Soil quality — Sampling of soil invertebrates — Part 5: Sampling and extraction of soil macro-invertebrates

ISO 23611-5:2011 specifies a method for sampling, extracting and preserving macro-invertebrates from soils, including the litter zone. The proposed method is a prerequisite for using these animals as bio-indicators (e.g. to assess the quality of a soil as a habitat for organisms). The main premise of this method is rapid assessment (completing the sampling of a plot in one or two days with only basic equipment and a small number of field assistants), in order to be able to address all the taxonomic groups of soil macro-invertebrates at the same time and in the same place. The Tropical Soil Biology and Fertility (TSBF) method has evolved and some modifications have been introduced in order to use it in temperate regions. The sampling and extraction methods in ISO 23611-5:2011 are applicable to almost all types of soils, with the exception of soils in extreme climatic conditions (hard, frozen or flooded soils) and matrices other than soil, e.g. tree trunks, plants or lichens. Sampling design is specified in ISO 23611-6.

Qualité du sol — Prélèvement des invertébrés du sol — Partie 5: Prélèvement et extraction des macro-invertébrés du sol

L'ISO 23611-5:2011 spécifie une méthode pour le prélèvement, l'extraction et la conservation des macro-invertébrés du sol, y compris la zone de litière. La méthode proposée est un prérequis à l'utilisation de ces animaux en tant que bio-indicateurs (par exemple pour évaluer la qualité d'un sol en tant qu'habitat pour des organismes). Les principes majeurs de cette méthode consistent à avoir une évaluation rapide (réaliser l'échantillonnage d'une zone en un ou deux jours avec un équipement de base et avec un nombre réduit d'assistants de terrain), pour être capable de traiter tous les groupes taxinomiques de macro‑invertébrés du sol en même temps et au même endroit. La méthode TSBF (biologie et fertilité des sols tropicaux) a évolué et quelques modifications ont été introduites afin de l'utiliser dans des régions tempérées. Les méthodes de prélèvement et d'extraction de l'ISO 23611-5:2011 sont applicables à la quasi‑totalité des sols. Les sols présents sous des conditions climatiques extrêmes (sols durs, gelés ou inondés) et les matrices autres que le sol, par exemple des troncs d'arbres, des plantes ou des lichens, peuvent constituer des exceptions. Le plan d'échantillonnage est spécifié dans l'ISO 23611-6.

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22-Nov-2011
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ISO 23611-5:2011 - Soil quality -- Sampling of soil invertebrates
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ISO 23611-5:2011 - Qualité du sol -- Prélevement des invertébrés du sol
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INTERNATIONAL  ISO
STANDARD 23611-5
First edition
2011-12-01
Soil quality — Sampling of soil
invertebrates —
Part 5:
Sampling and extraction of soil macro-
invertebrates
Qualité du sol — Prélèvement des invertébrés du sol — Partie 5:
Prélèvement et extraction des macro-invertébrés du sol
Reference number
ISO 23611-5:2011(E)
 ISO 2011
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ISO 23611-5:2011(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
©  ISO 2011

All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,

electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or ISO’s

member body in the country of the requester.
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Fax + 41 22 749 09 47
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Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2011 – All rights reserved
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ISO 23611-5:2011(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies

(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO

technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been

established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and

non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International

Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.

International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.

The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards

adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an

International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent

rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.

ISO 23611-5 was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4, Biological

methods.

ISO 23611 consists of the following parts, under the general title Soil quality — Sampling of soil invertebrates:

—  Part 1: Hand-sorting and formalin extraction of earthworms
—  Part 2: Sampling and extraction of micro-arthropods (Collembola and Acarina)
—  Part 3: Sampling and soil extraction of enchytraeids
—  Part 4: Sampling, extraction and identification of soil-inhabiting nematodes
—  Part 5: Sampling and extraction of soil macro-invertebrates

—  Part 6: Guidance for the design of sampling programmes with soil invertebrates

© ISO 2011 – All rights reserved  iii
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ISO 23611-5:2011(E)
Introduction

This part of ISO 23611  was prepared in response to a need to standardize sampling and extraction methods for

soil macro-invertebrates in several European (temperate) and tropical countries. These methods are needed

for the following purposes:

—  biological classification of soils, including soil quality assessment (e.g. References [21], [32] and [41]);

—  terrestrial bio-indication and long-term monitoring (e.g. References [71], [79], [80] and [81]).

Data collected using standardized methods can be evaluated more accurately as it allows more reliable

comparison between sites (e.g. polluted vs non-polluted sites, changes in land-use practices).

Soils of the world host an abundance of highly diverse macro-invertebrate communities. Their biology and

ecology have been widely studied. Soil invertebrates are irreplaceable actors of soil formation and conservation

in natural ecosystems. Their relevance to the soil system comes from their abundance and diversity, and also

from their role in key biological processes. They are sensitive indicators of soil quality and recognized agents

of its fertility (e.g. References [63] and [56]). Among the wide diversity of species, adaptive strategies and size

ranges represented, one specific group, also called “soil ecosystem engineers”, includes large invertebrates

that actually determine the activities of other smaller organisms through the mechanical activities they produce

in soil (e.g. References [24] and [49]).

Soil macro-invertebrates span a wide range of ecological functions in soil: decomposition of organic matter,

through their own activity and by stimulating the soil’s microbiological activity (e.g. References [8], [10] and

[40]), predation that plays an important part in food webs (e.g. References [16], [55], [61], [64] and [68]), soil

aggregation by the production of organo-mineral structures (e.g. nests, galleries, casts) that can last for days,

months or years, and soil bioturbation (e.g. Reference [32]), etc. These characteristics, coupled with in-depth

taxonomic knowledge, has enabled their use as study organisms in several research programmes dealing

with the impacts of forest practices (e.g. References [18], [40], [50], [62], [65] and [75]) or crop management

practices (e.g. References [15], [25], [31], [33], [34], [37], [42], [60] and [66]). These features make them suitable

organisms for use as bio-indicators of changes in soil quality, especially with respect to land-use practices and

pollution (e.g. References [26], [39], [48], [52], [53], [59], [65] and [79]).

The method proposed in this part of ISO 23611 covers the sampling of all soil macro-invertebrates. However,

the sampling of earthworms is already covered in ISO 23611-1. This method is described in ISO 23611-1:2006,

Annex C, as an alternative sampling method for earthworms.
iv © ISO 2011 – All rights reserved
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 23611-5:2011(E)
Soil quality — Sampling of soil invertebrates —
Part 5:
Sampling and extraction of soil macro-invertebrates
1 Scope

This part of ISO 23611 specifies a method for sampling, extracting and preserving macro-invertebrates from

soils, including the litter zone. The proposed method is a prerequisite for using these animals as bio-indicators

(e.g. to assess the quality of a soil as a habitat for organisms). The main premise of this method is rapid

assessment (completing the sampling of a plot in one or two days with only basic equipment and a small

number of field assistants) in order to be able to address all the taxonomic groups of soil macro-invertebrates

at the same time and in the same place. The Tropical Soil Biology and Fertility (TSBF) method has evolved and

some modifications have been introduced in order to use it in temperate regions.

The sampling and extraction methods in this part of ISO 23611 are applicable to almost all types of soil, with

the exception of soils in extreme climatic conditions (hard, frozen or flooded soils) and matrices other than soil,

e.g. tree trunks, plants or lichens.
A sampling design is specified in ISO 23611-6.

NOTE 1  The method specified in this part of ISO 23611 is based on guidelines developed under the Tropical Soil

[7]
Biology and Fertility Program (TSBF method) .

NOTE 2  Basic information on the ecology of macro-invertebrates and their use can be found in the references listed in

the Bibliography.
2 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
2.1
macro-invertebrates
soil organism whose longest dimension is greater than 10 mm
NOTE  See Annex A for further details.

EXAMPLE  These include especially the following groups: Oligochaeta, Gastropoda, Chilopoda, Diplopoda, Isopoda,

Arachnida, plus various insects: Coleoptera, Orthoptera, Hymenoptera, Hemiptera, Dermaptera, Lepidoptera (larvae) and

Diptera (larvae).
2.2
blotted mass

mass of individuals after preservation in formalin or ethanol (when the substance used for preservation has

been absorbed by the tissues)
3 Principle

Soil macro-invertebrates are collected in the field using a metallic frame to delimit the soil surface of the

sampling point. Macro-invertebrates present in litter and soil are picked up separately. In temperate regions, a

reagent is used to extract macro-invertebrates from soil. The sampling is completed by hand-sorting. Animals

are preserved and transported to the laboratory for further identifications (e.g. References [11], [12], [13], [14],

[17], [19], [20], [22], [23], [27], [28], [29], [30], [35] ,[36], ,[38], [45], [46], [47], [54], [57], [70], [72], [73], [76], [77],

[78] and [84]). Abundance values are usually recalculated relative to area (1 m).

© ISO 2011 – All rights reserved  1
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ISO 23611-5:2011(E)
4 Reagents
4.1 Ethanol, (70 % volume fraction).
4.2 Formalin [formaldehyde solution], 4 % (volume fraction).

Both 70 % ethanol and 4 % formalin should be available for the preservation of specimens (4 % formalin is

more suitable for taxa with soft body parts, which can be transferred to ethanol after about 4 d fixation).

4.3 Formalin, 0,2 % (volume fraction), prepared by diluting 25 ml of formalin (39 %) in 5 l of water, for soil

macro-invertebrate extraction.
5 Apparatus
Use standard laboratory equipment and the following.
5.1 Petri dishes.
5.2 Stereo-microscope.
5.3 Plastic vials.
5.4 Entomological forceps.
5.5 Pencil, notebook, water-resistant marker, labels.
5.6 Tape measures.
5.7 Knife (cut glass).
5.8 Spade.
5.9 Plastic-weave produce sacks, for spreading on the ground.
5.10 Precision balance.

5.11 Large flat plastic trays (500 mm × 400 mm × 100 mm), for sorting the soil and litter.

5.12 Trowel.
5.13 Small plastic trays.
5.14 Fine forceps (or entomological forceps), pipette, fine paint brushes.
5.15 Sample vials, in various sizes with secure alcohol-tight caps.
5.16 Indian-ink pen (waterproof).
5.17 Stiff card for labels, ranging compass.
5.18 Large strong plastic bags (sealable).
2 © ISO 2011 – All rights reserved
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ISO 23611-5:2011(E)
5.19 Table and plastic chairs, for sorting.
5.20 Cover, for protection from heavy rain.
5.21 Polyvinyl gloves, to protect hands from formalin.
5.22 Metallic frame, preferably 250 mm × 250 mm.

Sample frame (250 mm × 250 mm × 50 mm) made of stainless steel and with sharpened edges to delimit the

sampling point where animals are sampled from the litter layer and soil.
5.23 Watering can.
5.24 Pair of scissors, to cut vegetation inside the frame.
5.25 Field balances.
6 Field procedure
6.1 General

Sampling should take place when accessible biodiversity is thought to be largest. In temperate regions, it

corresponds to spring or autumn, and in the tropics, it should take place towards the end of the rainy season.

When sampling soil invertebrates, it is strongly recommended that the site be physico-chemically characterized.

In particular, pH, particle size distribution, C/N ratio, organic carbon content and water-holding capacity should

be measured using ISO 10390, ISO 10694, ISO 11274, ISO 11277, ISO 11461, ISO 11465.

6.2 Collecting macro-invertebrates from the litter zone

At each sampling point (= monolith) (previously defined according to sampling design rules), a litter sample is

collected using a metallic frame (5.22). The metallic frame is pressed into the litter by hand. The litter inside the

frame is removed and checked manually in the field using a large tray (5.11). Litter invertebrates are preserved

in 4 % formalin (4.2).
6.3 Collecting macro-invertebrates from soil
6.3.1 General

In temperate countries, the extraction of soil macro-invertebrates is carried out in two steps (see 6.3.2.1 and

6.3.2.2), while in tropical countries only the second step shall be performed (see 6.3.3).

6.3.2 Temperate regions
6.3.2.1 Formalin extraction

The soil surface delimited by the metallic frame (5.22) is sprayed with 0,2 % formalin (4.3) using a watering can

(5.23). Two applications of 1,5 l of formalin are performed at intervals of about 10 min. Soil invertebrates coming

up to the surface are collected and preserved in vials (5.3) containing formalin (4.2).

6.3.2.2 Hand-sorting of “passive” macro-invertebrates

At the end of the formalin extraction, the metallic frame (5.22) is removed and the upper 150 mm of soil is

excavated within the frame area (250 mm × 250 mm). The excavated soil is placed in a plastic bag (5.18) that

can be closed with a cover to prevent animals from escaping from the soil sample.

© ISO 2011 – All rights reserved  3
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ISO 23611-5:2011(E)

Appropriate sub-samples of soil are taken from the container and spread on a large tray (5.11). Macro-invertebrates

are collected and preserved in vials (5.3) with formalin (4.2). When hand-sorting is finished, the excavated soil

is replaced to avoid creating holes on the sampling site.
6.3.3 Tropical regions

In tropical countries, soil macro-invertebrates are sampled using a 250 mm × 250 mm × 300 mm deep soil

monolith. The monolith is isolated by cutting with a spade (5.8) a few centimetres outside the quadrate (metallic

frame) and then digging a 20 mm wide by 300 mm deep trench around it. This facilitates cutting of the sample

into horizontal strata and collecting animals escaping from the block.

The delimited block is divided into three layers, 0 mm to 100 mm, 100 mm to 200 mm and 200 mm to 300 mm,

and the soil and litter material is hand-sorted in trays (5.11). Since formalin is not applied in tropical regions, the

sampling depth shall be doubled in order to be sure to collect endogenic species of earthworms.

For social insects, it is recommended that special measures be considered that take account of their high

abundance and marked patchiness; a nest can contain millions of individuals, of which none are sampled

by a short transect, and the contribution of the species concerned to a macrofaunal assemblage can thus

be completely missed. On the other hand, a highly populated nest sampled directly by a monolith can lead

to a large overestimation of the overall numerical or biomass density. In general, the TSBF transect should

be placed so as to avoid direct contact with termite and ant nests. For discussions, see References [39] and

[40]. The protocol for a 100 m × 2 m transect designed to assess termite biodiversity (and feeding group

representation) is given in Reference [52]. In suitable circumstances, this protocol can also be deployed in

parallel with the TSBF transect.

NOTE  Besides the general characterization of the site, it is useful to determine the actual moisture of the soil to be

sampled.
7 Laboratory procedure
7.1 Treatment of collected samples

In the laboratory, samples are cleaned and animals are placed in new vials (5.15) with ethanol (70 % volume

fraction) (4.1). Organisms with soft body parts are kept in formalin for at least 4 d, or forever if possible.

For taxonomic identification, specimens are placed on petri dishes (5.1) and observed under the stereo-

microscope (5.2). A practical way to identify macro-invertebrates is to group them first into orders. Each order

is then identified into families and each family into species using taxonomy keys (examples of taxonomy keys

are given in the Bibliography (see Rerences [11], [12], [13], [14], [17], [19], [20], [23], [27], [28], [29], [30], [35],

[36], [38], [45], [46], [47], [57], [72], [73], [77], [78] and [84]).

Ideally, taxonomic determination should be based on the species level. If identification of species levels fails

due to time constraints, taxonomic expertise or missing taxonomic keys, e.g. mainly in tropical regions, sorting

to genus (and some higher taxonomic units) represents a good compromise between the morphospecies and

ordinal level approaches, especially as this allows most specimens to be assigned to a functional group.

WARNING — Appropriate precautions (i.e. gloves, mask) shall be taken when dealing with formalin

to avoid danger from inhalation or skin exposure. According to the “Material Safety Data Sheet” for

formaldehyde 37 % solution published by producing companies, the compound is a skin sensitizer

and is considered to be carcinogenic (humans: limited evidence; animals: sufficient evidence). It is

legally notified in industrialized countries for scientific use.
7.2 Preservation of specimens

From any mixed soil sample of macrofauna, the following steps should be followed in order to obtain standardized

preserved specimens.

a)  If the animal has no soft body parts, the organisms should be preserved in 70 % ethanol (commercial

ethanol should be diluted).
4 © ISO 2011 – All rights reserved
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ISO 23611-5:2011(E)

b)  If the animal has soft body parts, the organism should be fixed in 4 % formalin and should, if possible, be

preserved in the same solution. Alternatively, 80 % ethanol could be used (if the organism has been fixed

during at least 4 d with 4 % formalin).

c)  In all cases, samples should be stored separately in different vials, according to the smallest unit of

analysis (i.e. a monolith if the data is compared at that level).

d)  Every vial should be labelled without using code numbers and should at least be written using permanent

ink, like Indian or Chinese ink, and using sturdy paper like goatskin parchment. Every label should contain

the following information:
—  country;
—  region;
—  locality;
—  collector’s name;
—  date of collection.
e)  For storing specimens:

—  use vials (or glass tubes) that are not degraded by the ethanol or formalin, with screw caps;

—  monitor levels of ethanol and formalin in order to keep them constant;
—  store vials away from direct sunlight;
—  change the preserving solution of each vial once every five years.
7.3 Biomass determination

Determination of biomass is performed using the preserved material. The animal’s surface should be gently

dried with filter paper, then weighed using a precision balance (0,001 g).

It is virtually impossible to keep invertebrates alive after their capture in order to measure fresh masses. In most

cases, invertebrates are conserved in 70 % (volume fraction) ethanol or 4 % (volume fraction) formalin. The

latter is recommended for earthworms that shall at least be fixed in formalin before being kept in 70 % ethanol.

Preservation always involves a decrease in mass, as body water is extracted by osmotic forces. The amount

lost can vary between 15 % and 40 %, depending on the water content of the animal and its physiological state.

Since most studies only aim to compare different sites and/or situations, mass loss is not likely to distort the

result. If accurate fresh mass data are necessary, it is easy to keep an aliquot of each group and compare the

mass, alive and fixed, a few days after fixation.
8 Assessment of results

The following measurement end points can be used for the bioclassification of a soil, including bio-indication

or biomonitoring (e.g. anthropogenic stress-like chemicals or land-use changes):
—  abundance (number of individuals per area);
—  biomass;
—  number of species or other taxonomically or ecologically defined groups;
—  diversity indices (alpha, beta and gamma diversity).

Firstly, the number of individuals (total number by species or group) is counted and expressed as individuals

per sample. Secondly, the total abundance of individuals is multiplied by a factor (16) to obtain the number of

individuals per square metre.
© ISO 2
...

NORME  ISO
INTERNATIONALE 23611-5
Première édition
2011-12-01
Qualité du sol — Prélèvement des
invertébrés du sol —
Partie 5:
Prélèvement et extraction des macro-
invertébrés du sol
Soil quality — Sampling of soil invertebrates — Part 5: Sampling and
extraction of soil macro-invertebrates
Numéro de référence
ISO 23611-5:2011(F)
 ISO 2011
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ISO 23611-5:2011(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
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Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous

quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord écrit

de l’ISO à l’adresse ci-après ou du comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.

ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
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Publié en Suisse
ii © ISO 2011 – Tous droits réservés
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ISO 23611-5:2011(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de

normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux

comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité

technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,

en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission

électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.

Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,

Partie 2.

La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes

internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur

publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités membres

votants.

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de droits

de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir

identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.

L’ISO 23611-5 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4, Méthodes

biologiques.

L’ISO 23611 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité du sol — Prélèvement

des invertébrés du sol:
—  Partie 1: Tri manuel et extraction au formol des vers de terre

—  Partie 2: Prélèvement et extraction des micro-arthropodes (Collembola et Acarina)

—  Partie 3: Prélèvement et extraction des enchytréides
—  Partie 4: Prélèvement, extraction et identification des nématodes du sol
—  Partie 5: Prélèvement et extraction des macro-invertébrés du sol

—  Partie 6: Lignes directrices pour la conception de programmes d’échantillonnage des invertébrés du sol

© ISO 2011 – Tous droits réservés  iii
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ISO 23611-5:2011(F)
Introduction

La présente partie de l’ISO 23611 a été élaborée en raison de la nécessité de normaliser les méthodes

de prélèvement et d’extraction des macro-invertébrés du sol dans plusieurs pays (tempérés) européens et

tropicaux. Ces méthodes sont nécessaires pour les applications suivantes:

—  la classification biologique des sols, y compris l’évaluation de la qualité des sols (par exemple

Références [21], [32] et [41]);

—  la bio-indication terrestre et la surveillance à long terme (par exemple Références [71], [79], [80] et [81]).

Les données obtenues à l’aide de méthodes normalisées permettent des évaluations plus précises et donc

des comparaisons plus fiables entre différents sites (par exemple sites pollués face à des sites non pollués,

modifications des pratiques d’utilisation du sol).

Les sols du monde entier abritent des communautés de macro-invertébrés abondantes et très diversifiées,

dont la biologie et l’écologie ont été largement étudiées. Les invertébrés du sol sont en effet des acteurs

irremplaçables de la formation et de la conservation des sols dans les écosystèmes naturels. Leur importance

pour le sol est due à leur grande abondance et à leur grande diversité, mais aussi au rôle qu’ils jouent dans les

principaux processus biologiques. Ils constituent des indicateurs sensibles de la qualité des sols et sont des

agents reconnus de leur fertilité (par exemple Références [63] et [56]). Parmi la grande variété d’espèces, de

stratégies adaptatives et d’échelles de taille, un groupe spécifique, dont les membres sont également appelés

«ingénieurs de l’écosystème du sol», inclut de grands invertébrés qui déterminent véritablement les activités

d’autres organismes plus petits du fait des activités mécaniques qu’ils réalisent dans le sol (par exemple

Références [24] et [49]).

Les macro-invertébrés du sol couvrent une large gamme de fonctions écologiques dans le sol: la décomposition

de la matière organique, par leur activité propre et par la stimulation de l’activité microbiologique du sol (par

exemple Références [8], [10] et [40]), la prédation qui joue un rôle important dans les réseaux trophiques (par

exemple Références [16], [55], [61], [64] et [68]), l’agrégation du sol, par la production de structures organo-

minérales (par exemple nids, galeries, turricules) qui peuvent persister pendant des jours, des mois ou des

années et la bioturbation du sol (par exemple Référence [32]), etc. Ces caractéristiques, ajoutées à la bonne

connaissance de leur taxinomie, ont permis leur utilisation en tant qu’organismes d’étude au sein de plusieurs

programmes de recherche traitant des impacts de l’exploitation forestière (par exemple Références [18], [40],

[50], [62], [65] et [75]) ou des pratiques de gestion des cultures (par exemple Références [15], [25], [31], [33],

[34], [37], [42], [60] et [66]). Ces caractéristiques en font des organismes pertinents pour être utilisés comme

bio-indicateurs afin de mesurer des changements de la qualité du sol, en particulier en raison des pratiques

d’exploitation du sol et de la pollution (par exemple Références [26], [39], [48], [52], [53], [59], [65] et [79]).

La méthode proposée dans la présente partie de l’ISO 23611 couvre le prélèvement de tous les macro-invertébrés

du sol. Toutefois, le prélèvement des vers de terre est déjà couvert dans l’ISO 23611-1. Cette méthode est

décrite dans l’ISO 23611-1:2006, Annexe C, en tant que variante pour le prélèvement des vers de terre.

iv © ISO 2011 – Tous droits réservés
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NORME INTERNATIONALE ISO 23611-5:2011(F)
Qualité du sol — Prélèvement des invertébrés du sol —
Partie 5:
Prélèvement et extraction des macro-invertébrés du sol
1 Domaine d’application

La présente partie de l’ISO 23611 spécifie une méthode pour le prélèvement, l’extraction et la conservation des

macro-invertébrés du sol, y compris la zone de litière. La méthode proposée est un prérequis à l’utilisation de

ces animaux en tant que bio-indicateurs (par exemple pour évaluer la qualité d’un sol en tant qu’habitat pour

des organismes). Les principes majeurs de cette méthode consistent à avoir une évaluation rapide (réaliser

l’échantillonnage d’une zone en un ou deux jours avec un équipement de base et avec un nombre réduit

d’assistants de terrain), pour être capable de traiter tous les groupes taxinomiques de macro-invertébrés du

sol en même temps et au même endroit. La méthode TSBF (biologie et fertilité des sols tropicaux) a évolué et

quelques modifications ont été introduites afin de l’utiliser dans des régions tempérées.

Les méthodes de prélèvement et d’extraction de la présente partie de l’ISO 23611 sont applicables à la

quasi-totalité des sols, à l’exception des sols présents sous des conditions climatiques extrêmes (sols durs,

gelés ou inondés) et les matrices autres que le sol, par exemple des troncs d’arbres, des plantes ou des lichens.

Le plan d’échantillonnage est spécifié dans l’ISO 23611-6.

NOTE 1  La méthode spécifiée dans la présente partie de l’ISO 23611 est basée sur les lignes directrices qui ont été

[7]

développées dans le cadre du programme de biologie et de fertilité des sols tropicaux (méthode TSBF) .

NOTE 2  Les informations de base sur l’écologie des macro-invertébrés et leur utilisation peuvent être trouvées dans

les références citées dans la Bibliographie.
2 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

2.1
macro-invertébrés
organismes du sol d’une taille moyenne supérieure à 10 mm
NOTE  Voir Annexe A pour plus de détails.

EXEMPLE  Ce sont notamment les groupes suivants: les Oligochètes, les Gastéropodes, les Chilopodes, les

Diplopodes, les Isopodes, les Arachnides, plus divers insectes: les Coléoptères, les Orthoptères, les Hyménoptères, les

Hémiptères, les Dermaptères, les Lépidoptères (larves) et les Diptères (larves).
2.2
masse imprégnée

masse des individus après conservation dans le formol ou l’éthanol (lorsque la substance utilisée pour la

conservation a été absorbée par les tissus)
3 Principe

Les macro-invertébrés du sol sont collectés sur le terrain au moyen d’un cadre métallique pour délimiter

la surface de sol du point d’échantillonnage. Les macro-invertébrés de la litière et du sol sont prélevés

séparément. Dans les régions tempérées, un réactif est utilisé pour extraire les macro-invertébrés du sol.

L’échantillonnage est complété par tri manuel. Les animaux sont conservés et transportés au laboratoire en

vue de leur identification (par exemple Références [11], [12], [13], [14], [17], [19], [20], [22], [23], [27], [28], [29],

© ISO 2011 – Tous droits réservés  1
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ISO 23611-5:2011(F)

[30], [35], [36], [38], [45], [46], [47], [54], [57], [70], [72], [73], [76], [77], [78] et [84]). Les valeurs d’abondance

sont généralement recalculées et rapportées à une surface (1 m).
4 Réactifs
4.1 Éthanol, 70 % (fraction volumique).
4.2 Formol (solution de formaldéhyde), 4 % (fraction volumique).

Il convient de disposer à la fois d’éthanol à 70 % et de formol à 4 % pour la conservation des spécimens (le

formol à 4 % est plus approprié pour les taxons dont le corps comporte des parties molles, qui peuvent être

transférés dans l’éthanol après 4 jours de fixation).

4.3 Formol, 0,2 % (fraction volumique), préparé en diluant 25 ml de formol (39 %) dans 5 l d’eau, pour

l’extraction des macro-invertébrés du sol.
5 Appareillage
Utiliser du matériel courant de laboratoire ainsi que ce qui suit.
5.1 Boîtes de Petri.
5.2 Loupe binoculaire.
5.3 Flacons en plastique.
5.4 Pinces entomologiques.
5.5 Crayon, carnet de notes, marqueur indélébile, étiquettes.
5.6 Mètres rubans.
5.7 Couteau (verre taillé).
5.8 Bêche.
5.9 Sacs en plastique tissé (pour poser sur le sol).
5.10 Balance de précision.

5.11 Plateaux plats larges en plastique (500 mm × 400 mm × 100 mm), pour trier le sol et la litière.

5.12 Tarière.
5.13 Petits plateaux en plastique.
5.14 Pinces fines (ou pinces entomologiques), pipette, pinceaux fins.

5.15 Flacons d’échantillonnage, de différentes dimensions, munis de couvercles hermétiques étanches à

l’alcool.
5.16 Stylo à encre de Chine (résistante à l’eau).
2 © ISO 2011 – Tous droits réservés
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ISO 23611-5:2011(F)
5.17 Carton rigide pour étiquettes, boussole.
5.18 Grands sacs en plastique épais (scellables).
5.19 Table et chaises en plastique, pour le tri.
5.20 Bâche, pour abriter de la pluie battante.
5.21 Gants en polyvinyle, pour se protéger les mains du formol.
5.22 Cadre métallique, de préférence de 250 mm × 250 mm.

Cadre de prélèvement (250 mm × 250 mm × 50 mm), en acier inoxydable et présentant des bords tranchants

pour délimiter le point d’échantillonnage où les animaux sont prélevés dans la couche de litière et dans le sol.

5.23 Arrosoir.
5.24 Paire de ciseaux, pour couper la végétation à l’intérieur du cadre.
5.25 Balances de terrain.
6 Mode opératoire sur le terrain
6.1 Généralités

Il convient de réaliser le prélèvement au moment où l’on pense pouvoir disposer de la biodiversité la plus large.

Dans les régions tempérées, cela correspond au printemps ou à l’automne; dans les régions tropicales, il

convient que le prélèvement soit effectué vers la fin de la saison des pluies.

Lorsqu’on prélève des invertébrés du sol, il est fortement recommandé de déterminer les caractéristiques

physico-chimiques du sol. Il convient de mesurer notamment le pH, la granulométrie, le rapport C/N, la teneur

en carbone organique et la capacité de rétention d’eau en utilisant l’ISO 10390, l’ISO 10694, l’ISO 11274,

l’ISO 11277, l’ISO 11461 et l’ISO 11465.
6.2 Collecte des macro-invertébrés de la litière

À chaque point d’échantillonnage (= monolithe) (préalablement défini selon les règles du plan d’échantillonnage),

un échantillon de litière est prélevé en utilisant un cadre métallique (5.22). Le cadre métallique est enfoncé

manuellement dans la litière. La litière à l’intérieur du cadre est retirée et contrôlée à la main sur le terrain en

utilisant un plateau large (5.11). Les invertébrés de la litière sont conservés dans le formol à 4 % (4.2).

6.3 Collecte des macro-invertébrés du sol
6.3.1 Généralités

Dans les pays tempérés, l’extraction des macro-invertébrés du sol est réalisée en deux étapes (voir 6.3.2.1 et

6.3.2.2), tandis que dans les pays tropicaux, seule la seconde étape doit être exécutée (voir 6.3.3).

6.3.2 Régions tempérées
6.3.2.1 Extraction au formol

La surface du sol délimitée par le cadre métallique (5.22) est arrosée de formol à 0,2 % (4.3) au moyen d’un

arrosoir (5.23). Deux applications de 1,5 l de formol espacées d’environ 10 min sont réalisées. Les invertébrés

du sol remontant à la surface sont ramassés et conservés dans des flacons (5.3) contenant du formol (4.2).

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ISO 23611-5:2011(F)
6.3.2.2 Tri manuel des macro-invertébrés «passifs»

À la fin de l’extraction au formol, le cadre métallique (5.22) est retiré et la couche correspondant aux 150 mm

supérieurs du sol est creusée à l’intérieur de la surface du cadre (250 mm × 250 mm). Le sol creusé est placé

dans un sac en plastique (5.18) qui peut être fermé par un couvercle pour empêcher les animaux de s’échapper

de l’échantillon de sol.

Des sous-échantillons de sol appropriés sont prélevés dans le sac et étalés sur un plateau large (5.11). Les

macro-invertébrés sont prélevés et conservés dans des flacons (5.3) contenant du formol (4.2). Après avoir

procédé au tri manuel des macro-invertébrés, remettre le sol trié en place pour reboucher les trous du site

d’échantillonnage.
6.3.3 Régions tropicales

Dans les pays tropicaux, les macro-invertébrés du sol sont échantillonnés en utilisant un monolithe de sol de

250 mm × 250 mm sur 300 mm de profondeur. Le monolithe est isolé en creusant le sol de quelques centimètres

à l’extérieur du carré (cadre métallique) au moyen d’une bêche (5.8), puis en creusant une tranchée de 20 mm

de largeur sur 300 mm de profondeur autour du carré. Cela facilite le découpage de l’échantillon en strates

horizontales et la collecte des animaux s’échappant du bloc.

Le bloc délimité est divisé en trois couches, 0 mm à 100 mm, 100 mm à 200 mm et 200 mm à 300 mm, et le

sol avec de la litière est trié manuellement dans des plateaux (5.11). Étant donné que le formol n’est pas utilisé

dans les régions tropicales, la profondeur du prélèvement doit être doublée afin d’assurer le prélèvement des

espèces de vers endogés.

Pour les insectes sociaux, il est recommandé de prendre des mesures spéciales qui prennent en compte

leur grande abondance et leur dispersion inégale marquée; un nid peut contenir des millions d’individus dont

il est possible qu’aucun ne soit prélevé par un transect court et la contribution de l’espèce concernée à un

assemblage de macrofaune peut ainsi être totalement perdue. À l’inverse, un nid fortement peuplé directement

prélevé par un monolithe peut produire une importante surestimation de la densité numérique totale ou de la

densité de la biomasse. De manière générale, il convient que le transect TSBF soit placé de manière à éviter

un contact direct avec des nids de termites ou de fourmis. Pour plus d’informations, voir Références [39]

et [40]. Le protocole pour un transect de 100 m × 2 m conçu pour évaluer la biodiversité des termites (et la

représentation du groupe trophique) est donné dans la Référence [52]. Lorsque les circonstances s’y prêtent,

ce protocole peut également être déployé en parallèle avec le transect TSBF.

NOTE  Outre la caractérisation générale du site, il est utile de déterminer l’humidité réelle du sol à échantillonner.

7 Mode opératoire au laboratoire
7.1 Traitement des échantillons collectés

Au laboratoire, les échantillons sont nettoyés et les animaux sont placés dans de nouveaux flacons (5.15) avec

de l’éthanol (70 %, fraction volumique) (4.1). Les organismes dont le corps comporte des parties molles sont

conservés dans le formol au moins pendant 4 jours ou à demeure si possible.

Pour l’identification taxonomique, les spécimens sont placés sur des boîtes de Petri (5.1) et observés à la

loupe binoculaire (5.2). Une méthode pratique d’identification des macro-invertébrés consiste à les regrouper

d’abord par ordres. Dans chaque ordre, on identifie ensuite les familles, et dans chaque famille, les espèces,

en utilisant des clés taxonomiques (des exemples de clés taxonomiques sont cités dans la Bibliographie

(Références [11], [12], [13], [14], [17], [19], [20], [23], [27], [28], [29], [30], [35], [36], [38], [45], [46], [47], [57],

[72], [73], [77], [78] et [84]).

Il convient, dans l’idéal, de procéder à la détermination taxonomique des espèces. Si l’identification de l’espèce

n’est pas possible à cause des contraintes de temps, de l’expertise taxonomique ou du manque de clés

taxonomiques (un cas fréquent pour les régions tropicales, par exemple), le tri par genre (et certaines unités

taxonomiques de rang supérieur) représente un bon compromis entre l’approche par espèces morphologiques

et l’approche par le niveau ordinal, notamment en permettant d’affecter la plupart des spécimens à un groupe

fonctionnel.
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AVERTISSEMENT — Des précautions adéquates (c’est-à-dire le port de gants, d’un masque) doivent

être prises lors de l’utilisation du formol pour éviter tout risque d’inhalation ou d’exposition cutanée.

D’après la «Fiche de données de sécurité» pour une solution de formaldéhyde à 37 % éditée par

les fabricants, le composé est un allergène cutané considéré comme cancérigène (chez l’homme:

symptômes limités; chez les animaux: éléments probants suffisants). Dans les pays industrialisés, il

est légalement indiqué pour une utilisation scientifique.
7.2 Conservation des spécimens

Pour n’importe quel échantillon mixte de macrofaune du sol, il convient de suivre les étapes suivantes pour

obtenir des spécimens conservés selon des méthodes normalisées.

a)  Si le corps de l’animal ne comporte pas de parties molles, il convient que les organismes soient conservés

dans de l’éthanol à 70 % (il convient de diluer l’éthanol commercial).

b)  Si le corps de l’animal comporte des parties molles, il convient que l’organisme soit fixé dans le formol à

4 % et il convient si possible qu’il soit conservé dans la même solution. En variante, on pourrait utiliser de

l’éthanol à 80 % (si l’organisme a été fixé pendant au moins 4 jours avec du formol à 4 %).

c)  Dans tous les cas, il convient que les échantillons soient conservés séparément dans des flacons

différents en tenant compte de la plus petite unité d’analyse (c’est-à-dire un monolithe si les données sont

comparées à ce niveau).

d)  Il convient que chaque flacon soit étiqueté sans utiliser de codes chiffrés et au moins qu’il porte des

inscriptions écrites à l’encre permanente, telle de l’encre de Chine, et en utilisant un papier résistant tel

que le parchemin de chèvre. Il convient que chaque étiquette contienne les informations suivantes:

—  le pays;
—  la région;
—  la localité;
—  le nom du collecteur;
—  la date de la collecte.
e)  Pour la conservation des spécimens:

—  utiliser des flacons (ou des tubes en verre) qui ne sont pas dégradés par l’éthanol ou le formol et sont

munis de couvercles à vis;

—  surveiller les niveaux d’éthanol et de formol de manière qu’ils demeurent constants;

—  ranger les flacons à l’abri des rayons du soleil;

—  changer la solution de conservation de chaque flacon une fois tous les cinq ans.

7.3 Détermination de la biomasse

La détermination de la biomasse est réalisée sur le matériel conservé. Il convient que la surface des animaux

soit séchée avec précaution au moyen d’un papier filtre, puis que les animaux soient pesés à l’aide d’une

balance de précision (0,001 g).

Il est pratiquement impossible de maintenir des invertébrés vivants après leur capture pour mesurer leurs

masses fraîches. Dans la plupart des cas, les invertébrés sont conservés dans l’éthanol à 70 % (fraction

volumique) ou dans le formol à 4 % (fraction volumique). Ce dernier est recommandé pour les vers de terre,

qui doivent au moins être fixés dans le formol avant d’être conservés dans l’éthanol à 70 %. La conservation

implique toujours une réduction de masse car l’eau du corps est extraite sous l’effet des forces osmotiques. La

quantité d’eau perdue peut varier entre 15 % et 40 % selon la teneur en eau de l’animal et son état physiologique.

Étant donné que la plupart des études ont pour seul but de comparer des situations et/ou des sites différents,

la perte de masse ne risque pas de fausser le résultat. Si des données exactes relatives à la masse fraîche

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sont nécessaires, il est facile de conserver une aliquote de chaque groupe et de comparer la masse vivante et

la masse fixée, quelques jours après fixation.
8 Évaluation des résultats

Il est possible d’utiliser les mesures suivantes pour la bioclassification d’un sol, y compris la bio-indication ou

la biosurveillance (d’une contrainte anthropique telle que les produits chimiques ou des changements liés à

l’exploitation du sol, par exemple):
—  l’abondance (nombre d’individus par unité de surface);
—  la biomasse;

—  le nombre d’espèces ou d’autres groupes définis d’un point de vue taxonomique ou écologique;

—  les indices de diversité (diversité alpha, bêta et gamma).

En premier lieu, le nombre d’individus (nombre total par espèce ou par groupe) est compté et exprimé sous

forme d’individus par échantillon. En second lieu, l’abondance totale des individus est multipliée par un

facteur (16) afin d’obtenir le nombre d’individus par mètre carré.

La masse fraîche mesurée sur le terrain est la façon idéale de calculer la biomasse. À défaut, il est admis

d’utiliser la masse imprégnée, après conservation. D’autres méthodes sont rapportées dans la littérature,

par exemple masse fraîche après imprégnation, masse sèche obtenue après séchage toute la nuit à 60 °C,

séchage à masse constante à des températures plus élevées, masse fraîche évidée, masse sèche évidée,

masse fraîche × une constante (pour une teneur en eau supposée) et largeur de la tête (rapportée à une courbe

d’étalonnage). Cependant, ces méthodes ont une moins grande signification biologique que la masse fraîche.

9 Rapport d’essai
Le rapport d’essai doit au moins contenir les informations suivantes:

a)  une référence à la présente partie de l’ISO 23611 (c’est-à-dire l’ISO 23611-5:2011);

b)  une description complète de la conception et des modes opératoires de l’étude;

c)  la caractérisation du site étudié (en particulier, les propriétés du sol);
d)  la méthode de prélèvement;

e)  la description des conditions de prélèvement, y compris la date et la durée de l’échantillonnage sur le

terrain et les paramètres climatiques tels que la température et l’humidité de l’air, la pluie ou la neige, etc.;

f)  les détails concernant le procédé d’extraction du matériel biologique;

g)  les valeurs ramenées à 1 m ou toute autre dimension normalisée, si nécessaire;

h)  un résumé des résultats obtenus;
i)  l’interprétation des résultats;

j)  toutes les informations, y compris toutes les données brutes mesurées et tous les problèmes ayant pu

survenir ou se développer au cours de toutes les étapes de l’étude.
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Annexe A
(normative)
Informations de base

Les macro-invertébrés du sol peuvent également être définis comme des organismes appartenant à des taxons

dont plus de 90 % des spécimens sont visibles à l’œil nu. Les macro-invertébrés du sol comprennent les groupes

suivants: les Oligochètes (Annélides), les Gastéropodes (escargots et limaces), les Coléoptères (larves et

adultes), les Isoptères, les Diplopodes, les Chilopodes, les Hyménoptères, les Arachnides, les Dictyoptères,

les Orthoptères, les Hémiptères, les Dermaptères, les Isopodes, les Lépidoptères (larves) et les Diptères

(larves). Sont spécifiquement exclus les groupes comprenant un nombre relativement réduit de spécimens qui

sont visibles à l’œil nu, tels les Nématodes (par exemple Mermithidae), les Enchytraeidae, les Collemboles, les

Acariens, les Symphyla, les Pauropodes et les Diplures. Il convient que les unités taxinomiques fondamentales

soient adoptées comme unités standards pour l’échantillonnage de la macrofaune. Le choix de 17 taxons

principaux a été effectué au cours d’un atelier AIOB en utilisant la base de données sur la macrofaune (MDB)

qui contient des informations sur 32 pays et près de 1 000 sites échantillonnés. Les 17 taxons [Oligochaeta

(de l’ordre des opisthopora), Coléoptères (larves et adultes), Isoptères, Diplopodes, Chilopodes, Formicidae,

Gastéropodes, Aranaea, Blattoïdes, Orthoptères, Dermaptères, Isopodes, Hémiptères, larves de Lépidoptères,

Diptères (larves et adultes) et résidus (insectes et non insectes)] correspondent aux macro-invertébrés du sol

les plus importants en termes d’abondance et de biomasse.

Le choix d’un monolithe mesurant 250 mm × 250 mm × 300 mm est basé sur une expérience approfondie, bien

que largement empirique. Utilisé pour la première fois par Zajonc (1956), il a été proposé comme standard pour

[7][59]

le programme de biologie et de fertilité des sols tropicaux (TSBF) . Cette taille de monolithe s’applique à la

fois aux sols tropicaux et aux sols tempérés. L’objectif était de proposer une méthode qui ne soit pas trop longue

à mettre en place tout en permettant d’évaluer avec exactitude la composition et la structure des communautés

de macro-invertébrés du sol. La méthode a rencontré un très grand succès et est devenue une référence

utilisée sur plusieurs centaines de sites. Bien que les études visant des groupes spécifiques, en particulier

les termites, les vers de terre ou les fourmis, semblent privilégier des tailles d’échantillons différentes, la taille

proposée représente un très bon compromis qui permet d’obtenir un nombre satisfaisant de réplicats et une

représentation acceptable de la plupart des ordres dans un échantillon unique. Les échantillons de plus grande

taille exigent trop de temps, ce qui ne permet pas de réaliser un nombre suffisant de réplicats. Dans la plupart

des cas, un groupe de quatre personnes bien entraînées peut trier 10 échantillons par jour. Des études sur

le terrain non publiées ont montré que 15 à 20 échantillons sont nécessaires dans un seul site pour réduire

la variance à une proportion de moyenne raisonnablement basse (<20 %). Cependant, la comparaison de

sites ayant des couvertures végétales ou des sols différents et/ou soumis à des options de gestion différentes

permet de révéler des différences significatives avec pas plus de cinq échantillons, à condition qu’un traitement

statistique adapté (souvent des analyses à plusieurs variables) soit mis en œuvre.

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ISO 23611-5:2011(F)
Bibliographie
[1]  ISO 10390, Qualité du sol — Détermination du pH

[2]  ISO 10694, Qualité du sol — Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion

sèche (analyse élémentaire)

[3]  ISO 11274, Qualité du sol — Détermination de la caractéristique de la rétention en eau — Méthodes de

laboratoire

[4]  ISO 11277, Qualité du sol — Détermination de la répartition granulométrique de la matière minérale des

sols — Méthode par tamisage et sédimentation

[5]  ISO 11461, Qualité du sol — Détermination de la teneur en eau du sol en fraction volumique, à l’aide

de carottiers — Méthode gravimétrique

[6]  ISO 11465, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau —

Méthode gravimétrique

[7]  Anderson, J.M. et  IngrAm, J.S.I. Eds., 1993.  Fertilité et biologie des sols tropicaux – Manuel de

méthodes. 2  ed. CAB International, Wallingford

[8]  Andren, O., BrussAArd, L., ClArholm, M., 1999. Influence des organismes du sol sur les processus

au niveau de l’écosystème – contournement de la hiérarchie écologique.  Applied Soil Ecology  11:

177-188

[9]  AokI, J. (éd) ,1999: Clés illustrées des animaux du sol au Japon. Tokai University Press, 1076 p., Tokyo

[10]  ArAujo, Y., luIzAo, F.J., BArros, E., 2004. Effet de l’ajout de v
...

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