ISO 16256:2021
(Main)Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems — Broth micro-dilution reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against yeast fungi involved in infectious diseases
Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems — Broth micro-dilution reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against yeast fungi involved in infectious diseases
This document describes a method for testing the susceptibility to antifungal agents of yeasts, including Candida spp. and Cryptococcus neoformans, that cause infections. The reference method described here has not been used in studies of the yeast forms of dimorphic fungi, such as Blastomyces dermatitidis and/or Histoplasma capsulatum variety capsulatum. Moreover, testing filamentous fungi (moulds) introduces several additional problems in standardization not addressed by the current procedure. Those methods are beyond the scope of this document. This document describes the broth micro-dilution reference method, which can be implemented by either of two pathways. One pathway involves visual determination of MICs (CLSI method)[1][5]; the second pathway involves spectrophotometric determination of MICs (EUCAST method)[2][10]. The MIC reflects the activity of the drug under the described test conditions and can be interpreted for clinical management purposes by taking into account other factors, such as drug pharmacology or antifungal resistance mechanisms. In addition, MIC distributions can be used to define wild type or non-wild type fungal populations. Clinical interpretation of the MIC value is beyond the scope of this document; interpretive category breakpoints specific to the CLSI- and EUCAST-derived methods can be found by consulting the latest interpretive tables provided by the organizations[5][15]. Routine susceptibility testing methods or diagnostic test devices can be compared with this reference method in order to ensure comparable and reliable results for validation or registration purposes.
Laboratoires d’analyses de biologie médicale et systèmes de diagnostic in vitro — Méthode de référence de microdilution en milieu liquide pour soumettre à essai l’activité in vitro des agents antimicrobiens par rapport aux levures impliquées dans les maladies infectieuses
Le présent document décrit une méthode d’essai de la sensibilité aux agents antifongiques des levures pathogènes, dont Candida spp. et Cryptococcus neoformans. La méthode de référence décrite ici n’a pas été utilisée dans des études sur les phases levures de champignons dimorphes tels que Blastomyces dermatitidis et/ou Histoplasma capsulatum variété capsulatum. En outre, les essais sur les champignons filamenteux (moisissures) posent d’autres problèmes de normalisation qui ne sont pas traités par le présent mode opératoire. Ces méthodes vont au-delà du domaine d’application du présent document. Le présent document décrit la méthode de référence de microdilution en milieu liquide qui peut être réalisée de deux façons. La première implique une détermination visuelle de la CMI (méthode CLSI)[1][5]; la seconde implique une détermination spectrophotométrique de la CMI (méthode EUCAST)[2][10]. La CMI reflète l’activité de l’agent antimicrobien dans les conditions d’essai décrites et peut, avec d’autres facteurs tels que la pharmacologie de l’agent ou les mécanismes de résistance antifongique, servir dans la prise de décision de traitement clinique. Par ailleurs, les CMI peuvent servir à définir les populations en types sauvage ou non sauvage. L’interprétation clinique de la CMI sort du domaine d’application du présent document. Des critères d’interprétation catégoriels spécifiques aux méthodes du CLSI et de l’EUCAST sont donnés dans les derniers tableaux d’interprétation édités par ces organismes[5][15]. Dans le cadre d’une validation ou d’un enregistrement, les méthodes d’essai de sensibilité de routine ou les dispositifs de diagnostic peuvent être comparés avec la présente méthode de référence, afin de garantir des résultats comparables et fiables.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16256
Second edition
2021-10
Clinical laboratory testing and in
vitro diagnostic test systems — Broth
micro-dilution reference method
for testing the in vitro activity of
antimicrobial agents against yeast
fungi involved in infectious diseases
Laboratoires d’analyses de biologie médicale et systèmes de
diagnostic in vitro — Méthode de référence de microdilution en
milieu liquide pour soumettre à essai l’activité in vitro des agents
antimicrobiens par rapport aux levures impliquées dans les maladies
infectieuses
Reference number
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Published in Switzerland
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ISO 16256:2021(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction . vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Test procedures . 3
4.1 General . 3
4.1.1 Trays and method . 3
4.1.2 Conditions for use of disposable micro-dilution trays . 3
4.2 Medium . 3
4.2.1 General . 3
4.2.2 Visual reading pathway. 3
4.2.3 Spectrophotometric reading pathway . 4
4.3 Antifungal agents . 4
4.3.1 General . 4
4.3.2 Preparation of stock solutions . 4
4.3.3 Preparation of working solutions . 5
4.4 Preparation of broth micro-dilution trays . 6
4.4.1 Preparation for tests read visually – Visual reading pathway . 6
4.4.2 Preparation for tests read by spectrophotometer - Spectrophometric
reading pathway . 6
4.5 Storage of micro-dilution trays. 6
4.6 Preparation of inoculum . 7
4.6.1 General . 7
4.6.2 Preparation of inoculum for visual test reading . 7
4.6.3 Preparation of inoculum for spectrophotometric test reading . 7
4.7 Inoculation of micro-dilution trays . 7
4.8 Incubation of micro-dilution trays . 8
4.8.1 General . 8
4.8.2 Visual pathway . 8
4.8.3 Spectrophotometric pathway . 8
4.9 Reading MIC results . 8
4.9.1 General . 8
4.9.2 Visual reading method . 8
4.9.3 Spectrophotometric reading methods . 8
4.10 Interpretation of MICs . 9
5 Quality Control (QC) . 9
Annex A (informative) RPMI-1640 medium .12
Annex B (informative) McFarland 0,5 barium sulfate turbidity standard .14
Bibliography .15
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ISO 16256:2021(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to
the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see
www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 212, Clinical laboratory testing and in
vitro diagnostic test systems, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN)
Technical Committee CEN/TC 140, In vitro diagnostic medical devices, in accordance with the Agreement
on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 16256:2012), which has been technically
revised.
The main changes are as follows:
— addition of “broth micro-dilution” to the title;
— removal of 48 h reading for Candida species by the visual reading method;
— removal of definitions for susceptibility and resistance that are beyond the scope of this test
performance document;
— inclusion of considerations for antifungal testing of yeast species with micro-dilution trays “treated”
by manufacturers of the trays prior to use in the tests;
— updating of viable count testing methods for visual and spectrophotometer test pathways.
— addition of new antifungals (isavuconazole, rezafungin) to the testing and quality control range
tables;
— detailed characterization of the components of one formulation of RPMI-1640 known to provide
reproducible results of antifungal susceptibility tests for Candida species and Cryptococcus
neoformans;
— reassigning of annexes;
— update of bibliography to more relevant information about performance of antifungal susceptibility
testing for yeast fungi.
iv
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ISO 16256:2021(E)
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
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ISO 16256:2021(E)
Introduction
In vitro susceptibility tests are performed on microorganisms suspected of causing disease, particularly
if the organism is thought to belong to a species that can exhibit acquired resistance to frequently used
antimicrobial agents. The tests are also important in resistance surveillance, epidemiological studies of
susceptibility and in comparisons of new and existing agents.
Dilution procedures are used to determine the minimum inhibitory concentrations (MICs) of
antimicrobial agents and represent the reference method for antifungal susceptibility testing. MIC
methods are used in resistance surveillance, comparative testing of new agents for research or
registration purposes, to establish the susceptibility of organisms that give equivocal results in routine
tests, for tests with organisms where routine tests can be unreliable and when a quantitative result is
needed for clinical management. In dilution tests, microorganisms are tested for their ability to produce
discernible growth on a series of agar plates (agar dilution) or in broth (broth dilution) containing serial
dilutions of the antimicrobial agent.
The lowest concentration of an antimicrobial agent (in mg/l) that, under defined in vitro test conditions,
reduces visible or optically measurable growth of a microorganism within a defined period of time
is known as the MIC. The MIC is a guide for the clinician to the susceptibility of the organism to the
antimicrobial agent and aids treatment decisions. Careful control and standardization are required
for intra- and inter-laboratory reproducibility, as results can be influenced by the method used. It is
generally accepted that broth MIC tests are reproducible to within one doubling dilution of the true end
point (i.e. ±1 well or tube in a doubling dilution series).
Broth dilution is a technique in which containers holding identical volumes of broth with antimicrobial
agent solutions in incrementally (usually two-fold) increasing concentrations are inoculated with a
known number of microorganisms.
Broth micro-dilution denotes the performance of the broth dilution test in micro-dilution trays.
The reference methods described in this document are intended for the testing of pure cultures of yeast
fungi. The broth micro-dilution methods described in this document are the same as those described
[1][5]
by the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) and by the European Committee on
[2][10]
Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) . These methods were initially shown to provide
[3]
MICs of fluconazole that were similar, if not identical up to 2 mg/l . Further the methods have been
shown to provide MICs for two quality control strains of licensed antifungal agents that are similar
as described in this document although quality control results for the spectrophotometer can trend
slightly lower than for the visual reading method. The laboratory that wishes to use this document
for conducting studies of newer antifungal agents, or as a reference method for comparison to MICs
generated by a diagnostic device, can select which of the procedure options to use based upon the choice
[5]
of MIC reading determined by visual inspection (CLSI method) or by use of a spectrophotometer
[2][10]
(EUCAST method) . In either case, the procedural details for that option should be followed
explicitly. In the first edition of this document, i.e. ISO 16256:2012, the reported quality control
tests were performed using broth micro-dilution trays that were not treated in some way by the
manufacturers of the plastic trays for either the visual or spectrophotometer method.
In this document the following verbal forms are used:
— “shall” indicates a requirement;
— “should” indicates a recommendation;
— ”may” indicates a permission;
— “can” indicates a possibility or a capability.
vi
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 16256:2021(E)
Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test
systems — Broth micro-dilution reference method for
testing the in vitro activity of antimicrobial agents against
yeast fungi involved in infectious diseases
WARNING — The use of this document can involve hazardous materials, operations and
equipment. This document does not purport to address all of the safety problems associated
with its use. It is the responsibility of the user of this document to establish appropriate safety
and health practices and determine the applicability of regulatory limitations prior to use.
1 Scope
This document describes a method for testing the susceptibility to antifungal agents of yeasts, including
Candida spp. and Cryptococcus neoformans, that cause infections. The reference method described here
has not been used in studies of the yeast forms of dimorphic fungi, such as Blastomyces dermatitidis
and/or Histoplasma capsulatum variety capsulatum. Moreover, testing filamentous fungi (moulds)
introduces several additional problems in standardization not addressed by the current procedure.
Those methods are beyond the scope of this document.
This document describes the broth micro-dilution reference method, which can be implemented by
[1][5]
either of two pathways. One pathway involves visual determination of MICs (CLSI method) ; the
[2][10]
second pathway involves spectrophotometric determination of MICs (EUCAST method) . The MIC
reflects the activity of the drug under the described test conditions and can be interpreted for clinical
management purposes by taking into account other factors, such as drug pharmacology or antifungal
resistance mechanisms. In addition, MIC distributions can be used to define wild type or non-wild
type fungal populations. Clinical interpretation of the MIC value is beyond the scope of this document;
interpretive category breakpoints specific to the CLSI- and EUCAST-derived methods can be found by
[5][15]
consulting the latest interpretive tables provided by the organizations . Routine susceptibility
testing methods or diagnostic test devices can be compared with this reference method in order to
ensure comparable and reliable results for validation or registration purposes.
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
antifungal agent
substance of biological, semi-synthetic or synthetic origin that inhibits the growth of or kills fungi, and
is thus of potential use in the treatment of infections
Note 1 to entry: Disinfectants, antiseptics and preservatives are not included in this definition.
3.2 Antifungal agents — properties
1
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3.2.1
potency
active fraction of a test substance, determined in a bioassay against a reference powder of the same
substance
Note 1 to entry: The potency is expressed as mass fraction in milligrams per gram (mg/g), or as activity content
in International Units (IU) per gram, or as a volume fraction or mass fraction in percent, or as an amount-of-
substance concentration (mass fraction) in mole per litre of ingredients in the test substance.
3.2.2
concentration
amount of an antifungal agent (3.1) in a specified volume of liquid
Note 1 to entry: The concentration is expressed as mg/l.
Note 2 to entry: mg/l = µg/ml but use of the unit µg/ml is not recommended.
3.3
stock solution
initial solution used for further dilutions
3.4
minimum inhibitory concentration
MIC
lowest concentration (3.2.2) that, under specified in vitro test conditions, reduces growth by an agreed
amount within a specified period of time
Note 1 to entry: The MIC is expressed in mg/l.
3.5
wild type
absence of phenotypically-detectable acquired resistance mechanisms to the antifungal agent (3.1) in a
given fungal strain
3.6
reference strain
catalogued, well-characterized fungal strain with stable, specified antifungal susceptibility phenotypes
and/or genotypes
Note 1 to entry: Reference strains are kept as stock cultures, from which working cultures are derived. They are
obtainable from culture collections and used for quality control.
3.7 Susceptibility testing method
3.7.1
broth dilution
technique in which containers are filled with appropriate volumes of an antifungal solution, employing
incrementally (usually two-fold) increasing concentrations (3.2.2) of the antifungal agent (3.1) and
appropriate volumes of broth (3.8) with a specified inoculum (3.9)
Note 1 to entry: The aim of this method is the determination of the minimum inhibitory concentration (3.4).
3.7.2
broth micro-dilution
performance of broth dilution (3.7.1) in micro-dilution trays with a capacity of ≤300 µl per well
3.8
broth
fluid medium used for the in vitro growth of yeast fungi
2
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3.9
inoculum
number of colony-forming units of yeast in a suspension, calculated with respect to the final volume
Note 1 to entry: The inoculum is expressed as colony-forming units per millilitre (CFU/ml).
4 Test procedures
4.1 General
4.1.1 Trays and method
The tests are performed in plastic disposable micro-dilution trays. The method is based on the
preparation of double strength antifungal agent working solutions in 100 µl volumes per well with the
addition of an inoculum also in a volume of 100 µl.
4.1.2 Conditions for use of disposable micro-dilution trays
The tests were originally performed in broth micro-dilution trays that have had no additional
treatment by the manufacturer. Quality control data by manufacturers of untreated trays (and on
which this document was originally based) have shown that quality control results are consistently
in specification for all antifungal agents tested. In some jurisdictions there has been a suggestion that
results can be more consistent using treatment of the plastic trays. Treatment of the plastic, either
by coating or corona discharge to impart an electrical charge to the plastic, is used in tissue culture
studies and allows the tissue cells to adhere to the plastic. It is unknown if this process has been
standardized for all micro-dilution tray manufacturers. It is known that with some antifungal agents
the treated trays can result in elevated MICs compared to untreated trays. Such treatment can affect
[13]
the reporting of results for those agents . Those laboratories that use “treated” micro-dilution trays
and read by spectrophotometer should ensure that the treated trays being utilized in testing provide
the same quality control results as those indicated in Table 5. Those quality control ranges were
originally performed with untreated trays. The data indicates that for almost all antifungal agents,
the quality control ranges for the two standard strains listed in this document (Candida parapsilosis
1)
ATCC® 22019 and Candida krusei ATCC® 6258) are the within one log2 dilution for both testing/
reading methods. Comparative quality control ranges for those strains for the spectrophotometer
[10] [2]
method are the same as originally reported using untreated trays and for treated trays , with the
exception of caspofungin (see Table 5). Comparative MIC observations for clinical isolates provided
[5] [2]
by the visual reading method and those spectrophotometer readings using treated plates for both
testing methods should be interpreted with caution.
4.2 Medium
4.2.1 General
RPMI-1640 broth shall be used (see Table A.1 and Table A.2 for details for preparation of the two
complete product versions of RPMI-1640 glucose broth) for both reading methods.
4.2.2 Visual reading pathway
The RPMI-1640 medium should contain 0,2 % glucose. The RPMI-1640 broth is prepared and dispensed
at single strength with double strength antifungal agent dilutions and the inoculum is delivered in
equal volumes of RPMI-1640 broth containing the adjusted yeast inoculum suspension.
1) ATCC is the registered trademark of a product supplied by the American Type Culture Collection. This information
is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product
named. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
3
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4.2.3 Spectrophotometric reading pathway
The RPMI-1640 medium should contain 2,0 % glucose. The RPMI-1640 broth and antifungal agents are
both prepared at double strength with the inoculum subsequently added in an equal volume of sterile
distilled water.
4.3 Antifungal agents
4.3.1 General
Antifungal agents shall be obtained directly from the manufacturer or from reliable commercial
sources; pharmaceutical preparations for clinical use are not acceptable. The antifungal agents shall
be supplied with a lot number, potency, an expiry date and details of recommended storage conditions.
Substances shall be stored in tightly closed containers in the dark, at −20 °C, with a desiccant unless
otherwise recommended by the manufacturer. Hygroscopic agents should be dispensed into aliquots,
one of which is used on each test occasion.
Allow containers to warm to room temperature before opening them in order to avoid condensation
and loss of potency.
4.3.2 Preparation of stock solutions
The use of a calibrated analytical balance is required for weighing antifungal agents. Allowance for the
potency of the powder shall be made by use of Formulae (1) and (2) to obtain the amount of antifungal
agent substance or the volume of diluent needed for a standard solution:
V×ρ
m= (1)
P
mP×
V = (2)
ρ
where
ρ is the concentration of the stock solution, in mg/l;
m is mass of the antifungal agent (powder), in g;
P is the potency of the antifungal agent (powder), in mg/g;
V is the volume of diluent, in l.
Concentrations of stock solutions should be 1 000 mg/l or greater, although the solubility of some agents
is a limiting factor. The actual concentrations of stock solutions depend on the method of preparing
working solutions (serial dilutions). Some agents require alternative solvents (see Table 1). Sterilization
of solutions is not usually necessary. If required, sterilization should be done by membrane filtration
and samples before and after sterilization should be compared by assay to ensure that adsorption has
not occurred.
Unless information is available on stability of stock solutions under specified storage conditions, they
should be prepared fresh for each test batch.
4
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Table 1 — Solvents and diluents for preparation of stock solutions of antifungal agents
Antifungal agent Solvent Diluent
(Full strength and intermediate solutions)
a
Amphotericin B DMSO Medium
a
Anidulafungin DMSO Medium
a
Caspofungin DMSO Medium
a
Flucytosine DMSO Medium
a
Fluconazole DMSO Medium
a
Isavuconazole DMSO Medium
a
Itraconazole DMSO Medium
a
Ketoconazole DMSO Medium
a
Micafungin DMSO Medium
a
Posaconazole DMSO Medium
a
Ravuconazole DMSO Medium
a
Rezafungin DMSO Medium
a
Voriconazole DMSO Medium
a
DMSO (dimethyl sulfoxide) is potentially toxic.
4.3.3 Preparation of working solutions
The interval of concentrations selected for testing depends on the organisms and antifungal agent. The
chosen range shall allow full end point MIC determination for appropriate reference strains. A two-fold
dilution series based on 1 mg/l is prepared in RPMI-1640 glucose broth. The procedure outlined in
Tables 2 and 3 are known to reliably produce a satisfactory dilution series and should be followed unless
an alternative method is carefully validated. For example, it has been reported that serial dilutions of
[6]
the more hydrophilic compounds can produce acceptable results . Working solutions shall be used
the same day unless information is available from the manufacturer on stability of the solutions under
specified storage conditions.
Table 2 — Scheme for preparing dilutions of water-soluble antifungal agents used in broth
dilution susceptibility tests
Antifungal solution
Step Concentration Source Volume + Medium = Intermediate = Final Log
2
Concentration Concentration
at 1:10
mg/l ml ml mg/l mg/l
1 5 120 Stock 1,0 3,0 1 280 128 7
2 5 120 Stock 1,0 7,0 640 64 6
3 640 Step 2 1,0 1,0 320 32 5
4 640 Step 2 1,0 3,0 160 16 4
5 160 Step 4 1,0 1,0 80 8 3
6 160 Step 4 0,5 1,5 40 4 2
7 160 Step 4 0,5 3,5 20 2 1
8 20 Step 7 1,0 1,0 10 1 0
9 20 Step 7 0,5 1,5 5 0,5 -1
10 20 Step 7 0,5 3,5 2,5 0,25 -2
11 2,5 Step 10 1,0 1,0 1,25 0,125 -3
12 2,5 Step 10 0,5 1,5 0,625 0,062 5 -4
13 2,5 Step 10 0,5 3,5 0,312 5 0,031 25 -5
5
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Table 3 — Scheme for preparing dilutions series of water-insoluble
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 16256
Deuxième édition
2021-10
Laboratoires d’analyses de biologie
médicale et systèmes de diagnostic
in vitro — Méthode de référence de
microdilution en milieu liquide pour
soumettre à essai l’activité in vitro des
agents antimicrobiens par rapport aux
levures impliquées dans les maladies
infectieuses
Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems —
Broth micro-dilution reference method for testing the in vitro activity
of antimicrobial agents against yeast fungi involved in infectious
diseases
Numéro de référence
ISO 16256:2021(F)
© ISO 2021
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ISO 16256:2021(F)
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Web: www.iso.org
Publié en Suisse
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ISO 16256:2021(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction . vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions . 1
4 Modes opératoires d’essai .3
4.1 Généralités . 3
4.1.1 Plaques et méthode . 3
4.1.2 Conditions d’utilisation des plaques de microdilution jetables . 3
4.2 Milieu . . 4
4.2.1 Généralités . 4
4.2.2 Lecture visuelle . 4
4.2.3 Lecture spectrophotométrique . 4
4.3 Agents antifongiques . 4
4.3.1 Généralités . 4
4.3.2 Préparation des solutions mères . 4
4.3.3 Préparation des solutions de travail. 5
4.4 Préparation des plaques de microdilution en milieu liquide . 6
4.4.1 Préparation pour les essais à lecture visuelle – Lecture visuelle . 6
4.4.2 Préparation pour les essais à lecture spectrophotométrique – Lecture
spectrophotométrique . 7
4.5 Stockage des plaques de microdilution . 7
4.6 Préparation de l’inoculum . 7
4.6.1 Généralités . 7
4.6.2 Préparation de l’inoculum pour des essais à lecture visuelle . 7
4.6.3 Préparation de l’inoculum pour des essais à lecture spectrophotométrique . 8
4.7 Inoculation des plaques de microdilution . 8
4.8 Incubation des plaques de microdilution . . 8
4.8.1 Généralités . 8
4.8.2 Lecture visuelle . 8
4.8.3 Lecture spectrophotométrique . 9
4.9 Lecture des résultats de CMI . 9
4.9.1 Généralités . 9
4.9.2 Méthode de lecture visuelle . 9
4.9.3 Méthode de lecture spectrophotométrique . 9
4.10 Interprétation des CMI . 9
5 Contrôle qualité (CQ) .9
Annexe A (informative) Milieu RPMI-1640 .13
Annexe B (informative) Étalon de turbidité de 0,5 McFarland au sulfate de baryum .15
Bibliographie .16
iii
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ISO 16256:2021(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a
été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 212, Laboratoires de biologie médicale
et systèmes de diagnostic in vitro, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 140, Dispositifs
médicaux de diagnostic in vitro, du Comité européen de normalisation (CEN) conformément à l’Accord de
coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 16256:2012), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
Les principales modifications sont les suivantes:
— dans le titre, ajout de «microdilution en milieu liquide»;
— suppression de la lecture à 48 h pour l’espèce Candida par la méthode de lecture visuelle;
— suppression des définitions de sensibilité et de résistance qui sont en dehors du domaine d’application
du présent document relatif au déroulement des essais;
— inclusion de considérations relatives aux essais de sensibilité aux agents antifongiques d’espèces de
levure, avec des plaques de microdilution «traitées» par des fabricants de plaques avant utilisation
dans les essais;
— mise à jour des méthodes de dénombrement de cellules viables pour les méthodes de lecture visuelle
et spectrophotométrique;
— ajout de nouveaux agents antifongiques (isavuconazole, rezafungine) dans les tableaux répertoriant
les plages pour les essais et le contrôle qualité;
iv
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ISO 16256:2021(F)
— caractérisation détaillée des composés d’une formulation de RPMI-1640 connue pour donner des
résultats reproductibles aux essais de sensibilité aux agents antifongiques des espèces de Candida
et de Cryptococcus neoformans;
— réassignation des annexes;
— mise à jour de la bibliographie avec des informations plus pertinentes sur le déroulement des essais
de sensibilité aux agents antifongiques des levures.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
v
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ISO 16256:2021(F)
Introduction
Les essais de sensibilité in vitro sont réalisés sur des micro-organismes soupçonnés d’être pathogènes,
particulièrement s’ils sont supposés appartenir à des espèces pouvant avoir développé une résistance à
des agents antimicrobiens courants. Ces essais sont également utilisés dans le cadre de la surveillance
de résistance, des études épidémiologiques de sensibilité, ainsi que pour comparer les nouveaux agents
avec ceux existants.
La détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI) des agents antimicrobiens se fait via
des modes opératoires de dilution qui constituent la méthode de référence pour les essais de sensibilité
aux agents antifongiques. Les méthodes de détermination de CMI servent à surveiller la résistance,
aux essais comparatifs de nouveaux agents à des fins de recherche ou d’enregistrement, à établir la
sensibilité des organismes produisant des résultats ambigus lors d’essais de routine, aux essais sur
les organismes lorsque les essais de routine sont peu fiables et à obtenir des résultats quantitatifs
nécessaires à un traitement clinique. Dans des essais par dilution, on éprouve la capacité des micro-
organismes à se développer de façon discernable sur une série de boîtes de gélose (dilution en milieu
solide) ou de bouillons de culture (dilution en milieu liquide) renfermant des dilutions consécutives
d’agents antimicrobiens.
La CMI est définie comme la plus faible concentration d’un agent antimicrobien (en mg/l) qui, dans
des conditions d’essai in vitro données, réduit de façon mesurable visuellement ou optiquement, la
croissance d’un micro-organisme sur une durée donnée. La CMI est un indicateur de la sensibilité de
l’organisme à l’agent antimicrobien et aide à la prise de décision de traitement clinique. Les résultats
pouvant être influencés par la méthode utilisée, un contrôle et une normalisation soigneux sont
nécessaires pour maintenir une reproductibilité intra- et interlaboratoires. Il est généralement reconnu
que les déterminations de CMI en milieu liquide sont reproductibles jusqu’à une dilution au demi de la
concentration critique (c’est-à-dire à plus ou moins une cupule ou un tube dans une série de dilutions
au demi).
La dilution en milieu liquide est une technique dans laquelle des contenants renfermant des volumes
identiques de solutions d’agent antimicrobien aux concentrations croissantes (généralement au demi)
sont ensemencés d’une quantité connue de micro-organismes.
La microdilution en milieu liquide correspond à un essai de dilution en milieu liquide sur une plaque de
microdilution.
Les méthodes de référence décrites dans le présent document sont destinées aux essais sur des cultures
pures de levures. Les méthodes de microdilution en milieu liquide décrites dans le présent document
sont essentiellement identiques à celles décrites par le Clinical et Laboratory Standards Institute
[1][5] [2][10]
(CLSI) et par le Comité européen des antibiogrammes (EUCAST) . Au départ, ces méthodes
[3]
se sont révélées présenter des CMI du fluconazole similaires, si ce n’est identiques, à 2 mg/l près .
Ensuite, les méthodes se sont avérées présenter des CMI pour deux souches de contrôle qualité d’agents
antifongiques autorisés qui étaient similaires à celles décrites dans le présent document, même si les
résultats du contrôle qualité obtenus pour la méthode spectrophotométrique peuvent avoir tendance
à être légèrement inférieurs à ceux obtenus pour la méthode de lecture visuelle. Le laboratoire qui
souhaiterait utiliser le présent document pour des études sur de nouveaux agents antifongiques
ou comme méthode de référence pour des comparaisons avec des CMI obtenues par un dispositif de
diagnostic, peut choisir les options du mode opératoire à employer en fonction du mode de lecture de la
[5]
CMI, selon qu’elle se fasse par inspection visuelle (méthode CLSI) ou par spectrophotométrie (méthode
[2][10]
EUCAST) . Quel que soit son choix, il convient de respecter scrupuleusement le mode opératoire de
l’option choisie. Dans la première édition du présent document, c’est-à-dire l’ISO 16256:2012, les essais
de contrôle qualité rapportés ont été effectués en utilisant des plaques de microdilution en milieu
liquide non traitées par les fabricants de plaques en plastique, que ce soit pour la méthode de lecture
visuelle ou pour la méthode spectrophotométrique.
Dans le présent document, les formes verbales suivantes sont utilisées:
— «doit» indique une exigence;
vi
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ISO 16256:2021(F)
— «il convient de/que» indique une recommandation;
— «peut/il est admis/permis» indique une autorisation;
— «peut/il est possible que» indique une possibilité ou une capacité.
vii
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NORME INTERNATIONALE ISO 16256:2021(F)
Laboratoires d’analyses de biologie médicale et systèmes
de diagnostic in vitro — Méthode de référence de
microdilution en milieu liquide pour soumettre à essai
l’activité in vitro des agents antimicrobiens par rapport
aux levures impliquées dans les maladies infectieuses
AVERTISSEMENT — Le présent document peut impliquer l’utilisation de produits dangereux
et la mise en œuvre de modes opératoires et d’appareillage à caractère dangereux. Le présent
document n’est pas destiné à traiter de tous les problèmes de sécurité liés à son utilisation. Il
incombe à l’utilisateur du présent document d’établir, avant de l’utiliser, des pratiques d’hygiène
et de sécurité appropriées et de déterminer l’applicabilité des restrictions réglementaires.
1 Domaine d’application
Le présent document décrit une méthode d’essai de la sensibilité aux agents antifongiques des
levures pathogènes, dont Candida spp. et Cryptococcus neoformans. La méthode de référence décrite
ici n’a pas été utilisée dans des études sur les phases levures de champignons dimorphes tels que
Blastomyces dermatitidis et/ou Histoplasma capsulatum variété capsulatum. En outre, les essais sur les
champignons filamenteux (moisissures) posent d’autres problèmes de normalisation qui ne sont pas
traités par le présent mode opératoire. Ces méthodes vont au-delà du domaine d’application du présent
document.
Le présent document décrit la méthode de référence de microdilution en milieu liquide qui peut être
[1]
réalisée de deux façons. La première implique une détermination visuelle de la CMI (méthode CLSI)
[5] [2][10]
; la seconde implique une détermination spectrophotométrique de la CMI (méthode EUCAST) . La
CMI reflète l’activité de l’agent antimicrobien dans les conditions d’essai décrites et peut, avec d’autres
facteurs tels que la pharmacologie de l’agent ou les mécanismes de résistance antifongique, servir dans
la prise de décision de traitement clinique. Par ailleurs, les CMI peuvent servir à définir les populations
en types sauvage ou non sauvage. L’interprétation clinique de la CMI sort du domaine d’application du
présent document. Des critères d’interprétation catégoriels spécifiques aux méthodes du CLSI et de
[5][15]
l’EUCAST sont donnés dans les derniers tableaux d’interprétation édités par ces organismes . Dans
le cadre d’une validation ou d’un enregistrement, les méthodes d’essai de sensibilité de routine ou les
dispositifs de diagnostic peuvent être comparés avec la présente méthode de référence, afin de garantir
des résultats comparables et fiables.
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
1
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ISO 16256:2021(F)
3.1
agent antifongique
substance d’origine biologique, semi-synthétique ou synthétique qui inhibe la croissance des
champignons ou les tue et peut, par conséquent, servir au traitement des infections
Note 1 à l'article: Cette définition n’inclut pas les produits désinfectants, antiseptiques et conservateurs.
3.2 Agents antifongiques — Propriétés
3.2.1
teneur
fraction active d’une substance d’essai, déterminée par dosage par rapport à une poudre de référence
de la même substance
Note 1 à l'article: La teneur peut être exprimée par une fraction massique en milligrammes par grammes (mg/g),
par un contenu actif en unités internationales (UI) par gramme, par un pourcentage volumique ou massique ou
par une concentration massique en moles d’ingrédient par litre de la substance d’essai.
3.2.2
concentration
quantité d’agent antifongique (3.1) dans un volume spécifié de liquide
Note 1 à l'article: La concentration est exprimée en mg/l.
Note 2 à l'article: mg/l = µg/ml, mais l’emploi de l’unité µg/ml n’est pas recommandé.
3.3
solution mère
solution initiale servant aux dilutions
3.4
concentration minimale inhibitrice
CMI
concentration (3.2.2) la plus faible qui, dans des conditions d’essai in vitro spécifiées, réduit la croissance
dans une mesure donnée sur une période spécifiée
Note 1 à l'article: La CMI est exprimée en mg/l.
3.5
type sauvage
absence, chez une souche fongique donnée, de mécanisme acquis phénotypiquement détectable de
résistance à l’agent antifongique (3.1)
3.6
souche de référence
souche fongique répertoriée, bien connue, aux phénotypes et/ou génotypes de sensibilité antifongique
stables et spécifiés
Note 1 à l'article: Les souches de référence sont conservées sous forme de cultures mères desquelles sont
obtenues des cultures de travail. Elles proviennent de collections de cultures et servent au contrôle qualité.
3.7 Méthode d’essai de sensibilité
3.7.1
dilution en milieu liquide
technique selon laquelle des conteneurs sont remplis de volumes appropriés d’une solution antifongique
aux concentrations (3.2.2) croissantes (souvent d’un facteur de 2) en agent antifongique (3.1), puis
complétés de volumes adaptés de bouillon (3.8) contenant un inoculum (3.9) spécifié
Note 1 à l'article: Cette méthode a pour but de déterminer la concentration minimale inhibitrice (3.4).
2
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ISO 16256:2021(F)
3.7.2
microdilution en milieu liquide
réalisation d’une dilution en milieu liquide (3.7.1) dans des plaques de microdilution d’une capacité
≤300 µl par cupule
3.8
bouillon
milieu liquide employé pour cultiver les levures in vitro
3.9
inoculum
nombre d’unités formant colonie de levures dans une suspension, calculé par rapport au volume final
Note 1 à l'article: L’inoculum est exprimé en unités formant colonie par millilitre (UFC/ml).
4 Modes opératoires d’essai
4.1 Généralités
4.1.1 Plaques et méthode
Les essais sont réalisés dans des plaques de microdilution en plastique jetables. La méthode consiste à
préparer des solutions de travail d’agent antifongique doublement concentrées, à raison de 100 µl par
cupule, puis de leur ajouter un inoculum lui aussi de 100 µl.
4.1.2 Conditions d’utilisation des plaques de microdilution jetables
Au départ, les essais ont été effectués dans des plaques de microdilution en milieu liquide n’ayant subi
aucun traitement supplémentaire de la part du fabricant. Les données de contrôle qualité fournies
par les fabricants de plaques non traitées (et sur lesquelles le présent document reposait au départ)
ont montré que les résultats du contrôle qualité sont systématiquement dans la spécification de tous
les agents antifongiques soumis à essai. Certains pays ont avancé que les résultats peuvent être plus
cohérents en cas de traitement des plaques en plastique. Le traitement du plastique, que ce soit par
revêtement ou par décharge corona pour conférer une charge électrique au plastique, est utilisé dans
les études de culture tissulaire et permet aux cellules tissulaires d’adhérer au plastique. On ne sait
pas si ce procédé a été normalisé pour tous les fabricants de plaques de microdilution. On sait qu’avec
certains agents antifongiques, les plaques traitées peuvent donner des CMI élevées par rapport à celles
obtenues avec des plaques non traitées. Ce traitement peut affecter le compte-rendu des résultats pour
[13]
ces agents . Il convient que les laboratoires qui utilisent des plaques de microdilution «traitées» et
lues par un spectrophotomètre s’assurent que les plaques traitées utilisées lors des essais donnent les
mêmes résultats de contrôle qualité que celles indiquées dans le Tableau 5. Au départ, ces résultats
de contrôle qualité ont été obtenus avec des plaques non traitées. Les données indiquent que pour
pratiquement tous les agents antifongiques, les résultats de contrôle qualité pour les deux souches de
1)
référence énumérées dans le présent document (Candida parapsilosis ATCC® 22019 et Candida krusei
ATCC® 6258) sont conformes à la dilution de base log pour les méthodes d’essai/de lecture. Pour ces
2
souches et pour la méthode spectrophotométrique, les résultats comparatifs du contrôle qualité sont les
[10] [2]
mêmes que ceux consignés au départ en utilisant les plaques non traitées et les plaques traitées ,
à l’exception de la caspofungine (voir Tableau 5). Pour les isolats cliniques fournis par la méthode de
[5] [2]
lecture visuelle et par la méthode de lecture spectrophotométrique à l’aide de plaques traitées
pour les deux méthodes d’essai, il convient d’interpréter les observations comparatives de la CMI avec
prudence.
1) ATCC est l’appellation commerciale d’un produit fourni par l’American Type Culture Collection. Cette information
est donnée par souci de commodité à l'intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un
engagement de l'ISO à l’égard de ce produit. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils
conduisent aux mêmes résultats.
3
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ISO 16256:2021(F)
4.2 Milieu
4.2.1 Généralités
Le milieu à employer est un bouillon RPMI-1640 (voir Tableau A.1 et Tableau A.2 pour plus d’informations
sur la préparation des deux versions du produit complet du bouillon glucosé RPMI-1640) pour les deux
méthodes de lecture.
4.2.2 Lecture visuelle
Il convient que le milieu RPMI-1640 contienne 0,2 % de glucose. Le bouillon RPMI-1640 est préparé
simplement concentré, puis mélangé à des dilutions d’agent antifongique doublement concentrées
et l’inoculum est ajouté dans des volumes égaux de bouillon RPMI-1640 contenant la suspension de
levures renfermant l’inoculum.
4.2.3 Lecture spectrophotométrique
Il convient que le milieu RPMI-1640 contienne 2,0 % de glucose. Le bouillon RPMI-1640 et l’agent
antifongique sont tous deux préparés doublement concentrés et l’inoculum est ensuite ajouté dans un
volume égal d’eau distillée stérile.
4.3 Agents antifongiques
4.3.1 Généralités
Les agents antifongiques doivent être obtenus directement auprès de leur fabricant ou de sources
commerciales fiables. Les préparations pharmaceutiques pour usage clinique ne sont pas acceptables.
Les agents antifongiques doivent être fournis avec un numéro de lot, une teneur, une date de péremption
et des indications sur les conditions de stockage recommandées. Sans consigne particulière du
fabricant, les substances doivent être conservées dans des conteneurs hermétiques, à l’obscurité, à
–20 °C, avec un dessiccatif. Il convient que les agents hygroscopiques soient répartis en aliquotes, dont
un est utilisé à chaque essai.
Afin d’éviter toute condensation et perte de teneur, laisser les conteneurs se réchauffer à température
ambiante avant de les ouvrir.
4.3.2 Préparation des solutions mères
La pesée des agents antifongiques doit se faire au moyen d’une balance analytique étalonnée. En
fonction de la teneur en poudre, les Formules (1) et (2) donnent la quantité de substance antifongique
ou le volume de diluant nécessaire pour obtenir la solution mère:
V×ρ
m= (1)
P
mP×
V = (2)
ρ
où
ρ est la concentration de la solution mère, en mg/l;
m est la masse d’agent antifongique (poudre), en g;
P est la teneur en agent antifongique (poudre), en mg/g;
V est le volume de diluant, en l.
4
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ISO 16256:2021(F)
Bien que la solubilité de certains agents soit un facteur limitant, il convient que la concentration des
solutions mères soit de 1 00
...
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16256
Second edition
Clinical laboratory testing and in
vitro diagnostic test systems — Broth
micro-dilution reference method
for testing the in vitro activity of
antimicrobial agents against yeast
fungi involved in infectious diseases
Laboratoires d’analyses de biologie médicale et systèmes de
diagnostic in vitro — Méthode de référence de microdilution en
milieu liquide pour soumettre à essai l’activité in vitro des agents
antimicrobiens par rapport aux levures impliquées dans les maladies
infectieuses
PROOF/ÉPREUVE
Reference number
ISO 16256:2021(E)
©
ISO 2021
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ISO 16256:2021(E)
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be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting
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Published in Switzerland
ii PROOF/ÉPREUVE © ISO 2021 – All rights reserved
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ISO 16256:2021(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Test procedures . 3
4.1 General . 3
4.1.1 Trays and method . 3
4.1.2 Conditions for use of disposable micro-dilution trays . 3
4.2 Medium . 3
4.2.1 General. 3
4.2.2 Visual reading pathway . 3
4.2.3 Spectrophotometric reading pathway. 4
4.3 Antifungal agents . 4
4.3.1 General. 4
4.3.2 Preparation of stock solutions . 4
4.3.3 Preparation of working solutions . 5
4.4 Preparation of broth micro-dilution trays . 6
4.4.1 Preparation for tests read visually – Visual reading pathway . 6
4.4.2 Preparation for tests read by spectrophotometer - Spectrophometric
reading pathway . 6
4.5 Storage of microdilution trays . 6
4.6 Preparation of inoculum . 7
4.6.1 General. 7
4.6.2 Preparation of inoculum for visual test reading . 7
4.6.3 Preparation of inoculum for spectrophotometric test reading . 7
4.7 Inoculation of micro-dilution trays . 7
4.8 Incubation of micro-dilution trays . 8
4.8.1 General. 8
4.8.2 Visual pathway . 8
4.8.3 Spectrophotometric pathway . 8
4.9 Reading MIC results . 8
4.9.1 General. 8
4.9.2 Visual reading method . 8
4.9.3 Spectrophotometric reading methods . 8
4.10 Interpretation of MICs . 9
5 Quality Control (QC) . 9
Annex A (informative) RPMI-1640 medium .12
Annex B (informative) McFarland 0,5 barium sulfate turbidity standard .14
Bibliography .15
© ISO 2021 – All rights reserved PROOF/ÉPREUVE iii
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ISO 16256:2021(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www .iso .org/
iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 212, Clinical laboratory testing and in
vitro diagnostic test systems, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN)
Technical Committee CEN/TC 140, In vitro diagnostic medical devices, in accordance with the Agreement
on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 16256:2012), which has been technically
revised.
The main changes compared to the previous edition are as follows:
— addition of “broth micro-dilution” to the title;
— removal of 48 h reading for Candida species by the visual reading method;
— removal of definitions for susceptibility and resistance that are beyond the scope of this test
performance document;
— inclusion of considerations for antifungal testing of yeast species with micro-dilution trays “treated”
by manufacturers of the trays prior to use in the tests;
— updating of viable count testing methods for visual and spectrophotometer test pathways.
— addition of new antifungals (isavuconazole, rezafungin) to the testing and quality control range
tables;
— detailed characterization of the components of one formulation of RPMI-1640 known to provide
reproducible results of antifungal susceptibility tests for Candida species and Cryptococcus
neoformans;
— reassigning of annexes;
— update of bibliography to more relevant information about performance of antifungal susceptibility
testing for yeast fungi.
iv PROOF/ÉPREUVE © ISO 2021 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 16256:2021(E)
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
© ISO 2021 – All rights reserved PROOF/ÉPREUVE v
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 16256:2021(E)
Introduction
In vitro susceptibility tests are performed on microorganisms suspected of causing disease, particularly
if the organism is thought to belong to a species that can exhibit acquired resistance to frequently used
antimicrobial agents. The tests are also important in resistance surveillance, epidemiological studies of
susceptibility and in comparisons of new and existing agents.
Dilution procedures are used to determine the minimum inhibitory concentrations (MICs) of
antimicrobial agents and represent the reference method for antifungal susceptibility testing. MIC
methods are used in resistance surveillance, comparative testing of new agents for research or
registration purposes, to establish the susceptibility of organisms that give equivocal results in routine
tests, for tests with organisms where routine tests can be unreliable and when a quantitative result is
needed for clinical management. In dilution tests, microorganisms are tested for their ability to produce
discernible growth on a series of agar plates (agar dilution) or in broth (broth dilution) containing serial
dilutions of the antimicrobial agent.
The lowest concentration of an antimicrobial agent (in mg/l) that, under defined in vitro test conditions,
reduces visible or optically measurable growth of a microorganism within a defined period of time
is known as the MIC. The MIC is a guide for the clinician to the susceptibility of the organism to the
antimicrobial agent and aids treatment decisions. Careful control and standardization are required
for intra- and inter-laboratory reproducibility, as results can be influenced by the method used. It is
generally accepted that broth MIC tests are reproducible to within one doubling dilution of the true end
point (i.e. ±1 well or tube in a doubling dilution series).
Broth dilution is a technique in which containers holding identical volumes of broth with antimicrobial
agent solutions in incrementally (usually two-fold) increasing concentrations are inoculated with a
known number of microorganisms.
Broth micro-dilution denotes the performance of the broth dilution test in microdilution trays.
The reference methods described in this document are intended for the testing of pure cultures of yeast
fungi. The broth micro-dilution methods described in document are the same as those described by the
[1][5]
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) and by the European Committee on Antimicrobial
[2][10]
Susceptibility Testing (EUCAST) . These methods were initially shown to provide MICs of
[3]
fluconazole that were similar, if not identical up to 2 mg/l . Further the methods have been shown to
provide MICs for two quality control strains of licensed antifungal agents that are similar as described
in this document although quality control results for the spectrophotometer can trend slightly lower
than for the visual reading method. The laboratory that wishes to use this document for conducting
studies of newer antifungal agents, or as a reference method for comparison to MICs generated by a
diagnostic device, can select which of the procedure options to use based upon the choice of MIC reading
[5]
determined by visual inspection (CLSI method) or by use of a spectrophotometer (EUCAST method)
[2][10]
. In either case, the procedural details for that option should be followed explicitly. In the first
edition of this document, i.e. ISO 16256:2012, the reported quality control tests were performed using
broth micro-dilution trays that were not treated in some way by the manufacturers of the plastic trays
for either the visual or spectrophotometer method.
In this document the following verbal forms are used:
— “shall” indicates a requirement;
— “should” indicates a recommendation;
— ”may” indicates a permission;
— “can” indicates a possibility or a capability.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 16256:2021(E)
Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test
systems — Broth micro-dilution reference method for
testing the in vitro activity of antimicrobial agents against
yeast fungi involved in infectious diseases
WARNING — The use of this document can involve hazardous materials, operations and
equipment. This document does not purport to address all of the safety problems associated
with its use. It is the responsibility of the user of this document to establish appropriate safety
and health practices and determine the applicability of regulatory limitations prior to use.
1 Scope
This document describes a method for testing the susceptibility to antifungal agents of yeasts, including
Candida spp. and Cryptococcus neoformans, that cause infections. The reference method described here
has not been used in studies of the yeast forms of dimorphic fungi, such as Blastomyces dermatitidis
and/or Histoplasma capsulatum variety capsulatum. Moreover, testing filamentous fungi (moulds)
introduces several additional problems in standardization not addressed by the current procedure.
Those methods are beyond the scope of this document.
This document describes the broth micro-dilution reference method, which can be implemented by
[1][5]
either of two pathways. One pathway involves visual determination of MICs (CLSI method) ; the
[2][10]
second pathway involves spectrophotometric determination of MICs (EUCAST method) . The MIC
reflects the activity of the drug under the described test conditions and can be interpreted for clinical
management purposes by taking into account other factors, such as drug pharmacology or antifungal
resistance mechanisms. In addition, MIC distributions can be used to define wild type or non-wild
type fungal populations. Clinical interpretation of the MIC value is beyond the scope of this document;
interpretive category breakpoints specific to the CLSI- and EUCAST-derived methods can be found by
[5][15]
consulting the latest interpretive tables provided by the organizations . Routine susceptibility
testing methods or diagnostic test devices can be compared with this reference method in order to
ensure comparable and reliable results for validation or registration purposes.
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
3.1
antifungal agent
substance of biological, semi-synthetic or synthetic origin that inhibits the growth of or kills fungi, and
is thus of potential use in the treatment of infections
Note 1 to entry: Disinfectants, antiseptics and preservatives are not included in this definition.
3.2 Antifungal agents — properties
© ISO 2021 – All rights reserved PROOF/ÉPREUVE 1
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ISO 16256:2021(E)
3.2.1
potency
active fraction of a test substance, determined in a bioassay against a reference powder of the same
substance
Note 1 to entry: The potency is expressed as mass fraction in milligrams per gram (mg/g), or as activity content
in International Units (IU) per gram, or as a volume fraction or mass fraction in percent, or as an amount-of-
substance concentration (mass fraction) in mole per litre of ingredients in the test substance.
3.2.2
concentration
amount of an antifungal agent (3.1) in a specified volume of liquid
Note 1 to entry: The concentration is expressed as mg/l.
Note 2 to entry: mg/l = µg/ml but use of the unit µg/ml is not recommended.
3.3
stock solution
initial solution used for further dilutions
3.4
minimum inhibitory concentration
MIC
lowest concentration (3.2.2) that, under specified in vitro test conditions, reduces growth by an agreed
amount within a specified period of time
Note 1 to entry: The MIC is expressed in mg/l.
3.5
wild type
absence of phenotypically-detectable acquired resistance mechanisms to the antifungal agent (3.1) in a
given fungal strain
3.6
reference strain
catalogued, well-characterized fungal strain with stable, specified antifungal susceptibility phenotypes
and/or genotypes
Note 1 to entry: Reference strains are kept as stock cultures, from which working cultures are derived. They are
obtainable from culture collections and used for quality control.
3.7 Susceptibility testing method
3.7.1
broth dilution
technique in which containers are filled with appropriate volumes of an antifungal solution, employing
incrementally (usually two-fold) increasing concentrations (3.2.2) of the antifungal agent (3.1) and
appropriate volumes of broth (3.8) with a specified inoculum (3.9)
Note 1 to entry: The aim of this method is the determination of the minimum inhibitory concentration (3.4).
3.7.2
broth micro-dilution
performance of broth dilution (3.7.1) in micro-dilution trays with a capacity of ≤300 µl per well
3.8
broth
fluid medium used for the in vitro growth of yeast fungi
2 PROOF/ÉPREUVE © ISO 2021 – All rights reserved
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ISO 16256:2021(E)
3.9
inoculum
number of colony-forming units of yeast in a suspension, calculated with respect to the final volume
Note 1 to entry: The inoculum is expressed as colony-forming units per millilitre (CFU/ml).
4 Test procedures
4.1 General
4.1.1 Trays and method
The tests are performed in plastic disposable micro-dilution trays. The method is based on the
preparation of double strength antifungal agent working solutions in 100 µl volumes per well with the
addition of an inoculum also in a volume of 100 µl.
4.1.2 Conditions for use of disposable micro-dilution trays
The tests were originally performed in broth-microdilution trays that have had no additional treatment
by the manufacturer. Quality control data by manufacturers of untreated trays (and on which this
document was originally based) have shown that quality control results are consistently in specification
for all antifungal agents tested. In some jurisdictions there has been a suggestion that results can be
more consistent using treatment of the plastic trays. Treatment of the plastic, either by coating or corona
discharge to impart an electrical charge to the plastic, is used in tissue culture studies and allows the
tissue cells to adhere to the plastic. It is unknown if this process has been standardized for all micro-
dilution tray manufacturers. It is known that with some antifungal agents the treated trays can result in
elevated MICs compared to untreated trays. Such treatment can affect the reporting of results for those
[13]
agents . Those laboratories that use “treated” microdilution trays and read by spectrophotometer
should ensure that the treated trays being utilized in testing provide the same quality control results
as those indicated in Table 5. Those quality control ranges were originally performed with untreated
trays. The data indicates that for almost all antifungal agents, the quality control ranges for the two
1)
standard strains listed in this document (Candida parapsilosis ATCC® 22019 and Candida krusei
ATCC® 6258) are the within one log2 dilution for both testing/reading methods. Comparative quality
control ranges for those strains for the spectrophotometer method are the same as originally reported
[10] [2]
using untreated tray and for treated trays , with the exception of caspofungin (see Table 5).
[5]
Comparative MIC observations for clinical isolates provided by the visual reading method and those
[2]
spectrophotometer readings using treated plate for both testing methods should be interpreted with
caution.
4.2 Medium
4.2.1 General
RPMI-1640 broth shall be used (see Table A.2 for details for preparation of the two complete product
versions of RPMI-1640 glucose broth) for both reading methods.
4.2.2 Visual reading pathway
The RPMI-1640 medium should contain 0,2 % glucose. The RPMI-1640 broth is prepared and dispensed
at single strength with double strength antifungal agent dilutions and the inoculum is delivered in
equal volumes of RPMI-1640 broth containing the adjusted yeast inoculum suspension.
1) ATCC is the registered trademark of a product supplied by the American Type Culture Collection. This information
is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product
named. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
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ISO 16256:2021(E)
4.2.3 Spectrophotometric reading pathway
The RPMI-1640 medium should contain 2,0 % glucose. The RPMI-1640 broth and antifungal agents are
both prepared at double strength with the inoculum subsequently added in an equal volume of sterile
distilled water.
4.3 Antifungal agents
4.3.1 General
Antifungal agents shall be obtained directly from the manufacturer or from reliable commercial
sources; pharmaceutical preparations for clinical use are not acceptable. The antifungal agents shall
be supplied with a lot number, potency, an expiry date and details of recommended storage conditions.
Substances shall be stored in tightly closed containers in the dark, at −20 °C, with a desiccant unless
otherwise recommended by the manufacturer. Hygroscopic agents should be dispensed into aliquots,
one of which is used on each test occasion.
Allow containers to warm to room temperature before opening them in order to avoid condensation
and loss of potency.
4.3.2 Preparation of stock solutions
The use of a calibrated analytical balance is required for weighing antifungal agents. Allowance for the
potency of the powder shall be made by use of Formulae (1) and (2) to obtain the amount of antifungal
agent substance or the volume of diluent needed for a standard solution:
V×ρ
m= (1)
P
mP×
V = (2)
ρ
where
ρ is the concentration of the stock solution, in mg/l;
m is mass of the antifungal agent (powder), in g;
P is the potency of the antifungal agent (powder), in mg/g;
V is the volume of diluent, in l.
Concentrations of stock solutions should be 1 000 mg/l or greater, although the solubility of some agents
is a limiting factor. The actual concentrations of stock solutions depend on the method of preparing
working solutions (serial dilutions). Some agents require alternative solvents (see Table 1). Sterilization
of solutions is not usually necessary. If required, sterilization should be done by membrane filtration
and samples before and after sterilization should be compared by assay to ensure that adsorption has
not occurred.
Unless information is available on stability of stock solutions under specified storage conditions, they
should be prepared fresh for each test batch.
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ISO 16256:2021(E)
Table 1 — Solvents and diluents for preparation of stock solutions of antifungal agents
Antifungal agent Solvent Diluent
(Full strength and intermediate solutions)
a
Amphotericin B DMSO Medium
a
Anidulafungin DMSO Medium
a
Caspofungin DMSO Medium
a
Flucytosine DMSO Medium
a
Fluconazole DMSO Medium
a
Isavuconazole DMSO Medium
a
Itraconazole DMSO Medium
a
Ketoconazole DMSO Medium
a
Micafungin DMSO Medium
a
Posaconazole DMSO Medium
a
Ravuconazole DMSO Medium
a
Rezafungin DMSO Medium
a
Voriconazole DMSO Medium
a
DMSO (dimethyl sulfoxide) is potentially toxic.
4.3.3 Preparation of working solutions
The interval of concentrations selected for testing depends on the organisms and antifungal agent. The
chosen range shall allow full end point MIC determination for appropriate reference strains. A two-fold
dilution series based on 1 mg/l is prepared in RPMI-1640 glucose broth. The procedure outlined in
Tables 2 and 3 are known to reliably produce a satisfactory dilution series and should be followed unless
an alternative method is carefully validated. For example, it has been reported that serial dilutions of
[6]
the more hydrophilic compounds can produce acceptable results . Working solutions shall be used
the same day unless information is available from the manufacturer on stability of the solutions under
specified storage conditions.
Table 2 — Scheme for preparing dilutions of water-soluble antifungal agents used in broth
dilution susceptibility tests
Antifungal solution
Step Concentration Source Volume + Medium = Intermediate = Final Log
2
Concentration Concentration
at 1:10
mg/l ml ml mg/l mg/l
1 5 120 Stock 1,0 3,0 1 280 128 7
2 5 120 Stock 1,0 7,0 640 64 6
3 640 Step 2 1,0 1,0 320 32 5
4 640 Step 2 1,0 3,0 160 16 4
5 160 Step 4 1,0 1,0 80 8 3
6 160 Step 4 0,5 1,5 40 4 2
7 160 Step 4 0,5 3,5 20 2 1
8 20 Step 7 1,0 1,0 10 1 0
9 20 Step 7 0,5 1,5 5 0,5 -1
10 20 Step 7 0,5 3,5 2,5 0,25 -2
11 2,5 Step 10 1,0 1,0 1,25 0,125 -3
12 2,5 Step 10 0,5 1,5 0,625 0,062 5 -4
13 2,5 Step 10 0,5 3,5 0,312 5 0,031 25 -5
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...
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