ISO/TS 2963:2006

Cheese and processed cheese products — Determination of citric acid content — Enzymatic method

ISO/TS 2963|IDF/RM 34:2006 specifies an enzymatic method for the determination of the citric acid content of cheese and processed cheese products.

Fromages et fromages fondus — Détermination de la teneur en acide citrique — Méthode enzymatique

L'ISO/TS 2963|FIL/RM 34:2006 internationale spécifie une méthode enzymatique pour la détermination de la teneur en acide citrique des fromages et des fromages fondus.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 25-Apr-2006
• ICS: 67.100.30 - Cheese
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Completion Date: 07-Apr-2022

Relations

• Revises: ISO 2963:1997 - Cheese and processed cheese products — Determination of citric acid content — Enzymatic method
• Effective Date: 15-Apr-2008
• Consolidated By: ISO 11111-3:2005/Amd 2:2016 - Textile machinery — Safety requirements — Part 3: Nonwoven machinery — Amendment 2
• Effective Date: 06-Jun-2022

Standards Content (Sample)

TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 2963
IDF/RM
34
First edition
2006-05-01

Cheese and processed cheese
products — Determination of citric acid
content — Enzymatic method
Fromages et fromages fondus — Détermination de la teneur en acide
citrique — Méthode enzymatique




Reference numbers
ISO/TS 2963:2006(E)
IDF/RM 34:2006(E)
©
ISO and IDF 2006

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ISO/TS 2963:2006(E)
IDF/RM 34:2006(E)
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©  ISO and IDF 2006
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Published in Switzerland

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ISO/TS 2963:2006(E)
IDF/RM 34:2006(E)
Contents Page
Foreword. iv
Foreword. v
Introduction . vi
1 Scope . 1
2 Terms and definitions. 1
3 Principle. 1
4 Reagents. 1
5 Apparatus . 3
6 Sampling. 3
7 Preparation of test sample. 3
8 Procedure . 4
8.1 Check tests. 4
8.2 Test portion . 4
8.3 Reagent blank test. 4
8.4 Deproteination. 5
8.5 Determination. 5
9 Calculation and expression of results. 6
9.1 Calculation. 6
9.2 Expression of results . 7
10 Precision. 7
10.1 Interlaboratory test . 7
10.2 Repeatability. 7
10.3 Reproducibility. 7
11 Test report . 7
Annex A (normative) Good Laboratory Practice (GLP) rules for the performance of enzymatic
analyses. 8
Bibliography . 12

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ISO/TS 2963:2006(E)
IDF/RM 34:2006(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has
been established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
In other circumstances, particularly when there is an urgent market requirement for such documents, a
technical committee may decide to publish other types of normative document:
— an ISO Publicly Available Specification (ISO/PAS) represents an agreement between technical experts in
an ISO working group and is accepted for publication if it is approved by more than 50 % of the members
of the parent committee casting a vote;
— an ISO Technical Specification (ISO/TS) represents an agreement between the members of a technical
committee and is accepted for publication if it is approved by 2/3 of the members of the committee casting
a vote.
An ISO/PAS or ISO/TS is reviewed after three years in order to decide whether it will be confirmed for a
further three years, revised to become an International Standard, or withdrawn. If the ISO/PAS or ISO/TS is
confirmed, it is reviewed again after a further three years, at which time it must either be transformed into an
International Standard or be withdrawn.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO/TS 2963⎪IDF/RM 34 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee
SC 5, Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF). It is being published jointly by ISO
and IDF.
This edition of ISO/TS 2963⎪IDF/RM 34 cancels and replaces ISO 2963:1997, which has been technically
revised.

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ISO/TS 2963:2006(E)
IDF/RM 34:2006(E)
Foreword
IDF (the International Dairy Federation) is a worldwide federation of the dairy sector with a National
Committee in every member country. Every National Committee has the right to be represented on the IDF
Standing Committees carrying out the technical work. IDF collaborates with ISO in the development of
standard methods of analysis and sampling for milk and milk products.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the Action Teams and Standing Committees are circulated to the National Committees for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 50 % of the IDF National Committees
casting a vote.
In other circumstances, particularly when there is an urgent market requirement for such documents, a
Standing Committee may decide to publish an other type of normative document which is called by IDF:
Reviewed method. Such a method represents an agreement between the members of a Standing Committee
and is accepted for publication if it is approved by at least 50 % of the committee members casting a vote.
A Reviewed method is equal to an ISO/PAS or ISO/TS and will, therefore, also be published jointly under ISO
conditions.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO/TS 2963⎪IDF/RM 34 was prepared by the International Dairy Federation (IDF) and Technical Committee
ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk products. It is being published jointly by IDF
and ISO.
All work was carried out by the Joint ISO-IDF Action Team on Lactose and lactate determination, of the
Standing Committee on Main components of milk, under the aegis of its project leader, Mr C. Hughes (NZ).
This edition of ISO/TS 2963⎪IDF/RM 34 cancels and replaces IDF 34C:1992, which has been technically
revised.

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ISO/TS 2963:2006(E)
IDF/RM 34:2006(E)
Introduction
The method described in ISO 2963:1997 and IDF 34C:1992 did not fulfil the requirements for a fully validated
International Standard. No new interlaboratory tests could be organized with the method according to
ISO 5725-1 and ISO 5725-2 due to a lack of participants, hence the publication of this revision as a Technical
Specification/Reviewed method.
Reliable results with enzymatic methods will only be obtained if the good laboratory practice (GLP) rules for
such analyses are applied strictly. These GLP rules are given in Annex A.

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ISO/TS 2963:2006(E)
TECHNICAL SPECIFICATION
IDF/RM 34:2006(E)

Cheese and processed cheese products — Determination of
citric acid content — Enzymatic method
1 Scope
This Technical Specification specifies an enzymatic method for the determination of the citric acid content of
cheese and processed cheese products.
2 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
2.1
citric acid content
mass fraction of substances determined by the procedure described in this Technical Specification
NOTE The citric acid content is expressed as mass fraction in percent.
3 Principle
An extract of the sample is treated with the following enzymes and biochemical substances:
a) citrate lyase (CL) to convert citric acid to oxalacetate and acetate;
b) malate dehydrogenase (MDH) and lactate dehydrogenase (LDH), in the presence of reduced
nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), to catalyse the reduction of oxalacetate and its
decarboxylation product pyruvate to L-malate and L-lactate, respectively, with the subsequent conversion
+
of NADH to its oxidized form (NAD ).
The decrease in concentration of NADH is determined by measurement of the absorbance of the test solution
at 340 nm. The citric acid content is proportional to the decrease in NADH concentration.
4 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade and distilled water or water of at least equivalent purity,
unless otherwise specified. Take note of the production and expiry dates given by the manufacturer of the
reagents.
4.1 Enzymes
If an enzyme suspension is applied with other than the prescribed activity, the volume of the suspension
stated in the pipetting scheme (8.5.1) shall be increased or decreased proportionally.
The reagents described in 4.7 to 4.10 inclusive may be obtained commercially as a test combination.
4.2 Trichloroacetic acid solution (CCl COOH).
3
Dissolve 200,0 g of trichloroacetic acid in water. Dilute to 1 000 ml with water and mix.
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ISO/TS 2963:2006(E)
IDF/RM 34:2006(E)
4.3 Sodium hydroxide solution I, c(NaOH) = 5,0 mol/l.
Dissolve 200,0 g of sodium hydroxide in water. Dilute to 1 000 ml with water and mix.
4.4 Sodium hydroxide solution II, c(NaOH) = 1,0 mol/l.
Dissolve 40,0 g of sodium hydroxide in water. Dilute to 1 000 ml with water and mix.
4.5 Sodium hydroxide solution III, c(NaOH) = 0,1 mol/l.
Dissolve 4,0 g of sodium hydroxide in water. Dilute to 1 000 ml with water and mix.
4.6 Zinc chloride solution, c(ZnCl ) = 800 mg/l.
2
Dissolve 800 mg of zinc chloride in water. Dilute to 1 000 ml with water and mix.
4.7 Buffer solution, pH 7,8.
Dissolve 71,3 g of glycylglycine in about 700 ml of water. Adjust to pH 7,8 with sodium hydroxide solution I
(4.3). Add 100 ml of zinc chloride solution (4.6). Dilute to 1 000 ml with water and mix.
The buffer solution may be kept for 4 weeks if stored in a refrigerator at between 0 °C and +5 °C.
4.8 Reduced nicotinamide adenine dinucleotide solution
Dissolve 50 mg of reduced nicotinamide adenine dinucleotide disodium salt (C H N O P Na ) and 100 mg
21 27 7 14 2 2
of sodium hydrogen carbonate (NaHCO ) in 10 ml of water.
3
The reduced nicotinamide adenine dinucleotide solution may be kept for 4 weeks if stored in a refrigerator at
between 0 °C and +5 °C.
4.9 Malate dehydrogenase/lactate dehydrogenase suspension
Mix suitable amounts of malate dehydrogenase (MDH from pig heart; suspension in ammonium sulfate
1)
solution, 3,2 mol/l, at pH 6,0 ± 0,2; EC 1.1.1.37) and lactate dehydrogenase (LDH from rabbit muscle;
suspension in ammonium sulfate solution, 3,2 mol/l, at pH 7 ± 0,2; EC 1.1.1.27). Dilute with ammonium sulfate
2) 2)
solution (3,2 mol/l) so as to obtain a final suspension containing about 600 units of MDH/ml and 1 400 units
of LDH/ml.
The malate dehydrogenase/lactate dehydrogenase suspension may be kept for 1 year if stored in a
refrigerator at between 0 °C and +5 °C.
4.10 Citrate lyase solution
Dissolve a suitable amount of citrate lyase [lyophilisate (CL) from Aerobacter aerogenes; EC 4.1.3.6] in ice-
2)
cold water so as to obtain a solution containing 40 units/ml .
The citrate lyase solution may be kept for 1 week if stored at between 0 °C and +5 °C, and for 4 weeks if
stored at −20 °C.
4.11 Citric acid standard solution.
Dissolve 1,600 g of citric acid monohydrate (C H O⋅H O) in water. Dilute to 1 000 ml with water and mix.
6 8 7 2

1) The EC number refers to the Enzyme Classification number as given in Reference [4].
2) This unit (often called International or Standard Unit) is defined as the amount of enzyme which will catalyse the
transformation of 1 µmol of substrate per minute under standard conditions.
2 © ISO and IDF 2006 – All rights reserved

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ISO/TS 2963:2006(E)
IDF/RM 34:2006(E)
5 Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the following:
5.1 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 1 mg, with a readability of 0,1 mg.
5.2 pH meter.
5.3 Glass beakers, of capacity 50 ml.
5.4 Macerator, equipped with a suitable beaker.
5.5 One-mark volumetric flasks, of capacity 100 ml.
5.6 Pipettes, capable of delivering 0,02 ml, 1 ml, 2 ml, 5 ml, 25 ml and 40 ml, respectively.
5.7 Graduated pipettes, capable of delivering 10 ml, graduated in 0,1 ml divisions.
5.8 Measuring cylinder, of capacity 50 ml.
5.9 Filter funnel, of diameter approximately 7 cm.
5.10 Filter paper, medium grade, of diameter approximately 15 cm.
5.11 Spectrometer, suitable for measuring at a wavelength of 340 nm, equipped with cells of optical path
length 1 cm.
5.12 Plastic paddles, suitable for mixing the sample-enzyme mixture in the spectrometer cell.
5.13 Water bath, capable of maintaining a temperature of 20 °C to 25 °C, with rack suitable for holding the
spectrometer cell (5.11) during the incubation period (optional; see 8.5.1).
Incubation of the cells in the water bath is only necessary if the room temperature is below 20 °C.
6 Sampling
A representative sample should have been sent to the laboratory. It should not have been damaged or
changed during transport or storage.
Sampling is not part of the method specified in this Technical Specification. A recommended sampling method
is given in ISO 707|IDF 50.
7 Preparation of test sample
Prepare a homogeneous sample taking care to avoid loss of moisture, using the following procedure.
a) In the case of cheese, remove the rind or mouldy surface layer of the cheese in such a way as to provide
a sample representative of the cheese as it is usually consumed.
Grind or grate the sample by using an appropriate device, mix the ground or grated mass quickly and, if
possible, grind or grate a second time and again mix thoroughly by intensive stirring and kneading.
b) In the case of processed cheese, remove a sample representative of the product. Mix the sample mass
quickly and grind if necessary. Mix thoroughly by intensive stirring and kneading.
© ISO and IDF 2006 – All rights reserved 3

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...

SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 2963
FIL/MR
34
Première édition
2006-05-01


Fromages et fromages fondus —
Détermination de la teneur en acide
citrique — Méthode enzymatique
Cheese and processed cheese products — Determination of citric acid
content — Enzymatic method




Numéros de référence
ISO/TS 2963:2006(F)
FIL/MR 34:2006(F)
©
ISO et FIL 2006

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ISO/TS 2963:2006(F)
FIL/MR 34:2006(F)
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soit de l'ISO, soit de la FIL à l’adresse respective ci-après.
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Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20 Diamant Building • Boulevard Auguste Reyers 80 • B-1030 Bruxelles
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Fax + 41 22 749 09 47 Fax + 32 2 733 04 13
E-mail [e-mail] E-mail [e-mail]
Web www.iso.org Web www.fil-idf.org
Publié en Suisse

ii © ISO et FIL 2006 – Tous droits réservés

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ISO/TS 2963:2006(F)
FIL/MR 34:2006(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Avant-propos. v
Introduction . vi
1 Domaine d'application. 1
2 Termes et définitions. 1
3 Principe. 1
4 Réactifs . 1
5 Appareillage . 3
6 Échantillonnage . 3
7 Préparation de l’échantillon pour essai. 4
8 Mode opératoire . 4
8.1 Essais de contrôle . 4
8.2 Prise d’essai . 5
8.3 Essai à blanc du réactif. 5
8.4 Défécation. 5
8.5 Détermination. 5
9 Calculs et expression des résultats. 7
9.1 Calculs . 7
9.2 Expression des résultats . 7
10 Fidélité . 8
10.1 Essai interlaboratoires . 8
10.2 Répétabilité. 8
10.3 Reproductibilité. 8
11 Rapport d’essai . 8
Annexe A (normative) Bonnes pratiques de laboratoire (BPL) relatives aux analyses
enzymatiques . 9
Bibliographie . 13

© ISO et FIL 2006 – Tous droits réservés iii

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ISO/TS 2963:2006(F)
FIL/MR 34:2006(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
Dans d'autres circonstances, en particulier lorsqu'il existe une demande urgente du marché, un comité
technique peut décider de publier d'autres types de documents normatifs:
— une Spécification publiquement disponible ISO (ISO/PAS) représente un accord entre les experts dans
un groupe de travail ISO et est acceptée pour publication si elle est approuvée par plus de 50 % des
membres votants du comité dont relève le groupe de travail;
— une Spécification technique ISO (ISO/TS) représente un accord entre les membres d'un comité technique
et est acceptée pour publication si elle est approuvée par 2/3 des membres votants du comité.
Une ISO/PAS ou une ISO/TS fait l'objet d'un examen après trois ans afin de décider si elle est confirmée pour
trois nouvelles années, révisée pour devenir une Norme internationale, ou annulée. Lorsqu'une ISO/PAS ou
une ISO/TS a été confirmée, elle fait l'objet d'un nouvel examen après trois ans qui décidera soit de sa
transformation en Norme internationale, soit de son annulation.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO/TS 2963⎪FIL/MR 34 a été élaborée par l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et
produits laitiers, et la Fédération internationale de laiterie (FIL). Elle est publiée conjointement par l’ISO et la
FIL.
Cette édition de l'ISO/TS 2963⎪FIL/MR 34 annule et remplace l’ISO 2963:1997, qui a fait l'objet d'une révision
technique.
iv © ISO et FIL 2006 – Tous droits réservés

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ISO/TS 2963:2006(F)
FIL/MR 34:2006(F)
Avant-propos
La FIL (Fédération internationale de laiterie) est une fédération mondiale du secteur laitier avec un Comité
national dans chacun de ses pays membres. Chaque Comité national a le droit de faire partie des Comités
permanents de la FIL auxquels sont confiés les travaux techniques. La FIL collabore avec l’ISO pour
l’élaboration de méthodes normalisées d’analyse et d’échantillonnage pour le lait et les produits laitiers.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les Équipes d’action et les Comités permanents sont soumis aux Comités
nationaux pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 50 % au moins
des Comités nationaux votants.
Dans d'autres circonstances, en particulier lorsqu'il existe une demande urgente du marché, un Comité
permanent peut décider de publier un autre type de document normatif, désigné par la FIL: Méthode révisée.
Cette méthode est le fruit d’un accord entre les membres d’un Comité permanent, et elle est acceptée pour
publication si elle est approuvée par 50 % au moins des membres votants du comité. Une Méthode révisée
équivaut à une ISO/PAS ou à une ISO/TS et sera donc également publiée conjointement dans les conditions
de l’ISO.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO/TS 2963⎪FIL/MR 34 a été élaborée par la Fédération internationale de laiterie (FIL) et l’ISO/TC 34,
Produits alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers. Elle est publiée conjointement par la FIL et
l’ISO.
L’ensemble des travaux a été confié à l’Équipe d’action mixte ISO-FIL, Dosage du lactose et du lactate du
Comité permanent Principaux composants du lait, sous la conduite de son chef de projet, Monsieur
C. Hughes (NZ).
Cette édition de l'ISO/TS 2963⎪FIL/MR 34 annule et remplace la FIL 34C:1992, qui a fait l'objet d'une révision
technique.
© ISO et FIL 2006 – Tous droits réservés v

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ISO/TS 2963:2006(F)
FIL/MR 34:2006(F)
Introduction
La méthode décrite dans l’ISO 2963:1997 et la FIL 34C:1992 ne satisfaisait pas aux exigences d’une Norme
internationale dûment validée. Il n’a pas été possible d’organiser de nouveaux essais interlaboratoires avec la
méthode selon l’ISO 5725-1 et l’ISO 5725-2 par manque de participants, d’où la publication en tant que
Spécification technique/Méthode révisée.
Des résultats fiables ne seront obtenus avec les méthodes enzymatiques que si les règles de bonnes
pratiques de laboratoire concernant ce type d’analyses sont strictement appliquées. Ces règles sont indiquées
en Annexe A.

vi © ISO et FIL 2006 – Tous droits réservés

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ISO/TS 2963:2006(F)
SPÉCIFICATION TECHNIQUE
FIL/MR 34:2006(F)

Fromages et fromages fondus — Détermination de la teneur en
acide citrique — Méthode enzymatique
1 Domaine d'application
La présente Spécification technique internationale spécifie une méthode enzymatique pour la détermination
de la teneur en acide citrique des fromages et des fromages fondus.
2 Termes et définitions
Pour les besoins de la présente Spécification technique, les termes et définitions suivants s'appliquent.
2.1
teneur en acide citrique
fraction massique des substances, déterminée selon la méthode décrite dans la présente Spécification
technique
NOTE La teneur en acide citrique est exprimée en pourcentage en masse.
3 Principe
Traitement d’un extrait d’échantillon par les enzymes et les substances biochimiques suivantes:
a) citrate lyase (CL) pour convertir l’acide citrique en oxaloacétate et acétate;
b) malate déshydrogénase (MDH) et lactate déshydrogénase (LDH) en présence de nicotinamide-adénine-
dinucléotide réduit (NADH) pour catalyser la réduction de l’oxaloacétate et de son produit de
décarboxylation, le pyruvate, en L-malate et L-lactate, respectivement, avec la conversion simultanée de
+
NADH en sa forme oxydée (NAD ).
Détermination de la diminution de la concentration de NADH en mesurant l’absorbance de la solution d’essai
à 340 nm. La teneur en acide citrique est proportionnelle à cette diminution de concentration de NADH.
4 Réactifs
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l’eau distillée ou de l’eau de pureté au
moins équivalente, sauf spécification contraire.
4.1 Enzymes
Prendre note de la date de fabrication et de la date limite d’utilisation des réactifs, indiquées par le fabricant.
Si une suspension enzymatique est utilisée pour une autre activité que celle spécifiée, le volume de
suspension indiqué en 8.5.1 doit être augmenté ou diminué en proportion.
Les réactifs décrits de 4.7 à 4.10 inclus sont en vente dans le commerce en combinaison pour essai.
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4.2 Solution d’acide trichloroacétique (CCl COOH).
3
Dissoudre 200,0 g d’acide trichloroacétique dans l’eau. Diluer avec de l’eau et compléter à 1 000 ml, puis
homogénéiser.
4.3 Hydroxyde de sodium, solution I, c(NaOH) = 5,0 mol/l.
Dissoudre 200,0 g d’hydroxyde de sodium dans l’eau. Diluer avec de l’eau et compléter à 1 000 ml, puis
homogénéiser.
4.4 Hydroxyde de sodium, solution II, c(NaOH) = 1,0 mol/l.
Dissoudre 40,0 g d’hydroxyde de sodium dans l’eau. Diluer avec de l’eau et compléter à 1 000 ml, puis
homogénéiser.
4.5 Hydroxyde de sodium, solution III, c(NaOH) = 0,1 mol/l.
Dissoudre 4,0 g d’hydroxyde de sodium dans l’eau. Diluer avec de l’eau et compléter à 1 000 ml, puis
homogénéiser.
4.6 Solution de chlorure de zinc, c(ZnCl ) = 800 mg/l.
2
Dissoudre 800 mg de chlorure de zinc dans l’eau. Diluer avec de l’eau et compléter à 1 000 ml, puis
homogénéiser.
4.7 Solution tampon, pH 7,8.
Dissoudre 71,3 g de glycylglycine dans environ 700 ml d’eau. Ajuster à pH 7,8 avec la solution d’hydroxyde
de sodium (4.3). Ajouter 100 ml de solution de chlorure de zinc (4.6). Diluer avec de l’eau et compléter à
1 000 ml, puis homogénéiser.
La solution tampon peut être conservée pendant 4 semaines si elle est conservée au réfrigérateur entre 0 °C
et +5 °C.
4.8 Solution de nicotinamide-adénine-dinucléotide réduit
Dissoudre 50 mg de sel disodique de nicotinamide-adénine-dinucléotide réduit (C H N O P Na ) et
21 27 7 14 2 2
100 mg d’hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO ) dans 10 ml d’eau.
3
La solution de nicotinamide-adénine-dinucléotide réduit peut être conservée pendant 4 semaines si elle est
conservée au réfrigérateur entre 0 °C et +5 °C.
4.9 Suspension de malate déshydrogénase/lactate déshydrogénase
Mélanger des quantités équivalentes de malate déshydrogénase (MDH extraite de cœur de porc; suspension
1)
dans une solution de sulfate d’ammonium, 3,2 mol/l, pH 6,0 ± 0,2; EC 1.1.1.37) et de lactate déshydro-
génase (LDH de muscle de lapin; suspension dans une solution de sulfate d’ammonium, 3,2 mol/l, pH 7 ± 0,2;
EC 1.1.1.27) et diluer avec la solution de sulfate d’ammonium (3,2 mol/l), de manière à obtenir une
2) 2)
suspension contenant environ 600 unités de MDH par millilitre et 1 400 unités de LDH par millilitre.
La suspension de malate déshydrogénase/lactate déshydrogénase peut être conservée pendant un an si elle
est conservée au réfrigérateur entre 0 °C et +5 °C.

1) Le nombre EC renvoie au nombre de la Classification des enzymes, tel qu’il figure dans la Référence [4].
2) Cette unité (appelée fréquemment unité internationale ou unité standard) équivaut à la quantité d’enzymes nécessaire
pour catalyser la transformation de 1 µmol de substrat par minute dans des conditions normalisées.
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4.10 Solution de citrate lyase
Dissoudre suffisamment de citrate lyase [lyophilisat (CL) provenant d’Aerobacter aerogenes; EC 4.1.3.6] dans
2)
de l’eau glacée, de manière à obtenir une solution contenant 40 unités par millilitre.
La solution de citrate lyase peut être conservée pendant une semaine si elle est conservée entre 0 °C et
+5 °C et pendant 4 semaines si elle est conservée à −20 °C.
4.11 Solution étalon d'acide citrique
Dissoudre 1,600 g d’acide citrique monohydraté (C H O ,H O) dans de l’eau. Diluer avec de l’eau et
6 8 7 2
compléter à 1 000 ml, puis homogénéiser.
5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit:
5.1 Balance analytique, d’une précision de 1 mg et d’une lisibilité de 0,1 mg.
5.2 pH-mètre.
5.3 Béchers en verre, de 50 ml de capacité.
5.4 Homogénéisateur, avec bécher adapté.
5.5 Fioles jaugées à un trait, d’une capacité de 100 ml.
5.6 Pipettes, de 0,02 ml, 1 ml, 2 ml, 5 ml, 25 ml et 40 ml de capacité.
5.7 Pipettes graduées, de 10 ml de capacité, graduées en 0,1 ml.
5.8 Éprouvette graduée, de 50 ml de capacité.
5.9 Entonnoir à filtre, d’environ 7 cm de diamètre.
5.10 Papier-filtre, de porosité moyenne, d’environ 15 cm de diamètre.
5.11 Spectromètre, capable d’effectuer des mesures à 340 nm et équipé de cellules de 1 cm de parcours
optique.
5.12 Spatules en plastique, destinées à agiter le mélange échantillon/enzyme dans la cellule du
spectromètre.
5.13 Bain d’eau, réglable entre 20 °C et 25 °C, équipé d’un support adéquat pour maintenir la cellule du
spectromètre (5.11) durant la période d’incubation (facultatif; voir 8.5.1).
L’incubation des cellules dans le bain d’eau n’est nécessaire que si la température de la pièce est inférieure à
20 °C.
6 Échantillonnage
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou modifié
lors du transport ou de l’entreposage.
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode indiquée dans la présente Spécification technique. Une
méthode d’échantillonnage recommandée est indiquée dans l’ISO 707⎪FIL 50.
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7 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer un échantillon homogène, en évitant des pertes d’humidité, selon la méthode suivante:
a) S’il s’agit de fromage, enlever la croûte ou la surface moisie du fromage, de manière à obtenir un
échantillon représentatif du fromage tel qu’il est ordinairement consommé.
Moudre ou râper l’échantillon avec un instrument approprié, mélanger rapidement la masse moulue ou
râpée et, si possible, moudre ou râper une seconde fois et mélanger bien de nouveau, en agitant et en
malaxant énergiquement.
b) S’il s’agit de fromage fondu, prélever un échantillon représentatif du produit. Mélanger rapidement la
masse de l’échantillon et le moudre, si nécessaire. Mélanger bien en agitant et en malaxant
énergiquement.
c) S’il s’agit de fromage fondu contenant des morceaux d’autres aliments (par exemple jambon, fruits, noix,
fines herbes), constater si l’objectif de l’analyse est de doser l’acide citrique dans le fromage fondu
proprement dit ou dans le produit entier. Dans le premier cas, séparer les morceaux de l’autre aliment et
procéder comme dans le cas du fromage fondu.
Placer l’échantillon dans un récipient pourvu d’
...