit.
7.1 Enceinte ou local thermostaté.
3) Les algues fournies par Freshwater Biological Association, Ambleside, Royaume-Uni, sont un exemple de produit
approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs de la présente Norme
internationale et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif des produits de ce fournisseur.
4) Les billes d'algues fournies par MicroBioTests, Mariakerke (Gent), Belgique sont un exemple de produit approprié
disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et
ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif des produits de ce fournisseur.
4 © ISO 2008 – Tous droits réservés
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ISO 20666:2008(F)
7.2 Récipients pour essai; microplaques à usage unique, fabriquées en un matériau chimiquement inerte,
comprenant des puits de contenance supérieure ou égale à 1 ml, permettant d'obtenir une hauteur d'eau si
possible inférieure à la profondeur de champ de la loupe (7.5). Par exemple, des microplaques de 24 (4 × 6)
puits ayant un diamètre de puits d'environ 16 mm sont appropriées. Ne pas utiliser de microplaques à fond
rond. Comme alternative, utiliser des récipients uniques et fermés.
7.3 Dispositif permettant de mesurer la concentration algale, par exemple microscope équipé d'un
hématimètre ou d'un compteur de particules. Des méthodes indirectes (spectrophotomètre, turbidimètre,
fluorimètre, par exemple) peuvent être utilisées si une corrélation acceptable avec la concentration cellulaire
peut être établie.
7.4 Pipette de prélèvement des rotifères, de diamètre suffisant pour capturer les animaux tout en
permettant de ne prélever qu'un faible volume de milieu. Par exemple, des mini-pipettes capillaires de 1 ml à
usage unique conviennent.
7.5 Loupe binoculaire, grossissant au moins 8 fois et, si possible, permettant d'obtenir un grossissement
continu.
7.6 Système d'analyse de l'image, pour compter et mesurer les Brachionus calyciflorus.
7.7 Éclairage, capable de fournir une intensité lumineuse comprise dans une gamme de 1 000 lx à 4 000 lx
dans les récipients d'essai (7.2).
7.8 Flacons de collecte d'échantillons, conformes à l'ISO 5667-16:1998, 3.2.
7.9 Tamis, de dimension nominale d'ouverture < 50 µm (une toile à bluter ayant une dimension nominale
d'ouverture de 10 µm ou de 20 µm est appropriée).
8 Traitement et préparation des échantillons
8.1 Précautions particulières pour l'échantillonnage, le transport, la conservation et le
traitement d'échantillons d'eaux, d'effluents, ou d'extraits aqueux soumis à essai
Il convient d'effectuer l'échantillonnage, le transport et la conservation des échantillons conformément aux
modes opératoires généraux spécifiés dans l'ISO 5667-16.
Recueillir les échantillons dans des flacons en matériaux chimiquement inertes (7.8).
Procéder à l'essai de toxicité dès que possible, idéalement dans les 12 h suivant le recueil des échantillons.
Si cet intervalle de temps ne peut pas être respecté, refroidir l'échantillon entre 0 °C et 4 °C et soumettre
l'échantillon à l'essai dans les 24 h. S'il n'est pas possible de réaliser l'essai dans les 72 h, l'échantillon peut
être congelé et maintenu à une température inférieure à −18 °C en vue d'effectuer l'essai dans les 2 mois
après le recueil, à condition de s'assurer que ses caractéristiques ne sont pas altérées par la congélation. Au
moment de l'essai, homogénéiser l'échantillon à analyser par agitation manuelle et, si nécessaire, mettre à
décanter pendant 2 h dans un récipient; prélever (à la pipette) la quantité requise de surnageant en
maintenant l'extrémité de la pipette au centre de la section de l'éprouvette et à mi-distance entre la surface
des substances formant le précipité et la surface du liquide.
Dans le cas où l'échantillon brut ou le surnageant de décantation est susceptible de perturber l'essai (matières
en suspension résiduelles, protozoaires, micro-organismes, etc.), filtrer ou centrifuger l'échantillon brut ou
décanté. Cependant, il convient d'éviter cette manipulation de l'échantillon sauf nécessité absolue car elle est
susceptible de modifier les caractéristiques physico-chimiques et éventuellement d'éliminer certaines matières
toxiques de l'échantillon.
L'échantillon obtenu par l'une ou l'autre de ces méthodes est l'échantillon soumis à essai.
Mesurer le pH (comme spécifié dans l'ISO 10523) et de la concentration en oxygène dissous (comme spécifié
dans l'ISO 5814) et enregistrer ces valeurs dans le rapport d'essai (Article 12).
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Si l'objectif visé consiste à évaluer la toxicité chronique sans tenir compte des effets du pH, il est également
possible d'effectuer l'essai après ajustement du pH à 7,6 ± 0,3 avec des solutions d'acide chlorhydrique ou
d'hydroxyde de sodium. Procéder s'il y a lieu comme indiqué ci-dessus pour la séparation des matières en
suspension formées à la suite de l'ajustement du pH. Mentionner tout ajustement du pH dans le rapport
d'essai (Article 12).
8.2 Préparation des solutions mères de substances à soumettre à essai
Préparer la solution mère de la substance à soumettre à essai par dissolution d'une quantité connue de
substance dans un volume défini de milieu d'essai (6.3). La préparation a lieu au moment de l'emploi.
Toutefois, si la solution mère de la substance est stable dans certaines conditions, elle peut être préparée à
l'avance et conservée dans lesdites conditions.
Pour les substances faiblement solubles dans le milieu d'essai, se reporter aux spécifications de
l'ISO 5667-16.
9 Mode opératoire
9.1 Choix des concentrations
Il convient que l'essai comprenne au moins cinq concentrations de l'échantillon à soumettre à essai, avec un
pas de raison géométrique inférieur ou égal à 3,2 entre chaque concentration.
Tenir compte des critères suivants pour choisir la gamme de concentrations à examiner: pour obtenir une
valeur de CE , il est souhaitable que cette valeur soit encadrée par au moins deux concentrations, l'une
x
induisant un effet supérieur à x % et l'autre un effet inférieur à x %.
Réaliser au moins 8 répliques pour chaque concentration. Ces 8 répliques constituent un lot d'essai (3.5).
Inclure dans chaque essai un lot témoin (3.1) sans l'échantillon à soumettre à essai. Un lot témoin est
également constitué d'au moins 8 répliques (au mieux, de 16).
Lorsqu'un produit chimique (solvant, émulsifiant, réactif d'extraction, etc.) est utilisé pour solubiliser ou
disperser les substances, la concentration de ce produit chimique doit être identique dans tous les récipients
et un second lot témoin contenant le produit chimique à la concentration utilisée doit être inclus. Dans ce cas,
lorsqu'un effet minimal mais cependant acceptable est constaté dans le solvant témoin, celui-ci est à utiliser
dans les calculs statistiques du point final. Cela correspond à la situation où l'effet dans le solvant témoin est
faible et où l'essai est tout de même valide.
Dans le cas d'échantillons d'eaux, d'effluents, et d'extraits aqueux, la plus forte concentration soumise à essai
ne peut pas être égale à une fraction volumique de 100 % de l'échantillon initial du fait que l'apport de
nourriture doit correspondre à un volume le plus faible possible (inférieur ou égal à 10 % du volume final de
l'échantillon et de ses dilutions).
9.2 Préparation des solutions d'essai et des solutions témoins
Préparer les solutions d'essai en mélangeant les volumes appropriés de l'échantillon soumis à essai
(8.1 ou 8.2) ou de sa dilution initiale, de milieu d'essai (6.3) et de nourriture (6.4).
Calculer la quantité de nourriture contenue dans chaque puits de la microplaque comme indiqué en 6.4. Le
volume total doit être de 1 ml par puits.
Préparer les solutions témoins en mélangeant le milieu d'essai (6.3) et la nourriture (6.4). Si l'on utilise un
produit chimique conformément à 9.1, préparer un solvant témoin pour le produit chimique.
Répartir les solutions d'essai et les solutions témoins à raison de 1 ml par puits, environ 1 h à 2 h avant la fin
de la période d'éclosion.
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NOTE 1 En utilisant deux microplaques de 4 × 6 puits, on peut disposer les plaques de façon à représenter 6 colonnes
de 8 puits constituant un lot de 8 répliques. Une colonne est utilisée pour le témoin et les 5 autres colonnes servent à
l'essai des 5 concentrations différentes.
NOTE 2 Il est également possible de réaliser les dilutions de l'échantillon soumis à essai directement dans les puits,
soit en cascade, soit à partir d'une solution mère ou de sa dilution. La nourriture est ensuite introduite dans les puits
conformément à 6.4. Le volume total est de 1 ml par puits. Dans ce cas, pour éviter une contamination entre les puits, il
est recommandé de commencer à déposer la nourriture (6.4) dans la colonne de puits témoins, puis de poursuivre l'ajout
de nourriture de la plus faible concentration à la plus forte. Toutefois, si l'on soupçonne la présence de composés volatils,
il est nécessaire de remplacer les microplaques ouvertes par des récipients uniques et fermés pour chaque réplique ou de
recouvrir tous les puits d'un film adhésif percé de manière appropriée.
9.3 Introduction des organismes
Placer les microplaques ou les récipients uniques et fermés contenant les solutions d'essai et les solutions
témoins dans une enceinte ou un local thermostaté (7.1) de façon à obtenir une température des solutions
d'essai et des solutions témoins de (25 ± 1) °C.
Sous une loupe binoculaire (7.5), prélever un Brachionus calyciflorus à l'aide d'une pipette de prélèvement
(7.4), puis le déposer sous la surface de la solution d'essai en réduisant le plus possible le volume de milieu
d'éclosion introduit avec le rotifère.
Pendant les différentes phases de l'essai, maintenir les Brachionus calyciflorus à (25 ± 1) °C pour les protéger
de toute variation de température susceptible d'induire ultérieurement l'apparition de mâles.
NOTE 1 Pour faciliter le prélèvement des rotifères, notamment si ceux-ci sont nombreux dans le récipient d'éclosion, il
est possible de les diluer dans le milieu d'essai (6.3) porté préalablement à la même température que le milieu d'éclosion.
NOTE 2 Si l'on utilise une mini-pipette capillaire de 1 ml, le volume qui sert à transvaser l'organisme est généralement
inférieur à 20 µl.
Placer un Brachionus calyciflorus par puits ou par récipient unique et fermé, en procédant par concentrations
croissantes et en changeant de pipette entre chaque série.
Commencer par la série 1 dans l'ordre suivant: témoin, concentration C , concentration C , concentration C ,
1 2 3
concentration C , concentration C . Changer de pipette et poursuivre de la même manière pour la série 2.
4 5
Changer de pipette et poursuivre ainsi jusqu'à la série 8. Voir Tableau 1.
Tableau 1 — Modèle d'enregistrement des données
N° de série Témoin Concentration
C C C C C
1 2 3 4 5
1
2
3
4
5
6
7
8
Vérifier qu'il n'y a qu'un seul rotifère dans chaque puits ou récipient unique fermé. Éventuellement, retirer ou
ajouter le ou les rotifères en trop ou manquant(s).
Recouvrir la microplaque ou le récipient unique fermé à l'aide d'un film, par exemple en polyéthylène et/ou
avec le couvercle de la microplaque.
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9.4 Incubation du système d'essai
Mettre la
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