ISO 18187:2016

Soil quality — Contact test for solid samples using the dehydrogenase activity of Arthrobacter globiformis

ISO 18187:2016 specifies a rapid method for assessing solid samples in an aerobic suspension, by determining the inhibition of dehydrogenase activity of Arthrobacter globiformis using the redox dye resazurin. It is applicable for assessing the effect of water-soluble and solid matter bounded non-volatile contaminants of natural samples, such as soils and waste materials. The test yields a result within 6 h and can therefore be used for screening potentially contaminated material.

Qualité du sol — Essai contact pour échantillons solides utilisant l'activité déshydrogénase de Arthrobacter globiformis

ISO 18187:2016 spécifie une méthode rapide d'évaluation d'échantillons solides en suspension aérobie, en déterminant l'inhibition de l'activité déshydrogénase de Arthrobacter globiformis à l'aide d'un indicateur redox coloré, la résazurine. Cette méthode est applicable à l'évaluation de l'effet de contaminants non volatils, liés aux matières solides ou solubles dans l'eau, présents dans des échantillons naturels tels que des sols et des déchets. L'essai délivre un résultat en 6 h et peut donc être utilisé pour le criblage de matériaux potentiellement contaminés.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 19-Apr-2016
• ICS: 13.080.30 - Biological properties of soils
• Technical Committee: ISO/TC 190/SC 4 - Biological characterization
• Drafting Committee: ISO/TC 190/SC 4/WG 4 - Effects on soil micro-organisms
• Current Stage: 9092 - International Standard to be revised
• Completion Date: 20-Oct-2021

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 18187
First edition
2016-05-01
Soil quality — Contact test for solid
samples using the dehydrogenase
activity of Arthrobacter globiformis
Qualité du sol — Essai contact pour échantillons solides
utilisant l’activité déshydrogénase de Arthrobacter globiformis
Reference number
ISO 18187:2016(E)
©
ISO 2016

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ISO 18187:2016(E)

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ISO 18187:2016(E)

Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 4
5 Reagents and material . 4
5.1 Test organisms . 4
5.2 Control substrates . 4
5.2.1 General. 4
5.2.2 Control for soils . 4
5.2.3 Control for waste material . 5
5.3 Test substrates . 5
5.4 Chemicals . 6
6 Apparatus . 8
7 Procedure. 9
7.1 Preparation of dilutions . 9
7.2 Reference substance and positive control preparation . 9
7.3 Contact test procedure . 9
7.3.1 General. 9
7.3.2 Aeration .10
7.3.3 Deactivation .10
7.3.4 Preparation of the inoculum .11
7.3.5 Incubation and fluorescence measurement .11
7.4 Interferences .11
8 Calculation and expression of results .12
8.1 Calculation .12
8.1.1 Relative fluorescence .12
8.1.2 Determining the percentage of inhibition .12
8.2 Expression of results .12
9 Validity of the test .13
10 Statistical analysis .13
11 Test report .14
Annex A (informative) Results on the ring test .15
Annex B (informative) Preparation of test organisms .21
Annex C (informative) Testing chemical substances .23
Bibliography .25
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ISO 18187:2016(E)

Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical
Barriers to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4, Biological
methods.
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ISO 18187:2016(E)

Introduction
This International Standard describes the miniaturized solid contact assay with Arthrobacter globiformis
that allows the preliminary assessment of solid material (i.e. soil and waste materials) within 6 h. The
principle of the assay relies on dehydrogenase activity inhibition of an added test organism, caused by
bioavailable toxic substances in soil and waste samples. This is an ecologically relevant assay as far as
[16][6]
it uses a ubiquitous soil bacteria species with high affinity to surfaces which dehydrogenases are
involved in different biological mechanisms withstanding bacteria integrity (e.g. respiratory chains).
Moreover, it has been noticed that this parameter (dehydrogenase activity inhibition) is quite sensitive
[19][10][14][15]
to different toxic substances.
Overall, this assay is non-labour-intensive, rapid, cost-effective and sensitive, providing results that
improve the physical and chemical assessment of natural samples while allowing a quick indication of
their biological effects.
The miniaturized solid contact assay is based on the solid contact assay established by Reference [7].
This International Standard is also based on Reference [23].
The results of an interlaboratory trial towards the evaluation of test variability to assess different
waste and soil samples, as well as chemicals, are presented in Annex A.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 18187:2016(E)
Soil quality — Contact test for solid samples using the
dehydrogenase activity of Arthrobacter globiformis
1 Scope
This International Standard specifies a rapid method for assessing solid samples in an aerobic
suspension, by determining the inhibition of dehydrogenase activity of Arthrobacter globiformis using
the redox dye resazurin.
It is applicable for assessing the effect of water-soluble and solid matter bounded non-volatile
contaminants of natural samples, such as soils and waste materials. The test yields a result within 6 h
and can therefore be used for screening potentially contaminated material.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 5667-15, Water quality — Sampling — Part 15: Guidance on the preservation and handling of sludge
and sediment samples
ISO 10381-6, Soil quality — Sampling — Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil
under aerobic conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the
laboratory
CEN/TR 15310-1, Characterization of waste — Sampling of waste materials — Part 1: Guidance on
selection and application of criteria for sampling under various conditions
EN 14735, Characterization of waste — Preparation of waste samples for ecotoxicity tests
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
contact time
exposure period of the bacteria to a suspension of solid matter
3.2
negative control
sample of a control substrate (3.6) with a mixture of known solutions [distilled water, medium B or
inoculum (3.12)].
Note 1 to entry: It is used to standardize the analysis.
3.3
positive control
sample of a control substrate (3.6) with a mixture of known solutions [distilled water, medium B or
inoculum (3.12)] and a reference substance
Note 1 to entry: It is used to check the sensitivity of the test organism.
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ISO 18187:2016(E)

3.4
blank A
blank, which sets the own fluorescence of the substrate after being deactivated
Note 1 to entry: Blank is not added with bacteria.
3.5
blank B
blank, which sets the natural fluorescence of the substrate without being deactivated
Note 1 to entry: Blank is not added with bacteria.
3.6
control substrate
reference or standard substrate used as a control and as medium (3.13) for preparing
dilution/concentration series with test substrates (3.7) or a reference substance
EXAMPLE Quartz sand or LUFA standard soil type 2.2.
3.7
test substrate
natural or artificial substrate that is naturally contaminated or spiked with a test chemical
Note 1 to entry: The test substrate is the test material (3.8) after being prepared for testing (e.g. sieved) and/or
diluted with a control substrate (3.6).
3.8
test material
original sample of soil or waste material without any changes (e.g. sieving)
3.9
dehydrogenase activity
activity of hydrogen-abstracting enzymes which are involved in many energy and biosynthesis
metabolic processes (e.g. the respiratory chain) and which require cell integrity to be produced
[6]
Note 1 to entry: These enzymes can reduce resazurin into resorufin in the extracellular environment.
Note 2 to entry: See Reference [21].
3.10
effect concentration for x % effect
ECx
concentration (mass fraction) of a test substance or sample that causes x % of an effect on a given
endpoint within a given exposure period when compared with a control
EXAMPLE An EC50 is a concentration estimated to cause an effect on a test end point in 50 % of an exposed
population over a defined exposure period.
Note 1 to entry: The ECx is expressed as a percentage of soil or waste tested per dry mass of soil mixture. When
chemicals are tested, the ECx is expressed as mass of the test substance per dry mass of soil, in milligrams per
kilogram.
3.11
freeze-dried bacteria
bacterial culture preserved through the water removing of a frozen cell suspension by sublimation
under reduced vacuum pressure
Note 1 to entry: The preserved cultures can be stored at (-20 ± 2) °C. The bacteria are active after being
reconstituted with sterilized distilled water [20 min to 30 min at (6 ± 2) °C] and ready to be used in the test, see
7.3.4 b).
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3.12
inoculum
suspension of bacteria used to inoculate a nutrient solution
3.13
medium
aqueous nutritive solution required for bacterial growth
3.14
optical density of bacterial inoculum
measurement of the attenuation of a light beam passing through a bacterial suspension at 600 nm (used
to determine the cell count indirectly)
Note 1 to entry: In a bacterial test, the absorbance is usually measured as FAU (formazine attenuation units) at
600 nm (see Reference [3]).
3.15
test start
moment when the substrates, reagents and the bacterial inoculum (3.12) are prepared immediately
before the incubation and reaction period
Note 1 to entry: Here is when preparing the test and control substrates (3.6) for incubation (i.e. Table 1, day 0).
3.16
reaction time
time it takes for the enzyme to react (from the addition of the resazurin solution until the end of the
reaction)
3.17
slope
quotient of the relative fluorescence (3.18) variation along the reaction time (3.16) between 15 min
and 45 min
-1
Note 1 to entry: The slope (expressed as min ) results from fitting a linear regression model to the fluorescence
readings over time.
3.18
relative fluorescence
fluorescence measured for each treatment (control and test) after subtracting the fluorescence of the
respective blank A (3.4)
3.19
stock culture
bacterial culture obtained from a pure strain culture acquired from a certified laboratory
Note 1 to entry: This stock culture provides an inoculum (3.12) for the pre-culture in the test procedure.
3.20
lowest ineffective dilution
LID-value
lowest value of the dilution factor (LID) for which the test does not give an ecotoxicological relevant
reduction
Note 1 to entry: The LID is expressed as the reciprocal value of dilution.
EXAMPLE An often used dilution series is 1/2/4/8/16 [= 100 %/50 %/25 %/12,5 %/6,25 % test substrate
(3.7) to control substrate (3.6)]. A LID 8 corresponds to a dilution of soil or waste of 1 : 8.
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4 Principle
The bacteria Arthrobacter globiformis is added to the solid material and incubated at (30 ± 1) °C for
2 h. After this contact time, the non-toxic redox dye resazurin is added. Due to the dehydrogenase
[6]
activity, resazurin is transformed into resorufin, in the extracellular environment. Resorufin can be
detected fluorometrically (excitation at 535 nm, emission at 590 nm) in the presence of solid matter.
The increase of resorufin is determined by measuring the fluorescence every 15 min for a period of
1 h. In order to determine the inhibition of the dehydrogenase activity, the rate of resorufin increase
in the sample is compared with the rate of resorufin increase in the control. In the presence of toxic
substances, an inhibition of dehydrogenase activity is expected. This is reflected by the reduction of
resorufin production and subsequent lowering of fluorescence emission.
5 Reagents and material
5.1 Test organisms
The test organism is Arthrobacter globiformis (Conn 1982) Conn and Dimmick 1947 (strain number
ATCC 8010), which is common in soils. Arthrobacter species belong to the Microccocaceae family. They
are mostly obligate aerobic organisms, although some species may exhibit anaerobic metabolism under
[9]
limiting oxygen conditions. Arthrobacter spp. are chemoheterotrophic, and present pleomorphic
characteristics, since they show a rod-to-coccus morphology change as they enter in the stationary
phase. Although Arthrobacter is gram-positive, it can stain gram-negative during the log-phase.
Variations in the cell wall thickness along the bacteria growth can lead to gram variability by differential
[22]
staining of the granules. However, this characteristic does not induce a differential sensitivity
between assays, as far as an inoculum in exponential growth phase is used during the reaction time.
Arthrobacter globiformis is classified in the risk group I — non-pathogenic organism.
The bacteria strain can be achieved from commercially available freeze-dried or liquid-dried reagents,
or from culture collections, e.g. Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, or
1)
ARS Culture collection NCAUR. The bacterial suspensions used for toxicity measurements shall be
freshly prepared from stock cultures or directly used from a ready-to-use freeze-dried batch. The stock
culturing and freeze drying process of the bacteria is described in Annex B.
5.2 Control substrates
5.2.1 General
The control substrates selected from the options presented below are to prepare both the negative
(addition of distilled water, see 5.2.2, 5.2.3) and positive (addition of the reference substance, see 7.2)
controls. The moistening of the control substrates (soil or waste material) shall be made one or two
days before the test start (see Table 1). Store the substrate(s) at (4 ± 2) °C until the test start.
5.2.2 Control for soils
There are three possibilities for the choice of the control soil (see also Reference [4]). The reference soil
a) is preferred, but if such a soil is not available, either a standard natural soil or a standard artificial
soil may be used. In any case, the water content of the control soil should be adjusted to 20 %.
a) If reference soils from uncontaminated areas near a contaminated site are available, they should
be treated and characterized like the soils to be tested. If a toxic contamination or unusual soil
properties cannot be ruled out, standard control soils b) or c) should be preferred.

1) Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH, Mascheroder Weg 10, D-38124
Braunschweig, Germany; or ARS (Agricultural Research Service) Culture collection (also known as NRRL) belonging
to the National Center for Agricultural Utilization Research (NCAUR), 1815 N, University Street, Peoria, Illinois
61604, USA are examples of firms that sell this bacteria. This information is given for the convenience of users of
this document and does not constitute an endorsement by ISO of these firms.
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ISO 18187:2016(E)

b) Standard natural soil with the following characteristics: C ≤ (1,7 to 2,6) %; sand (particle size
org
0,063 mm to 2 mm) content of 50 % to 75 %; <20 % of particles less than 0,02 mm; pH 5 to 7,5.
2)
EXAMPLE LUFA standard soil type 2.2.
c) Standard artificial soil or quartz sand (with 50 % to 75 % of sand with particle size between
0,063 mm and 2 mm).
[17]
The substrate called artificial soil has the following composition:
Percentage expressed on
dry mass basis
—  Sphagnum peat finely ground and with no visible plant remains
(particle size ≤1 mm) 5 %
—  Kaolinite clay containing not less than 30 % kaolinite 20 %
—  Industrial quartz sand (dominant fine sand with 50 % to 75 % of par-
ticle size 0,063 mm to 2 mm) 74 %
—  Calcium carbonate 1 %
Artificial soil prepared with modified peat and quartz sand particle size should be analysed more in
detail. The presence of low density particles (e.g. peat) in this artificial substrate that are likely to float
can influence the fluorescence readings.
5.2.3 Control for waste material
Quartz sand, see 5.2.2 c). The quartz sand should have a water content of 20 %.
5.3 Test substrates
The samples (soil or waste material) should be tested as soon as possible after sampling. Collect samples
as specified
— for soil in ISO 10381-6, or
— for waste materials in ISO 5667-15, EN 14735 and CEN/TR 15310-1.
Store them in the dark at (4 ± 2) °C for not more than two weeks. For long-term storage, the samples
may be frozen at (-20 ± 2) °C.
Soil and waste samples shall be passed through a sieve of 2 mm square mesh. Waste raw material (e.g.
construction waste material) should be grounded before testing (refer to EN 14735). The screening of
metals and organic contaminants in the samples is strongly advised as it provides helpful information
for data interpretation.
For interpretation of test results, the following characteristics should be determined for each sample:
a) pH in accordance with ISO 10390 for soil samples, EN 15933 for biowaste samples and ISO 10390
for other solid wastes;
b) texture (sand, loam, silt) in accordance with ISO 11277;
c) water content in accordance with ISO 11465 for soil samples and EN 15934 for biowaste samples;
d) water holding capacity according to ISO 11268-2;
e) cation exchange capacity in accordance with ISO 11260;

2) LUFA Standard soil type 2.2 is the trade name of a product supplied by LUFA Speyer. This information is given
for the convenience of users of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of the
product named. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
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ISO 18187:2016(E)

f) organic carbon in accordance with ISO 10694 for soil samples and EN 15936 for biowaste samples.
Only samples with a pH between 5 and 9 will be appropriately assessed by this contact test (see 7.4).
The water content shall be adjusted to 20 % (soil, waste material; see 5.2.2 and 5.2.3). This adjustment
shall be calculated according to the original water content of samples, which should be determined
before the preparation of the test. The moistening of samples shall be done one or two days before the
test start (see Table 1). Store the samples at (4 ± 2) °C until the test start.
When using natural samples, dilutions may also be prepared (see 7.1).
In case of testing a chemical substance in soil, a different procedure should be followed (see Annex C).
Waste materials consisting of sewage sludge with high organic matter (OM) or total organic carbon
(TOC) content should be added with more water (e.g. water content adjusted to 33 %). More tests are
being developed as to define the appropriate percentage of water content according to the level of OM
or TOC in this type of samples.
5.4 Chemicals
Unless otherwise specified, only analytical-grade reagents shall be used.
5.4.1 Water, sterilized and non-sterilized, deionized, distilled or of equivalent purity
-1
(conductivity < 10 µS·cm ).
5.4.2 Dimethyl sulfoxide solution (DMSO), C H OS, volume fraction of 4 % in distilled water.
2 6
Sterilize the solution by filtration through a polyamide membrane filter having a pore size of 0,2 μm
and using a syringe.
-1
5.4.3 Sodium hydroxide solution, NaOH of, e.g. 1 mol·l .
NOTE For the adjustment of the media pH, it can be necessary to use bases of lower or higher concentration.
-1
5.4.4 Hydrochloric acid, HCl of, e.g. 1 mol·l .
NOTE For the adjustment of the media pH, it can be necessary to use acids of lower or higher concentration.
5.4.5 Medium A, for A. globiformis stock culture (pH 7,2 to 7,4).
Dissolve
— 10 g casein peptone,
— 5 g yeast extract,
— 5 g D(+)-glucose, and
— 5 g NaCl
in water (5.4.1), make up to 1 000 ml with water and autoclave for 20 min at (121 ± 3) °C. If stored
sterilized (never opened) at (4 ± 2) °C in the dark, the solution is stable up to 12 months.
5.4.6 Medium B, for preparing the lyophilizates and the test solution.
Dilute 333,3 ml of medium A (5.4.5) in 666,6 ml of sterilized water. Or, dissolve
— 3,33 g casein peptone,
— 1,67 g yeast extract,
— 1,67 g of D(+)-glucose, and
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— 1,67 g NaCl
in water (5.4.1) and make the volume up to 1 000 ml with water. Autoclave the medium for 20 min at
(121 ± 3) °C. If stored sterilized (never opened) at (4 ± 2) °C in the dark, the solution is stable up to
12 months.
5.4.7 Agar (casein-peptone soymeal-peptone) slant, for a dense cell suspension of A. globiformis.
Dissolve 40 g of tryptic soy agar in water (5.4.1) and make up to 1 000 ml with water. After being
dissolved, distribute 7 ml of this medium into culture tubes (6.15). The tubes should be filled until
allowing the agar to flow just 50 mm below the neck, when the neck is laid over a horizontal 10 ml glass
pipette. Seal them with caps and then autoclave for 20 min at (121 ± 3) °C. After cooling, the tubes are
ready for use.
5.4.8 Protective medium, for freeze-drying bacteria.
Dissolve
— 20 g skim milk, and
— 5 g myo-inositol
in water (5.4.1), make up to 100 ml with water and autoclave for 10 min at (121 ± 3) °C. After autoclaving
and cooling down to (80 ± 2) °C, place the medium immediately in an ice bath to avoid caramelization. If
stored sterilized (never opened) at (4 ± 2) °C in the dark, the solution is stable up to 12 months.
5.4.9 Phosphate buffer.
Dissolve
— 8,2 g KH PO ·H O,
2 4 2
— 13,24 g K HPO ·H O,
2 4 2
— 2 g sodium acetate, C H NaO , and
2 3 2
— 2 g D(+)-glucose
in water (5.4.1) and make up to 1 000 ml with water. Adjust the pH value of the buffer to 7,0 ± 0,2 with
diluted hydrochloric acid (5.4.4) or sodium hydroxide solution (5.4.3). Autoclave the medium for 20 min
at (121 ± 3) °C. If stored at (4 ± 2) °C in the dark, the solution is stable
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 18187
Première édition
2016-05-01
Qualité du sol — Essai contact pour
échantillons solides utilisant l’activité
déshydrogénase de Arthrobacter
globiformis
Soil quality — Contact test for solid samples using the
dehydrogenase activity of Arthrobacter globiformis
Numéro de référence
ISO 18187:2016(F)
©
ISO 2016

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ISO 18187:2016(F)

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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 4
5 Réactifs et matériau . 4
5.1 Micro-organismes d’essai . 4
5.2 Substrats témoins . 5
5.2.1 Généralités . 5
5.2.2 Témoin pour les sols . 5
5.2.3 Témoin pour les déchets . 5
5.3 Substrats d’essai . 6
5.4 Produits chimiques . 6
6 Appareillage . 9
7 Mode opératoire.10
7.1 Préparation des dilutions .10
7.2 Préparation de la substance de référence et du témoin positif .10
7.3 Mode opératoire de l’essai contact .10
7.3.1 Généralités .10
7.3.2 Aération .11
7.3.3 Désactivation .11
7.3.4 Préparation de l’inoculum .12
7.3.5 Incubation et mesurage de la fluorescence .12
7.4 Interférences .12
8 Calcul et expression des résultats .13
8.1 Calcul .13
8.1.1 Fluorescence relative .13
8.1.2 Détermination du pourcentage d’inhibition .13
8.2 Expression des résultats .13
9 Validité de l’essai .14
10 Analyse statistique .14
11 Rapport d’essai .15
Annexe A (informative) Résultats de l’essai interlaboratoires .17
Annexe B (informative) Préparation des micro-organismes d’essai .23
Annexe C (informative) Essais avec les substances chimiques .25
Bibliographie .27
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ISO 18187:2016(F)

Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à
l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes
de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Méthodes biologiques.
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ISO 18187:2016(F)

Introduction
La présente Norme internationale décrit l’essai contact miniaturisé sur solide avec Arthrobacter
globiformis qui permet d’effectuer une évaluation préliminaire en 6 h des matériaux solides (c’est-à-dire
des sols et des déchets). Le principe de l’évaluation repose sur l’inhibition de l’activité déshydrogénase
d’un micro-organisme d’essai ajouté, provoquée par des substances toxiques biodisponibles dans des
échantillons de sol et de déchets. Il s’agit d’un essai pertinent d’un point de vue écologique dans la
mesure où il utilise une espèce de bactérie omniprésente dans les sols présentant une forte affinité
[16][6]
vis-à-vis des surfaces et dont les déshydrogénases sont impliquées dans divers mécanismes
biologiques supportant l’intégrité bactérienne (des chaînes respiratoires, par exemple). De plus, il a
été noté que ce paramètre (inhibition de l’activité déshydrogénase) est assez sensible aux différentes
[19][10][14][15]
substances toxiques.
Globalement, cet essai demande peu de main-d’œuvre, il a un bon rapport coût-efficacité et est sensible;
il fournit des résultats qui améliorent l’évaluation physique et chimique des échantillons naturels tout
en permettant une indication rapide de leurs effets biologiques.
L’essai de contact miniaturisé sur solide est basé sur l’essai contact sur solide décrit par la Référence [7].
La présente Norme internationale se base également sur la Référence [23].
Les résultats d’un essai interlaboratoires visant à estimer la variabilité de l’essai pour évaluer différents
échantillons de déchets et de sols, ainsi que des produits chimiques, sont présentés à l’Annexe A.
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NORME INTERNATIONALE ISO 18187:2016(F)
Qualité du sol — Essai contact pour échantillons solides
utilisant l’activité déshydrogénase de Arthrobacter
globiformis
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode rapide d’évaluation d’échantillons solides en
suspension aérobie, en déterminant l’inhibition de l’activité déshydrogénase de Arthrobacter globiformis
à l’aide d’un indicateur redox coloré, la résazurine.
Cette méthode est applicable à l’évaluation de l’effet de contaminants non volatils, liés aux matières
solides ou solubles dans l’eau, présents dans des échantillons naturels tels que des sols et des déchets.
L’essai délivre un résultat en 6 h et peut donc être utilisé pour le criblage de matériaux potentiellement
contaminés.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 5667-15, Qualité de l’eau — Échantillonnage — Partie 15: Lignes directrices pour la conservation et le
traitement des échantillons de boues et de sédiments
ISO 10381-6, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 6: Lignes directrices pour la collecte, la
manipulation et la conservation, dans des conditions aérobies, de sols destinés à l’évaluation en laboratoire
des processus, de la biomasse et de la diversité microbiens
CEN/TR 15310-1, Caractérisation des déchets — Prélèvement des déchets — Partie 1: Guide relatif au
choix et à l’application des critères d’échantillonnage dans diverses conditions
EN 14735, Caractérisation des déchets — Préparation des échantillons de déchets en vue d’essais
écotoxicologiques
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
temps de contact
durée d’exposition des bactéries à une suspension de matériau solide
3.2
témoin négatif
échantillon d’un substrat témoin (3.6) avec un mélange de solutions connues [eau distillée, milieu B ou
inoculum (3.12)]·
Note 1 à l’article: Il est utilisé dans le but de normaliser l’analyse.
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ISO 18187:2016(F)

3.3
témoin positif
échantillon d’un substrat témoin (3.6) contenant un mélange de solutions connues [eau distillée, milieu B
ou inoculum (3.12)] et une substance de référence
Note 1 à l’article: Il est utilisé pour vérifier la sensibilité de l’organisme d’essai.
3.4
blanc A
blanc qui fixe la fluorescence propre au substrat après sa désactivation
Note 1 à l’article: Aucune bactérie n’est ajoutée au blanc.
3.5
blanc B
blanc qui fixe la fluorescence naturelle du substrat sans désactivation
Note 1 à l’article: Aucune bactérie n’est ajoutée au blanc.
3.6
substrat témoin
substrat de référence ou standard, utilisé comme témoin et comme milieu (3.13) de préparation des
séries de dilutions/concentrations des substrats d’essai (3.7) ou d’une substance de référence
EXEMPLE Sable de quartz ou sol standard de type LUFA 2.2.
3.7
substrat d’essai
substrat naturel ou artificiel qui est naturellement contaminé ou qui est dopé avec un produit chimique
soumis à essai
Note 1 à l’article: Le substrat d’essai est le matériau d’essai (3.8) qui a été préparé pour être testé (par exemple,
qui a été tamisé) et/ou qui a été dilué avec un substrat témoin (3.6).
3.8
matériau d’essai
échantillon initial de sol ou de déchets n’ayant subi aucune modification (par exemple, tamisage)
3.9
activité déshydrogénase
activité d’enzymes captant l’hydrogène, impliquées dans divers processus métaboliques énergétiques
et de biosynthèse (la chaîne respiratoire, par exemple) et nécessitant l’intégrité cellulaire pour être
produites
[6]
Note 1 à l’article: Ces enzymes peuvent réduire la résazurine en résorufine dans l’environnement extracellulaire.
Note 2 à l’article: Voir Référence [21].
3.10
concentration d’effet pour un effet de x %
CEx
concentration (fraction massique) d’une substance ou d’un échantillon soumis à essai qui produit un
effet de x % pour un paramètre donné, pendant une durée d’exposition définie, par rapport à un témoin
EXEMPLE Une CE50 est une concentration qui produit un effet, pour le paramètre de l’essai, sur 50 % d’une
population exposée sur une durée d’exposition définie.
Note 1 à l’article: La concentration CEx est exprimée sous la forme d’un pourcentage du sol ou des déchets soumis
à essai (matière sèche) dans le mélange de sol (masse de matière sèche). Pour les essais sur les produits chimiques,
la concentration CEx est exprimée en masse de substance d’essai dans le sol (équivalent sec), en milligrammes
par kilogramme.
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ISO 18187:2016(F)

3.11
bactéries lyophilisées
culture bactérienne conservée en éliminant l’eau d’une suspension de cellules congelées, par sublimation
sous pression négative réduite
Note 1 à l’article: Les cultures lyophilisées peuvent être conservées à (-20 ± 2) °C. Les bactéries sont actives après
reconstitution avec de l’eau distillée stérilisée [20 min à 30 min à (6 ± 2) °C] et prêtes à être utilisées pour l’essai
[voir 7.3.4 b)].
3.12
inoculum
suspension bactérienne utilisée pour ensemencer une solution nutritive
3.13
milieu
solution nutritive aqueuse nécessaire à la croissance des bactéries
3.14
densité optique de l’inoculum bactérien
mesure de l’atténuation d’un faisceau de lumière traversant une suspension bactérienne à 600 nm
(utilisée pour déterminer le nombre de cellules de façon indirecte)
Note 1 à l’article: Dans un essai bactérien, l’absorbance est généralement mesurée en FAU (unités d’atténuation
formazine) à 600 nm (voir Référence [3]).
3.15
début de l’essai
moment où les substrats, les réactifs et l’inoculum (3.12) bactérien sont préparés, précédant
immédiatement la période d’incubation et de réaction
Note 1 à l’article: Dans le cas présent, il s’agit du jour où le substrat d’essai et le substrat témoin (3.6) sont préparés
pour l’incubation (c’est-à-dire Tableau 1, jour 0).
3.16
temps de réaction
temps que prend l’enzyme pour réagir (à partir de l’ajout de la solution de résazurine jusqu’à la fin de la
réaction)
3.17
pente
rapport de la variation de fluorescence relative (3.18) pendant le temps de réaction (3.16), entre 15 min
et 45 min
-1
Note 1 à l’article: La pente (exprimée en min ) est obtenue par application d’un modèle de régression linéaire aux
valeurs de fluorescence en fonction du temps.
3.18
fluorescence relative
fluorescence mesurée pour chaque traitement (témoin et essai) à laquelle est soustraite la fluorescence
du blanc A (3.4) correspondant
3.19
culture mère
culture bactérienne obtenue à partir d’une culture pure de la souche provenant d’un laboratoire certifié
Note 1 à l’article: Cette culture mère fournit un inoculum (3.12) pour la pré-culture du mode opératoire d’essai.
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ISO 18187:2016(F)

3.20
dilution minimale sans effet
valeur de DMSE
plus faible niveau de dilution (DMSE) pour lequel l’essai n’aboutit pas à une réduction pertinente d’un
point de vue écotoxicologique
Note 1 à l’article: La DMSE est exprimée en tant que valeur inverse de la dilution.
EXEMPLE La série de dilutions 1/2/4/8/16 [= 100 %/50 %/25 %/12,5 %/6,25 % de substrat d’essai (3.7) par
rapport au substrat témoin (3.6)] est couramment employée. Une DMSE de 8 correspond à une dilution de sol ou
de déchets de 1:8.
4 Principe
La bactérie Arthrobacter globiformis est ajoutée au matériau solide et incubée à (30 ± 1) °C pendant
2 h. À l’issue de ce temps de contact, on ajoute la résazurine, un indicateur coloré d’oxydoréduction
non toxique. L’activité déshydrogénase entraîne une transformation de la résazurine en résorufine
[6]
dans l’environnement extracellulaire. La résorufine peut être détectée par fluorométrie (excitation
à 535 nm, émission à 590 nm) en présence de matériau solide. L’augmentation de résorufine est
déterminée en mesurant la fluorescence toutes les 15 min pendant 1 h. Afin de déterminer l’inhibition de
l’activité déshydrogénase, le taux d’augmentation de résorufine dans l’échantillon est comparé au taux
d’augmentation de résorufine dans le témoin. Une inhibition de l’activité déshydrogénase est attendue
en présence de substances toxiques. Cette inhibition se traduit par la réduction de la production de
résorufine et par la diminution de l’émission de fluorescence qui en découle.
5 Réactifs et matériau
5.1 Micro-organismes d’essai
L’organisme utilisé pour cet essai est Arthrobacter globiformis (Conn 1982) Conn et Dimmick 1947
(souche ATCC 8010), qui est courant dans les sols. Les espèces de Arthrobacter appartiennent à la
famille des Microccocaceae. Il s’agit principalement de micro-organismes aérobies stricts, même
si certaines espèces sont susceptibles de présenter un mécanisme anaérobie dans des conditions
[9]
limitantes en oxygène. Arthrobacter spp. sont chimiohétérotrophes et présentent des caractéristiques
pléomorphes dans la mesure où ils présentent une modification de leur morphologie, de bâtonnets à
coccus, lorsqu’ils entrent en phase stationnaire. Bien que Arthrobacter soit gram-positif, il peut être
gram-négatif pendant la phase de croissance exponentielle. Des fluctuations de l’épaisseur de paroi
cellulaire durant la croissance bactérienne peuvent aboutir à une variabilité de la coloration de Gram, se
[21]
traduisant par une coloration différentielle des granules. Cependant, cette caractéristique n’induit
aucune différence en termes de sensibilité entre les essais, dans la mesure où on utilise un inoculum en
phase de croissance exponentielle pendant le temps de réaction. Arthrobacter globiformis appartient au
groupe de risque I — micro-organisme non pathogène.
La souche bactérienne peut être obtenue à partir de réactifs lyophilisés ou déshydratés du commerce ou
de collections de cultures disponibles, par exemple auprès du Deutsche Sammlung für Mikroorganismen
1)
und Zellkulturen GmbH, ou auprès de l’ARS Culture Collection NCAUR. Les suspensions bactériennes
utilisées pour les mesures de toxicité doivent être fraîchement préparées à partir des cultures mères ou
doivent être directement utilisées lorsqu’elles proviennent d’un lot lyophilisé prêt à l’emploi. Le procédé
de préparation des cultures mères et de lyophilisation des bactéries est présenté à l’Annexe B.

1) Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH, Mascheroder Weg 10, D-38124
Brunswick, Allemagne ou ARS (Agricultural Research Service) Culture collection (également connu sous le nom de
NRRL) appartenant au National Center for Agricultural Utilization Research (NCAUR), 1815 N, University Street,
Peoria, Illinois 61604, USA (États-Unis d’Amérique), sont des exemples de sociétés commercialisant cette bactérie.
Cette information n’est donnée aux utilisateurs du présent document que par souci de commodité et ne constitue en
rien une recommandation de ces sociétés par l’ISO.
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5.2 Substrats témoins
5.2.1 Généralités
Les substrats témoins sélectionnés en fonction des options présentées ci-dessous sont destinés à être
employés dans la préparation des témoins négatifs (ajout d’eau distillée, voir 5.2.2, 5.2.3) et des témoins
positifs (ajout de la substance de référence, voir 7.2). L’humidification des substrats témoins (sols ou
déchets) doit être effectuée un ou deux jours avant le début de l’essai (voir Tableau 1). Conserver le ou
les substrats à (4 ± 2) °C jusqu’au début de l’essai.
5.2.2 Témoin pour les sols
Il existe trois choix possibles de sol témoin (voir également Référence [4]). Le sol de référence a) est
préféré, mais si un tel sol n’est pas disponible, il est possible d’utiliser un sol standard naturel ou
artificiel. Dans tous les cas, il convient d’ajuster la teneur en eau du sol témoin à 20 %.
a) Si des sols de référence provenant de zones non contaminées proches d’un site contaminé sont
disponibles, il convient de les traiter et de les caractériser comme les sols devant être soumis à
essai. Si l’hypothèse d’une contamination toxique ou de propriétés inhabituelles du sol ne peut être
exclue, il convient de préférer les sols témoins standard b) ou c).
b) Sol standard naturel présentant les caractéristiques suivantes: C ≤ (1,7 à 2,6) %; teneur en sable
org
(granulométrie de 0,063 mm à 2 mm) de 50 % à 75 %; <20 % de particules de moins de 0,02 mm;
pH compris entre 5 et 7,5.
2)
EXEMPLE Sol standard LUFA de type 2.2.
c) Sol standard artificiel ou sable quartzeux (50 % à 75 % des particules de sable présentant une
granulométrie comprise entre 0,063 mm et 2 mm).
[17]
Le substrat appelé sol artificiel a la composition suivante:
Pourcentage exprimé par rapport à
la masse sèche
—  Tourbe de sphaigne finement broyée et sans résidus de plante visible
(granulométrie ≤ 1 mm) 5 %
—  Argile kaolinique contenant moins de 30 % de kaolinite 20 %
—  Sable de quartz industriel (majoritairement constitué de sable fin,
50 % à 75 % des grains présentant une granulométrie comprise entre
0,063 mm et 2 mm) 74 %
—  Carbonate de calcium 1 %
Il convient d’analyser plus en détail un sol artificiel préparé à partir de tourbe et de sable de quartz de
granulométrie modifiée. La présence dans ce substrat artificiel de particules de faible masse volumique
(tourbe, par exemple) susceptibles de flotter peut influencer les mesures de fluorescence.
5.2.3 Témoin pour les déchets
Sable de quartz, voir 5.2.2, c). Il convient que le sable de quartz présente une teneur en eau de 20 %.

2) Le sol standard LUFA de type 2.2 est l’appellation commerciale d’un produit fourni par LUFA Speyer. Cette
information n’est donnée aux utilisateurs de la présente Norme internationale que par souci de commodité et ne
constitue en rien une recommandation de ce produit par l’ISO. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est
démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
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ISO 18187:2016(F)

5.3 Substrats d’essai
Il convient de tester les échantillons (sols ou déchets) le plus rapidement possible après prélèvement.
Recueillir les échantillons comme spécifié ci-dessous:
— dans l’ISO 10381-6 pour les sols; ou
— dans l’ISO 5667-15, l’EN 14735 et le CEN/TR 15310-1 pour les déchets.
Conserver les échantillons à l’abri de la lumière à (4 ± 2) °C pendant au maximum deux semaines. Pour
une conservation de longue durée, les échantillons peuvent être congelés à (-20 ± 2) °C.
Les échantillons de sol et de déchets doivent être tamisés à 2 mm (tamis à mailles carrées). Il convient
de broyer les déchets bruts (déchets de construction, par exemple) avant de les soumettre à essai (se
référer à l’EN 14735). Il est vivement conseillé de procéder à une recherche de métaux et de contaminants
organiques dans les échantillons afin d’obtenir des informations utiles à l’interprétation des données.
Pour l’interprétation des résultats d’essai, il convient de déterminer les caractéristiques suivantes pour
chaque échantillon:
a) le pH conformément à l’ISO 10390 pour les échantillons de sol, à l’EN 15933 pour les échantillons de
biodéchets et à l’ISO 10390 pour les autres déchets solides;
b) la texture (sable, limon, silt) conformément à l’ISO 11277;
c) la teneur en eau conformément à l’ISO 11465 pour les échantillons de sol et à l’EN 15934 pour les
échantillons de biodéchets;
d) la capacité de rétention d’eau conformément à l’ISO 11268-2;
e) la capacité d’échange cationique conformément à l’ISO 11260;
f) le carbone organique conformément à l’ISO 10694 pour les échantillons de sol et à l’EN 15936 pour
les échantillons de biodéchets.
Seuls les échantillons dont le pH est compris entre 5 et 9 seront évalués de manière adéquate par cet
essai contact (voir 7.4). La teneur en eau doit être ajustée à 20 % (pour les sols et les déchets, voir 5.2.2
et 5.2.3). Cet ajustement doit être calculé en fonction de la teneur en eau d’origine des échantillons,
qu’il convient de déterminer avant la préparation de l’essai. L’humidification des échantillons doit
être effectuée un ou deux jours avant le début de l’essai (voir Tableau 1). Conserver les échantillons à
(4 ± 2) °C jusqu’au début de l’essai.
Il est également possible de préparer des dilutions (voir 7.1) pour des échantillons naturels.
Pour les essais de substances chimiques dans les sols, il convient de suivre un mode opératoire différent
(voir Annexe C).
Il convient d’ajouter plus d’eau aux déchets constitués de boues d’épuration à teneur élevée en matière
organique (MO) ou à teneur élevée en carbone organique total (COT) (teneur en eau ajustée à 33 % par
exemple). Des essais supplémentaires visant à définir le pourcentage approprié de teneur en eau en
fonction du niveau de MO ou de COT dans ce type d’échantillons sont en cours de développement.
5.4 Produits chimiq
...

PROJET
NORME ISO/FDIS
FINAL
INTERNATIONALE 18187
ISO/TC 190/SC 4
Qualité du sol — Essai contact
Secrétariat: AFNOR
pour échantillons solides utilisant
Début de vote:
2016-01-11 l’activité déshydrogénase de
Arthrobacter globiformis
Vote clos le:
2016-03-11
Soil quality — Contact test for solid samples using the dehydrogenase
activity of Arthrobacter globiformis
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET SONT
INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS OBSER-
VATIONS, NOTIFICATION DES DROITS DE PRO-
PRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT ÉVENTUELLEMENT
CONNAISSANCE ET À FOURNIR UNE DOCUMEN-
TATION EXPLICATIVE.
OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR
ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES FINS
INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET COM-
Numéro de référence
MERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE
ISO/FDIS 18187:2016(F)
DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE
CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR POSSI-
BILITÉ DE DEVENIR DES NORMES POUVANT
SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA RÉGLEMENTA-
©
TION NATIONALE. ISO 2016

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ISO/FDIS 18187:2016(F)

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ISO/FDIS 18187:2016(F)

Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 4
5 Réactifs et matériau . 4
5.1 Micro-organismes d’essai . 4
5.2 Substrats témoins . 5
5.2.1 Généralités . 5
5.2.2 Témoin pour les sols . 5
5.2.3 Témoin pour les déchets . 5
5.3 Substrats d’essai . 6
5.4 Produits chimiques . 6
6 Appareillage . 9
7 Mode opératoire.10
7.1 Préparation des dilutions .10
7.2 Préparation de la substance de référence et du témoin positif .10
7.3 Mode opératoire de l’essai contact .10
7.3.1 Généralités .10
7.3.2 Aération .11
7.3.3 Désactivation .11
7.3.4 Préparation de l’inoculum .11
7.3.5 Incubation et mesurage de la fluorescence .11
7.4 Interférences .12
8 Calcul et expression des résultats .13
8.1 Calcul .13
8.1.1 Fluorescence relative .13
8.1.2 Détermination du pourcentage d’inhibition .13
8.2 Expression des résultats .13
9 Validité de l’essai .14
10 Analyse statistique .14
11 Rapport d’essai .15
Annexe A (informative) Résultats de l’essai circulaire .17
Annexe B (informative) Préparation des micro-organismes d’essai .23
Annexe C (informative) Test pour des substances chimiques .25
Bibliographie .27
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ISO/FDIS 18187:2016(F)

Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer
un engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à
l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes
de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Méthodes biologiques.
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ISO/FDIS 18187:2016(F)

Introduction
La présente Norme internationale décrit l’essai contact miniaturisé sur solide avec Arthrobacter
globiformis qui permet d’effectuer une évaluation préliminaire en 6 h des matériaux solides (c’est-à-dire
des sols et des déchets). Le principe de l’évaluation repose sur l’inhibition de l’activité déshydrogénase
d’un micro-organisme d’essai ajouté, provoquée par des substances toxiques biodisponibles dans des
échantillons de sol et de déchets. Il s’agit d’un essai pertinent d’un point de vue écologique dans la
mesure où il utilise une espèce de bactérie omniprésente dans les sols présentant une forte affinité
[15][6]
vis-à-vis des surfaces et dont les déshydrogénases sont impliquées dans divers mécanismes
biologiques supportant l’intégrité bactérienne (des chaînes respiratoires, par exemple). De plus, il a
été noté que ce paramètre (inhibition de l’activité déshydrogénase) est assez sensible aux différentes
[18][10][13][14]
substances toxiques.
Globalement, cet essai demande peu de main-d’œuvre, il a un bon rapport coût-efficacité et est sensible;
il fournit des résultats qui améliorent l’évaluation physique et chimique des échantillons naturels tout
en permettant une indication rapide de leurs effets biologiques.
L’essai de contact miniaturisé sur solide est basé sur l’essai contact sur solide décrit par la Référence [7].
La présente Norme internationale se base également sur la Référence [22].
Les résultats d’un essai interlaboratoire visant à estimer la variabilité de l’essai pour évaluer différents
échantillons de déchets et de sols, ainsi que des produits chimiques, sont présentés à l’Annexe A.
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PROJET FINAL DE NORME INTERNATIONALE ISO/FDIS 18187:2016(F)
Qualité du sol — Essai contact pour échantillons solides
utilisant l’activité déshydrogénase de Arthrobacter
globiformis
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode rapide d’évaluation d’échantillons solides en
suspension aérobie, en déterminant l’inhibition de l’activité déshydrogénase de Arthrobacter globiformis
à l’aide d’un indicateur redox coloré, la résazurine.
Cette méthode est applicable à l’évaluation de l’effet de contaminants non volatils, liés aux matières
solides ou solubles dans l’eau, présents dans des échantillons naturels tels que des sols et des
déchets. L’essai délivre un résultat en 6 h et peut donc être utilisé pour le criblage de matériaux
potentiellement contaminés.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 5667-15, Qualité de l’eau — Échantillonnage — Partie 15: Lignes directrices pour la conservation et le
traitement des échantillons de boues et de sédiments
ISO 10381-6, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 6: Lignes directrices pour la collecte, la
manipulation et la conservation, dans des conditions aérobies, de sols destinés à l’évaluation en laboratoire
des processus, de la biomasse et de la diversité microbiens
CEN/TR 15310-1, Caractérisation des déchets — Prélèvement des déchets — Partie 1: Guide relatif au
choix et à l’application des critères d’échantillonnage dans diverses conditions
EN 14735, Caractérisation des déchets — Préparation des échantillons de déchets en vue d’essais
écotoxicologiques
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
temps de contact
durée d’exposition des bactéries à une suspension de matériau solide
3.2
témoin négatif
échantillon d’un substrat témoin (3.6) avec un mélange de solutions connues (eau distillée, milieu B ou
inoculum (3.12))
Note 1 à l’article: Il est utilisé dans le but de normaliser l’analyse.
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ISO/FDIS 18187:2016(F)

3.3
témoin positif
échantillon d’un substrat témoin (3.6) contenant un mélange de solutions connues (eau distillée, milieu B
ou inoculum (3.12)) et une substance de référence
Note 1 à l’article: Il est utilisé pour vérifier la sensibilité de l’organisme d’essai.
3.4
blanc A
blanc qui fixe la fluorescence propre au substrat après sa désactivation
Note 1 à l’article: Aucune bactérie n’est ajoutée au blanc.
3.5
blanc B
blanc qui fixe la fluorescence naturelle du substrat sans désactivation
Note 1 à l’article: Aucune bactérie n’est ajoutée au blanc.
3.6
substrat témoin
substrat de référence ou standard, utilisé comme témoin et comme milieu (3.13) de préparation des
séries de dilutions/concentrations des substrats d’essai (3.7) ou d’une substance de référence
EXEMPLE Sable de quartz ou sol standard de type LUFA 2.2.
3.7
substrat d’essai
substrat naturel ou artificiel qui est naturellement contaminé ou qui est dopé avec un produit chimique
soumis à essai
Note 1 à l’article: Le substrat d’essai est le matériau d’essai (3.8) qui a été préparé pour être testé (par exemple,
qui a été tamisé) et/ou qui a été dilué avec un substrat témoin (3.6).
3.8
matériau d’essai
échantillon initial de sol ou de déchet n’ayant subi aucune modification (par exemple, tamisage)
3.9
activité déshydrogénase
activité d’enzymes captant l’hydrogène, impliquées dans divers processus métaboliques énergétiques et
de biosynthèse (la chaîne respiratoire, par exemple) et nécessitant l’intégrité cellulaire pour être produites
[6]
Note 1 à l’article: Ces enzymes peuvent réduire la résazurine en résorufine dans l’environnement extracellulaire.
Note 2 à l’article: Voir Référence [20].
3.10
concentration d’effet pour un effet de x %
CEx
concentration (fraction massique) d’une substance ou d’un échantillon soumis à essai qui produit un
effet de x % pour un paramètre donné, pendant une durée d’exposition définie, par rapport à un témoin
EXEMPLE Une CE50 est une concentration qui produit un effet, pour le paramètre de l’essai, sur 50 % d’une
population exposée sur une durée d’exposition définie.
Note 1 à l’article: La concentration CEx est exprimée sous la forme d’un pourcentage du sol soumis à essai
(matière sèche) dans le mélange de sol (matière sèche). Pour les essais sur les substances, la concentration CEx
est exprimée en masse de substance d’essai dans le sol (équivalent sec), en milligrammes par kilogramme.
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3.11
bactéries lyophilisées
culture bactérienne conservée en éliminant l’eau d’une suspension de cellules congelées, par sublimation
sous pression négative réduite
Note 1 à l’article: Les cultures lyophilisées peuvent être conservées à (-20 ± 2) °C. Les bactéries sont actives après
reconstitution avec de l’eau distillée stérilisée (20 min à 30 min à 6 °C) et prêtes à être utilisées pour l’essai
(voir 7.3.4, b)).
3.12
inoculum
suspension bactérienne utilisée pour ensemencer une solution nutritive
3.13
milieu
solution nutritive aqueuse nécessaire à la croissance des bactéries
3.14
densité optique de l’inoculum bactérien
mesure de l’atténuation d’un faisceau de lumière traversant une suspension bactérienne à 600 nm
(utilisée pour déterminer le nombre de cellules de façon indirecte)
Note 1 à l’article: Dans un essai bactérien, l’absorbance est généralement mesurée en FAU (unités d’atténuation
formazine) à 600 nm (voir Référence [3]).
3.15
début de l’essai
moment où les substrats, les réactifs et l’inoculum (3.12) bactérien sont préparés, précédant
immédiatement la période d’incubation et de réaction
Note 1 à l’article: Dans le cas présent, il s’agit du jour où le substrat d’essai et le substrat témoin (3.6) sont préparés
pour l’incubation (c’est-à-dire Tableau 1, jour 0).
3.16
temps de réaction
temps que prend l’enzyme pour réagir (à partir de l’ajout de la solution de résazurine jusqu’à la fin
de la réaction)
3.17
pente
rapport de la variation de fluorescence relative (3.18) pendant le temps de réaction (3.16), entre
15 min et 45 min
-1
Note 1 à l’article: La pente (exprimée en min ) est obtenue par application d’un modèle de régression linéaire aux
valeurs de fluorescence en fonction du temps.
3.18
fluorescence relative
fluorescence mesurée pour chaque traitement (témoin et essai) à laquelle est soustraite la fluorescence
du blanc A (3.4) correspondant
3.19
culture mère
culture bactérienne obtenue à partir d’une culture pure de la souche provenant d’un laboratoire certifié
Note 1 à l’article: Cette culture mère fournit un inoculum (3.12) pour la pré-culture du mode opératoire d’essai.
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ISO/FDIS 18187:2016(F)

3.20
dilution minimale sans effet
valeur de DMSE
plus faible niveau de dilution (DMSE) pour lequel l’essai n’aboutit pas à une réduction pertinente d’un
point de vue écotoxicologique
Note 1 à l’article: La DMSE est exprimée en tant que valeur inverse de la dilution.
EXEMPLE La série de dilutions 1/2/4/8/16 [= 100 %/50 %/25 %/12,5 %/6,25 % de substrat d’essai (3.7) par
rapport au substrat témoin (3.6)] est couramment employée. Une DMSE de 8 correspond à une dilution d’extrait
de sol de 1:8.
4 Principe
La bactérie Arthrobacter globiformis est ajoutée au matériau solide et incubée à (30 ± 1) °C pendant
2 h. À l’issue de ce temps de contact, on ajoute la résazurine, un indicateur coloré d’oxydoréduction
non toxique. L’activité déshydrogénase entraîne une transformation de la résazurine en résorufine
[6]
dans l’environnement extracellulaire. La résorufine peut être détectée par fluorométrie (excitation
à 535 nm, émission à 590 nm) en présence de matériau solide. L’augmentation de résorufine est
déterminée en mesurant la fluorescence toutes les 15 min pendant 1 h. Afin de déterminer l’inhibition de
l’activité déshydrogénase, le taux d’augmentation de résorufine dans l’échantillon est comparé au taux
d’augmentation de résorufine dans le témoin. Une inhibition de l’activité déshydrogénase est attendue
en présence de substances toxiques. Cette inhibition se traduit par la réduction de la production de
résorufine et par la diminution de l’émission de fluorescence qui en découle.
5 Réactifs et matériau
5.1 Micro-organismes d’essai
L’organisme utilisé pour cet essai est Arthrobacter globiformis (Conn 1982) Conn et Dimmick 1947
(souche ATCC 8010), qui est courant dans les sols. Les espèces de Arthrobacter appartiennent à la
famille des Microccocaceae. Il s’agit principalement de micro-organismes aérobies stricts, même
si certaines espèces sont susceptibles de présenter un mécanisme anaérobie dans des conditions
[9]
limitantes en oxygène. Arthrobacter spp. sont chimiohétérotrophes et présentent des caractéristiques
pléomorphes dans la mesure où ils présentent une modification de leur morphologie, de bâtonnets à
coccus, lorsqu’ils entrent en phase stationnaire. Bien que Arthrobacter soit gram-positif, il peut être
gram-négatif pendant la phase de croissance exponentielle. Des fluctuations de l’épaisseur de paroi
cellulaire durant la croissance bactérienne peuvent aboutir à une variabilité de la coloration de Gram, se
[21]
traduisant par une coloration différentielle des granules. Cependant, cette caractéristique n’induit
aucune différence en termes de sensibilité entre les essais, dans la mesure où on utilise un inoculum en
phase de croissance exponentielle pendant le temps de réaction. Arthrobacter globiformis appartient au
groupe de risque I — micro-organisme non pathogène.
La souche bactérienne peut être obtenue à partir de réactifs lyophilisés ou déshydratés du commerce ou
de collections de cultures disponibles, par exemple auprès du Deutsche Sammlung für Mikroorganismen
1)
und Zellkulturen GmbH, ou auprès de l’ARS Culture Collection NCAUR. Les suspensions bactériennes
utilisées pour les mesures de toxicité doivent être fraîchement préparées à partir des cultures mères ou
doivent être directement utilisées lorsqu’elles proviennent d’un lot lyophilisé prêt à l’emploi. Le procédé
de préparation des cultures mères et de lyophilisation des bactéries est présenté à l’Annexe B.

1) Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH, Mascheroder Weg 10, D-38124
Brunswick, Allemagne ou ARS (Agricultural Research Service) Culture collection (également connu sous le nom de
NRRL) appartenant au National Center for Agricultural Utilization Research (NCAUR), 1815 N, University Street,
Peoria, Illinois 61604, USA (États-Unis d’Amérique), sont des exemples de sociétés commercialisant cette bactérie.
Cette information n’est donnée aux utilisateurs du présent document que par souci de commodité et ne constitue en
rien une recommandation de ces sociétés par l’ISO.
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5.2 Substrats témoins
5.2.1 Généralités
Les substrats témoins sélectionnés en fonction des options présentées ci-dessous sont destinés à être
employés dans la préparation des témoins négatifs (ajout d’eau distillée, voir 5.2.2, 5.2.3) et des témoins
positifs (ajout de la substance de référence, voir 7.2). L’humidification des substrats témoins (sols ou
déchets) doit être effectuée un ou deux jours avant le début de l’essai (voir Tableau 1). Conserver le ou
les substrats à (4 ± 2) °C jusqu’au début de l’essai.
5.2.2 Témoin pour les sols
Il existe trois choix possibles de sol témoin (voir également Référence [4]). Le sol de référence a) est
préféré, mais si un tel sol n’est pas disponible, il est possible d’utiliser un sol standard naturel ou
artificiel. Dans tous les cas, il convient d’ajuster la teneur en eau du sol témoin à 20 %.
a) Si des sols de référence provenant de zones non contaminées proches d’un site contaminé sont
disponibles, il convient de les traiter et de les caractériser comme les sols devant être soumis à
essai. Si l’hypothèse d’une contamination toxique ou de propriétés inhabituelles du sol ne peut être
exclue, il convient de préférer les sols témoins standard b) ou c).
b) Sol standard naturel présentant les caractéristiques suivantes: C ≤ (1,7 à 2,6) %; teneur en sable
org
(granulométrie de 0,063 mm à 2 mm) de 50 % à 75 %; <20 % de particules de moins de 0,02 mm;
pH compris entre 5 et 7,5.
2)
EXEMPLE Sol standard LUFA de type 2.2.
c) Sol standard artificiel ou sable quartzeux (50 % à 75 % des particules de sable présentant une
granulométrie comprise entre 0,063 mm et 2 mm).
[16]
Le substrat appelé sol artificiel a la composition suivante:
Pourcentage exprimé par rapport
à la masse sèche
—  Tourbe de sphaigne finement broyée et sans résidus de plante
visible (granulométrie ≤ 1 mm) 5 %
—  Argile kaolinique contenant moins de 30 % de kaolinite 20 %
—  Sable de quartz industriel (majoritairement constitué de sable
fin,
50 % à 75 % des grains présentant une granulométrie comprise
entre 0,063 mm et 2 mm) 74 %
—  Carbonate de calcium 1 %
Il convient d’analyser plus en détail un sol artificiel préparé à partir de tourbe et de sable de quartz de
granulométrie modifiée. La présence dans ce substrat artificiel de particules de faible masse volumique
(tourbe, par exemple) susceptibles de flotter peut influencer les mesures de fluorescence.
5.2.3 Témoin pour les déchets
Sable de quartz, voir 5.2.2, c). Il convient que le sable de quartz présente une teneur en eau de 20 %.

2) Le sol standard LUFA de type 2.2 est l’appellation commerciale d’un produit fourni par LUFA Speyer. Cette
information n’est donnée aux utilisateurs de la présente Norme internationale que par souci de commodité et ne
constitue en rien une recommandation de ce produit par l’ISO. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est
démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
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5.3 Substrats d’essai
Il convient de tester les échantillons (sols ou déchets) le plus rapidement possible après prélèvement.
Recueillir les échantillons comme spécifié ci-dessous:
— dans l’ISO 10381-6 pour les sols; ou
— dans l’ISO 5667-15, l’EN 14735 et le CEN/TR 15310-1 pour les déchets.
Conserver les échantillons à l’abri de la lumière à (4 ± 2) °C pendant au maximum deux semaines. Pour
une conservation de longue durée, les échantillons peuvent être congelés à (-20 ± 2) °C.
Les échantillons de sol et de déchets doivent être tamisés à 2 mm (tamis à mailles carrées). Il convient
de broyer les déchets bruts (déchets de construction, par exemple) avant de les soumettre à essai (se
référer à l’EN 14735). Il est vivement conseillé de procéder à une recherche de métaux et de contaminants
organiques dans les échantillons afin d’obtenir des informations utiles à l’interprétation des données.
Pour l’interprétation des résultats d’essai, il convient de déterminer les caractéristiques suivantes pour
chaque échantillon:
a) le pH conformément à l’ISO 10390 pour les échantillons de sol et à l’EN 15933 pour les échantillons
de biodéchets;
b) la texture (sable, limon, silt) conformément à l’ISO 11277;
c) la teneur en eau conformément à l’ISO 11465 pour les échantillons de sol et à l’EN 15934 pour les
échantillons de biodéchets;
d) la capacité de rétention d’eau conformément à l’ISO 11268-2;
e) la capacité d’échange cationique conformément à l’ISO 11260;
f) le carbone organique conformément à l’ISO 10694 pour les échantillons de sol et à l’EN 15936 pour
les échantillons de biodéchets.
Seuls les échantillons dont le pH est compris entre 5 et 9 seront évalués de manière adéquate par cet
essai contact (voir 7.4). La teneur en eau doit être ajustée à 20 % (pour les sols et les déchets, voir 5.2.2
et 5.2.3). Cet ajustement doit être calculé en fonction de la teneur en eau d’origine des échantillons,
qu’il convient de déterminer avant la préparation de l’essai. L’humidification des échantillons doit
être effectuée un ou deux jours avant le début de l’essai (voir Tableau 1). Conserver les échantillons à
(4 ± 2) °C jus
...