ISO 10560:1993
(Main)Milk and milk products — Detection of Listeria monocytogenes
Milk and milk products — Detection of Listeria monocytogenes
The principle of the method specified comprises (at least) the following three stages: enrichment in selective liquid medium, isolation and presumptive identification, confirmation.
Lait et produits laitiers — Recherche de Listeria monocytogenes
General Information
Relations
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Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 10560
First edition
1993-08-0 1
Milk and milk products - Detection of
Listeria monocytogenes
Lait et produits laitiers - Recherche de Listeria monocytogenes
Reference number
ISO 10560:1993(E)
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 10560:1993(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national Standards bodies (ISO member bodies). The work
of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Esch member body interested in a subject for
which a technical committee has been established has the right to be
represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard ISO 10560 was prepared by Technical Committee
ISO/rC 34, Agricultural food products, Sub-Committee SC 5, Milk and mik
products, in collaboration with the International Dairy Federation (IDF) and
the Association of Official Analytical Chemists (AOAC), and will also be
published by these organizations.
Annex A forms an integral part of this International Standard. Annex B is
for information only.
0 ISO 1993
All rights reserved. No patt of this publication may be reproduced or utilized in any form or
by any means, electronie or mechanical, including photocopying and microfilm, without per-
mission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
Case Postale 56 l CH-l 211 Geneve 20 l Switzerland
Printed in Switzerland
ii
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 10560:1993(E)
Milk and milk products -
Detection of Lisferia
monocytogenes
3.2 detection of Listeria monocytogenes: Determi-
1 Scope
nation of the presence or absence of this
microorganism, in a specified mass or volume, when
This International Standard specifies methods for the
tests are carried out in accordance with this Inter-
detection of Listeria monocytogenes in milk and milk
national Standard.
products.
2 Normative references
4 Principle
The following Standards contain provisions which,
In general, the detection of Listeria spp. necessitates
through reference in this text, constitute provisions
at least three successive stages as in 4.1 to 4.3. See
of this International Standard. At the time of publi-
also the diagram of procedure in figure 1.
cation, the editions indicated were valid. All Standards
are subject to revision, and Parties to agreements
based on this International Standard are encouraged
to investigate the possibility of applying the most re-
Test Portion (25 g or 25 ml)
cent editions of the Standards indicated below.
+
Members of IEC and ISO maintain registers of cur-
Selective enrichment medium (225 ml)
rently valid International Standards.
Incubation at 30 “C for 48 h
ISO 7218: 1985, Microbiology - General guidance for
1
microbiological examina tions.
Streak-out on Oxford agar
ISO 8261: 1989, Milk and milk products - Preparation
Incubation at 37 “C for 48 h
of test samples and dilutions for microbiological
1
examination.
Selection of five characteristic colonies
(for each plate)
1
Inoculation on TSYEA
3 Definitions
Incubation at 37 “C for 24 h (or longer if necessary)
For the purposes of this International Standard, the
1
following definitions apply.
Further examinations
3.1 Listeria spp.: Microorganisms which form typical
Figure 1 - Diagram of procedure
colonies on a solid selective medium and which dis-
play the morphological, physiological and biochemical
characteristics described when tests are carried out
in accordance with this International Standard.
4.1 Enrichment in selective liquid medium
3.1 .l Listeria monocytogenes: A Listeria species
which is considered as pathogenic and which tan be
differentiated by specific biochemical characteristics Inoculation of the selective medium with the test
from other, non-pathogenic species occurring in milk Portion of the Sample ‘and incubation at 30 “C for
and milk products. 48 h.
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ISO 10560:1993(E)
5.2.1.2 Supplement 1
4.2 Isolation and presumptive identification
5.2.1.2.1 Composition
Inoculation of the isolation medium with the culture
obtained in the enrichment medium (4.1), incubation
at 37 “C and examination after 48 h to check for the
presence of colonies which, from their appearance,
Acriflavine hydrochloride 23 mg
are considered to be presumptive Listeria spp.
10 ml
Water
4.3 Confirmation
5.2.1.2.2 Preparation
Subculturing of colonies of presumptive Listeria spp.
Dissolve the acriflavine hydrochloride in the water.
(4.2) on a non-selective solid medium, and confir-
Sterilize by filtration.
mation by means of appropriate morphological,
physiological and biochemical tests.
NOTE 1 For details of the technique of sterilization by
filtration, reference may be made to any appropriate text-
book on microbiology.
5 Culture media and reagent
5.2.1.3 Supplement 2
5.1 General
5.2.1.3.1 Composition
For current laboratory practice, see ISO 7218.
46 mg
Nalidixic acid (sodium salt)
10 ml
Sodium hydroxide (0,05 mol/l)
5.2 Culture media
5.2.1 Selective medium: Enrichment medium
5.2.1.3.2 Preparation
Dissolve the nalidixic acid in the sodium hydroxide
5.2.1.1 Base
solution. Sterilize by filtration.
5.2.1.1.1 Composition
5.2.1.4 Supplement 3
5.2.1.4.1 Composition
Tryptone soya brothl)
30 g
Yeast extract
6g
1 000 ml
Water
57,5 mg
Cycloheximide
4 ml
Ethanol
1) Composition of tryptone so ya broth
6 ml
Water
Tryptone (pancreatic digest of casein): 17 g
Soytone (papaic digest of soyabean meal): 3 g
Dextrose: 2,5 g
5.2.1.4.2 Preparation
Sodium chloride: 5 g
Dipotassium Phosphate: 2,5 g
Dissolve the cycloheximide in the ethanol/water mix-
ture. Sterilize by filtration.
5.2.1.5 Complete medium
5.2.1 .1.2 Preparation
Store the base (5.2.1 .l) and the prepared supple-
Dissolve the dehydrated components or dehydrated
ments (5.2.1.2 to 5.2.1.4) separately in the dark at a
complete base in the water by boiling.
temperature between 2 “C and 5 “C. Prepare the
Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization complete medium by adding 1 ml of Supplement 1,
it is 7,3 “C at 25 “C. 2 ml of Supplement 2 and 2 ml of Supplement 3 to
225 ml of the base medium (5.2.1 .l).
Dispense the base in quantities of 225 ml into flasks
of 500 ml capacity (or multiples of 225 ml into flasks
NOTE 2 Multiples of 1 ml, 2 ml and 225 ml, respectively,
of suitable capacity). Sterilize for 15 min in the in flasks of suitable capacity may be used where appropri-
ate.
autoclave (6.1 .1.2) set at 121 “C.
2
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ISO 10560:1993(E)
5.2.3 Solid culture medium: Tryptone soya yeast
5.2.2 Isolation medium (Oxford agar)
extract agar (TSYEA)
5.2.2.1 Agar base
5.2.3.1 Composition
5.2.2.1 .l Composition
Tryptone soya broth
30 g
Yeast extract
6g
Columbia agar base
39 g
g to 18 g
Agarl) 12
Aesculin
ICI
Water 1 000 ml
Ammonium iron( I II) citrate 0,5 g
Lithium chloride
15g 1) According to the gel strength of the agar.
1 000 ml
Water
5.2.3.2 Preparation
5.2.2.1.2 Preparation
Dissolve the components or dehydrated complete
Dissolve the solid ingredients in the water by boiling.
medium in the water by boiling.
Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization
it is 7,3 “C at 25 “C.
5.2.2.2 Supplement for 500 ml medium
Dispense quantities of about 6 ml of the solid culture
medium into tubes (6.2.2).
5.2.2.2.1 Composition
Sterilize the tubes for 15 min in the autoclave
(6.1 .1.2) set at 121 “C.
Cycloheximide 200 mg
Allow to set in a sloping Position.
10 mg
Colistin sulfate
For the preparation of agar plates, sterilize the solid
Acrif lavin 25 mg
culture medium in flasks or bottles of suitable ca-
1 mg
Cefotetan
pacity. Dispense the medium while still liquid in
quantities of about 15 ml into sterile Petri dishes and
5 mg
Fosfomycin
allow to solidify.
2,5 ml
Ethanol
2,5 ml
Water
Liquid culture medium: Tryptone soya
5.2.4
yeast extract broth (TSYEB)
5.2.2.2.2 Preparation
Dissolve the solid ingredients in the ethanol/water
mixture. Sterilize by filtration.
5.2.4.1 Composition
The formulation of the medium, is described in
5.2.1 .l .l . Use 6 g of yeast extract.
5.2.2.3 Preparation of complete medium
Take 500 ml of the agar base (5.2.2.1). Sterilize for
15 min in the autoclave (6.1 .1.2) set at 121 “C. Cool
5.2.4.2 Preparation
to 50 “C and aseptically add the Supplement
(5.2.2.2). The pH of the final medium should be
Prepare the medium as described in 5.2.1.1.2.
7,0 “C at 25 “C.
Dispense quantities of about 6 ml into tubes before
Dispense the medium into sterile Petri dishes in
sterilizing in the autoclave.
quantities of about 15 ml and allow to solidify.
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ISO 10560:1993(E)
5.2.5 Blood agar Sterilize for 15 min in the autoclave (6.1 .1.2) set at
121 “C.
5.2.5.1 Composition
5.2.6.2 Carbohydrate solutions
5.2.6.2.1 Composition
Blood agar base No. 21)
40 g
1 000 ml
Water
70 ml
Horse or sheep defibrinated blood
Carbohydratel)
5g
Water 100 ml
1) Composition of blood agar base No. 2
Proteose peptone: 15 g
1) 100 ml of L-rhamnose Solution and 100 ml of
Liver digest: 2,5 g
D-Xylose Solution are required.
Yeast extract: 5 g
Sodium chloride: 5 g
Agar (according to the gel strength of the agar):
5.2.6.2.2 Preparation
12 g to 18 g
Dissolve separately each carbohydrate in 100 ml of
water. Sterilize by filtration.
5.2.5.2 Preparation
5.2.6.3 Complete media
Dissolve the dehydrated blood agar base in the water
by boiling.
For each carbohydrate, add aseptically 1 ml of Solution
(5.2.6.2) to 9 ml of the base medium (5.2.6.1). If
Adjust the pH, if necessaty, so that after sterilization
smaller volumes of base medium are prepared, add
it is 7,0 “C at 25 “C. Dispense the medium into tubes
accordingly smaller volumes of the carbohydrate sol-
or flasks of not more than 500 ml capacity.
ution.
Sterilize the blood agar base for 15 min in the
autoclave (6.1 .1.2) set at 121 “C.
5.2.7 Motility medium
Cool the medium to 45 “C. Add the defibrinated blood
5.2.7.1 Composition
and mix weil.
Dispense the medium in quantities of about 20 ml
into sterile Petri dishes and allow to solidify.
Casein peptone
mo g
Meat peptone
61 g
5.2.6 Carbohydrate utilization broth
Agar
315 g
Water 1 000 ml
5.2.6.1 Base
5.2.6.1 .l Composition
5.2.7.2 Preparation
Dissolve the components in the water by boiling.
Proteose peptone
1og
Beef extract
Jg
Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization
it is 7,3 “C at 25 “C.
Sodium chloride
5g
Bromocresol purple 0,02 g
Dispense the medium into tubes in quantities of about
5 ml.
1 000 ml
Water
Sterilize for 15 min in the autoclave (6.1 J.2) set at
121 “C.
5.2.6.1.2 Preparation
NOTE 3 Commercially available media for the examin-
Dissolve the components in the water by boiling.
ation of motility may be used.
Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization
5.2.8 CAMP (Christie, Atkins, Munch-Petersen)
it is 6,8 “C at 25 “C.
test
Dispense the medium into tubes in quantities such
that after sterilization 9 ml will remain. Blood agar plates (5.2.5) may be used for this test, but
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ISO 10560:1993(E)
it is preferable to use double-layered sheep blood agar Maintain stock cultures of S. aureus, R. equi, L.
monocytogenes, L. innocua and L. ivanovii by inocu-
plates with a very thin blood layer (5.2.8.3).
lating the TSYEA slopes (5.2.3) incubating them at
37 “C for 24 h to 28 h, or until growth has occurred,
5.2.8.1 Base
and storing in the refrigerator (6.1 .lO) at 4 “C. Sub-
culture at least once per month.
5.2.8.1 .l Composition
5.3 Reagent
Blood agar base No. 2 (see 5.2.5)
40 g
5.3.1 Hydrogen peroxide Solution, 3% (VW)
1 000 ml
Water
6 Apparatus and glassware
5.2.8.1.2 Preparation
IMPORTANT - Sterilize all apparatus that will
enter into contact with the culture media, the di-
Dissolve the dehydrated base in the water by boiling.
lution fluid or the Sample, except for apparatus
Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization
that is supplied sterile (particularly plastic appar-
it is 7,0 “C at 25 “C.
atus).
Dispense the base into bottles or flasks in quantities
6.1 Apparatus
of 100 ml.
Sterilize for 15 min in the autoclave (6.1 .1.2) set at
Usual microbiological laboratory apparatus and, in
121 “C. Cool to 45 “C.
particular, the following.
5.2.8.2 Blood medium
6.1.1 Apparatus for dry sterilization (oven) or
wet sterilization (autoclave) (see ISO 7218)
5.2.8.2.1 Composition
6.1.1.1 Oven, capable of operating at 173 “C
+ 3 “C.
-
100 ml
Basal layer medium (5.2.8.1)
6.1.1.2 Autoclave, capable of operating at 121 “C
7 ml
Sheep or horse defibrinated blood
+ 1 “C.
-
6.1.2 lncubator, capable of operating at 30 “C
5.2.8.2.2 Preparation
+ 1 “C.
-
Add the defibrinated blood to the sterilized, molten
6.1.3 Incubator, capable of operating at 37 “C
base (5.2.8.1).
+ 1 “C.
-
5.2.8.3 Complete medium
6.1.4 Incubator, capable of operating at 25 “C
+ 1 “C.
-
Dispense the base (5.2.8.1) into sterile Petri dishes in
quantities of about 10 ml and allow to solidify. Pour a
very thin layer of the blood medium (5.2.8.2) using 6.1.5 Water baths, capable of being maintained at
amounts not greater than 3 ml per plate. 45 “C + 1 “C or at 37 “C & 1 “C.
-
Allow to solidify in an even layer. If the blood is added
6.1.6 Blending equipment
to dishes containing the base which have been pre-
pared in advance, it may be necessary to warm the
Use one of the following:
dishes for 20 min by placing them in an incubator set
at 37 “C before pouring the blood layer.
a) rotary blender, operating at a rotational frequency
between 8 000 min-’ and 45 000 min-‘, with
Dry the plates before use.
glass or metal bowls fitted with lids, resistant to
the conditions of sterilization; or
5.2.8.4 CAMP reaction cultures
b) peristaltic-type blender (stomacher), with sterile
A weakly b-haemolytic strain of Staphylococcus
plastic bags.
aureus (e.g. NCTC 1803) and a strain of Rhodococcus
equi (e.g. NCTC 1621) are required to undertake the
NOTE 4 The bowls or plastic bags should have suf-
CAMP test. Not all strains of Staphyococcus aureus ficient capacity to allow the Sample to be properly mixed
with the appropriate amount of diluent. In general, the
are suitable for the CAMP test.
5
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 10560:1993(E)
volume of the Container should be equal to about twice Sampling is not patt of the method specified in this
the volume of the Sample plus diluent.
pling
International Standard. A recommended san
method is given in ISO 707 Ul.
6.1.7 Loops, of platinum/iridium, nickel/chromium
The instructions for sampling for microbiologica
or plastic, of diameter approximately 3 mm.
poses should be followed.
6.1.8 Inoculating needle, of platinum/iridium,
nickel/chromium or plastic.
8 Preparation of test Sample
See ISO 8261.
6.1.9 Temperature-compensated pH-meter (for
measuring the pH of prepared media and reagents),
accurate to + 0,l pH units at 25 “C.
-
8.1 Milk
6.1.10 Refrigerator (for storage of prepared media Agitate the Sample carefully so that the microorgan-
and reagents), capable of operating at + 2 “C to isms are distributed as evenly as possible by rapidly
+ 5 “C. inverting the Sample Container 25 times. Foaming
should be avoided or foam allowed to disperse. The
interval between mixing and removing the test Portion
6.1.11 Source of beamed white light
should not exceed 3 min.
6.1.12 Mirror, flat or concave.
8.2 Dried milk, dried whey, dried buttermilk,
lactose, casein and caseinate
6.1.13 Tripod, for illuminating Petri dishes.
Thoroughly mix the contents of th
...
NORME
ISO
INTERNATIONALE
10560
Première édition
1993-08-o 1
Lait et produits laitiers - Recherche de
Lister;a monocytogenes
Milk and milk products -
Detection of Listeria monocytogenes
Numéro de référence
10560:1993(F)
60
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 10560:1993(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mités membres votants.
La Norme internationale ISO 10560 a été élaborée par le comité technique
ISO/TC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et pro-
duits laitiers, en collaboration avec la Fédération internationale de laiterie
(FIL) et l’Association des chimistes analytiques officiels (AOAC) et sera
également publiée par ces organisations.
L’annexe A fait partie intégrante de la présente Norme internationale.
L’annexe B est donnée uniquement à titre d’information.
0 ISO 1993
Droits de reproduction réservés. Aucune partie de cette publication ne peut être reproduite
ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-l 211 Genève 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
II
---------------------- Page: 2 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 10560:1993(F)
Recherche de Lisferia
Lait et produits laitiers -
monocytogenes
différenciée d’autres espèces non pathogènes se
1 Domaine d’application
preésentant dans le lait et les produits laitiers par des
caractéristiques biochimiques spécifiques.
La présente Norme internationale prescrit des mé-
thodes de recherche des Listeria monocytogenes
dans le lait et les produits laitiers.
3.2 recherche de Listeria monocytogenes: Déter-
mination de la présence ou de l’absence de ce
microorganisme dans une masse ou un volume dé-
les essais sont effectués selon la
terminé, quand
2 Références normatives
?
présente Norme internationale.
Les normes suivantes contiennent des dispositions
qui, par suite de la référence qui en est faite, consti-
tuent des dispositions valables pour la présente
Norme internationale. Au moment de la publication,
les éditions indiquées étaient en vigueur. Toute
4 Principe
norme est sujette a révision et les parties prenantes
des accords fondés sur la présente Norme internatio-
En général, la recherche de Listeria spp. nécessite au
nale sont invitées a rechercher la possibilité d’appli-
quer les éditions les plus récentes des normes moins trois étapes successives telles que décrites de
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de I’ISO 4.1 a 4.3. Voir également la représentation schémati-
possèdent le registre des Normes internationales en que du mode opératoire, figure 1.
vigueur à un moment donne.
ISO 72 18: 1985, Microbiologie - Directives générales
Prise d’essai (25 g ou 25 ml)
pour les examens microbiologiques.
+
Milieu d’enrichissement sélectif (225 ml)
ISO 8261 :1989, Lait et produits laitiers - Préparation
des échantillons pour essai et des dilutions en vue de
Incubation à 30 “C pendant 48 h
l’examen microbiologique.
1
Ensemencement en stries sur gélose d’Oxford
1
3 Définitions
Incubation à 37 “C pendant 48 h
1
Pour les besoins de la présente Norme internationale,
Sélection de cinq colonies caractéristiques (pour
les définitions suivantes s’appliquent.
chaque boîte)
1
3.1 Lister!a spp.: Microorganismes formant des co-
Ensemencement sur TSYEA
lonies typiques sur un milieu sélectif solide et possé-
1
dant les caractéristiques morphologiques, physio-
Incubation a 37 “C pendant 24 h (ou plus, si né-
logiques et biochimiques decrites quand les essais
cessaire)
sont effectués selon la présente Norme internatio-
1
nale.
Examens complémentaires
3.1 .l Listeria monocytogenes: Espéce de Listeria Figure 1 - Représentation schématique du
qui est considéree comme pathogéne et qui peut être mode opératoire
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 10560:1993(F)
Enrichissement en milieu sélectif liquide Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’après stérili-
4.1
sation, il soit de 7,3 “C a 25 OC.
Ensemencement du milieu sélectif avec la prise d’es-
Répartir le milieu de base par quantités de 225 ml
sai de l’échantillon et incubation a 30 “C pendant
dans des flacons de 500 ml (ou par multiples de
48 h.
225 ml dans des flacons de capacité appropriée).
Stériliser à l’autoclave (6.1 .1.2) réglé a 121 “C pendant
4.2 Isolement et identification présumée
15 min.
Ensemencement du milieu d’isolement avec la culture
5.2.1.2 Supplément 1
obtenue dans le milieu d’enrichissement (4.1),
incubation à 37 “C et examen après 48 h pour vérifier
la présence de colonies qui, selon leur apparence,
5.2.1.2.1 Composition
sont considérées comme des Listeria spp. présu-
mées.
Chlorhydrate d’acriflavine 23 mg
4.3 Confirmation
Eau 10 ml
Repiquage de colonies de Listeria spp. présumées
(4.2) sur milieu solide non sélectif, et confirmation de
l’identité par des essais morphologiques, physio-
5.2.1.2.2 Préparation
logiques et biochimiques appropriés.
Dissoudre le chlorhydrate dans l’eau. Stériliser par fil-
tration.
5 Milieux de culture et réactif
NOTE 1 Pour de plus amples détails à propos de la
technique de stérilisation par filtration, on pourra se référer
5.1 Généralités
à n’importe quel ouvrage de microbiologie approprié.
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir
5.2.1.3 Supplément 2
ISO 7218.
5.2.1.3.1 Composition
5.2 Milieux de culture
5.2.1 Milieu sélectif: Bouillon d’enrichissement
Sel de sodium de l’acide nalidixique 46 mg
10 ml
Hydroxyde de sodium (0,05 mol/l)
5.2.1 .l Base
5.2.1 .l .l Composition
5.2.1.3.2 Préparation
Bouillon de tryptone sojal)
30 g Dissoudre l’acide nalidixique dans la solution d’hy-
droxyde de sodium. Stériliser par filtration.
Extrait de levure
6g
Eau 1 000 ml
5.2.1.4 Supplément 3
1) Composants du bouillon de tryptone soja
5.2.1.4.1 Composition
Tryptone (digestat pancréatique de caséine):
17 g
Sojatone (digestat papaïque de farine de soja):
Cycloheximide 57,5 mg
3g
Glucose: 2,5 g
Éthanol 4 ml
Chlorure de sodium: 5 g
Eau 6 ml
Phosphate dipotassique: 2,5 g
5.2.1 .1.2 Préparation 5.2.1.4.2 Préparation
Dissoudre les composants ou le milieu complet
Dissoudre la cycloheximide dans le mélange
deshydraté dans l’eau, en portant a l’ébullition.
éthanol/eau.
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 10560:1993(F)
5.2.1.5 Milieu complet Refroidir a 50 “C et ajouter aseptiquement le supplé-
ment (5.2.2.2). Le pH du milieu final doit être de
7,0 “C à 25 “C.
Conserver la base (5.2.1 .l ) et les suppléments
preparés (5.2.1.2 à 5.2.1.4) séparément dans I’obscu-
Repartir le milieu par quantités de 15 ml dans des
rite a une temperature comprise entre 2 OC et 5 OC.
boîtes de Petri stériles et le laisser se solidifier.
Préparer le milieu complet en ajoutant 1 ml de sup-
plément 1, 2 ml de supplément 2 et 2 ml de supplé-
ment 3 a 225 ml du milieu de base (5.2.1 .l ).
5.2.3 Milieu de culture gélosé: Tryptone soja
extrait de levure (TSYEA)
NOTE 2 Si nécessaire on pourra utiliser respectivement
des multiples de 1 ml, de 2 ml et 225 ml, placés dans des
flacons de capacité appropriée.
5.2.3.1 Composition
5.2.2 Milieu d’isolement (gélose d’Oxford)
Bouillon de tryptone soja
30 g
5.2.2.1 Milieu de base gelosé
Extrait de levure
6g
Agar-agarl) 12 g à 18 g
5.2.2.1 .l Composition
Eau 1 000 ml
1) Selon le pouvoir gélifiant de I’Agar-agar.
Gélose Columbia
39 g
Esculine
lg
Citrate de fer(l II) ammoniacal
0’5 g
5.2.3.2 Phparation
Chlorure de lithium
15g
Dissoudre les composants ou le milieu complet des-
Eau 1 000 ml
hydrate dans l’eau, en portant à I’ebullition.
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’après stérili-
5.2.2.1.2 Préparation sation, il soit de 7,3 “C à 25 “C.
Repartir le milieu de culture, par quantités d’environ
Dissoudre les ingrédients solides dans l’eau en por-
6 ml dans des tubes (6.2.2).
tant a I’ebullition.
Steriliser à l’autolave (6.1 .1.2) réglé à 121 “C pendant
Suppl6ment pour un milieu de 500 ml
5.2.2.2
15 min.
Laisser refroidir les tubes en position inclinée.
5.2.2.2.1 Composition
Pour la préparation des boîtes de gélose, steriliser le
milieu de culture solide dans des flacons de capacité
200 mg
Cycloheximide
appropriee. Repartir le milieu pendant qu’il est encore
liquide par quantités d’environ 15 ml dans des boîtes
Sulfate de colistine 10 mg
de Petri steriles et le laisser se solidifier.
Acrif lavine
25 mg
1 mg
Céfotetan
5.2.4 Milieu de culture liquide: Tryptone soja
Fosphomycine 5 mg
extrait de levure (TSYEB)
Éthanol 2,5 ml
Eau 2,5 ml
5.2.4.1 Composition
La composition du milieu est decrite en 5.2.1 .l .l .
Utiliser 6 g d’extrait de levure.
5.2.2.2.2 Préparation
Dissoudre les ingrédients solides dans le mélange
5.2.4.2 Préparation
éthanol/eau. Stériliser par filtration.
Préparer le mileu de culture comme décrit en
5.2.2.3 Préparation du milieu complet
5.2.1 .1.2.
Prelever 500 ml de base gélosée (5.2.2.1). Steriliser Repartir le milieu par quantités d’environ 6 ml dans
des tubes, avant de stériliser a l’autoclave.
a l’autoclave (6.1 .1.2) réglé à 121 OC pendant 15 min.
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 10560:1993(F)
5.2.5 Gélose au sang Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’après stérili-
sation, il soit de 6,8 “C a 25 OC.
5.2.5.1 Composition
Répartir dans des tubes par quantités telles qu’après
stérilisation, il reste 9 ml.
Base de gélose au sang no 21)
Stériliser l’autoclave (6.1 J.2) réglé a 121 “C pendant
40 cl
15 min.
Eau
1 000 ml
Sang défibriné de. cheval ou de mou-
5.2.6.2 Solutions d’hydrates de carbone
ton 70 ml
5.2.6.2.1 Composition
1) Composition de la base de gélose au sang
no 2
Peptone de proteose: 15 g
Hydrate de carbonel)
5g
Digestat de foie: 2,5 g
Eau 100 ml
Extrait de levure: 5 g
Chlorure de sodium: 5 g
Agar-Agar (selon le pouvoir gélifiant de I’agar-
1) 100 ml de solution de L-rhamnose et 100 ml
agar): 12 g a 18 g
de solution de D-xybse sont nécessaires.
5.2.5.2 Préparation
5.2.6.2.2 Préparation
Dissoudre la base de gélose au sang déshydratée
Dissoudre séparément chaque hydrate de carbone
dans l’eau, en portant a l’ébullition.
dans 100 ml d’eau. Stériliser par filtration.
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’après sterili-
sation, il soit de 7,0 “C à 25 “C.
5.2.6.3 Milieu complet
Repartir la base dans des flacons de 500 ml de capa-
Pour chacun des hydrates de carbone, ajouter
cité maximale.
aséptiquement 1 ml de solution (5.2.6.2) à 9 ml de
milieu de base (5.2.6.1). Si de plus petits volumes de
Stériliser à l’autoclave (6.1 .1.2) réglé a 121 “C pendant
milieu de base ont été préparés, ajouter alors
15 min.
également de plus petits volumes de solution
Refroidir le milieu a 45 “C. Ajouter le sang défibriné d’hydrate de carbone.
et bien mélanger.
5.2.7 Milieu de motilité
Répartir le milieu par quantités d’environ 20 ml dans
des boîtes de Pétri stériles et le laisser se solidifier.
5.2.7.1 Composition
5.2.6 Bouillon pour l’utilisation des hydrates de
carbone
Peptone de caséine
mo g
5.2.6.1 Base
Peptone de viande
61 g
Agar-agar
33 g
5.2.6.1 .l Composition
Eau 1 000 ml
Protéose peptone
1og
Extrait de boeuf 5.2.7.2 Préparation
Ig
Chlorure de sodium
5g
Dissoudre les composants dans l’eau en portant à
Pourpre de bromocrésol
om g
l’ébullition.
Eau 1 000 ml
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’après stérili-
sation, il soit de 7,3 “C à 25 “C.
5.2.6.1.2 Préparation
Répartir dans des tubes par quantités d’environ 5 ml. .
Dissoudre les composants dans l’eau en portant a Stériliser à l’autoclave (6.1 .1.2) réglé a 121 “C pendant
l’ébullition. 15 min.
4
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO ‘10560:1993(F)
NOTE 3 Les milieux disponibles dans le commerce pour
parées à l’avance, il peut s’avérer necessaire de
l’examen de la motilité peuvent être utilisés.
chauffer les boîtes pendant 20 min en les plaçant
dans une étuve réglée a 37 “C avant de verser la pel-
licule de sang.
5.2.8 Essai de CAMP (Christie, Atkins,
Munch-Petersen)
Sécher les boîtes avant l’emploi.
Les boîtes de gélose au sang (5.2.5) peuvent convenir
5.2.8.4 Cultures de réaction CAMP
pour cet essai, mais il est préférable d’utiliser des
boîtes de Petri à deux très minces couches de gélose
Une souche faiblement /%hémolytique de Staphylo-
au sang de mouton (5.2.8.3).
CO~CUS aureus (par exemple, NCTC 1803) et une
souche de Rhodococcus equi (par exemple, NCTC
1621) sont nécessaires pour réaliser l’essai de CAMP.
5.2.8.1 Base
Toutes les souches de Staphylococcus aureus ne se
prêtent pas à l’essai de CAMP.
5.2.8.1 .l Composition
Conserver les cultures de S. aureus, R. equi, L. mo-
nocytogenes, L. innocua et L. ivanovii en ensemen-
çant les tubes inclines de TSYEA (5.2.3), et en
Base de gélose au sang no 2 (voir 5.2.5)
40 g
incubant a 37 “C pendant 24 h à 28 h, ou jusqu’à ce
Eau 1 000 ml
qu’une croissance se produise, et les conserver au
réfrigérateur (6.1 .lO) à 4 OC. Repiquer les cultures au
moins une fois par mois.
5.2.8.1.2 Préparation
5.3 Réactif
Dissoudre la base déshydratée dans l’eau en portant
a l’ébullition.
5.3.1 Solution de peroxyde d’hydrogène,
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’aprés stérili-
3 % (Vw)
sation, il soit de 7,0 “C à 25 “C.
Repartir dans des tubes ou des flacons par quantités
6 Appareillage et verrerie
de 100 ml.
IMPORTANT - Stériliser tous les appareils qui
Stériliser l’autoclave (6.1 J.2) réglé à 121 “C pendant
entreront en contact avec les milieux de culture,
15 min. Laisser refroidir a 45 OC.
le liquide de dilution ou l’échantillon, sauf s’il
s’agit d’appareils livres en condition stérile (en
5.2.8.2 Milieu au sang
particulier les appareils en matière plastique).
5.2.8.2.1 Composition
6.1 Appareillage
Materiel courant de laboratoire de microbiologie et,
en particulier, ce qui suit.
Couche de base (5.2.8.1) 100 ml
7 ml
Sang défibrine de cheval ou de mouton
6.1.1 Appareils pour la stbrilisation en chaleur
sèche (four) ou en chaleur humide (autoclave) (voir
ISO 7218)
5.2.8.2.2 Preparation
Four, réglable a 173 “C k 3 “C.
6.1.1.1
Ajouter le sang défibrine à la base fondue et sterilisée
(5.2.8.1).
6.1.1.2 Autoclave, réglable à 121 .“C + 1 “C.
5.2.8.3 Milieu complet
6.1.2 Étuve, réglable a 30 “C & 1 OC.
Répartir la base (5.2.8.1) dans des boîtes de Petri
steriles par quantités d’environ 10 ml et laisser se 6.1.3 Étuve, réglable à 37 “C & 1 OC.
solidifier. Verser une tres fine couche du milieu de
sang (5.2.8.2) en utilisant des quantités n’excédant
6.1.4 Étuve, réglable a 25 “C & 1 OC.
pas 3 ml par boîte.
6.1.5 Bains d’eau, réglables à 45 “C & 1 “C ou à
Laisser se solidifier en une pellicule uniforme. Si le
37 “C * 1 “C.
sang est ajoute à des boîtes contenant la base pré-
---------------------- Page: 7 ----------------------
6.1.6 Appareillage pour l’homogénéisation 6.2.4 Pipettes graduées, de 25 ml, 10 ml et 1 ml
de capacité, graduées respectivement en 0,5 ml,
Utiliser l’un des appareils suivants:
0,5 ml et 0,l ml.
homogénéisateur rotatif, dont la fréquence de
a)
6.2.5 Boîtes de Pétri stériles
rotation est comprise entre 8 000 min-’ et
45 000 min-’ , avec des bols en verre ou en métal,
munis de couvercles resistant aux conditions de
6.2.6 Lames pour microscope
stérilisation; ou
6.2.7 Billes en verre
homogénéisateur de
péristaltique
b) type
(stomacher), avec des sacs stériles en matiére
plastique.
7 Échantillonnage
NOTE 4 Les bols ou les sacs en matière plastique
doivent avoir une capacité suffisante pour permettre de II est important que le laboratoire reçoive un échan-
mélanger correctement la prise d’essai avec la quantité tillon réellement représentatif, non endommagé ou
appropriée de diluant. En général, le volume du récipient
modifié lors du transport et de l’entreposage.
doit être environ le double du volume de la prise d’essai
additionnée du diluant. L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode
spécifiée dans la présente Norme internationale. Une
méthode d’échantillonnage recommandée est donnée
6.1.7 Anses bouclées, en platine iridié ou en
dans I’ISO 707 CII.
nickel-chrome, ou en matière plastique, d’environ
3 mm de diamètre.
II convient de suivre les instructions pour I’échan-
tillonnage à des fins microbiologiques.
6.1.8 Fil d’ensemencement, en platineliridié, en
nickel-chrome ou en matière plastique.
8 Préparation de l’échantillon
6.1.9 pH-mètre à température compensée (pour
mesurer le pH des milieux préparé et des réactifs),
Voir ISO 8261.
précis à + 0,l unité le pH a 25 “C.
-
8.1 Lait
6.1.10 Réfrigérateur (pour conserver les milieux
préparés et les réactifs), pouvant fonctionner a une
Agiter soigneusement l’échantillon afin d’assurer une
température comprise entre + 2 “C et + 5 OC.
répartition aussi uniforme que possible des
microorganismes, en retournant rapidement 25 fois le
6.1.11 Faisceau de lumière blanche
recipient contenant l’échantillon. II faut éviter la for-
mation de mousse ou bien la laisser se disperser si
6.1.12 Miroir, plat ou concave.
elle se forme. L’intervalle de temps entre le mélange
et le prélèvement de la prise d’essai ne doit pas dé-
passer 3 min.
6.1.13 Trépied, pour éclairer les boîtes de Pétri.
6.1.14 Microscope a contraste de phase, avec ob-
Lait sec, poudre de lactosérum, babeurre
8.2
jectif à immersion à I’huile.
en poudre, lactose, caséine, caséinate
6.2 Verrerie Mélanger soigneusement le contenu du récipient
fermé en secouant et en retournant manuellement de
La verrerie doit resister à des stérilisations répétées.
façon répétée. Si le récipient est trop rempli pour
pe
...
NORME
ISO
INTERNATIONALE
10560
Première édition
1993-08-o 1
Lait et produits laitiers - Recherche de
Lister;a monocytogenes
Milk and milk products -
Detection of Listeria monocytogenes
Numéro de référence
10560:1993(F)
60
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 10560:1993(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mités membres votants.
La Norme internationale ISO 10560 a été élaborée par le comité technique
ISO/TC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et pro-
duits laitiers, en collaboration avec la Fédération internationale de laiterie
(FIL) et l’Association des chimistes analytiques officiels (AOAC) et sera
également publiée par ces organisations.
L’annexe A fait partie intégrante de la présente Norme internationale.
L’annexe B est donnée uniquement à titre d’information.
0 ISO 1993
Droits de reproduction réservés. Aucune partie de cette publication ne peut être reproduite
ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-l 211 Genève 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
II
---------------------- Page: 2 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 10560:1993(F)
Recherche de Lisferia
Lait et produits laitiers -
monocytogenes
différenciée d’autres espèces non pathogènes se
1 Domaine d’application
preésentant dans le lait et les produits laitiers par des
caractéristiques biochimiques spécifiques.
La présente Norme internationale prescrit des mé-
thodes de recherche des Listeria monocytogenes
dans le lait et les produits laitiers.
3.2 recherche de Listeria monocytogenes: Déter-
mination de la présence ou de l’absence de ce
microorganisme dans une masse ou un volume dé-
les essais sont effectués selon la
terminé, quand
2 Références normatives
?
présente Norme internationale.
Les normes suivantes contiennent des dispositions
qui, par suite de la référence qui en est faite, consti-
tuent des dispositions valables pour la présente
Norme internationale. Au moment de la publication,
les éditions indiquées étaient en vigueur. Toute
4 Principe
norme est sujette a révision et les parties prenantes
des accords fondés sur la présente Norme internatio-
En général, la recherche de Listeria spp. nécessite au
nale sont invitées a rechercher la possibilité d’appli-
quer les éditions les plus récentes des normes moins trois étapes successives telles que décrites de
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de I’ISO 4.1 a 4.3. Voir également la représentation schémati-
possèdent le registre des Normes internationales en que du mode opératoire, figure 1.
vigueur à un moment donne.
ISO 72 18: 1985, Microbiologie - Directives générales
Prise d’essai (25 g ou 25 ml)
pour les examens microbiologiques.
+
Milieu d’enrichissement sélectif (225 ml)
ISO 8261 :1989, Lait et produits laitiers - Préparation
des échantillons pour essai et des dilutions en vue de
Incubation à 30 “C pendant 48 h
l’examen microbiologique.
1
Ensemencement en stries sur gélose d’Oxford
1
3 Définitions
Incubation à 37 “C pendant 48 h
1
Pour les besoins de la présente Norme internationale,
Sélection de cinq colonies caractéristiques (pour
les définitions suivantes s’appliquent.
chaque boîte)
1
3.1 Lister!a spp.: Microorganismes formant des co-
Ensemencement sur TSYEA
lonies typiques sur un milieu sélectif solide et possé-
1
dant les caractéristiques morphologiques, physio-
Incubation a 37 “C pendant 24 h (ou plus, si né-
logiques et biochimiques decrites quand les essais
cessaire)
sont effectués selon la présente Norme internatio-
1
nale.
Examens complémentaires
3.1 .l Listeria monocytogenes: Espéce de Listeria Figure 1 - Représentation schématique du
qui est considéree comme pathogéne et qui peut être mode opératoire
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 10560:1993(F)
Enrichissement en milieu sélectif liquide Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’après stérili-
4.1
sation, il soit de 7,3 “C a 25 OC.
Ensemencement du milieu sélectif avec la prise d’es-
Répartir le milieu de base par quantités de 225 ml
sai de l’échantillon et incubation a 30 “C pendant
dans des flacons de 500 ml (ou par multiples de
48 h.
225 ml dans des flacons de capacité appropriée).
Stériliser à l’autoclave (6.1 .1.2) réglé a 121 “C pendant
4.2 Isolement et identification présumée
15 min.
Ensemencement du milieu d’isolement avec la culture
5.2.1.2 Supplément 1
obtenue dans le milieu d’enrichissement (4.1),
incubation à 37 “C et examen après 48 h pour vérifier
la présence de colonies qui, selon leur apparence,
5.2.1.2.1 Composition
sont considérées comme des Listeria spp. présu-
mées.
Chlorhydrate d’acriflavine 23 mg
4.3 Confirmation
Eau 10 ml
Repiquage de colonies de Listeria spp. présumées
(4.2) sur milieu solide non sélectif, et confirmation de
l’identité par des essais morphologiques, physio-
5.2.1.2.2 Préparation
logiques et biochimiques appropriés.
Dissoudre le chlorhydrate dans l’eau. Stériliser par fil-
tration.
5 Milieux de culture et réactif
NOTE 1 Pour de plus amples détails à propos de la
technique de stérilisation par filtration, on pourra se référer
5.1 Généralités
à n’importe quel ouvrage de microbiologie approprié.
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir
5.2.1.3 Supplément 2
ISO 7218.
5.2.1.3.1 Composition
5.2 Milieux de culture
5.2.1 Milieu sélectif: Bouillon d’enrichissement
Sel de sodium de l’acide nalidixique 46 mg
10 ml
Hydroxyde de sodium (0,05 mol/l)
5.2.1 .l Base
5.2.1 .l .l Composition
5.2.1.3.2 Préparation
Bouillon de tryptone sojal)
30 g Dissoudre l’acide nalidixique dans la solution d’hy-
droxyde de sodium. Stériliser par filtration.
Extrait de levure
6g
Eau 1 000 ml
5.2.1.4 Supplément 3
1) Composants du bouillon de tryptone soja
5.2.1.4.1 Composition
Tryptone (digestat pancréatique de caséine):
17 g
Sojatone (digestat papaïque de farine de soja):
Cycloheximide 57,5 mg
3g
Glucose: 2,5 g
Éthanol 4 ml
Chlorure de sodium: 5 g
Eau 6 ml
Phosphate dipotassique: 2,5 g
5.2.1 .1.2 Préparation 5.2.1.4.2 Préparation
Dissoudre les composants ou le milieu complet
Dissoudre la cycloheximide dans le mélange
deshydraté dans l’eau, en portant a l’ébullition.
éthanol/eau.
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 10560:1993(F)
5.2.1.5 Milieu complet Refroidir a 50 “C et ajouter aseptiquement le supplé-
ment (5.2.2.2). Le pH du milieu final doit être de
7,0 “C à 25 “C.
Conserver la base (5.2.1 .l ) et les suppléments
preparés (5.2.1.2 à 5.2.1.4) séparément dans I’obscu-
Repartir le milieu par quantités de 15 ml dans des
rite a une temperature comprise entre 2 OC et 5 OC.
boîtes de Petri stériles et le laisser se solidifier.
Préparer le milieu complet en ajoutant 1 ml de sup-
plément 1, 2 ml de supplément 2 et 2 ml de supplé-
ment 3 a 225 ml du milieu de base (5.2.1 .l ).
5.2.3 Milieu de culture gélosé: Tryptone soja
extrait de levure (TSYEA)
NOTE 2 Si nécessaire on pourra utiliser respectivement
des multiples de 1 ml, de 2 ml et 225 ml, placés dans des
flacons de capacité appropriée.
5.2.3.1 Composition
5.2.2 Milieu d’isolement (gélose d’Oxford)
Bouillon de tryptone soja
30 g
5.2.2.1 Milieu de base gelosé
Extrait de levure
6g
Agar-agarl) 12 g à 18 g
5.2.2.1 .l Composition
Eau 1 000 ml
1) Selon le pouvoir gélifiant de I’Agar-agar.
Gélose Columbia
39 g
Esculine
lg
Citrate de fer(l II) ammoniacal
0’5 g
5.2.3.2 Phparation
Chlorure de lithium
15g
Dissoudre les composants ou le milieu complet des-
Eau 1 000 ml
hydrate dans l’eau, en portant à I’ebullition.
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’après stérili-
5.2.2.1.2 Préparation sation, il soit de 7,3 “C à 25 “C.
Repartir le milieu de culture, par quantités d’environ
Dissoudre les ingrédients solides dans l’eau en por-
6 ml dans des tubes (6.2.2).
tant a I’ebullition.
Steriliser à l’autolave (6.1 .1.2) réglé à 121 “C pendant
Suppl6ment pour un milieu de 500 ml
5.2.2.2
15 min.
Laisser refroidir les tubes en position inclinée.
5.2.2.2.1 Composition
Pour la préparation des boîtes de gélose, steriliser le
milieu de culture solide dans des flacons de capacité
200 mg
Cycloheximide
appropriee. Repartir le milieu pendant qu’il est encore
liquide par quantités d’environ 15 ml dans des boîtes
Sulfate de colistine 10 mg
de Petri steriles et le laisser se solidifier.
Acrif lavine
25 mg
1 mg
Céfotetan
5.2.4 Milieu de culture liquide: Tryptone soja
Fosphomycine 5 mg
extrait de levure (TSYEB)
Éthanol 2,5 ml
Eau 2,5 ml
5.2.4.1 Composition
La composition du milieu est decrite en 5.2.1 .l .l .
Utiliser 6 g d’extrait de levure.
5.2.2.2.2 Préparation
Dissoudre les ingrédients solides dans le mélange
5.2.4.2 Préparation
éthanol/eau. Stériliser par filtration.
Préparer le mileu de culture comme décrit en
5.2.2.3 Préparation du milieu complet
5.2.1 .1.2.
Prelever 500 ml de base gélosée (5.2.2.1). Steriliser Repartir le milieu par quantités d’environ 6 ml dans
des tubes, avant de stériliser a l’autoclave.
a l’autoclave (6.1 .1.2) réglé à 121 OC pendant 15 min.
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 10560:1993(F)
5.2.5 Gélose au sang Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’après stérili-
sation, il soit de 6,8 “C a 25 OC.
5.2.5.1 Composition
Répartir dans des tubes par quantités telles qu’après
stérilisation, il reste 9 ml.
Base de gélose au sang no 21)
Stériliser l’autoclave (6.1 J.2) réglé a 121 “C pendant
40 cl
15 min.
Eau
1 000 ml
Sang défibriné de. cheval ou de mou-
5.2.6.2 Solutions d’hydrates de carbone
ton 70 ml
5.2.6.2.1 Composition
1) Composition de la base de gélose au sang
no 2
Peptone de proteose: 15 g
Hydrate de carbonel)
5g
Digestat de foie: 2,5 g
Eau 100 ml
Extrait de levure: 5 g
Chlorure de sodium: 5 g
Agar-Agar (selon le pouvoir gélifiant de I’agar-
1) 100 ml de solution de L-rhamnose et 100 ml
agar): 12 g a 18 g
de solution de D-xybse sont nécessaires.
5.2.5.2 Préparation
5.2.6.2.2 Préparation
Dissoudre la base de gélose au sang déshydratée
Dissoudre séparément chaque hydrate de carbone
dans l’eau, en portant a l’ébullition.
dans 100 ml d’eau. Stériliser par filtration.
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’après sterili-
sation, il soit de 7,0 “C à 25 “C.
5.2.6.3 Milieu complet
Repartir la base dans des flacons de 500 ml de capa-
Pour chacun des hydrates de carbone, ajouter
cité maximale.
aséptiquement 1 ml de solution (5.2.6.2) à 9 ml de
milieu de base (5.2.6.1). Si de plus petits volumes de
Stériliser à l’autoclave (6.1 .1.2) réglé a 121 “C pendant
milieu de base ont été préparés, ajouter alors
15 min.
également de plus petits volumes de solution
Refroidir le milieu a 45 “C. Ajouter le sang défibriné d’hydrate de carbone.
et bien mélanger.
5.2.7 Milieu de motilité
Répartir le milieu par quantités d’environ 20 ml dans
des boîtes de Pétri stériles et le laisser se solidifier.
5.2.7.1 Composition
5.2.6 Bouillon pour l’utilisation des hydrates de
carbone
Peptone de caséine
mo g
5.2.6.1 Base
Peptone de viande
61 g
Agar-agar
33 g
5.2.6.1 .l Composition
Eau 1 000 ml
Protéose peptone
1og
Extrait de boeuf 5.2.7.2 Préparation
Ig
Chlorure de sodium
5g
Dissoudre les composants dans l’eau en portant à
Pourpre de bromocrésol
om g
l’ébullition.
Eau 1 000 ml
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’après stérili-
sation, il soit de 7,3 “C à 25 “C.
5.2.6.1.2 Préparation
Répartir dans des tubes par quantités d’environ 5 ml. .
Dissoudre les composants dans l’eau en portant a Stériliser à l’autoclave (6.1 .1.2) réglé a 121 “C pendant
l’ébullition. 15 min.
4
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ISO ‘10560:1993(F)
NOTE 3 Les milieux disponibles dans le commerce pour
parées à l’avance, il peut s’avérer necessaire de
l’examen de la motilité peuvent être utilisés.
chauffer les boîtes pendant 20 min en les plaçant
dans une étuve réglée a 37 “C avant de verser la pel-
licule de sang.
5.2.8 Essai de CAMP (Christie, Atkins,
Munch-Petersen)
Sécher les boîtes avant l’emploi.
Les boîtes de gélose au sang (5.2.5) peuvent convenir
5.2.8.4 Cultures de réaction CAMP
pour cet essai, mais il est préférable d’utiliser des
boîtes de Petri à deux très minces couches de gélose
Une souche faiblement /%hémolytique de Staphylo-
au sang de mouton (5.2.8.3).
CO~CUS aureus (par exemple, NCTC 1803) et une
souche de Rhodococcus equi (par exemple, NCTC
1621) sont nécessaires pour réaliser l’essai de CAMP.
5.2.8.1 Base
Toutes les souches de Staphylococcus aureus ne se
prêtent pas à l’essai de CAMP.
5.2.8.1 .l Composition
Conserver les cultures de S. aureus, R. equi, L. mo-
nocytogenes, L. innocua et L. ivanovii en ensemen-
çant les tubes inclines de TSYEA (5.2.3), et en
Base de gélose au sang no 2 (voir 5.2.5)
40 g
incubant a 37 “C pendant 24 h à 28 h, ou jusqu’à ce
Eau 1 000 ml
qu’une croissance se produise, et les conserver au
réfrigérateur (6.1 .lO) à 4 OC. Repiquer les cultures au
moins une fois par mois.
5.2.8.1.2 Préparation
5.3 Réactif
Dissoudre la base déshydratée dans l’eau en portant
a l’ébullition.
5.3.1 Solution de peroxyde d’hydrogène,
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’aprés stérili-
3 % (Vw)
sation, il soit de 7,0 “C à 25 “C.
Repartir dans des tubes ou des flacons par quantités
6 Appareillage et verrerie
de 100 ml.
IMPORTANT - Stériliser tous les appareils qui
Stériliser l’autoclave (6.1 J.2) réglé à 121 “C pendant
entreront en contact avec les milieux de culture,
15 min. Laisser refroidir a 45 OC.
le liquide de dilution ou l’échantillon, sauf s’il
s’agit d’appareils livres en condition stérile (en
5.2.8.2 Milieu au sang
particulier les appareils en matière plastique).
5.2.8.2.1 Composition
6.1 Appareillage
Materiel courant de laboratoire de microbiologie et,
en particulier, ce qui suit.
Couche de base (5.2.8.1) 100 ml
7 ml
Sang défibrine de cheval ou de mouton
6.1.1 Appareils pour la stbrilisation en chaleur
sèche (four) ou en chaleur humide (autoclave) (voir
ISO 7218)
5.2.8.2.2 Preparation
Four, réglable a 173 “C k 3 “C.
6.1.1.1
Ajouter le sang défibrine à la base fondue et sterilisée
(5.2.8.1).
6.1.1.2 Autoclave, réglable à 121 .“C + 1 “C.
5.2.8.3 Milieu complet
6.1.2 Étuve, réglable a 30 “C & 1 OC.
Répartir la base (5.2.8.1) dans des boîtes de Petri
steriles par quantités d’environ 10 ml et laisser se 6.1.3 Étuve, réglable à 37 “C & 1 OC.
solidifier. Verser une tres fine couche du milieu de
sang (5.2.8.2) en utilisant des quantités n’excédant
6.1.4 Étuve, réglable a 25 “C & 1 OC.
pas 3 ml par boîte.
6.1.5 Bains d’eau, réglables à 45 “C & 1 “C ou à
Laisser se solidifier en une pellicule uniforme. Si le
37 “C * 1 “C.
sang est ajoute à des boîtes contenant la base pré-
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6.1.6 Appareillage pour l’homogénéisation 6.2.4 Pipettes graduées, de 25 ml, 10 ml et 1 ml
de capacité, graduées respectivement en 0,5 ml,
Utiliser l’un des appareils suivants:
0,5 ml et 0,l ml.
homogénéisateur rotatif, dont la fréquence de
a)
6.2.5 Boîtes de Pétri stériles
rotation est comprise entre 8 000 min-’ et
45 000 min-’ , avec des bols en verre ou en métal,
munis de couvercles resistant aux conditions de
6.2.6 Lames pour microscope
stérilisation; ou
6.2.7 Billes en verre
homogénéisateur de
péristaltique
b) type
(stomacher), avec des sacs stériles en matiére
plastique.
7 Échantillonnage
NOTE 4 Les bols ou les sacs en matière plastique
doivent avoir une capacité suffisante pour permettre de II est important que le laboratoire reçoive un échan-
mélanger correctement la prise d’essai avec la quantité tillon réellement représentatif, non endommagé ou
appropriée de diluant. En général, le volume du récipient
modifié lors du transport et de l’entreposage.
doit être environ le double du volume de la prise d’essai
additionnée du diluant. L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode
spécifiée dans la présente Norme internationale. Une
méthode d’échantillonnage recommandée est donnée
6.1.7 Anses bouclées, en platine iridié ou en
dans I’ISO 707 CII.
nickel-chrome, ou en matière plastique, d’environ
3 mm de diamètre.
II convient de suivre les instructions pour I’échan-
tillonnage à des fins microbiologiques.
6.1.8 Fil d’ensemencement, en platineliridié, en
nickel-chrome ou en matière plastique.
8 Préparation de l’échantillon
6.1.9 pH-mètre à température compensée (pour
mesurer le pH des milieux préparé et des réactifs),
Voir ISO 8261.
précis à + 0,l unité le pH a 25 “C.
-
8.1 Lait
6.1.10 Réfrigérateur (pour conserver les milieux
préparés et les réactifs), pouvant fonctionner a une
Agiter soigneusement l’échantillon afin d’assurer une
température comprise entre + 2 “C et + 5 OC.
répartition aussi uniforme que possible des
microorganismes, en retournant rapidement 25 fois le
6.1.11 Faisceau de lumière blanche
recipient contenant l’échantillon. II faut éviter la for-
mation de mousse ou bien la laisser se disperser si
6.1.12 Miroir, plat ou concave.
elle se forme. L’intervalle de temps entre le mélange
et le prélèvement de la prise d’essai ne doit pas dé-
passer 3 min.
6.1.13 Trépied, pour éclairer les boîtes de Pétri.
6.1.14 Microscope a contraste de phase, avec ob-
Lait sec, poudre de lactosérum, babeurre
8.2
jectif à immersion à I’huile.
en poudre, lactose, caséine, caséinate
6.2 Verrerie Mélanger soigneusement le contenu du récipient
fermé en secouant et en retournant manuellement de
La verrerie doit resister à des stérilisations répétées.
façon répétée. Si le récipient est trop rempli pour
pe
...
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