Water quality — Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater fish [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)] — Part 3: Flow-through method

Specifies a flow-through method for the determination of the acute lethal toxicity of stable, non-volatile, single substances, soluble in water under specified conditions, to a freshwater fish (Brachydanio rerio - zebra fish). Replaces the first edition.

Qualité de l'eau — Détermination de la toxicité aiguë létale de substances vis-à-vis d'un poisson d'eau douce [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Téléostei, Cyprinidae)] — Partie 3: Méthode avec renouvellement continu

La présente partie de l'ISO 7346 prescrit une méthode avec renouvellement continu pour la détermination de la toxicité aiguë létale de substances simples, stables, non volatiles, solubles dans l'eau dans les conditions prescrites, vis-à-vis d'un poisson d'eau douce [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Téléostei, Cyprinidae) -- nom commun, poisson-zèbre], dans une eau de qualité donnée. La méthode est applicable pour chaque substance à expérimenter, pour donner une idée globale de la toxicité aiguë létale vis-à-vis du Brachydanio rerio, dans les conditions de l'essai. Les résultats sont en eux-mêmes insuffisants pour définir des normes de qualité de l'eau en vue de la protection de l'environnement. La méthode est également applicable à certaines autres espèces de poissons d'eau douce comme organismes pour essai1). La méthode peut être adaptée pour d'autres poissons d'eau douce, marine ou saumâtre avec des modifications appropriées des conditions d'essai, concernant notamment la quantité et la qualité de l'eau de dilution et la température.

Kakovost vode - Ugotavljanje akutne smrtne strupenosti snovi s sladkovodnimi ribami (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)) - 3. del: Pretočna metoda

General Information

Status
Published
Publication Date
12-Jun-1996
Current Stage
9093 - International Standard confirmed
Start Date
11-Jan-2008
Completion Date
21-Jan-2019

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ISO 7346-3:1996 - Water quality -- Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater fish [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)]
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ISO 7346-3:1996 - Qualité de l'eau -- Détermination de la toxicité aiguë létale de substances vis-a-vis d'un poisson d'eau douce [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Téléostei, Cyprinidae)]
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ISO 7346-3:1996 - Qualité de l'eau -- Détermination de la toxicité aiguë létale de substances vis-a-vis d'un poisson d'eau douce [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Téléostei, Cyprinidae)]
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INTERNATIONAL
Is0
STANDARD
7346-3
Second edition
1996-06-I 5
Water quality - Determination of the
acute lethal toxicity of substances to a
freshwater fish [ Brachydanio rerio
Hamilton-Buchanan (Teleostei,
Cyprinidae)] -
Part 3:
Flow-through method
Qua/it@ de I’eau - Dktermination de la toxicit aigue ktale de substances
vis-&vis d ’un Poisson d ’eau deuce [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan
(Tkkostei, Cyprinidae)] -
Partie 3: M&hode avec renouvellement continu
Reference number
IS0 7346-3:1996(E)
---------------------- Page: 1 ----------------------
IS0 7346-3: 1996(E)
Foreword
IS0 (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national standards bodies (IS0 member bodies). The work
of preparing International Standards is normally carried out through IS0
technical committees. Each member body interested in a subject for
which a technical committee has been established has the right to be
represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. IS0
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(I EC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard IS0 7346-3 was prepared by Technical Committee ~
ISOnC 147, Water quality, Subcommittee SC 5, Biological methods.
This second edition cancels and replaces the first edition
(IS0 7346-3:1984), which has been technically revised.
IS0 7346 consists of the following parts, under the general title VVater
Determination of the acute lethal toxicity of substances to a
quality -
freshwater fish [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei,
Cyprinidae)]:
- Part I: Static method
- Part 2: Semi-static method
- Part 3: Flow-through method
Annexes A, B and C of this part of IS0 7346 are for information only.
0 IS0 1996

All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced

or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and

microfilm, without permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
Case Postale 56 l CH-1211 Geneve 20 l Switzerland
Printed in Switzerland
---------------------- Page: 2 ----------------------
0 IS0
IS0 7346-3: 1996(E)
Introduction
The three parts of IS0 7346 describe methods of determining the acute
lethal toxicity of substances to the zebra fish (Brachydanio rerio
Hamilton-Buchanan) but it must be emphasized that the recommended
use of the zebra fish does not preclude the use of other species. The
methodologies presented here may also be used for other species of
freshwater, marine or brackish water fish, with appropriate modifications
of, for example, dilution water quality and the temperature conditions of
the test.
Within the three parts of IS0 7346, a choice can be made between static,
semi-static and flow-through methods. The static test, described in
IS0 7346-1, in which the solution is not renewed, has the advantage of
requiring simple apparatus, although the substances in the test vessel may
become depleted during the course of the test and the general quality of
the water may deteriorate. The flow-through method, described in this
part of IS0 7346, in which the test solution is replenished continuously,
overcomes such problems but requires the use of more complex appar-
atus. In the semi-static procedure, described in IS0 7346-2, the test sol-
utions are renewed every 24 h or 48 h, this method being a compromise
between the other two.
The flow-through method can be used for most types of substances, in-
cluding those unstable in water, but the concentrations of the test sub-
stance are determined wherever possible. The static method is limited to
the study of substances whose tested concentrations remain relatively
constant during the test period. The semi-static method can be used for
testing those substances whose concentrations can be maintained satis-
factorily throughout the test by renewal of the solutions every 24 h or
48 h. Special arrangements may be necessary for substances which are
highly volatile.
To assist in the preparation and maintenance of concentrations of sub-
stances which may be lethal at concentrations close to that of their
aqueous solu.bility, a small volume of solvent may be used, as specified in
the methods.
---------------------- Page: 3 ----------------------
This page intentionally left blank
---------------------- Page: 4 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD 0 IS0 IS0 7346-3: 1996(E)
Water quality - Determination of the acute lethal
toxicity of substances to a freshwater fish [5~~hydanio
rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)] -
Part 3:
Flow-through method
with appropriate modification of the test conditions,
1 Scope
particularly with respect to the quantity and quality of
the dilution water and the temperature.
This part of IS0 7346 specifies a flow-through method
for the determination of the acute lethal toxicity of
stable, non-volatile, single substances, soluble in
2 Principle
water under specified conditions, to a freshwater fish
[ Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei,
Determination, under specified conditions, of the
Cyprinidae) - common name, zebra fish] in water of
concentrations at which a substance is lethal to
a specified quality.
50 % of a test population of Brachydanio rerio after
exposure periods of 24 h, 48 h, 72 h and 96 h to that
The method is applicable for assigning, for each test
substance in the ambient water. These median lethal
substance, broad categories of acute lethal toxicity to
concentrations are designated the 24 h - LC50,
Brachydanio rerio under the test conditions.
48 h - LC50, 72 h - LC50 and 96 h - LC50.
The results are insufficient by themselves to define
The test is carried out in two stages:
water quality standards for environmental protection.
a) a preliminary test which gives an approximate in-
The method is also applicable when using certain
dication of the acute median lethal concentrations
other species of freshwater fish as the test
and serves to determine the range of concen-
organism?
trations for the final test;
b) a final test, the results of which alone are re-
The method may be adapted for use with other
ported.
freshwater fish and marine and brackish water fish

1) The following species of freshwater fish can be used, in addition to Brachydanio rerio, without modification to this part of

IS0 7346.
- Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae)
- Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae)
- Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae)
- Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae)
---------------------- Page: 5 ----------------------
IS0 7346=3:1996(E) 0 IS0
Where evidence is available to show that test con-
3.2 Standard dilution water
centrations remain relatively constant (i.e. within

about 20 % of the nominal values) throughout the The freshly prepared standard dilution water shall

test, then either measured or nominal concentrations
have a pH of 7,8 + 0,2, and a calcium hardness of
are used in the estimation of the LC50. Where such
approximately 250 mg/l, expressed as calcium
analyses show that the concentrations present remain
carbonate, and shall contain the following concen-
relatively constant but are less than about 80 %, or
trations of salts dissolved in distilled or deionized
greater than 120 %, of the nominal values, then the
water:
analytical values are used in estimating the LC50.
294,0 mg/ I CaCI,.2H,O
Where evidence is not available to show that the test
concentrations remained at an acceptable level
123,3 mg/ I MgSO,.7H,O
throughout the test period, or where it is known (or
suspected) that the concentrations of the test chemi-
NaHCO,
63,0 mg/l
cal have declined significantly at any stage during the
test, then, irrespective of whether or not chemical
5,5 mg/l KCI
analytical data are available, the LC50 cannot be de-
fined using this test method. In these cases, the test
Aerate the dilution water until the concentration of
is not necessarily invalidated but it can only be stated
dissolved oxygen reaches at least 90 % of its air
that the LC50 of the substance is < x mg/l, the value,
saturation value (ASV) and the pH is constant at
X, being estimated from the nominal concentrations
7,8 + 0,2. If necessary, adjust the pH of the solution
used.
by adding sodium hydroxide solution or hydrochloric
acid. The dilution water thus prepared shall receive
no further forced aeration before use in the tests.
3 Test organism and reagents
3.3 Stock solutions of test substances
The reagents shall be of recognized analytical grade.
The water used for the preparation of solutions shall
A stock solution of the test substance should be pre-
be glass-distilled water or deionized water of at least
pared by dissolving a known amount of test sub-
equivalent purity.
stance in a defined volume of dilution water,
deionized water or glass-distilled water. The stock
solution should be prepared at a frequency appropri-
ate to the stability of the test substance. To enable
3.1 Test organism
stock solutions to be prepared and to assist in their
transfer to the test vessels, substances of low
The test species shall be Brachydanio rerio Hamilton-
aqueous solubility may be dissolved or dispersed by
Buchanan (Teleostei, Cyprinidae), commonly known
suitable means, including ultrasonic devices and or-
as the zebra fish. Each test fish shall have a total
ganic solvents of low toxicity to fish. If any such or-
length of 30 mm + 5 mm, which, in principle, corre-
ganic solvent is used, its concentration in the test
sponds to a mass of 0,3 g + 0,l g. They shall be
solution shall not exceed 0,l ml/l, or the volume con-
selected from a population cf a single stock. This
taining 0,l g/l, whichever is the greater. Where a sol-
stock should have been acclimatized and, in any case,
vent is used, two sets of controls, one containing
maintained for at least 7 d prior to the test in dilution
solvent at the maximum concentration used in any
water, continuously aerated using bubbled air (see
test vessel and one without solvent or test substance,
3.2), under conditions of water quality and illumination
shall be included.
similar to those used in the test. They shall be fed as
normal up to the 24 h period immediately preceding
the test.
3.4 Test solutions
Test fish shall be free of overt disease or visible
Test solutions are prepared by adding appropriate
malformation. They shall not receive treatment for
amounts of the stock solution of the test substance
disease during the test or in the 2 weeks preceding
to the dilution water to give the required concen-
the test. Subsequent to the test, fish remaining alive
trations. It is recommended that, when a stock sol-
should be suitably disposed of.
ution is prepared in distilled or deionized water, no
maintena nce and more than JO0 ml of stock solution should be added
Enviro nmental conditions for the
per 10 litres of dilution water.
breedi ng of ze b ra fish are given in annex A.
---------------------- Page: 6 ----------------------
0 IS0 IS0 734693:1996( E)
4 Apparatus 6 Procedure
All materials which may come into contact with any
6.1 Condition of the fish
liquid into which the fish are to be placed, or with
which they may come into contact, shall be inert and
Whenever there is a change of stock population, carry
should not absorb the test substance significantly.
out a toxicity test using the method specified in this
part of IS0 7346 using a suitable reference chemical
Usual laboratory equipment and the following.
[e.g. potassium dichromate (K,Cr,O,)]. The results of
such tests shall be in reasonable agreement with re-
sults obtained previously in the same laboratory.
4.1 Test vessels, which may be of different forms,
suitable for the properties of the test material and the
Test fish shall not have been used for any previous
need to achieve the validity criteria [especially
testing procedure.
7.1 b)]. For volatile materials, an enclosed system may
Maintain the temperature of the water in the stock
be required. When non-volatile chemicals are being
tanks at 23 “C + 1 “C (4.2).
tested, the vessels may be open topped. The volume
of the test vessels should be sufficient that a loading
rate of I,5 g of fish per litre of water should not be
6.2 Limit test
exceeded at any time during the test.
Using the procedures described in this part of
Before use, the test vessels shall be cleaned
IS0 7346, a limit test may be performed at the limit
thoroughly, for example with a non-ionic detergent
of aqueous solubility under the conditions of the test
(followed by acid and solvent washes for substances
or at 100 mg/l, whichever is the lower, in order to
expected to adsorb strongly to the vessel).
demonstrate that the 96 h - LC50 is greater than this
concentration. If no fish die in the limit test, no further
testing is required.
4.2 Temperature control equipment, to regulate

the temperature of the test solutions and the water Perform the limit test using 10 fish, with the same

in the stock tanks to 23 “C + 1 “C by a suitable number in the control(s).
method.
NOTE 1 Binominal theory dictates that, when 10 fish are
used, with zero mortality there is a 99,9 % confidence that
the 96 h - LC50 is greater than the limit-test concentration.
4.3 Solution replacement equipment, dosing and
If mortalities occur, a complete study (see 6.3 and 6.4) may
mixing apparatus capable of maintaining the required
need to be considered. If sub-lethal effects are observed,
concentrations of the test substance in the test flasks
these should be recorded.
to within 20 %, and set to renew the test solutions in
the flasks at a rate which is sufficient to prevent the
6.3 Preliminary test
concentration of oxygen in the vessels from falling
below 60 % ASV.
6.3.1 If possible, use the flow-through method for
the preliminary test, adopting the same range of con-
centrations, number of fish per test solution concen-
4.4 Dip-net, made of nylon or of another chemically
tration and method of observation of the fish as
inert material, for the control vessels and another for
described in 6.3.2 for the alternative, preliminary static
all the test vessels (4.1).
test.
6.3.2 Add at least 2,5 litres, preferably 5 litres, of
standard dilution water (3.2) to each of six test
5 Test environment
vessels (4.1) and aerate if necessary to restore the

The preparation and storage of solutions, the holding concentration of dissolved oxygen to at least 90 % of

of fish, and all the manipulations and tests shall be its air saturation value.
carried out in premises with an atmosphere free from
Prepare test solutions by adding appropriate amounts
harmful concentrations of airborne contaminants.
of stock solution of the test substance (3.3) to five of
the vessels in order to obtain an adequate geometric
Take care to avoid any unwanted disturbance that
range of concentrations, for example 1 000 mg/l;
may change the behaviour of the fish. Carry out all
...

SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 7346-3:1997
01-januar-1997
.DNRYRVWYRGH8JRWDYOMDQMHDNXWQHVPUWQHVWUXSHQRVWLVQRYLVVODGNRYRGQLPL
ULEDPL %UDFK\GDQLRUHULR+DPLOWRQ%XFKDQDQ 7HOHRVWHL&\SULQLGDH GHO
3UHWRþQDPHWRGD

Water quality -- Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater

fish [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)] -- Part 3: Flow-

through method

Qualité de l'eau -- Détermination de la toxicité aiguë létale de substances vis-à-vis d'un

poisson d'eau douce [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Téléostei, Cyprinidae)] --

Partie 3: Méthode avec renouvellement continu
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 7346-3:1996
ICS:
13.060.70 Preiskava bioloških lastnosti Examination of biological
vode properties of water
SIST ISO 7346-3:1997 en

2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.

---------------------- Page: 1 ----------------------
SIST ISO 7346-3:1997
---------------------- Page: 2 ----------------------
SIST ISO 7346-3:1997
INTERNATIONAL
Is0
STANDARD
7346-3
Second edition
1996-06-I 5
Water quality - Determination of the
acute lethal toxicity of substances to a
freshwater fish [ Brachydanio rerio
Hamilton-Buchanan (Teleostei,
Cyprinidae)] -
Part 3:
Flow-through method
Qua/it@ de I’eau - Dktermination de la toxicit aigue ktale de substances
vis-&vis d ’un Poisson d ’eau deuce [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan
(Tkkostei, Cyprinidae)] -
Partie 3: M&hode avec renouvellement continu
Reference number
IS0 7346-3:1996(E)
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IS0 7346-3: 1996(E)
Foreword
IS0 (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national standards bodies (IS0 member bodies). The work
of preparing International Standards is normally carried out through IS0
technical committees. Each member body interested in a subject for
which a technical committee has been established has the right to be
represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. IS0
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(I EC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard IS0 7346-3 was prepared by Technical Committee ~
ISOnC 147, Water quality, Subcommittee SC 5, Biological methods.
This second edition cancels and replaces the first edition
(IS0 7346-3:1984), which has been technically revised.
IS0 7346 consists of the following parts, under the general title VVater
Determination of the acute lethal toxicity of substances to a
quality -
freshwater fish [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei,
Cyprinidae)]:
- Part I: Static method
- Part 2: Semi-static method
- Part 3: Flow-through method
Annexes A, B and C of this part of IS0 7346 are for information only.
0 IS0 1996

All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced

or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and

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Printed in Switzerland
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0 IS0
IS0 7346-3: 1996(E)
Introduction
The three parts of IS0 7346 describe methods of determining the acute
lethal toxicity of substances to the zebra fish (Brachydanio rerio
Hamilton-Buchanan) but it must be emphasized that the recommended
use of the zebra fish does not preclude the use of other species. The
methodologies presented here may also be used for other species of
freshwater, marine or brackish water fish, with appropriate modifications
of, for example, dilution water quality and the temperature conditions of
the test.
Within the three parts of IS0 7346, a choice can be made between static,
semi-static and flow-through methods. The static test, described in
IS0 7346-1, in which the solution is not renewed, has the advantage of
requiring simple apparatus, although the substances in the test vessel may
become depleted during the course of the test and the general quality of
the water may deteriorate. The flow-through method, described in this
part of IS0 7346, in which the test solution is replenished continuously,
overcomes such problems but requires the use of more complex appar-
atus. In the semi-static procedure, described in IS0 7346-2, the test sol-
utions are renewed every 24 h or 48 h, this method being a compromise
between the other two.
The flow-through method can be used for most types of substances, in-
cluding those unstable in water, but the concentrations of the test sub-
stance are determined wherever possible. The static method is limited to
the study of substances whose tested concentrations remain relatively
constant during the test period. The semi-static method can be used for
testing those substances whose concentrations can be maintained satis-
factorily throughout the test by renewal of the solutions every 24 h or
48 h. Special arrangements may be necessary for substances which are
highly volatile.
To assist in the preparation and maintenance of concentrations of sub-
stances which may be lethal at concentrations close to that of their
aqueous solu.bility, a small volume of solvent may be used, as specified in
the methods.
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SIST ISO 7346-3:1997
INTERNATIONAL STANDARD 0 IS0 IS0 7346-3: 1996(E)
Water quality - Determination of the acute lethal
toxicity of substances to a freshwater fish [5~~hydanio
rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)] -
Part 3:
Flow-through method
with appropriate modification of the test conditions,
1 Scope
particularly with respect to the quantity and quality of
the dilution water and the temperature.
This part of IS0 7346 specifies a flow-through method
for the determination of the acute lethal toxicity of
stable, non-volatile, single substances, soluble in
2 Principle
water under specified conditions, to a freshwater fish
[ Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei,
Determination, under specified conditions, of the
Cyprinidae) - common name, zebra fish] in water of
concentrations at which a substance is lethal to
a specified quality.
50 % of a test population of Brachydanio rerio after
exposure periods of 24 h, 48 h, 72 h and 96 h to that
The method is applicable for assigning, for each test
substance in the ambient water. These median lethal
substance, broad categories of acute lethal toxicity to
concentrations are designated the 24 h - LC50,
Brachydanio rerio under the test conditions.
48 h - LC50, 72 h - LC50 and 96 h - LC50.
The results are insufficient by themselves to define
The test is carried out in two stages:
water quality standards for environmental protection.
a) a preliminary test which gives an approximate in-
The method is also applicable when using certain
dication of the acute median lethal concentrations
other species of freshwater fish as the test
and serves to determine the range of concen-
organism?
trations for the final test;
b) a final test, the results of which alone are re-
The method may be adapted for use with other
ported.
freshwater fish and marine and brackish water fish

1) The following species of freshwater fish can be used, in addition to Brachydanio rerio, without modification to this part of

IS0 7346.
- Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae)
- Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae)
- Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae)
- Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae)
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SIST ISO 7346-3:1997
IS0 7346=3:1996(E) 0 IS0
Where evidence is available to show that test con-
3.2 Standard dilution water
centrations remain relatively constant (i.e. within

about 20 % of the nominal values) throughout the The freshly prepared standard dilution water shall

test, then either measured or nominal concentrations
have a pH of 7,8 + 0,2, and a calcium hardness of
are used in the estimation of the LC50. Where such
approximately 250 mg/l, expressed as calcium
analyses show that the concentrations present remain
carbonate, and shall contain the following concen-
relatively constant but are less than about 80 %, or
trations of salts dissolved in distilled or deionized
greater than 120 %, of the nominal values, then the
water:
analytical values are used in estimating the LC50.
294,0 mg/ I CaCI,.2H,O
Where evidence is not available to show that the test
concentrations remained at an acceptable level
123,3 mg/ I MgSO,.7H,O
throughout the test period, or where it is known (or
suspected) that the concentrations of the test chemi-
NaHCO,
63,0 mg/l
cal have declined significantly at any stage during the
test, then, irrespective of whether or not chemical
5,5 mg/l KCI
analytical data are available, the LC50 cannot be de-
fined using this test method. In these cases, the test
Aerate the dilution water until the concentration of
is not necessarily invalidated but it can only be stated
dissolved oxygen reaches at least 90 % of its air
that the LC50 of the substance is < x mg/l, the value,
saturation value (ASV) and the pH is constant at
X, being estimated from the nominal concentrations
7,8 + 0,2. If necessary, adjust the pH of the solution
used.
by adding sodium hydroxide solution or hydrochloric
acid. The dilution water thus prepared shall receive
no further forced aeration before use in the tests.
3 Test organism and reagents
3.3 Stock solutions of test substances
The reagents shall be of recognized analytical grade.
The water used for the preparation of solutions shall
A stock solution of the test substance should be pre-
be glass-distilled water or deionized water of at least
pared by dissolving a known amount of test sub-
equivalent purity.
stance in a defined volume of dilution water,
deionized water or glass-distilled water. The stock
solution should be prepared at a frequency appropri-
ate to the stability of the test substance. To enable
3.1 Test organism
stock solutions to be prepared and to assist in their
transfer to the test vessels, substances of low
The test species shall be Brachydanio rerio Hamilton-
aqueous solubility may be dissolved or dispersed by
Buchanan (Teleostei, Cyprinidae), commonly known
suitable means, including ultrasonic devices and or-
as the zebra fish. Each test fish shall have a total
ganic solvents of low toxicity to fish. If any such or-
length of 30 mm + 5 mm, which, in principle, corre-
ganic solvent is used, its concentration in the test
sponds to a mass of 0,3 g + 0,l g. They shall be
solution shall not exceed 0,l ml/l, or the volume con-
selected from a population cf a single stock. This
taining 0,l g/l, whichever is the greater. Where a sol-
stock should have been acclimatized and, in any case,
vent is used, two sets of controls, one containing
maintained for at least 7 d prior to the test in dilution
solvent at the maximum concentration used in any
water, continuously aerated using bubbled air (see
test vessel and one without solvent or test substance,
3.2), under conditions of water quality and illumination
shall be included.
similar to those used in the test. They shall be fed as
normal up to the 24 h period immediately preceding
the test.
3.4 Test solutions
Test fish shall be free of overt disease or visible
Test solutions are prepared by adding appropriate
malformation. They shall not receive treatment for
amounts of the stock solution of the test substance
disease during the test or in the 2 weeks preceding
to the dilution water to give the required concen-
the test. Subsequent to the test, fish remaining alive
trations. It is recommended that, when a stock sol-
should be suitably disposed of.
ution is prepared in distilled or deionized water, no
maintena nce and more than JO0 ml of stock solution should be added
Enviro nmental conditions for the
per 10 litres of dilution water.
breedi ng of ze b ra fish are given in annex A.
---------------------- Page: 8 ----------------------
SIST ISO 7346-3:1997
0 IS0 IS0 734693:1996( E)
4 Apparatus 6 Procedure
All materials which may come into contact with any
6.1 Condition of the fish
liquid into which the fish are to be placed, or with
which they may come into contact, shall be inert and
Whenever there is a change of stock population, carry
should not absorb the test substance significantly.
out a toxicity test using the method specified in this
part of IS0 7346 using a suitable reference chemical
Usual laboratory equipment and the following.
[e.g. potassium dichromate (K,Cr,O,)]. The results of
such tests shall be in reasonable agreement with re-
sults obtained previously in the same laboratory.
4.1 Test vessels, which may be of different forms,
suitable for the properties of the test material and the
Test fish shall not have been used for any previous
need to achieve the validity criteria [especially
testing procedure.
7.1 b)]. For volatile materials, an enclosed system may
Maintain the temperature of the water in the stock
be required. When non-volatile chemicals are being
tanks at 23 “C + 1 “C (4.2).
tested, the vessels may be open topped. The volume
of the test vessels should be sufficient that a loading
rate of I,5 g of fish per litre of water should not be
6.2 Limit test
exceeded at any time during the test.
Using the procedures described in this part of
Before use, the test vessels shall be cleaned
IS0 7346, a limit test may be performed at the limit
thoroughly, for example with a non-ionic detergent
of aqueous solubility under the conditions of the test
(followed by acid and solvent washes for substances
or at 100 mg/l, whichever is the lower, in order to
expected to adsorb strongly to the vessel).
demonstrate that the 96 h - LC50 is greater than this
concentration. If no fish die in the limit test, no further
testing is required.
4.2 Temperature control equipment, to regulate

the temperature of the test solutions and the water Perform the limit test using 10 fish, with the same

in the stock tanks to 23 “C + 1 “C by a suitable number in the control(s).
method.
NOTE 1 Binominal theory dictates that, when 10 fish are
used, with zero mortality there is a 99,9 % confidence that
the 96 h - LC50 is greater than the limit-test concentration.
4.3 Solution replacement equipment, dosing and
If mortalities occur, a complete study (see 6.3 and 6.4) may
mixing apparatus capable of maintaining the required
need to be considered. If sub-lethal effects are observed,
concentrations of the test substance in the test flasks
these should be recorded.
to within 20 %, and set to renew the test solutions in
the flasks at a rate which is sufficient to prevent the
6.3 Preliminary test
concentration of oxygen in the vessels from falling
below 60 % ASV.
6.3.1 If possible, use the flow-through method for
the preliminary test, adopting the same range of con-
centrations, number of fish per test solution concen-
4.4 Dip-net, made of nylon or of another chemically
tration and method of observation of the fish as
inert material, for the control vessels and another for
described in 6.3.2 for the alternative, preliminary static
all the test vessels (4.1).
test.
6.3.2 Add at least 2,5 litres, preferably 5 litres, of
standard dilution water (3.2) to each of six test
5 Test environment
vessels (4.1) and aerate if necessa
...

NORME
Iso
IN.TERNATIONALE
7346-3
Deuxième édition
1996-06-I 5
Qualité de l’eau - Détermination de la
toxicité aiguë létale de substances vis-à-vis
d’un poisson d’eau douce [B~~c~ydanio rerio
Hamilton-Buchanan (Téléostei,
Cyprinidae)] -
Partie 3:
Méthode avec renouvellement continu
Water quality - Determination of the acute lethal toxicity of substances
to a freshwater fish [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei,
Cyprinidae)] -
Part 3: Flow-through method
Numéro de référence
ISO 7346-3:1996(F)
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 7346-3: 1996(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de KO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mités membres votants.
La Norme internationale ISO 7346-3 a été élaborée par le comité techni-
que lSO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité SC 5, Méthodes biologi-
ques.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition
(ISO 7346-3:1984), dont elle constitue une révision technique.
L’ISO 7346 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre gé-
néral Qualité de l’eau - Détermination de la toxicité aiguë létale de
substances vis-à-vis d’un poisson d’eau douce [Brachydanio rerio
Hamilton-Buchanan (Téléostei, Cyprinidae)]:
- Partie 1: Méthode statique
- Partie 2: Méthode semi-sta tique
- Partie 3: Méthode avec renouvellement continu
Les annexes A, B et C de la présente partie de I’ISO 7346 sont données
uniquement à titre d’information.
0 ISO 1996

Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-

cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-

cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord

écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-121 1 Genève 20 l Su isse
Imprimé en Suisse
---------------------- Page: 2 ----------------------
0 ISO
ISO 7346=3:1996(F)
Introduction
Les trois parties de I’ISO 7346 décrivent des procédures d’essai pour dé-
terminer la toxicité aiguë létale de substances vis-à-vis du poisson-zèbre
(Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan), mais il faut souligner que l’emploi
recommandé du poisson-zèbre n’exclut pas l’utilisation d’autres espèces.
Les méthodologies présentées ici peuvent aussi être utilisées pour d’au-
tres espèces de poissons d’eau douce, d’eau de mer ou d’eau saumâtre,
avec les modifications appropriées de, par exemple, la qualité de l’eau de
dilution ou des conditions de température de l’essai.
Parmi les trois parties de I’ISO 7346, un choix peut être fait entre les
méthodes statique, semi-statique et avec renouvellement continu. L’essai
statique décrit dans I’ISO 7346-1, dans lequel la solution n’est pas renou-
velée, a l’avantage de ne nécessiter qu’un appareillage simple, bien que
la substance puisse s’épuiser dans le récipient d’essais au cours de l’essai
et la qualité globale de l’eau se détériorer. La méthode avec renou-
vellement continu, décrite dans la présente partie de I’ISO 7346, dans la-
quelle la solution d’essai est renouvelée de façon continue, évite de tels
problèmes, mais nécessite l’emploi d’un appareillage plus complexe. Dans
la méthode semi-statique, décrite dans I’ISO 7346-2, les solutions d’essai
sont renouvelées toutes les 24 h ou 48 h, offrant ainsi un compromis en-
tre les deux.
La méthode avec renouvellement continu peut être utilisée pour la plupart
des types de substances, y compris celles qui sont instables dans l’eau,
mais les concentrations de la substance à expérimenter sont déterminées
chaque fois que c’est possible. La. méthode statique est limitée à l’étude
des substances dont les concentrations expérimentales restent rela-
tivement constantes pendant la durée de l’essai. La méthode semi-
statique peut être utilisée pour expérimenter des substances dont les
concentrations peuvent être maintenues constantes, de façon satisfai-
sante, tout au long de l’essai par le renouvellement des solutions toutes
les 24 h ou 48 h. Des adaptations peuvent être nécessaires pour les
substances hautement volatiles.
Pour faciliter la préparation et le maintien de concentrations de substances
qui peuvent être létales lorsqu’elles sont proches de la solubilité aqueuse,
il est possible d’utiliser un faible volume de solvant, comme prescrit dans
les méthodes.
---------------------- Page: 3 ----------------------
Page blanche
---------------------- Page: 4 ----------------------
NORME INTERNATIONALE 0 ISO ISO 7346-3: 1996(F)
Qualité de l’eau - Détermination de la toxicité aiguë
létale de substances vis-à-vis d’un poisson d’eau douce
[Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Téléostei,
Cyprinidae)] -
Partie 3:
Méthode avec renouvellement continu
La méthode est également applicable à certaines au-
1 Domaine d’application
tres espèces de poissons d’eau douce comme orga-
nismes pour essai?
La présente partie de I’ISO 7346 prescrit une mé-
La méthode peut être adaptée pour d’autres poissons
thode avec renouvellement continu pour la détermi-
d’eaux douce, marine ou saumâtre avec des modifi-
nation de la toxicité aiguë létale de substances
cations appropriées des conditions d’essai, concer-
simples, stables, non volatiles, solubles dans l’eau
nant notamment la quantité et la qualité de l’eau de
dans les conditions prescrites, vis-à-vis d’un poisson
dilution et la température.
d’eau douce [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan
(Téléostei Cyprinidae) - nom commun,
poisson-zkbre], dans une eau de qualité donnée.
2 Principe

La méthode est applicable pour chaque substance à Détermination, dans des conditions définies, des

expérimenter, pour donner une idée globale de la concentrations auxquelles une substance est létale

pour 50 % d’une population d’essai de Brachydanio
toxicité aiguë létale vis-à-vis du Brachydanio rerio,
rerio, après des périodes d’exposition à cette subs-
dans les conditions de l’essai.
tance de 24 h, 48 h, 72 h et 96 h dans l’eau ambiante.

Les résultats sont en eux-mêmes insuffisants pour Ces concentrations moyennes létales sont dési-

définir des normes de qualité de l’eau en vue de la gnées par CL50 - 24 h, CL50 - 48 h, CL50 - 72 h et

protection de l’environnement. CL50 - 96 h.

1) Les espèces suivantes de poissons d’eau douce peuvent être utilisées, en sus de Brachydanio rerio, sans modification de

la présente partie de I’ISO 7346:
- Lepomis macrochirus (Téléostei, Centrarchidae)
- Oryzias latipes (Téléostei, Poeciliidae)
- Pimephales promelas (Téléostei, Cyprinidae)
- Poecilia reticulata (Téléostei, Poeciliidae)
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 7346-3: 1996(F)

L’essai est réalisé en deux étapes: Les poissons pour essai doivent être exempts de

maladies ou de malformations visibles. Ils ne dei\ ent
a) un essai préliminaire qui donne une indication ap-
subir aucun traitement pendant l’essai ou pendant les
proximative des concentrations moyennes aiguës
2 semaines précédant l’essai. À l’issue de l’essai, il
létales et qui sert à déterminer la gamme des
convient d’éliminer de façon convenable les poissons
concentrations pour l’essai définitif;
restant en vie.

un essai définitif dont seuls les résultats sont re- Les conditions d’environnement pour la maintenance

et l’élevage du poisson-zèbre sont données dans
portés.
l’annexe A.
S’il est manifeste que les concentrations restent rela-
tivement constantes (par exemple s’écartant au plus
de 20 % de la valeur nominale) pendant l’essai, les
3.2 Eau de dilution normalisée
concentrations nominales ou mesurées sont utilisées
pour l’estimation de la CL50. Si des analyses mon-
L’eau de dilution normalisée fraîchement préparée
trent que les concentrations réelles restent rela-
doit avoir un pH de 7,8 + 0,2, une dureté calcique
tivement constantes, mais inférieures à 80 % ou
d’environ 250 mg/l, exprimée en carbonate de cal-
supérieures à 120 % des valeurs nominales, les va-
cium, et doit contenir les concentrations suivantes de
leurs analytiques sont utilisées pour l’estimation de la
sels dissous dans l’eau distillée ou déionisée:
CL50. S’il n’est pas manifeste que les concentrations
d’essai restent à un niveau acceptable pendant la du-
294,0 mg/1 CaC1,,2
-iO
rée de l’essai ou s’il est connu (ou suspecté) que les
123,3 mg/1 MgSO,
concentrations de la substance d’essai ont décru si- 7ti,O
gnificativement à un certain stade de l’essai, alors,
63,0 mg/1 NaHCO,
sans tenir compte des données analytiques disponi-
bles ou non, la CL50 ne peut être déterminée en uti-
5,5 mg/1 KCI
lisant la présente méthode d’essai. Dans ce cas,
l’essai n’est pas nécessairement invalidé, mais il peut
Aérer l’eau de dilution jusqu’à ce que la concentration
seulement être établi que la CL50 de la substance est
en oxygène dissous atteigne au moins 90 % de la
< x mg/l, la valeur, X, étant estimée à partir des
valeur de saturation dans l’air et jusqu’à stabilisation
concentrations nominales utilisées.
du pH à 7,8 + 0,2. Si nécessaire, ajuster le pH de la
solution en ajoutant une solution d’hydroxyde de so-
3 Organismes pour essai et réactifs
dium ou de l’acide chlorhydrique. L’eau de dilution
ainsi préparée ne doit recevoir aucune aération sup-
Les réactifs chimiques doivent être de qualité analyti-
plémentaire avant emploi dans les essais.
que reconnue. L’eau utilisée pour la préparation des
solutions de réactif doit être distillée dans un appareil
en verre ou déionisée d’une pureté au moins équiva-
3.3 Solutions mères des substances à
lente.
expérimenter
Il convient de préparer une solution mère de la subs-
31 . Organismes pour essai
tance à expérimenter par dissolution d’une quantité
connue de la substance dans un volume défini d’eau
L’espèce utilisée pour l’essai doit être le Brachydanio

rerio Hamilton-Buchanan (Téléostei, Cyprinidae), ap- de dilution, d’eau déionisée ou d’eau distillée dans un

pelée communément ((poisson-zèbre)). Chaque pois- appareil en verre. II convient de préparer la solution

son pour essai doit avoir une longueur totale de mère à une fréquence appropriée à la stabilité de la

30 mm + 5 mm ce qui, en principe, correspond à une substance à expérimenter. Afin de permettre la pré-

paration des solutions mères et d’aider à leur transfert
masse de 0,3 g + 0,l g. Ils doivent être sélectionnés
dans les récipients d’essais, les substances de faible
à partir d’une population mère unique. II convient que

cette population mère ait été acclimatée et, dans tous solubilité aqueuse peuvent être solubiiisées ou dis-

les cas, maintenue au moins 7 jours avant l’essai dans persées par des moyens adéquats, tels que des dis-

positifs à ultrasons et des solvants organiques de
l’eau de dilution, aérée de manière continue par
faible toxicité vis-à-vis du poisson. Lorsqu’un solvant
barbotage d’air (voir 3.2) dans des conditions de
organique est employé, sa concentration dans la so-
qualité de l’eau et d’éclairement semblables à celles
ution d’essai ne doit pas excéder 0,l ml/l ou un vo-
utilisées pour l’essai. Ils doivent être nourris nor-

malement jusqu’aux 24 h précédant immédiatement urne contenant 0,l g/l (prendre en compte la valeur

l’essai. a plus élevée). Lorsqu’un solvant est utilisé, deux jeux
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0 ISO
ISO 7346-3: 1996(F)

d’essais témoins, l’un contenant le solvant à la 4.4 Filet, en nylon ou en un autre matériau chimi-

concentration maximale utilisée dans les récipients quement inerte, pour les récipients de contrôle et un

d’essais et l’autre sans solvant ni substance à expéri- autre pour tous les récipients d’essais (4.1).

menter, doivent être inclus.
5 Environnement de l’essai
3.4 Solutions d’essai
La préparation et la conservation des solutions, la
Les solutions d’essai sont préparées par ajout des
conservation des poissons et l’ensemble des mani-
quantités appropriées de la solution mère de la subs-
pulations et des essais doivent être réalisés dans des
tance à expérimenter à l’eau de dilution pour obtenir
locaux dont l’atmosphère est exempte de contami-
les concentrations nécessaires. II est recommandé,
nants de l’air à des concentrations nocives.
lorsqu’une solution mère est préparée dans de l’eau
déionisée ou de l’eau distillée, de ne pas ajouter plus
Éviter soigneusement toute perturbation indésirable
de 100 ml de la solution mère pour 10 litres d’eau de
susceptible de modifier le comportement des pois-
dilution.
sons. Réaliser les essais sous un éclairement normal
de laboratoire d’une photopériode quotidienne de
4 Appareillage
12 h à 16 h.
Tout matériau qui est susceptible d’entrer en contact
avec tout liquide dans lequel les poissons sont placés
6 Mode opératoire
ou avec lequel ils sont mis en contact doit être inerte
et ne doit pas adsorber significativement la substance
6.1 État des poissons
à expérimenter.
En cas de changement de la population mère, effec-
Matériel courant de laboratoire et ce qui suit.
tuer un essai de toxicité
selon la méthode définie
dans la présente partie de
I’ISO 7346 en utilisant un
4.1 Récipients d’essais, qui peuvent être de diffé-
produit chimique de référence approprié [par exemple
rentes formes, adaptés aux propriétés de la subs-
le dichromate de potassium (K,Cr,O,)]. Les résultats
tance à expérimenter et tels que les critères de vali-
de tels essais doivent être en accord raisonnable avec
dité soient satisfaits [spécialement 7.1 b)]. Pour les
les résultats obtenus précédemment par le même la-
substances volatiles, un système fermé peut être né-
boratoire.
cessaire. Lorsque des produits chimiques non volatils
sont expérimentés, les récipients peuvent être ou-
Les poissons soumis à l’essai ne doivent pas avoir été
verts à leur extrémité supérieure. II convient que la
utilisés dans des essais antérieurs.
capacité des récipients d’essais soit suffisante afin de
ne pas dépasser, à aucun moment de l’essai, un rap-
Maintenir la température de l’eau dans les récipients
port massique de 1,5 g de poisson par litre d’eau.
de stockage à 23 “C &- 1 “C (4.2).
Avant emploi, les récipients d’essais doivent être soi-
gneusement nettoyés, par exemple à l’aide d’un dé-
6.2 Essai de limite
tergent non ionique (suivi par des lavages à l’aide
d’acide et de solvant pour les substances suscepti-
En utilisant les modes opératoires décrits dans la
bles de s’adsorber dans le récipient d’essais).
présente partie de I’ISO 7346, un essai de limite peut
être réalisé à la limite de solubilité aqueuse dans les
conditions de l’essai ou à 100 mg/1 (prendre en
4.2 Dispositif de contrôle de la température, pour

réguler la température des solutions d’essai et de compte la valeur la plus faible), afin de démontrer que

l’eau dans les récipients de stockage, à 23 “C + 1 “C la CL50 - 96 h est plus élevée que cette concen-

à l’aide d’une méthode appropriée. tration. Si aucun poisson ne meurt lors de l’essai de

limite, aucun essai supplémentaire n’est requis.
4.3 Dispositif de renouvellement des solutions,
Réaliser l’essai de limite à partir de 10 poissons, avec
appareillage doseur et mélangeur capable de mainte-
un nombre identique dans le(s) témoin(s).
nir les concentrations nécessaires de la substance à
expérimenter dans les récipients d’essais à & 20 %
NOTE 1 La théorie binomiale impose que lorsque 10
et installé de façon à suffisamment renouveler les
poissons sont utilisés, avec une mortalité nulle, il est sûr à
solutions d’essai des récipients pour prévenir une
99,9 % que la CL50 - 96 h est plus élevée que la concen-
chute de la concentration en oxygène dissous au-
tration de l’essai de limite. En cas de mortalité, il peut être

dessous de 60 % de la valeur de saturation dans l’air. nécessaire d’envisager une étude plus approfondie (voir 6.3

---------------------- Page: 7 ----------------------
Q KO
ISO 7346-3:1996(F)

et 6.4). Si des effets sublétaux sont observés, il convient requises et, dans d’autres cas, une gamme plus large

de les consigner.
peut être nécessaire.
Assembler au moins six récipients d’essais (4.1) et
6.3 Essai préliminaire
leur matériel annexe et y ajouter, excepté à un (ou
deux), des volumes appropriés de l’une des séries de
6.3.1 Lorsque cela est possible, utiliser la méthode
solutions d’essai respectivement, pour obtenir la
avec renouvellement continu pour l’essai préliminaire,
gamme particulière des concentrations de la subs-
en adoptant la même gamme de concentrations, le
tance à expérimenter qui a été sélectionnée pour
même nombre de poissons par concentration et la
l’essai. Remplir l’un des récipients qui restent (voir
même période d’observation que ceux décrits en
note 2) avec de l’eau de dilution normalisée seule,
6.3.2 pour un essai préliminaire statique.
pour tenir lie
...

NORME
Iso
IN.TERNATIONALE
7346-3
Deuxième édition
1996-06-I 5
Qualité de l’eau - Détermination de la
toxicité aiguë létale de substances vis-à-vis
d’un poisson d’eau douce [B~~c~ydanio rerio
Hamilton-Buchanan (Téléostei,
Cyprinidae)] -
Partie 3:
Méthode avec renouvellement continu
Water quality - Determination of the acute lethal toxicity of substances
to a freshwater fish [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei,
Cyprinidae)] -
Part 3: Flow-through method
Numéro de référence
ISO 7346-3:1996(F)
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Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de KO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mités membres votants.
La Norme internationale ISO 7346-3 a été élaborée par le comité techni-
que lSO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité SC 5, Méthodes biologi-
ques.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition
(ISO 7346-3:1984), dont elle constitue une révision technique.
L’ISO 7346 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre gé-
néral Qualité de l’eau - Détermination de la toxicité aiguë létale de
substances vis-à-vis d’un poisson d’eau douce [Brachydanio rerio
Hamilton-Buchanan (Téléostei, Cyprinidae)]:
- Partie 1: Méthode statique
- Partie 2: Méthode semi-sta tique
- Partie 3: Méthode avec renouvellement continu
Les annexes A, B et C de la présente partie de I’ISO 7346 sont données
uniquement à titre d’information.
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Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-

cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-

cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord

écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-121 1 Genève 20 l Su isse
Imprimé en Suisse
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Introduction
Les trois parties de I’ISO 7346 décrivent des procédures d’essai pour dé-
terminer la toxicité aiguë létale de substances vis-à-vis du poisson-zèbre
(Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan), mais il faut souligner que l’emploi
recommandé du poisson-zèbre n’exclut pas l’utilisation d’autres espèces.
Les méthodologies présentées ici peuvent aussi être utilisées pour d’au-
tres espèces de poissons d’eau douce, d’eau de mer ou d’eau saumâtre,
avec les modifications appropriées de, par exemple, la qualité de l’eau de
dilution ou des conditions de température de l’essai.
Parmi les trois parties de I’ISO 7346, un choix peut être fait entre les
méthodes statique, semi-statique et avec renouvellement continu. L’essai
statique décrit dans I’ISO 7346-1, dans lequel la solution n’est pas renou-
velée, a l’avantage de ne nécessiter qu’un appareillage simple, bien que
la substance puisse s’épuiser dans le récipient d’essais au cours de l’essai
et la qualité globale de l’eau se détériorer. La méthode avec renou-
vellement continu, décrite dans la présente partie de I’ISO 7346, dans la-
quelle la solution d’essai est renouvelée de façon continue, évite de tels
problèmes, mais nécessite l’emploi d’un appareillage plus complexe. Dans
la méthode semi-statique, décrite dans I’ISO 7346-2, les solutions d’essai
sont renouvelées toutes les 24 h ou 48 h, offrant ainsi un compromis en-
tre les deux.
La méthode avec renouvellement continu peut être utilisée pour la plupart
des types de substances, y compris celles qui sont instables dans l’eau,
mais les concentrations de la substance à expérimenter sont déterminées
chaque fois que c’est possible. La. méthode statique est limitée à l’étude
des substances dont les concentrations expérimentales restent rela-
tivement constantes pendant la durée de l’essai. La méthode semi-
statique peut être utilisée pour expérimenter des substances dont les
concentrations peuvent être maintenues constantes, de façon satisfai-
sante, tout au long de l’essai par le renouvellement des solutions toutes
les 24 h ou 48 h. Des adaptations peuvent être nécessaires pour les
substances hautement volatiles.
Pour faciliter la préparation et le maintien de concentrations de substances
qui peuvent être létales lorsqu’elles sont proches de la solubilité aqueuse,
il est possible d’utiliser un faible volume de solvant, comme prescrit dans
les méthodes.
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NORME INTERNATIONALE 0 ISO ISO 7346-3: 1996(F)
Qualité de l’eau - Détermination de la toxicité aiguë
létale de substances vis-à-vis d’un poisson d’eau douce
[Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Téléostei,
Cyprinidae)] -
Partie 3:
Méthode avec renouvellement continu
La méthode est également applicable à certaines au-
1 Domaine d’application
tres espèces de poissons d’eau douce comme orga-
nismes pour essai?
La présente partie de I’ISO 7346 prescrit une mé-
La méthode peut être adaptée pour d’autres poissons
thode avec renouvellement continu pour la détermi-
d’eaux douce, marine ou saumâtre avec des modifi-
nation de la toxicité aiguë létale de substances
cations appropriées des conditions d’essai, concer-
simples, stables, non volatiles, solubles dans l’eau
nant notamment la quantité et la qualité de l’eau de
dans les conditions prescrites, vis-à-vis d’un poisson
dilution et la température.
d’eau douce [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan
(Téléostei Cyprinidae) - nom commun,
poisson-zkbre], dans une eau de qualité donnée.
2 Principe

La méthode est applicable pour chaque substance à Détermination, dans des conditions définies, des

expérimenter, pour donner une idée globale de la concentrations auxquelles une substance est létale

pour 50 % d’une population d’essai de Brachydanio
toxicité aiguë létale vis-à-vis du Brachydanio rerio,
rerio, après des périodes d’exposition à cette subs-
dans les conditions de l’essai.
tance de 24 h, 48 h, 72 h et 96 h dans l’eau ambiante.

Les résultats sont en eux-mêmes insuffisants pour Ces concentrations moyennes létales sont dési-

définir des normes de qualité de l’eau en vue de la gnées par CL50 - 24 h, CL50 - 48 h, CL50 - 72 h et

protection de l’environnement. CL50 - 96 h.

1) Les espèces suivantes de poissons d’eau douce peuvent être utilisées, en sus de Brachydanio rerio, sans modification de

la présente partie de I’ISO 7346:
- Lepomis macrochirus (Téléostei, Centrarchidae)
- Oryzias latipes (Téléostei, Poeciliidae)
- Pimephales promelas (Téléostei, Cyprinidae)
- Poecilia reticulata (Téléostei, Poeciliidae)
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ISO 7346-3: 1996(F)

L’essai est réalisé en deux étapes: Les poissons pour essai doivent être exempts de

maladies ou de malformations visibles. Ils ne dei\ ent
a) un essai préliminaire qui donne une indication ap-
subir aucun traitement pendant l’essai ou pendant les
proximative des concentrations moyennes aiguës
2 semaines précédant l’essai. À l’issue de l’essai, il
létales et qui sert à déterminer la gamme des
convient d’éliminer de façon convenable les poissons
concentrations pour l’essai définitif;
restant en vie.

un essai définitif dont seuls les résultats sont re- Les conditions d’environnement pour la maintenance

et l’élevage du poisson-zèbre sont données dans
portés.
l’annexe A.
S’il est manifeste que les concentrations restent rela-
tivement constantes (par exemple s’écartant au plus
de 20 % de la valeur nominale) pendant l’essai, les
3.2 Eau de dilution normalisée
concentrations nominales ou mesurées sont utilisées
pour l’estimation de la CL50. Si des analyses mon-
L’eau de dilution normalisée fraîchement préparée
trent que les concentrations réelles restent rela-
doit avoir un pH de 7,8 + 0,2, une dureté calcique
tivement constantes, mais inférieures à 80 % ou
d’environ 250 mg/l, exprimée en carbonate de cal-
supérieures à 120 % des valeurs nominales, les va-
cium, et doit contenir les concentrations suivantes de
leurs analytiques sont utilisées pour l’estimation de la
sels dissous dans l’eau distillée ou déionisée:
CL50. S’il n’est pas manifeste que les concentrations
d’essai restent à un niveau acceptable pendant la du-
294,0 mg/1 CaC1,,2
-iO
rée de l’essai ou s’il est connu (ou suspecté) que les
123,3 mg/1 MgSO,
concentrations de la substance d’essai ont décru si- 7ti,O
gnificativement à un certain stade de l’essai, alors,
63,0 mg/1 NaHCO,
sans tenir compte des données analytiques disponi-
bles ou non, la CL50 ne peut être déterminée en uti-
5,5 mg/1 KCI
lisant la présente méthode d’essai. Dans ce cas,
l’essai n’est pas nécessairement invalidé, mais il peut
Aérer l’eau de dilution jusqu’à ce que la concentration
seulement être établi que la CL50 de la substance est
en oxygène dissous atteigne au moins 90 % de la
< x mg/l, la valeur, X, étant estimée à partir des
valeur de saturation dans l’air et jusqu’à stabilisation
concentrations nominales utilisées.
du pH à 7,8 + 0,2. Si nécessaire, ajuster le pH de la
solution en ajoutant une solution d’hydroxyde de so-
3 Organismes pour essai et réactifs
dium ou de l’acide chlorhydrique. L’eau de dilution
ainsi préparée ne doit recevoir aucune aération sup-
Les réactifs chimiques doivent être de qualité analyti-
plémentaire avant emploi dans les essais.
que reconnue. L’eau utilisée pour la préparation des
solutions de réactif doit être distillée dans un appareil
en verre ou déionisée d’une pureté au moins équiva-
3.3 Solutions mères des substances à
lente.
expérimenter
Il convient de préparer une solution mère de la subs-
31 . Organismes pour essai
tance à expérimenter par dissolution d’une quantité
connue de la substance dans un volume défini d’eau
L’espèce utilisée pour l’essai doit être le Brachydanio

rerio Hamilton-Buchanan (Téléostei, Cyprinidae), ap- de dilution, d’eau déionisée ou d’eau distillée dans un

pelée communément ((poisson-zèbre)). Chaque pois- appareil en verre. II convient de préparer la solution

son pour essai doit avoir une longueur totale de mère à une fréquence appropriée à la stabilité de la

30 mm + 5 mm ce qui, en principe, correspond à une substance à expérimenter. Afin de permettre la pré-

paration des solutions mères et d’aider à leur transfert
masse de 0,3 g + 0,l g. Ils doivent être sélectionnés
dans les récipients d’essais, les substances de faible
à partir d’une population mère unique. II convient que

cette population mère ait été acclimatée et, dans tous solubilité aqueuse peuvent être solubiiisées ou dis-

les cas, maintenue au moins 7 jours avant l’essai dans persées par des moyens adéquats, tels que des dis-

positifs à ultrasons et des solvants organiques de
l’eau de dilution, aérée de manière continue par
faible toxicité vis-à-vis du poisson. Lorsqu’un solvant
barbotage d’air (voir 3.2) dans des conditions de
organique est employé, sa concentration dans la so-
qualité de l’eau et d’éclairement semblables à celles
ution d’essai ne doit pas excéder 0,l ml/l ou un vo-
utilisées pour l’essai. Ils doivent être nourris nor-

malement jusqu’aux 24 h précédant immédiatement urne contenant 0,l g/l (prendre en compte la valeur

l’essai. a plus élevée). Lorsqu’un solvant est utilisé, deux jeux
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d’essais témoins, l’un contenant le solvant à la 4.4 Filet, en nylon ou en un autre matériau chimi-

concentration maximale utilisée dans les récipients quement inerte, pour les récipients de contrôle et un

d’essais et l’autre sans solvant ni substance à expéri- autre pour tous les récipients d’essais (4.1).

menter, doivent être inclus.
5 Environnement de l’essai
3.4 Solutions d’essai
La préparation et la conservation des solutions, la
Les solutions d’essai sont préparées par ajout des
conservation des poissons et l’ensemble des mani-
quantités appropriées de la solution mère de la subs-
pulations et des essais doivent être réalisés dans des
tance à expérimenter à l’eau de dilution pour obtenir
locaux dont l’atmosphère est exempte de contami-
les concentrations nécessaires. II est recommandé,
nants de l’air à des concentrations nocives.
lorsqu’une solution mère est préparée dans de l’eau
déionisée ou de l’eau distillée, de ne pas ajouter plus
Éviter soigneusement toute perturbation indésirable
de 100 ml de la solution mère pour 10 litres d’eau de
susceptible de modifier le comportement des pois-
dilution.
sons. Réaliser les essais sous un éclairement normal
de laboratoire d’une photopériode quotidienne de
4 Appareillage
12 h à 16 h.
Tout matériau qui est susceptible d’entrer en contact
avec tout liquide dans lequel les poissons sont placés
6 Mode opératoire
ou avec lequel ils sont mis en contact doit être inerte
et ne doit pas adsorber significativement la substance
6.1 État des poissons
à expérimenter.
En cas de changement de la population mère, effec-
Matériel courant de laboratoire et ce qui suit.
tuer un essai de toxicité
selon la méthode définie
dans la présente partie de
I’ISO 7346 en utilisant un
4.1 Récipients d’essais, qui peuvent être de diffé-
produit chimique de référence approprié [par exemple
rentes formes, adaptés aux propriétés de la subs-
le dichromate de potassium (K,Cr,O,)]. Les résultats
tance à expérimenter et tels que les critères de vali-
de tels essais doivent être en accord raisonnable avec
dité soient satisfaits [spécialement 7.1 b)]. Pour les
les résultats obtenus précédemment par le même la-
substances volatiles, un système fermé peut être né-
boratoire.
cessaire. Lorsque des produits chimiques non volatils
sont expérimentés, les récipients peuvent être ou-
Les poissons soumis à l’essai ne doivent pas avoir été
verts à leur extrémité supérieure. II convient que la
utilisés dans des essais antérieurs.
capacité des récipients d’essais soit suffisante afin de
ne pas dépasser, à aucun moment de l’essai, un rap-
Maintenir la température de l’eau dans les récipients
port massique de 1,5 g de poisson par litre d’eau.
de stockage à 23 “C &- 1 “C (4.2).
Avant emploi, les récipients d’essais doivent être soi-
gneusement nettoyés, par exemple à l’aide d’un dé-
6.2 Essai de limite
tergent non ionique (suivi par des lavages à l’aide
d’acide et de solvant pour les substances suscepti-
En utilisant les modes opératoires décrits dans la
bles de s’adsorber dans le récipient d’essais).
présente partie de I’ISO 7346, un essai de limite peut
être réalisé à la limite de solubilité aqueuse dans les
conditions de l’essai ou à 100 mg/1 (prendre en
4.2 Dispositif de contrôle de la température, pour

réguler la température des solutions d’essai et de compte la valeur la plus faible), afin de démontrer que

l’eau dans les récipients de stockage, à 23 “C + 1 “C la CL50 - 96 h est plus élevée que cette concen-

à l’aide d’une méthode appropriée. tration. Si aucun poisson ne meurt lors de l’essai de

limite, aucun essai supplémentaire n’est requis.
4.3 Dispositif de renouvellement des solutions,
Réaliser l’essai de limite à partir de 10 poissons, avec
appareillage doseur et mélangeur capable de mainte-
un nombre identique dans le(s) témoin(s).
nir les concentrations nécessaires de la substance à
expérimenter dans les récipients d’essais à & 20 %
NOTE 1 La théorie binomiale impose que lorsque 10
et installé de façon à suffisamment renouveler les
poissons sont utilisés, avec une mortalité nulle, il est sûr à
solutions d’essai des récipients pour prévenir une
99,9 % que la CL50 - 96 h est plus élevée que la concen-
chute de la concentration en oxygène dissous au-
tration de l’essai de limite. En cas de mortalité, il peut être

dessous de 60 % de la valeur de saturation dans l’air. nécessaire d’envisager une étude plus approfondie (voir 6.3

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Q KO
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et 6.4). Si des effets sublétaux sont observés, il convient requises et, dans d’autres cas, une gamme plus large

de les consigner.
peut être nécessaire.
Assembler au moins six récipients d’essais (4.1) et
6.3 Essai préliminaire
leur matériel annexe et y ajouter, excepté à un (ou
deux), des volumes appropriés de l’une des séries de
6.3.1 Lorsque cela est possible, utiliser la méthode
solutions d’essai respectivement, pour obtenir la
avec renouvellement continu pour l’essai préliminaire,
gamme particulière des concentrations de la subs-
en adoptant la même gamme de concentrations, le
tance à expérimenter qui a été sélectionnée pour
même nombre de poissons par concentration et la
l’essai. Remplir l’un des récipients qui restent (voir
même période d’observation que ceux décrits en
note 2) avec de l’eau de dilution normalisée seule,
6.3.2 pour un essai préliminaire statique.
pour tenir lie
...

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