SIST EN ISO 18743:2015
(Main)Microbiology of the food chain - Detection of Trichinella larvae in meat by artificial digestion method (ISO 18743:2015)
Microbiology of the food chain - Detection of Trichinella larvae in meat by artificial digestion method (ISO 18743:2015)
This International Standard specifies a method that is applicable for the detection of Trichinella spp. muscle stage larvae in meat of individual animal carcasses intended for human consumption. It is applicable for the examination of meat from domestic and sylvatic animal species which can be infected by nematodes of the genus Trichinella. This method does not allow the determination of the species or genotype of detected parasites; identification can be made by molecular methods.
Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln - Nachweis von Trichinellenlarven aus Fleischproben - Physikalisches Verdauungsverfahren (ISO 18743:2015)
In der vorliegenden Internationalen Norm wird ein Verfahren festgelegt, das zum Nachweis von Larven von Trichinella spp. in der Muskelphase (Muskellarven) im Fleisch von einzelnen Schlachttierkörpern, die für den menschlichen Verzehr bestimmt sind, angewendet werden kann. Es ist anwendbar zur Untersuchung von Fleisch von Haus- und Wildtierarten (aus dem domestischen und silvatischen Zyklus), die mit Nematoden der Gattung Trichinella infiziert sein können.
Dieses Verfahren ermöglicht keine Bestimmung der Art oder des Genotyps der nachgewiesenen Parasiten; eine Identifizierung kann mit molekularen Verfahren erfolgen.
Das in dieser Internationalen Norm beschriebene Verfahren ist in Verbindung mit den Leitlinien im OIE-Diagnosehandbuch und von der ICT zur Untersuchung auf Trichinella und zur Kontrolle von Schlachttierkörpern, die für den menschlichen Verzehr bestimmt sind, anzuwenden, sofern nicht auf andere Weise nachgewiesen wurde, dass das Tier kein Risiko bezüglich einer Trichinella-Exposition darstellte.
Das Magnetrührverfahren für die künstliche Verdauung wird als „Goldstandard“ (Maßstab) angesehen, weil in Validierungsstudien nachgewiesen wurde, dass es zu den zuverlässigsten Ergebnissen führt.
Vorausgesetzt, dass die Gleichwertigkeit mit dem in dieser Internationalen Norm beschriebenen Verfahren dokumentiert werden kann, dürfen alternative Verfahren zur Analyse angewendet werden.
Microbiologie de la chaîne alimentaire - Recherche des larves de Trichinella dans la viande par une méthode de digestion artificielle (ISO 18743:2015)
ISO 18743:2015 décrit une méthode de détection de larves musculaires de Trichinella spp. dans la viande provenant de carcasses individuelles d'animaux destinées à la consommation humaine. Elle est applicable à l'examen de viande d'espèces animales domestiques et sauvages qui peuvent être infectées par des nématodes du genre Trichinella.
Cette méthode ne permet pas d'identifier l'espèce ou le génotype des parasites détectés; l'identification de l'espèce ou du génotype peut être réalisée à l'aide de méthodes moléculaires.
La méthode décrite dans la présente Norme internationale est destinée à être utilisée en association avec les lignes directrices du Manuel des tests de diagnostic et des vaccins de l'OIE et celles émises par la Commission internationale sur la trichinellose (ICT) pour la recherche de Trichinella et l'inspection de carcasses destinées à la consommation humaine, sauf s'il a été prouvé par d'autres moyens que l'animal ne risquait pas d'avoir été exposé à Trichinella.
La méthode de digestion artificielle utilisant un agitateur magnétique est considérée comme la méthode normalisée puisqu'il a été démontré, lors d'études de validation, qu'elle donne les résultats les plus fiables.
NOTE Si l'équivalence avec la méthode décrite dans la présente Norme internationale peut être documentée, d'autres méthodes peuvent être utilisées pour l'analyse.
Mikrobiologija v prehranski verigi - Ugotavljanje prisotnosti ličink Trichinella v mesu z digestivno metodo (ISO 18743:2015)
Ta mednarodni standard določa metodo, ki se uporablja za ugotavljanje prisotnosti ličink Trichinella v mesu posameznih živalskih trupel, namenjenih za prehrano ljudi. Uporablja se za pregled mesa domačih in gozdnih živali, ki so lahko okužene s parazitom iz rodu Trichinella. Ta metoda ne omogoča ugotavljanja vrste ali genotipa odkritih parazitov; identifikacija se lahko izvede z molekularnimi metodami.
General Information
Relations
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Standards Content (Sample)
SLOVENSKI STANDARD
SIST EN ISO 18743:2015
01-december-2015
0LNURELRORJLMDYSUHKUDQVNLYHULJL8JRWDYOMDQMHSULVRWQRVWLOLþLQN7ULFKLQHOODY
PHVX]GLJHVWLYQRPHWRGR ,62
Microbiology of the food chain - Detection of Trichinella larvae in meat by artificial
digestion method (ISO 18743:2015)
Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln - Nachweis von Trichinellenlarven aus
Fleischproben - Physikalisches Verdauungsverfahren (ISO 18743:2015)
Microbiologie de la chaîne alimentaire - Recherche des larves de Trichinella dans la
viande par une méthode de digestion artificielle (ISO 18743:2015)
Ta slovenski standard je istoveten z: EN ISO 18743:2015
ICS:
07.100.30 Mikrobiologija živil Food microbiology
SIST EN ISO 18743:2015 en
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.
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SIST EN ISO 18743:2015
EN ISO 18743
EUROPEAN STANDARD
NORME EUROPÉENNE
September 2015
EUROPÄISCHE NORM
ICS 07.100.30
English Version
Microbiology of the food chain - Detection of Trichinella
larvae in meat by artificial digestion method (ISO
18743:2015)
Microbiologie de la chaîne alimentaire - Recherche des Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln -
larves de Trichinella dans la viande par une méthode Nachweis von Trichinellenlarven aus Fleischproben -
de digestion artificielle (ISO 18743:2015) Physikalisches Verdauungsverfahren (ISO
18743:2015)
This European Standard was approved by CEN on 24 July 2015.
CEN members are bound to comply with the CEN/CENELEC Internal Regulations which stipulate the conditions for giving this
European Standard the status of a national standard without any alteration. Up-to-date lists and bibliographical references
concerning such national standards may be obtained on application to the CEN-CENELEC Management Centre or to any CEN
member.
This European Standard exists in three official versions (English, French, German). A version in any other language made by
translation under the responsibility of a CEN member into its own language and notified to the CEN-CENELEC Management
Centre has the same status as the official versions.
CEN members are the national standards bodies of Austria, Belgium, Bulgaria, Croatia, Cyprus, Czech Republic, Denmark, Estonia,
Finland, Former Yugoslav Republic of Macedonia, France, Germany, Greece, Hungary, Iceland, Ireland, Italy, Latvia, Lithuania,
Luxembourg, Malta, Netherlands, Norway, Poland, Portugal, Romania, Slovakia, Slovenia, Spain, Sweden, Switzerland, Turkey and
United Kingdom.
EUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION
COMITÉ EUROPÉEN DE NORMALISATION
EUROPÄISCHES KOMITEE FÜR NORMUNG
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© 2015 CEN All rights of exploitation in any form and by any means reserved Ref. No. EN ISO 18743:2015 E
worldwide for CEN national Members.
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EN ISO 18743:2015 (E)
Contents Page
European foreword . 3
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EN ISO 18743:2015 (E)
European foreword
This document (EN ISO 18743:2015) has been prepared by Technical Committee ISO/TC 34 "Food
products" in collaboration with Technical Committee CEN/TC 275 “Food analysis - Horizontal methods”
the secretariat of which is held by DIN.
This European Standard shall be given the status of a national standard, either by publication of an
identical text or by endorsement, at the latest by March 2016, and conflicting national standards shall
be withdrawn at the latest by March 2016.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. CEN [and/or CENELEC] shall not be held responsible for identifying any or all such patent
rights.
According to the CEN-CENELEC Internal Regulations, the national standards organizations of the
following countries are bound to implement this European Standard: Austria, Belgium, Bulgaria,
Croatia, Cyprus, Czech Republic, Denmark, Estonia, Finland, Former Yugoslav Republic of Macedonia,
France, Germany, Greece, Hungary, Iceland, Ireland, Italy, Latvia, Lithuania, Luxembourg, Malta,
Netherlands, Norway, Poland, Portugal, Romania, Slovakia, Slovenia, Spain, Sweden, Switzerland,
Turkey and the United Kingdom.
Endorsement notice
The text of ISO 18743:2015 has been approved by CEN as EN ISO 18743:2015 without any modification.
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SIST EN ISO 18743:2015
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 18743
First edition
2015-09-15
Microbiology of the food chain —
Detection of Trichinella larvae in meat
by artificial digestion method
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Recherche des larves de
Trichinella dans la viande par une méthode de digestion
artificielle
Reference number
ISO 18743:2015(E)
©
ISO 2015
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ISO 18743:2015(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2015, Published in Switzerland
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form
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written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
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ISO 18743:2015(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
4.1 General . 2
4.2 Sample size . 2
4.3 Blending/grinding of the muscle sample . 2
4.4 Preparation of the digest fluid . 2
4.5 Digestion of the chopped meat . 2
4.6 Filtration of the digest fluid . 3
4.7 Sedimentation of the digest fluid . 3
4.8 Microscopic examination . 3
4.9 Verification of findings . 3
5 Reagents . 3
6 Apparatus . 4
7 Sampling, labelling, and transport . 5
8 Sample preparation . 5
9 Procedure. 5
9.1 General . 5
9.2 Blending/grinding . 5
9.3 Preparation of the digest fluid . 6
9.4 Digestion of the chopped meat in the glass beaker . 6
9.5 Filtration of the digest fluid . 6
9.6 Sedimentation of the digest fluid in the separatory funnel . 7
9.7 Collection of the primary and secondary sediment . 7
9.8 Microscopic examination . 7
10 Documentation . 8
11 Expression of the results . 8
12 Safety measures . 8
Annex A (normative) Sample collection . 9
Annex B (normative) Frozen samples .11
Annex C (informative) Artificial digestion magnetic stirrer method .12
Annex D (informative) Example of a laboratory worksheet for recording data when testing
pooled samples by digestion assay .14
Bibliography .15
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ISO 18743:2015(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical
Barriers to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology.
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ISO 18743:2015(E)
Introduction
Trichinella spp. are the causative agents of human trichinellosis, a disease which is a public health
hazard and, as a result, also represents an economic problem in porcine animal production. Due to
the zoonotic importance of this infection in many countries, the main efforts have focused on control
and/or eradication of Trichinella from domestic pigs, the most important source of human infection
worldwide. Digestion methods for detection of Trichinella larvae in muscle samples from pigs and other
susceptible animal species intended for human consumption (e.g. horses, wild boars, walruses, and
bears), are effective for preventing clinical trichinellosis in humans. Due to the limits of sensitivity of
digestion methods, these methods might not detect infected animals with very small numbers of larvae
in muscle samples, that can pose a risk for subclinical infections in humans.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 18743:2015(E)
Microbiology of the food chain — Detection of Trichinella
larvae in meat by artificial digestion method
WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory
practice. This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if
any, associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and
health practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions.
1 Scope
This International Standard specifies a method of detection of Trichinella spp. muscle stage larvae in meat
of individual animal carcasses intended for human consumption. It is applicable to the examination of meat
from domestic and sylvatic animal species, which can be infected by nematodes of the genus Trichinella.
This method does not allow the identification of the species or genotype of detected parasites; species
or genotype identification can be carried out by molecular methods.
The method described in this International Standard is intended to be used in conjunction with the
guidelines in the OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines and by the International Commission
on Trichinellosis (ICT) for Trichinella testing and the inspection of carcasses intended for human
consumption, unless it has been demonstrated by other means that the animal was not at risk for
exposure to Trichinella.
The artificial digestion/magnetic stirrer method is considered to be the standard method because it
has proven to give the most reliable results in validation studies.
NOTE Provided equivalence with the method described within this International Standard can be
documented, alternative methods can be used for analysis.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for the application of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 7218:2007, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
International Commission on Trichinellosis (ICT), “Quality Assurance in Digestion Testing Programs
for Trichinella”, Recommendations and Guidelines. 2012
World Organisation for Animal Health (OIE), Chapter 2.1.16 — “Trichinellosis”, Manual of Diagnostic
Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th ed. 2012
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
Trichinella muscle larvae
ML
first larval stage (L1) of nematodes belonging to the genus Trichinella, which is located in striated
muscles of animals worldwide and can infect humans
Note 1 to entry: These larvae are approximately 0,7 mm to 1,1 mm in length and 0,03 mm in width.
© ISO 2015 – All rights reserved 1
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SIST EN ISO 18743:2015
ISO 18743:2015(E)
3.2
digestion assay
method to detect Trichinella larvae in muscle tissue by an enzymatic digestion step to release larvae
from muscle tissues followed by filtration and sedimentation steps, and detection of recovered larvae
by microscopy
3.3
larvae per gram
lpg
number of Trichinella larvae present in one gram of muscle tissue
4 Principle
4.1 General
The artificial digestion method, which is accepted as the international reference method (see OIE,
Terrestrial Manual 2012, Chapter 2.1.16 — Trichinellosis, page 307), relies on enzymatic degradation of
muscle fibres in a fluid composed of pepsin and hydrochloric acid followed by a series of sedimentation
and washing steps; equivalent validated methods can also be used. Test performance is greatly
influenced by the sample size (1 g samples will enable the reliable detection of infections of ≥3 lpg, and
3 g to 5 g samples will enable reliable detection of ≥1 lpg), by the type of the selected muscle, by the
method used, and by the skills of the technician performing the test. A sensitivity of at least one to
three larvae per gram shall be achieved to protect human health; consequently, an appropriate size
of muscle sample should be collected from a predilection muscle of the target animal. There are no
internal quality controls that can be used while performing the method. Some key elements in the
principle of its use are as follows (see 4.2 to 4.9).
4.2 Sample size
For inspection of individual food animal carcasses for public health purposes, the sample shall be
collected from predilection sites (see Annex A) and the sample size shall be risk-based, as determined
by a competent authority, but not less than 1 g per carcass.
4.3 Blending/grinding of the muscle sample
Meat samples are chopped using a blender or grinder to increase the surface area for enzymatic
degradation. The blending or grinding procedure shall be adjusted to maximize digestion efficiency.
NOTE Too little blending or grinding can result in poor digestion, while too much blending or grinding can
damage or disrupt muscle larvae.
4.4 Preparation of the digest fluid
Pepsin is commercially available in powder, granular, and liquid forms. The activity of the pepsin shall
be certified and pepsin shall be stored according to the manufacturer’s recommendation.
NOTE The use of a liquid pepsin formulation can be advantageous as it could reduce the risk of occupational
hazard, such as allergic reaction in laboratory staff.
4.5 Digestion of the chopped meat
Viable Trichinella larvae are resistant to the pepsin-HCl digest fluid and therefore can be recovered free
from muscle tissue. Dead Trichinella larvae can be destroyed by artificial digestion.
To facilitate an efficient and rapid digestion, a maximum ratio of 1:20, meat to digest fluid, and a
temperature of 45 °C ± 2 °C, shall be maintained throughout the process. The time required for digestion
shall be at least 30 min, but in the case of muscle samples which are less digestible, such as from wildlife
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carcasses, or the tongue of many species (see Annex A), the digestion time should be increased but,
unless otherwise validated for a particular sample matrix, shall not exceed 60 min in total.
NOTE If the time-temperature conditions are less than the required values, there might be an incomplete
digestion of the muscle tissue. Conversely, elevated temperature (over 50 °C) or prolonged digestion times might
result in the destruction of larvae or the inactivation of the pepsin.
4.6 Filtration of the digest fluid
Following digestion, the digest fluid shall be filtered through a sieve with specific mesh size (6.11), in
order to retain undigested tissue, but allowing larvae to pass through. Sieves shall be free of debris
prior to use and shall be pre-wetted to allow digest fluid to pass through quickly.
4.7 Sedimentation of the digest fluid
Sedimentation of larvae is performed in a separatory funnel (primary sedimentation) and a glass
tube (secondary sedimentation). Larvae are collected in these primary and secondary sediments.
Sedimentation times shall be of 30 min and 10 min for the primary and secondary sedimentation,
respectively (see Annex B for sedimentation times for frozen muscle samples). If the sedimentation
times are less than stipulated above, not all larvae might be settled and might not be recovered in the
collected sediment.
4.8 Microscopic examination
Microscopic examination of the secondary sediment allows qualified analysts to recognize Trichinella
larvae and distinguish from many other nematodes, organisms, or artefacts. Knowledge of the
basic morphological characteristics of Trichinella larvae, including size (0,7 mm to 1,1 mm in length
and 0,03 mm in width), shape, and colour is required to examine the sediment (see Figure C.1 and
Figure C.2). The most distinguishing feature of Trichinella larvae, not recognized by stereomicroscopy
but by compound microscopy, is the stichosome, which consists of a series of discoid cells lining the
oesophagus and occupying the anterior half of the body. Trichinella larvae can appear coiled (when
cold) or motile (when warm), or C-shaped (when dead).
To be qualified to perform routine digestion testing, the analyst shall adequately perform the artificial
digestion/magnetic stirrer method using Trichinella spiked samples (proficiency testing panel)
to consistently recover and identify larvae. Analysts should be qualified based on performance of
proficiency testing in accordance with guidance from the International Commission on Trichinellosis.
4.9 Verification of findings
If positive or doubtful findings occur, confirmation and identification at the species level should
be performed by a qualified reference laboratory, as defined by “ICT guidelines Recommendations
for Quality Assurance in Digestion Testing Programs for Trichinella”, Part 1 — Quality assurance in
regulatory testing for Trichinella, i.e. “a laboratory formally recognised by a national or international
authority for a required level of scientific and diagnostic expertise for a particular animal disease
and/or testing methodology”.
5 Reagents
5.1 Tap water, heated to 47 °C ± 2 °C.
5.2 Hydrochloric acid (25 %, molar concentration: 7,8 to 7,9, or any other percentage).
5.3 Pepsin (Powder or granular: 1: 10.000 NF, 1: 12.500 BP, 2.000 FIP; liquid: 660 U/ml).
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NOTE The activity of pepsin powder is expressed per gram, either in “NF” (US National Formulary), “BP”
(British Pharmacopoea), or “FIP” (Fédération Internationale de Pharmacie); activity of liquid pepsin is expressed
in European Pharmacopoeia units per millilitre with a minimum of 660 U/ml. Other pepsin activities can be
used, provided the final activity in the digest fluid is equivalent to the activity of 10g of 1:10.000 NF.
5.4 Ethanol (70 % to 90 % ethyl alcohol).
5.5 Sodium hypochlorite.
6 Apparatus
Usual microbiological laboratory equipment (see ISO 7218) and, in particular, the following.
6.1 Labelled collection trays or plastic bags, for samples.
6.2 Knives, scissors, and forceps, for cutting samples and removing non-digestible tissue.
6.3 Calibrated scale, for weighing samples and/or pepsin (accuracy ± 0,1 g).
6.4 Glass, plastic, or steel blender, with a sharp chopping blade (regularly inspected and/or exchanged).
6.5 Magnetic stirrer, with an adjustable heating plate or magnetic stirrer put in an incubator.
6.6 Thermometer, (accurate to at least ±0,5 °C, minimum range of temperatures from 20 °C to 70 °C).
6.7 Stir bar, (5 cm in length minimum).
6.8 Glass beakers, (minimum 3 l capacity).
6.9 Aluminium foil, or lids, to cover the top of the glass beaker.
6.10 Funnels (glass, plastic, or steel), (minimum diameter of approximately 15 cm).
6.11 Sieve, made of brass or stainless steel, specific mesh size between 180 µm to 200 µm (with
diameter of approximately 10 cm or larger).
6.12 Conical glass separatory funnels (minimum 2,5 l in capacity), preferably with
polytetrafluoroethylene (PTFE) safety plugs (stopcocks).
6.13 Tubes or measuring cylinders, (50 ml or 100 ml glass).
6.14 Petri dishes (approximately 90 mm in diameter), gridded with squares of approximately 1 cm, or
equivalent equipment for larval counting.
6.15 Stereo-microscope, with a sub-stage transmitted adjustable light source, or trichinoscope with a
horizontal table. Image capture and storage capability (camera) are recommended, but not required to
document suspect results.
6.16 Pipettes, with capacity of 1 ml, 10 ml, and 25 ml.
4 © ISO 2015 – All rights reserved
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SIST EN ISO 18743:2015
ISO 18743:2015(E)
6.17 Small vials, for collection of recovered larvae.
Plasticware or teflonware should not be used for beakers or separatory funnels (other than stopcocks)
since a rough surface and electrostatic charge can contribute to larval adherence to the inner surface of
the equipment.
Equipment listed at 6.2, 6.4, and 6.11 should be regularly cleaned and free of any tissues which could
contain larvae from previous analyses.
7 Sampling, labelling, and transport
Sampling, labelling, and transport are not part of the method specified in this International Standard,
but are indicated in Annex A. If there are no specific International Standards dealing with sampling
of the animal carcasses or parts of them, it is recommended that the interested parties come to an
agreement on this subject.
In order to obtain the required sensitivity for Trichinella testing in animals, an appropriate size of
muscle sample shall be collected from a predilection muscle (see Annex A). Muscle samples taken from
the carcass for digestion testing should be at least twice the mass required for examination to allow for
trimming of non-diges
...
SLOVENSKI STANDARD
SIST EN ISO 18743:2015
01-december-2015
Mikrobiologija v prehranski verigi - Ugotavljanje prisotnosti ličink Trichinella v
mesu z digestivno metodo (ISO 18743:2015)
Microbiology of the food chain - Detection of Trichinella larvae in meat by artificial
digestion method (ISO 18743:2015)
Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln - Nachweis von Trichinellenlarven aus
Fleischproben - Physikalisches Verdauungsverfahren (ISO 18743:2015)
Microbiologie de la chaîne alimentaire - Recherche des larves de Trichinella dans la
viande par une méthode de digestion artificielle (ISO 18743:2015)
Ta slovenski standard je istoveten z: EN ISO 18743:2015
ICS:
07.100.30 Mikrobiologija živil Food microbiology
SIST EN ISO 18743:2015 en,fr,de
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.
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SIST EN ISO 18743:2015
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SIST EN ISO 18743:2015
EN ISO 18743
EUROPÄISCHE NORM
EUROPEAN STANDARD
September 2015
NORME EUROPÉENNE
ICS 07.100.30
Deutsche Fassung
Mikrobiologie der Lebensmittelkette - Nachweis von
Trichinella-Larven im Fleisch mit künstlichem
Verdauungsverfahren (ISO 18743:2015)
Microbiology of the food chain - Detection of Trichinella Microbiologie de la chaîne alimentaire - Recherche des
larvae in meat by artificial digestion method (ISO larves de Trichinella dans la viande par une méthode de
18743:2015) digestion artificielle (ISO 18743:2015)
Diese Europäische Norm wurde vom CEN am 24. Juli 2015 angenommen.
Die CEN-Mitglieder sind gehalten, die CEN/CENELEC-Geschäftsordnung zu erfüllen, in der die Bedingungen festgelegt sind, unter
denen dieser Europäischen Norm ohne jede Änderung der Status einer nationalen Norm zu geben ist. Auf dem letzten Stand
befindliche Listen dieser nationalen Normen mit ihren bibliographischen Angaben sind beim Management-Zentrum des CEN-
CENELEC oder bei jedem CEN-Mitglied auf Anfrage erhältlich.
Diese Europäische Norm besteht in drei offiziellen Fassungen (Deutsch, Englisch, Französisch). Eine Fassung in einer anderen
Sprache, die von einem CEN-Mitglied in eigener Verantwortung durch Übersetzung in seine Landessprache gemacht und dem
Management-Zentrum mitgeteilt worden ist, hat den gleichen Status wie die offiziellen Fassungen.
CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Bulgarien, Dänemark, Deutschland, der ehemaligen
jugoslawischen Republik Mazedonien, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Kroatien, Lettland,
Litauen, Luxemburg, Malta, den Niederlanden, Norwegen, Österreich, Polen, Portugal, Rumänien, Schweden, der Schweiz, der
Slowakei, Slowenien, Spanien, der Tschechischen Republik, der Türkei, Ungarn, dem Vereinigten Königreich und Zypern.
EUROPÄISCHES KOMITEE FÜR NORMUNG
EUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION
COMITÉ EUROPÉEN DE NORMALISATION
CEN-CENELEC Management-Zentrum: Avenue Marnix 17, B-1000 Brüssel
© 2015 CEN Alle Rechte der Verwertung, gleich in welcher Form und in welchem Ref. Nr. EN ISO 18743:2015 D
Verfahren, sind weltweit den nationalen Mitgliedern von CEN
vorbehalten.
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EN ISO 18743:2015 (D)
Inhalt
Seite
Europäisches Vorwort . 3
Vorwort . 4
Einleitung . 5
1 Anwendungsbereich . 6
2 Normative Verweisungen . 6
3 Begriffe . 7
4 Kurzbeschreibung . 7
4.1 Allgemeines . 7
4.2 Probenumfang . 7
4.3 Zerkleinern/Wolfen der Muskelprobe . 7
4.4 Herstellung der Verdauungsflüssigkeit . 8
4.5 Verdauung des zerkleinerten Fleisches . 8
4.6 Filtration der Verdauungsflüssigkeit . 8
4.7 Sedimentation der Verdauungsflüssigkeit . 8
4.8 Mikroskopische Untersuchung . 8
4.9 Verifizierung von Befunden . 9
5 Reagenzien . 9
6 Geräte . 9
7 Probenahme, Kennzeichnung und Transport . 10
8 Probenvorbereitung . 11
9 Verfahren . 11
9.1 Allgemeines . 11
9.2 Zerkleinern/Wolfen . 11
9.3 Herstellung der Verdauungsflüssigkeit . 11
9.4 Verdauung des zerkleinerten Fleisches im Becherglas . 12
9.5 Filtration der Verdauungsflüssigkeit . 12
9.6 Sedimentation der Verdauungsflüssigkeit in einem Scheidetrichter . 12
9.7 Sammeln des primären und sekundären Sediments. 12
9.8 Mikroskopische Untersuchung . 13
10 Dokumentation . 14
11 Auswertung . 14
12 Sicherheitsmaßnahmen . 14
Anhang A (normativ) Probenahme . 15
Anhang B (normativ) Gefrorene Proben . 17
Anhang C (informativ) Magnetrührverfahren für die künstliche Verdauung . 18
Anhang D (informativ) Beispiel für ein Labor-Arbeitsblatt zur Aufzeichnung von Daten bei der
Untersuchung von Sammelproben durch den Verdauungstest . 20
Literaturhinweise . 21
2
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EN ISO 18743:2015 (D)
Europäisches Vorwort
Dieses Dokument (EN ISO 18743:2015) wurde vom Technischen Komitee ISO/TC 34 „Food products“ in
Zusammenarbeit mit dem Technischen Komitee CEN/TC 275 „Lebensmittelanalytik - Horizontale Verfahren“
erarbeitet, dessen Sekretariat vom DIN gehalten wird.
Diese Europäische Norm muss den Status einer nationalen Norm erhalten, entweder durch Veröffentlichung
eines identischen Textes oder durch Anerkennung bis März 2016, und etwaige entgegenstehende nationale
Normen müssen bis März 2016 zurückgezogen werden.
Es wird auf die Möglichkeit hingewiesen, dass einige Elemente dieses Dokuments Patentrechte berühren
können. CEN [und/oder] CENELEC sind nicht dafür verantwortlich, einige oder alle diesbezüglichen
Patentrechte zu identifizieren.
Entsprechend der CEN-CENELEC-Geschäftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgenden
Länder gehalten, diese Europäische Norm zu übernehmen: Belgien, Bulgarien, Dänemark, Deutschland, die
ehemalige jugoslawische Republik Mazedonien, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island,
Italien, Kroatien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, Niederlande, Norwegen, Österreich, Polen, Portugal,
Rumänien, Schweden, Schweiz, Slowakei, Slowenien, Spanien, Tschechische Republik, Türkei, Ungarn,
Vereinigtes Königreich und Zypern.
Anerkennungsnotiz
Der Text von ISO 18743:2015 wurde vom CEN als EN ISO 18743:2015 ohne irgendeine Abänderung
genehmigt.
3
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SIST EN ISO 18743:2015
EN ISO 18743:2015 (D)
Vorwort
ISO (die Internationale Organisation für Normung) ist eine weltweite Vereinigung von Nationalen
Normungsorganisationen (ISO-Mitgliedsorganisationen). Die Erstellung von Internationalen Normen wird
normalerweise von ISO Technischen Komitees durchgeführt. Jede Mitgliedsorganisation, die Interesse an
einem Thema hat, für welches ein Technisches Komitee gegründet wurde, hat das Recht, in diesem Komitee
vertreten zu sein. Internationale Organisationen, staatlich und nicht-staatlich, in Liaison mit ISO, nehmen
ebenfalls an der Arbeit teil. ISO arbeitet eng mit der Internationalen Elektrotechnischen Kommission (IEC)
bei allen elektrotechnischen Themen zusammen.
Die Verfahren, die bei der Entwicklung dieses Dokuments angewendet wurden und die für die weitere Pflege
vorgesehen sind, werden in den ISO/IEC-Direktiven, Teil 1 beschrieben. Im Besonderen sollten die für die
verschiedenen ISO-Dokumentenarten notwendigen Annahmekriterien beachtet werden. Dieses Dokument
wurde in Übereinstimmung mit den Gestaltungsregeln der ISO/IEC-Direktiven, Teil 2 erarbeitet (siehe
www.iso.org/directives).
Es wird auf die Möglichkeit hingewiesen, dass einige Elemente dieses Dokuments Patentrechte berühren
können. ISO ist nicht dafür verantwortlich, einige oder alle diesbezüglichen Patentrechte zu identifizieren.
Details zu allen während der Entwicklung des Dokuments identifizierten Patentrechten finden sich in der
Einleitung und/oder in der ISO-Liste der empfangenen Patenterklärungen (siehe www.iso.org/patents).
Jeder in diesem Dokument verwendete Handelsname wird als Information zum Nutzen der Anwender
angegeben und stellt keine Anerkennung dar.
Eine Erläuterung der Bedeutung ISO-spezifischer Benennungen und Ausdrücke, die sich auf
Konformitätsbewertung beziehen, sowie Informationen über die Beachtung der WTO-Grundsätze zu
technischen Handelshemmnissen (TBT, en: Technical Barriers to Trade) durch ISO enthält der folgende Link:
Foreword - Supplementary information.
Das für dieses Dokument verantwortliche Komitee ist ISO/TC 34, Food products, Unterkomitee SC 9
Microbiology.
4
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EN ISO 18743:2015 (D)
Einleitung
Trichinella spp. sind die Verursacher der Trichinellose beim Menschen, einer Erkrankung, die eine Gefahr für
die öffentliche Gesundheit darstellt und als Folge davon auch ein wirtschaftliches Problem in der
Schweineerzeugung. Aufgrund der zoonotischen Bedeutung dieser Infektion in vielen Ländern
konzentrieren sich die Bemühungen hauptsächlich auf Bekämpfung und/oder Tilgung von Trichinella bei
Hausschweinen, die die wichtigste Quelle für Infektionen beim Menschen weltweit sind.
Verdauungsverfahren zum Nachweis von Trichinella-Larven in Muskelproben von Schweinen und anderen
empfänglichen Tierarten, die für den menschlichen Verzehr bestimmt sind (z. B. Pferde, Wildschweine,
Walrosse und Bären), sind effektive Verfahren zur Vorbeugung einer klinischen Trichinellose beim
Menschen. Aufgrund der begrenzten Empfindlichkeit von Verdauungsverfahren können infizierte Tiere mit
nur sehr geringer Larvenanzahl in Muskelproben, die möglicherweise ein Risiko für subklinische Infektionen
beim Menschen darstellen können, durch diese Verfahren nicht erkannt werden.
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SIST EN ISO 18743:2015
EN ISO 18743:2015 (D)
WARNUNG — Anwender dieser Internationalen Norm sollten mit der üblichen Laborpraxis vertraut
sein. Diese Internationale Norm gibt nicht vor, alle unter Umständen mit der Anwendung des
Verfahrens verbundenen Sicherheitsaspekte anzusprechen. Es liegt in der Verantwortung des
Anwenders, angemessene Sicherheits- und Schutzmaßnahmen zu treffen und sicherzustellen, dass
diese mit nationalen Festlegungen übereinstimmen.
1 Anwendungsbereich
Diese Internationalen Norm legt ein Verfahren zum Nachweis von Larven von Trichinella spp. in der
Muskelphase (Muskellarven) im Fleisch von einzelnen Schlachttierkörpern, die für den menschlichen
Verzehr bestimmt sind, fest. Es ist anwendbar auf die Untersuchung von Fleisch von Haus- und Wildtierarten
(aus dem domestischen und silvatischen Zyklus), die mit Nematoden der Gattung Trichinella infiziert sein
können.
Dieses Verfahren ermöglicht keine Bestimmung der Art oder des Genotyps der nachgewiesenen Parasiten;
eine Bestimmung der Art oder des Genotyps kann mittels molekularer Verfahren durchgeführt werden.
Das in dieser Internationalen Norm beschriebene Verfahren ist zur Anwendung in Verbindung mit den
Leitlinien im OIE-Handbuch zu Untersuchungsmethoden und Vakzinen und von der Internationalen
Kommission für Trichinellose (ICT, en: International Commission on Trichinellosis) zur Untersuchung auf
Trichinella und zur Kontrolle von Schlachttierkörpern, die für den menschlichen Verzehr bestimmt sind,
vorgesehen, sofern nicht auf andere Weise nachgewiesen wurde, dass das Tier kein Risiko bezüglich einer
Trichinella-Exposition darstellte.
Das Magnetrührverfahren für die künstliche Verdauung wird als Standardverfahren angesehen, weil in
Validierungsstudien nachgewiesen wurde, dass es zu den zuverlässigsten Ergebnissen führt.
ANMERKUNG Es können alternative Verfahren zur Analyse unter der Voraussetzung angewendet werden, dass die
Gleichwertigkeit mit dem in dieser Internationalen Norm beschriebenen Verfahren dokumentiert werden kann.
2 Normative Verweisungen
Die folgenden Dokumente, die in diesem Dokument teilweise oder als Ganzes zitiert werden, sind für die
Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene
Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments
(einschließlich aller Änderungen).
ISO 7218:2007, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
International Commission on Trichinellosis (ICT), “Quality Assurance in Digestion Testing Programs for
Trichinella”, Recommendations and Guidelines. 2012
World Organization for Animal Health (OIE), Chapter 2.1.16 — “Trichinellosis”, Manual of Diagnostic Tests
and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th ed. 2012
6
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SIST EN ISO 18743:2015
EN ISO 18743:2015 (D)
3 Begriffe
Für die Anwendung dieses Dokuments gelten die folgenden Begriffe.
3.1
Muskellarve von Trichinella
ML
erstes Larvenstadium (L1) von Nematoden, die zur Gattung Trichinella gehören, das weltweit in der quer
gestreiften Muskulatur (Skelettmuskeln) von Tieren zu finden ist und wodurch Menschen infiziert werden
können
Anmerkung 1 zum Begriff: Diese Larven sind etwa 0,7 mm bis 1,1 mm lang und 0,03 mm breit.
3.2
Verdauungstest
Verfahren zum Nachweis von Trichinella-Larven in Muskelgewebe durch einen enzymatischen
Verdauungsschritt zur Freisetzung der Larven aus Muskelgewebe mit anschließender Filtration und
Sedimentationsschritten sowie Nachweis der isolierten Larven mittels Mikroskopie
3.3
Larven je Gramm
lpg
Anzahl der Trichinella-Larven je Gramm Muskelgewebe
4 Kurzbeschreibung
4.1 Allgemeines
Das Verfahren der künstlichen Verdauung, das als das internationale Referenzverfahren anerkannt ist (siehe
OIE, Terrestrial Manual 2012, Abschnitt 2.1.16 — Trichinellosis, Seite 307), beruht auf dem enzymatischen
Aufschluss von Muskelfasern in einer aus Pepsin und Salzsäure bestehenden Flüssigkeit, gefolgt von einer
Reihe von Sedimentations- und Waschschritten; gleichwertige validierte Verfahren können ebenfalls
angewendet werden. Die Leistungsfähigkeit der Untersuchung wird in hohem Maß durch den Probenumfang
(1 g Probe ermöglicht den zuverlässigen Nachweis von Infektionen von ≥ 3 lpg und 3 g bis 5 g Probe
ermöglichen den zuverlässigen Nachweis von ≥ 1 lpg), die Art des gewählten Muskels, das angewendete
Verfahren und die Fertigkeiten des die Untersuchung durchführenden Fachpersonals beeinflusst. Eine
Empfindlichkeit von mindestens ein bis drei Larven je Gramm muss erreicht werden, um die Gesundheit des
Menschen zu schützen. Folglich sollte ein entsprechender Umfang einer Muskelprobe von einem
Prädilektionsmuskel des zu untersuchenden Tieres entnommen werden. Es gibt keine internen
Qualitätskontrollen, die bei der Durchführung des Verfahrens eingesetzt werden können. Einige
Schlüsselelemente bei seiner grundsätzlichen Anwendung sind wie folgt (siehe 4.2 bis 4.9).
4.2 Probenumfang
Zur Untersuchung einzelner Schlachtkörper von als Nahrungsmittel dienenden Tieren zu Zwecken der
öffentlichen Gesundheit muss die Probe von Stellen der Prädilektionsmuskeln (siehe Anhang A) entnommen
werden. Der Probenumfang muss sich nach dem durch eine zuständige Behörde bestimmten Risiko richten,
darf jedoch nicht weniger als 1 g je Schlachttierkörper betragen.
4.3 Zerkleinern/Wolfen der Muskelprobe
Fleischproben werden mit einem Mixer oder Fleischwolf zerkleinert, um die Oberfläche für den
enzymatischen Abbau zu erhöhen. Die Verfahrensweise beim Zerkleinern oder Wolfen muss so angepasst
werden, dass ein maximaler Wirkungsgrad der Verdauung erreicht wird.
7
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SIST EN ISO 18743:2015
EN ISO 18743:2015 (D)
ANMERKUNG Ein zu geringes Zerkleinern oder Wolfen kann zu einer mangelhaften Verdauung führen, während ein
zu starkes Zerkleinern oder Wolfen die Muskellarven beschädigen oder zerstören kann.
4.4 Herstellung der Verdauungsflüssigkeit
Pepsin ist im Handel als Pulver, Granulat und in flüssiger Form erhältlich. Die Aktivität von Pepsin muss
zertifiziert sein und das Pepsin ist entsprechend den Empfehlungen des Herstellers zu lagern.
ANMERKUNG Die Verwendung einer flüssigen Pepsin-Formulierung kann vorteilhaft sein, da sie die Gefahr eines
Berufsrisikos, wie z. B. einer allergischen Reaktion, des Laborpersonals vermindern kann.
4.5 Verdauung des zerkleinerten Fleisches
Lebensfähige Trichinella-Larven sind resistent gegenüber der Pepsin-HCl-Verdauungsflüssigkeit und können
deshalb frei aus dem Muskelgewebe isoliert werden. Tote Trichinella-Larven können durch die künstliche
Verdauung zerstört werden.
Um eine wirksame und schnelle Verdauung zu erleichtern, müssen im Verlauf des Prozesses ein maximales
Verhältnis von Fleisch zur Verdauungsflüssigkeit von 1:20 und eine Temperatur von 45 °C ± 2 °C
aufrechterhalten werden. Die für die Verdauung erforderliche Zeit muss mindestens 30 min betragen. Im
Fall von schwerer verdaubaren Muskelproben, wie z. B. von Schlachtkörpern von Wildtieren, oder für die
Zunge von vielen Tierarten (siehe Anhang A), sollte die Verdauungszeit erhöht werden. Jedoch darf sie,
sofern nicht anderweitig für eine bestimmte Probenmatrix validiert, insgesamt 60 min nicht überschreiten.
ANMERKUNG Wenn die Bedingungen in Bezug auf Zeit und Temperatur unterhalb der geforderten Werte liegen,
könnte eine unvollständige Verdauung des Muskelgewebes erfolgen. Umgekehrt könnte eine erhöhte Temperatur (über
50 °C) oder eine längere Verdauungszeit zur Zerstörung der Larven oder zur Inaktivierung von Pepsin führen.
4.6 Filtration der Verdauungsflüssigkeit
Nach der Verdauung muss die Verdauungsflüssigkeit durch ein Sieb mit einer bestimmten Maschenweite
(6.11) filtriert werden, mit dem unverdautes Gewebe zurückgehalten wird, durch das die Larven jedoch
hindurchgehen. Die Siebe müssen vor dem Gebrauch frei von Ablagerungen sein und vorher angefeuchtet
werden, um einen schnellen Durchgang der Verdauungsflüssigkeit zu ermöglichen.
4.7 Sedimentation der Verdauungsflüssigkeit
Die Sedimentation der Larven erfolgt in einem Scheidetrichter (primäre Sedimentation) und einem Glas-
röhrchen (sekundäre Sedimentation). Die Larven werden in diesen primären und sekundären Sedimenten
gesammelt. Die Sedimentationszeiten müssen 30 min und 10 min bei der primären bzw. sekundären
Sedimentation betragen (zu Sedimentationszeiten bei gefrorenen Muskelproben siehe Anhang B). Wenn die
Sedimentationszeiten kürzer sind als vorstehend festgelegt, könnten sich möglicherweise nicht alle Larven
absedimentieren, und im gesammelten Sediment nicht wiedergefunden werden.
4.8 Mikroskopische Untersuchung
Bei der mikroskopischen Untersuchung des sekundären Sediments können qualifizierte Analytiker
Trichinella-Larven erkennen und von vielen anderen Nematoden, Organismen oder Artefakten
unterscheiden. Die Kenntnis der grundlegenden morphologischen Eigenschaften von Trichinella-Larven,
einschließlich der Größe (0,7 mm bis 1,1 mm lang und 0,03 mm breit), Form und Farbe, ist für die
Untersuchung des Sediments erforderlich (siehe Bild C.1 und Bild C.2). Das charakteristischste Merkmal von
Trichinella-Larven, das nicht mit dem Stereomikroskop erkannt wird, sondern mit einem
zusammengesetzten Mikroskop (Verbundmikroskop), ist das Stichosom, das aus einer Reihe von diskoidalen
Zellen besteht, die den Ösophagus auskleiden und die vordere Hälfte des Körpers einnehmen. Trichinella-
Larven können in eingerollter (bei Kälte) oder beweglicher Form (bei Wärme) auftreten bzw. C-förmig sein
(wenn sie tot sind).
8
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EN ISO 18743:2015 (D)
Um für die Durchführung der Routineuntersuchung auf Trichinella durch den Verdauungstest qualifiziert zu
sein, muss der Analytiker das Magnetrührverfahren für die künstliche Verdauung unter Verwendung von mit
Trichinella gespikten Proben (Gruppe zur Leistungsprüfung) ordnungsgemäß durchführen, um die Larven
problemlos zu isolieren und zu identifizieren. Analytiker sollten, basierend auf der Durchführung von
Leistungsprüfungen nach der Anleitung der International Commission on Trichinellosis, qualifiziert sein.
4.9 Verifizierung von Befunden
Wenn positive oder nicht eindeutige Befunde auftreten, sollte eine Bestätigung und Identifizierung der
Trichinella-Art durch ein qualifiziertes Referenzlabor erfolgen, wie in den ICT-Leitlinien „Recommendations
for Quality Assurance in Digestion Testing Programs for Trichinella, Part 1− Quality assurance in regulatory
testing for Trichinella“ festgelegt, d.h. „ein Labor, dessen Erreichung eines erforderlichen Grades an
wissenschaftlicher und diagnostischer Expertise hinsichtlich einer bestimmten Tierseuche und/oder
bestimmter Untersuchungsverfahren durch eine nationale oder internationale Behörde formell anerkannt
wurde“.
5 Reagenzien
5.1 Leitungswasser, erwärmt auf 47 °C ± 2 °C.
5.2 Salzsäure (25%ig, Stoffmengenkonzentration (Molarität): 7,8 bis 7,9, oder ein beliebiger anderer
prozentualer Gehalt).
5.3 Pepsin (Pulver oder Granulat: 1:10 000 NF, 1:12 500 BP, 2 000 FIP; Flüssigkeit: 660 U/ml).
ANMERKUNG Die Aktivität von Pepsin in Pulverform wird je Gramm entweder in „NF“ (US National Formulary), „BP“
(British Pharmacopoea) oder „FIP“ (Fédération Internationale de Pharmacie) angegeben; die Aktivität von Pepsin in
flüssiger Form wird in Einheiten je Milliliter mit einem Minimum von 660 U/ml nach dem Europäischen Arzneibuch
angeben. Andere Aktivitäten von Pepsin können verwendet werden, vorausgesetzt, die endgültige Aktivität in der
Verdauungsflüssigkeit entspricht der Aktivität von 10 g mit 1:10 000 NF.
5.4 Ethanol (70 % bis 90 % Ethylalkohol).
5.5 Natriumhypochlorit.
6 Geräte
Übliche mikrobiologische Laborausrüstung (siehe ISO 7218) und insbesondere Folgendes:
6.1 Gekennzeichnete flache Sammelbehälter oder Kunststoffbeutel, für Proben.
6.2 Messer, Schere und Pinzette, zum Schneiden von Proben und Entfernen von nicht verdaulichem
Gewebe.
6.3 Kalibrierte Waage, zum Einwägen von Proben und/oder Pepsin (mit einer Genauigkeit von ± 0,1 g).
6.4 Mixer aus Glas, Kunststoff, oder Stahl, mit scharfem Schneidmesser (regelmäßig kontrolliert
und/oder ausgetauscht).
6.5 Magnetrührer, mit einer einstellbaren Heizplatte oder in einem Brutschrank angeordneter
Magnetrührer.
6.6 Thermometer, (mit einer Genauigkeit von mindestens ± 0,5 °C, Temperaturbereich mindestens von
20 °C bis 70 °C).
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EN ISO 18743:2015 (D)
6.7 Rührstab, (Mindestlänge 5 cm).
6.8 Bechergläser, (Fassungsvermögen mindestens 3 l).
6.9 Aluminiumfolie, oder Deckel, zum Abdecken der Bechergläser.
6.10 Trichter (Glas, Kunststoff oder Stahl, (Mindestdurchmesser etwa 15 cm).
6.11 Sieb, aus Messing oder nichtrostendem Stahl, spezifische Maschenweite zwischen 180 µm und 200 µm
(Durchmesser etwa 10 cm oder größer).
6.12 Konische Scheidetrichter aus Glas (Fassungsvermögen mindestens 2,5 l), vorzugsweise mit
Sicherheitsverschlüssen aus Polytetrafluorethylen (PTFE) (Absperrhahn).
6.13 Röhrchen oder Messzylinder, (50 ml oder 100 ml, Glas).
6.14 Petrischalen (Durchmesser etwa 90 mm), mit einem Raster aus Quadraten von etwa 1 cm, oder eine
gleichwertige Vorrichtung zum Auszählen der Larven.
6.15 Stereomikroskop, mit in der Intensität einstellbarer Durchlichtquelle oder Trichinoskop mit
Horizontaltisch. Möglichkeiten zur Bilderfassung und -speicherung (Kamera) werden zur Dokumentation
nicht eindeutiger Ergebnisse empfohlen, sind jedoch nicht erforderlich.
6.16 Pipetten, Fassungsvermögen 1 ml, 10 ml und 25 ml.
6.17 Kleine Glasfläschchen, zum Sammeln von isolierten Larven.
Becher oder Scheidetrichter sollten nicht aus Kunststoff oder Teflon bestehen (mit Ausnahme der
Absperrhähne), da eine raue Oberfläche und elektrostatische Aufladung dazu beitragen können, dass Larven
an der Innenfläche der Ausrüstung haften bleiben.
Die in 6.2, 6.4 und 6.11 angeführten Ausrüstungen sollten regelmäßig gereinigt werden und frei von
jeglichem Gewebe sein, das Larven aus vorhergehenden Untersuchungen enthalten könnte.
7 Probenahme, Kennzeichnung und Transport
Probenahme, Kennzeichnung und Transport sind nicht Teil des in dieser Internationalen Norm festgelegten
Verfahrens, werden jedoch in Anhang A angeführt. Falls zur Beprobung der Schlachttierkörper oder Teilen
davon keine bestimmten Internationalen Normen vorliegen, empfiehlt sich hinsichtlich dieses Themas eine
Absprache zwischen den interessierten Parteien.
Um die erforderliche Empfindlichkeit für die Untersuchung auf Trichinella bei Tieren zu erhalten, muss ein
entsprechender Probenumfang eines Prädilektionsmuskels (siehe Anhang A) entnommen werden. Aus dem
Schlachttierkörper für den Verdauungstest entnommene Muskelproben sollten mindestens das Doppelte der
für die Durchführung der Untersuchung geforderten Masse aufweisen, um das Entfernen von nicht
verdaulichem Gewebe zu ermöglichen.
Bei Eingang der Proben muss deren Eignung für die Untersuchung durch das Laborpersonal durch
Überprüfung von Masse, Zusammensetzung, Zustand, Kennzeichnung, und der Übereinstimmung mit den
Empfangsdokumenten verifiziert werden (Annahme nach Festlegung in ISO 7218:2
...
SLOVENSKI STANDARD
oSIST prEN ISO 18743:2013
01-september-2013
0LNURELRORJLMDåLYLOLQNUPH8JRWDYOMDQMHSULVRWQRVWLOLþLQN7ULFKLQHOODYPHVX
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Microbiology of food and animal feed - Detection of Trichinella Larvae in meat - Physical
method by digestion (ISO/DIS 18743:2013)
Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln - Nachweis von Trichinellenlarven aus
Fleischproben - Physikalisches Verdauungsverfahren (ISO/DIS 18743:2013)
Microbiologie des aliments - Recherche des larves de Trichinella dans la viande -
Methode physique par digestion (ISO/DIS 18743:2013)
Ta slovenski standard je istoveten z: prEN ISO 18743
ICS:
07.100.30 Mikrobiologija živil Food microbiology
oSIST prEN ISO 18743:2013 de
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.
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oSIST prEN ISO 18743:2013
EUROPÄISCHE NORM
ENTWURF
prEN ISO 18743
EUROPEAN STANDARD
NORME EUROPÉENNE
Juli 2013
ICS 07.100.30
Deutsche Fassung
Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln - Nachweis
von Trichinellenlarven aus Fleischproben - Physikalisches
Verdauungsverfahren (ISO/DIS 18743:2013)
Microbiology of food and animal feed - Detection of Microbiologie des aliments - Recherche des larves de
Trichinella Larvae in meat - Physical method by digestion Trichinella dans la viande - Methode physique par digestion
(ISO/DIS 18743:2013) (ISO/DIS 18743:2013)
Dieser Europäische Norm-Entwurf wird den CEN-Mitgliedern zur parallelen Umfrage vorgelegt. Er wurde vom Technischen Komitee
CEN/TC 275 erstellt.
Wenn aus diesem Norm-Entwurf eine Europäische Norm wird, sind die CEN-Mitglieder gehalten, die CEN-Geschäftsordnung zu erfüllen, in
der die Bedingungen festgelegt sind, unter denen dieser Europäischen Norm ohne jede Änderung der Status einer nationalen Norm zu
geben ist.
Dieser Europäische Norm-Entwurf wurde vom CEN in drei offiziellen Fassungen (Deutsch, Englisch, Französisch) erstellt. Eine Fassung in
einer anderen Sprache, die von einem CEN-Mitglied in eigener Verantwortung durch Übersetzung in seine Landessprache gemacht und
dem Management-Zentrum des CEN-CENELEC mitgeteilt worden ist, hat den gleichen Status wie die offiziellen
CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Bulgarien, Dänemark, Deutschland, der ehemaligen jugoslawischen
Republik Mazedonien, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Kroatien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta,
den Niederlanden, Norwegen, Österreich, Polen, Portugal, Rumänien, Schweden, der Schweiz, der Slowakei, Slowenien, Spanien, der
Tschechischen Republik, der Türkei, Ungarn, dem Vereinigten Königreich und Zypern.
Die Empfänger dieses Norm-Entwurfs werden gebeten, mit ihren Kommentaren jegliche relevante Patentrechte, die sie kennen, mitzuteilen
und unterstützende Dokumentationen zur Verfügung zu stellen.
Warnvermerk : Dieses Schriftstück hat noch nicht den Status einer Europäischen Norm. Es wird zur Prüfung und Stellungnahme
vorgelegt. Es kann sich noch ohne Ankündigung ändern und darf nicht als Europäischen Norm in Bezug genommen werden.
EUROPÄISCHES KOMITEE FÜR NORMUNG
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COMITÉ EUROPÉEN DE NORMALISATION
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Inhalt
Seite
Vorwort .3
Einleitung .4
1 Anwendungsbereich .5
2 Normative Verweisungen .5
3 Begriffe .5
4 Kurzbeschreibung .6
4.1 Allgemeingültiges .6
4.2 Probenumfang .6
4.3 Zerkleinern/Wolfen der Muskelprobe .6
4.4 Herstellung der Verdauungsflüssigkeit .6
4.5 Verdauung des zerkleinerten Fleisches .6
4.6 Filtration der Verdauungsflüssigkeit .7
4.7 Sedimentation der Verdauungsflüssigkeit .7
4.8 Mikroskopische Untersuchung .7
4.9 Verifizierung von Befunden .7
5 Reagenzien .7
6 Geräte .8
7 Probenahme, Kennzeichnu Machenweite nicht regelmäßig kalibriert zu werden. .9
7.1 Sedimentation der Verdauungsflüssigkeit in einem Scheidetrichter .9
7.2 Sammeln des primären und sekundären Sediments .9
7.3 Mikroskopische Untersuchung .9
8 Dokumentation . 10
9 Auswertung . 10
10 Sicherheitsmaßnahmen . 10
Anhang A (normativ) Probenahme . 11
Anhang B (normativ) Gefrorene Proben . 13
Anhang C (informativ) Magnetrührverfahren für die künstliche Verdauung . 14
Anhang D (informativ) Beispiel für ein Labor-Arbeitsblatt zur Aufzeichnung von Daten bei der
Untersuchung von Sammelproben durch den Verdauungstest . 16
Literaturhinweise . 17
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Vorwort
Dieses Dokument (prEN ISO 18743:2013) wurde vom Technischen Komitee ISO/TC 34 „Food products“ in
Zusammenarbeit mit dem Technischen Komitee CEN/TC 275 „Lebensmittelanalytik — Horizontale Verfahren“
erarbeitet, dessen Sekretariat vom DIN gehalten wird.
Dieses Dokument ist derzeit zur parallelen Umfrage vorgelegt.
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Der Text von ISO/DIS 18743:2013 wurde vom CEN als prEN ISO 18743:2013 ohne irgendeine Abänderung
genehmigt.
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prEN ISO 18743:2013 (D)
Einleitung
Trichinella spp. sind die Verursacher der Trichinellose beim Menschen, einer Erkrankung, die eine Gefahr für
die öffentliche Gesundheit darstellt und als Folge davon auch ein wirtschaftliches Problem in der Schweine-
erzeugung. Aufgrund der zoonotischen Bedeutung dieser Infektion in vielen Ländern konzentrieren sich die
Bemühungen hauptsächlich auf Bekämpfung und/oder Tilgung von Trichinella bei Hausschweinen, die die
wichtigste Quelle für Infektionen beim Menschen weltweit sind. Verdauungsverfahren zum Nachweis von
Trichinella-Larven in Muskelproben von Schweinen und anderen empfänglichen Tierarten, die für den
menschlichen Verzehr bestimmt sind (z. B. Pferde, Wildschweine, Walrosse und Bären), können zur
Vorbeugung einer klinischen Trichinellose beim Menschen angewendet werden, jedoch nicht zur Vorbeugung
einer Infektion.
4
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prEN ISO 18743:2013 (D)
1 Anwendungsbereich
In der vorliegenden Internationalen Norm wird ein Verfahren festgelegt, das zum Nachweis von Larven von
Trichinella spp. in der Muskelphase (Muskellarven) im Fleisch von einzelnen Schlachttierkörpern, die für den
menschlichen Verzehr bestimmt sind, angewendet werden kann. Es ist anwendbar zur Untersuchung von
Fleisch von Haus- und Wildtierarten (aus dem domestischen und silvatischen Zyklus), die mit Nematoden der
Gattung Trichinella infiziert sein können.
Dieses Verfahren ermöglicht keine Bestimmung der Art oder des Genotyps der nachgewiesenen Parasiten;
eine Identifizierung kann mit molekularen Verfahren erfolgen.
Das in dieser Internationalen Norm beschriebene Verfahren ist in Verbindung mit den Leitlinien im OIE-
Diagnosehandbuch und von der ICT zur Untersuchung auf Trichinella und zur Kontrolle von
Schlachttierkörpern, die für den menschlichen Verzehr bestimmt sind, anzuwenden, sofern nicht auf andere
Weise nachgewiesen wurde, dass das Tier kein Risiko bezüglich einer Trichinella-Exposition darstellte.
Das Magnetrührverfahren für die künstliche Verdauung wird als „Goldstandard“ (Maßstab) angesehen, weil in
Validierungsstudien nachgewiesen wurde, dass es zu den zuverlässigsten Ergebnissen führt.
Vorausgesetzt, dass die Gleichwertigkeit mit dem in dieser Internationalen Norm beschriebenen Verfahren
dokumentiert werden kann, dürfen alternative Verfahren zur Analyse angewendet werden.
2 Normative Verweisungen
Die folgenden zitierten Dokumente sind für die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten
Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte
Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschließlich aller Änderungen).
OIE, World Organization for Animal Health (2012), Chapter 2.1.16 — Trichinellosis. In : Manual of Diagnostic
Tests and Vaccines for Terrestrial Animals
ICT (International Commission on Trichinellosis), (2012). ICT Quality Assurance in Digestion Testing
Programs for Trichinella. In: ICT Recommendations and Guidelines. http://trichinellosis.org/Guidelines.html
ISO 7218:2007, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations.
3 Begriffe
Für die Anwendung dieses Dokuments gelten die folgenden Begriffe.
3.1
Muskellarve (ML) von Trichinella
erstes Larvenstadium (L1) von Nematoden, die zur Gattung Trichinella gehören, das weltweit in der quer
gestreiften Muskulatur (Skelettmuskeln) von Tieren zu finden ist und wodurch Menschen infiziert werden
können. Diese Larven sind etwa 0,7 mm bis 1,1 mm lang und 0,03 mm breit
3.2
Verdauungstest
Verfahren zum Nachweis von Trichinella-Larven in Muskelgewebe durch einen enzymatischen Verdauungs-
schritt zur Freisetzung der Larven aus Muskelgewebe mit anschießender Filtration und Sedimentations-
schritten sowie Nachweis der isolierten Larven mittels Mikroskopie
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oSIST prEN ISO 18743:2013
prEN ISO 18743:2013 (D)
4 Kurzbeschreibung
4.1 Allgemeingültiges
Das Magnetrührverfahren für die künstliche Verdauung von Sammelproben, das als das internationale
Referenzverfahren anerkannt ist, beruht auf den enzymatischen Aufschluss von Muskelfasern in einer aus
Pepsin und Salzsäure bestehenden Flüssigkeit, gefolgt von einer Reihe von Sedimentations- und
Waschschritten. Gleichwertige validierte Verfahren können ebenfalls angewendet werden. Die
Leistungsfähigkeit der Untersuchung wird stark durch den Probenumfang (1 g Probe ermöglicht den
zuverlässigen Nachweis von Infektionen von ≥ 3 lpg und 3 g bis 5 g Probe ermöglichen den zuverlässigen
Nachweis von ≥ 1 lpg), die Art des gewählten Muskels, das angewendete Verfahren und die Fertigkeiten des
die Untersuchung durchführenden Fachpersonals beeinflusst. Eine Empfindlichkeit von mindestens 1 bis
3 Larven je Gramm muss erreicht werden. Folglich sollte ein entsprechender Umfang einer Muskelprobe von
einem Prädilektionsmuskel des zu untersuchenden Tieres entnommen werden. Es gibt keine internen
Qualitätskontrollen, die bei der Durchführung des Verfahrens eingesetzt werden können. Einige
Schlüsselelemente bei seiner grundsätzlichen Anwendung sind folgende:
4.2 Probenumfang
Zur Untersuchung einzelner Schlachtkörper von als Nahrungsmittel dienenden Tieren zu Zwecken der
öffentlichen Gesundheit muss sich der zu untersuchende Probenumfang nach dem Risiko richten, bestimmt
durch eine zuständige Behörde (siehe Anhang A), er darf jedoch nicht weniger als ein Gramm betragen.
4.3 Zerkleinern/Wolfen der Muskelprobe
Fleischproben werden mit einem Mixer oder Fleischwolf zerkleinert, um die Oberfläche für den enzymatischen
Abbau zu erhöhen. Die Verfahrensweise beim Zerkleinern oder Wolfen muss so angepasst werden, dass ein
maximaler Wirkungsgrad der Verdauung erreicht wird.
ANMERKUNG Ein zu geringes Zerkleinern oder Wolfen bedingt möglicherweise eine mangelhafte Verdauung, während
ein zu starkes Zerkleinern oder Wolfen die Muskellarven zerstören kann.
4.4 Herstellung der Verdauungsflüssigkeit
Pepsin ist im Handel als Pulver, Granulat und in flüssiger Form erhältlich. Die Aktivität von Pepsin muss
zertifiziert sein und das Pepsin ist entsprechend den Empfehlungen des Herstellers zu lagern.
ANMERKUNG Die Verwendung einer flüssigen Pepsin-Formulierung kann vorteilhaft sein, da sie die Gefahr eines
Berufsrisikos, wie z. B. einer allergischen Reaktion, des Laborpersonals vermindern kann.
4.5 Verdauung des zerkleinerten Fleisches
Lebensfähige Trichinella-Larven sind resistent gegenüber der Pepsin-HCl-Verdauungsflüssigkeit und können
deshalb frei aus dem Muskelgewebe isoliert werden. Tote Trichinella-Larven werden möglicherweise durch
die künstliche Verdauung zerstört.
Um eine wirksame und schnelle Verdauung zu erleichtern, müssen im Verlauf des Prozesses ein maximales
Verhältnis von Fleisch zur Verdauungsflüssigkeit von 1:20 und eine Temperatur von (45 ± 2) °C aufrecht-
erhalten werden. Die für die Verdauung erforderliche Zeit muss mindestens 30 min betragen, im Fall von
schwerer verdaubaren Muskelproben, wie z. B. von Schlachtkörpern von Wildtieren, oder die Zunge von
vielen Tierarten (siehe Anhang A), sollte die Verdauungszeit erhöht werden, sie darf jedoch insgesamt 60 min
nicht überschreiten.
ANMERKUNG Wenn die Bedingungen in Bezug auf Zeit und Temperatur unterhalb der geforderten Werte liegen,
erfolgt möglicherweise eine unvollständige Verdauung des Muskelgewebes. Umgekehrt kann eine erhöhte Temperatur
(über 50 °C) oder eine längere Verdauungszeit zur Zerstörung der Larven oder zur Inaktivierung von Pepsin führen.
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prEN ISO 18743:2013 (D)
4.6 Filtration der Verdauungsflüssigkeit
Nach der Verdauung muss die Verdauungsflüssigkeit durch ein Sieb mit einer bestimmten Maschenweite
(6.11) filtriert werden, mit dem unverdautes Gewebe zurückgehalten wird, durch das die Larven jedoch
hindurchgehen. Die Siebe müssen vor dem Gebrauch frei von Ablagerungen sein und vorher angefeuchtet
werden, um einen schnellen Durchgang der Verdauungsflüssigkeit zu ermöglichen.
4.7 Sedimentation der Verdauungsflüssigkeit
Die Sedimentation der Larven erfolgt in einem Scheidetrichter (primäre Sedimentation) und einem Glas-
röhrchen (sekundäre Sedimentation). Die Larven werden in diesen primären und sekundären Sedimenten
gesammelt. Die Sedimentationszeiten müssen 30 min und 10 min bei der primären bzw. sekundären
Sedimentation betragen (zur Sedimentationszeit bei gefrorenen Muskelproben siehe Anhang B). Wenn die
Sedimentationszeit kürzer ist als vorstehend festgelegt, sedimentieren sich möglicherweise nicht alle Larven
ab und werden im gesammelten Sediment nicht wiedergefunden.
4.8 Mikroskopische Untersuchung
Bei der mikroskopischen Untersuchung des sekundären Sediments können qualifizierte Analytiker Trichinella-
Larven erkennen und von anderen Nematoden, Organismen und Artefakten unterscheiden. Für die
Qualifizierung muss der Analytiker das Magnetrührverfahren für die künstliche Verdauung unter Verwendung
von mit Trichinella gespikten Proben ordnungsgemäß durchführen (Gruppe zur Leistungsprüfung), um die
Larven problemlos zu isolieren und zu identifizieren. Die Kenntnis der grundlegenden morphologischen
Eigenschaften von Trichinella-Larven, einschließlich der Größe (0,7 mm bis 1,1 mm lang und 0,3 mm breit),
Form und Farbe, ist für die Untersuchung des Sediments erforderlich (siehe Bilder in Anhang C). Das
charakteristischste Merkmal von Trichinella-Larven, das nicht mit dem Stereomikroskop erkannt wird, sondern
mit einem zusammengesetzten Mikroskop (Verbundmikroskop), ist das Stichosom, das aus einer Reihe von
diskoidalen Zellen besteht, die den Ösophagus auskleiden und die vordere Hälfte des Körpers einnehmen.
Trichinella-Larven können in eingerollter (bei Kälte) oder beweglicher Form (bei Wärme) auftreten bzw.
C-förmig sein, wenn sie tot sind.
Analytiker sollten, basierend auf der Durchführung von Leistungsprüfungen nach der Anleitung der
Internationalen Kommission für Trichinellose (International Commission on Trichinellosis) —
http://www.trichinellosis.org/Guidelines.html — qualifiziert sein.
4.9 Verifizierung von Befunden
Wenn positive oder nicht eindeutige Befunde auftreten, sollte eine Bestätigung und Identifizierung der
Trichinella-Art durch ein qualifiziertes Referenzlabor erfolgen.
5 Reagenzien
Die benötigten Reagenzien sind:
5.1 Leitungswasser, erwärmt auf (47 ± 2) °C.
5.2 Salzsäure (25%ig, Stoffmengenkonzentration (Molarität): 7,8 bis 7,9, oder ein beliebiger anderer
prozentualer Gehalt).
5.3 Pepsin (Pulver oder Granulat: 1:10 000 NF, 1:12 500 BP, 2 000 FIP; Flüssigkeit: 660 U/ml).
ANMERKUNG Die Aktivität von Pepsin in Pulverform wird entweder in „NF“ (US National Formulary),
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.