ISO 7346-3:1984
(Main)Water quality — Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)) — Part 3: Flow-through method
Water quality — Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)) — Part 3: Flow-through method
Qualité de l'eau — Détermination de la toxicité aiguë létale de substances vis-à-vis d'un poisson d'eau douce (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)) — Partie 3: Méthode avec renouvellement continu
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International Standard @ 734613
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION*MEXPYHAPO~HAR OPrAHM3AUMR no CTAH,lAPTH3AUMM*ORGANlSATlON INTERNATIONALE DE NORMALISATION
Water quality - Determination of the acute lethal toxicity
0
of substances to a freshwater fish [Brachydanio rerio
Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae11 -
Part 3: Flow-through method
Qualité de l'eau - Détermination de la toxicité aiguë létale de substances vis-à-vis d'un poisson d'eau douce [Brachydanio rerio
Hamilton Buchanan (Teleostei, Cyprinidaell - Partie 3: Méthode avec renouvellement continu
First edition - 1984-12-01
UDC 574.631.64 Ref. No. ISO7346/3-1984 (E)
8
m
"I -
h Descriptors : water, quality, tests, determination, toxicity, toxic substances, fresh water, fishes.
O
U, Price based on 10 pages
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Foreword
IS0 (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of
national standards bodies (IS0 member bodies). The work of preparing International
Standards is normally carried out through IS0 technical committees. Each member
body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, govern-
mental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to
the member bodies for approval before their acceptance as International Standards by
the IS0 Council. They are approved in accordance with IS0 procedures requiring at
least 75 % approval by the member bodies voting.
International Standard IS0 7346/3 was prepared by Technical Committee
ISO/TC 147, Water quality.
0 International Organization for Standardization, 1984 0
Printed in Switzerland
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IS0 7346/3-1984 (E)
INTERNATIONAL STANDARD
Water quality - Determination of the acute lethal toxicity
of substances to a freshwater fish [Brachydanio rerio
Hamilton- Buc hanan (Teleostei, Cyprinidae)] -
Part 3: Flow-through method
O Introduction
those substances whose concentrations can be maintained
satisfactorily throughout the test by renewal of the solutions
every 24 h.
The three parts of IS0 7346 describe methods of determining
the acute lethal toxicity of substances to the zebra fish
To assist in the preparation and maintenance of concentrations
(Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan), but it must be
of substances which may be lethal at concentrations close to
emphasized that the recommended use of the zebra fish does
that of their aqueous solubility, a small volume of solvent may
not preclude the use of other species. The methodologies
be used , as specified in the methods.
presented here may also be used for other species of
freshwater, marine of brackish water fish, with appropriate
modifications of, for example, dilution water quality and the
1 Scope and field of application
temperature conditions of the test.
This part of IS0 7346 specifies a flow-through method for the
determination of the acute lethal toxicity of substances soluble
Within the three parts of IS0 7346, a choice can be made
in water under specified conditions to a species of freshwater
between static, semi-static and flow-through methods. The
fish [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei,
static test, described in IS0 7346/1, in which the solution is not
Cyprinidae) - common name, zebra fish1 in water of a
renewed, has the advantage of requiring simple apparatus
specified quality.
although the substance in the test vessel may become depleted
during the course of the test and the general quality of the
The method is applicable for assigning, for each test
water may deteriorate. The flow-through method, described in
substance, broad categories of acute lethal toxicity to
IS0 7346/3, in which the test solution is replaced almost con-
Brachydanio rerio under the test conditions.
tinuously, overcomes such problems but requires the use of
more complex apparatus. In the semi-static procedure, describ-
The results are insufficient by themselves to define water qual-
ed in IS0 7346/2, the test solutions are renewed daily, this
ity standards for environmental protection.
method being a compromise between the other two.
The method is also applicable when using certain other species
The flow-through method can be used for most types of
of freshwater fish as the test organism.')
substances, including those unstable in water, but the concen-
trations of the test substance are determined wherever poss-
The method may be adapted for use with other freshwater fish
ible. The static method is limited to the study of substances
and marine and brackish water fish with appropriate modifi-
whose tested concentrations remain relatively constant during
cation of the test conditions, particularly with respect to the
the test period. The semi-static method can be used for testing
quantity and quality of the dilution water and temperature.
The following species of freshwater fish can be used, in addition to Brachydanio rerio, without modification to this part of IS0 7346:
1)
- Cichlasoma nigrofasciatum (Teleostei, Cichlidae)
- Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrachidae)
- Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae)
- Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae)
- Poecilia reticulafa (Teleostei, Poeciliidae)
The results obtained from a test with one species cannot, however, be extrapolated to other species.
1
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IS0 7346/3-1984 (E)
2 Principle 3.2 Standard dilution water
The method determines, under specified conditions, the con-
The freshly prepared standard dilution water shall have a pH of
centrations at which a substance is lethal to 50 % of a test
7,8 k 0,2, and calcium hardness of approximately 250 mg/l,
population of Brachydanio rerio after exposure periods of 24;
expressed as calcium carbonate, and shall be prepared as
48; 72; and 96 h to that substance in the ambient water. These
follows.
median lethal concentrations are designated the 24 h LC50;
48 h LC50; 72 h LC50 and 96 h LC50.
Prepare the following solutions using distilled or deionized
water:
The test is carried out in two stages:
a) a preliminary test which gives an approximate indication a) Calcium chloride solution
of the acute median lethal concentrations and serves to
determine the range of concentrations for the final test;
Dissolve 11,76 g of calcium chloride dihydrate (CaCI2.2H,O)
in water and dilute to 1 litre.
b) a final test, the results of which alone are recorded.
b) Magnesium sulfate solution
Where evidence is available to show that test concentrations
remain relatively constant (i.e. within about 20 % of the
nominal values) throughout the test then either measured or Dissolve 4,93 g of magnesium sulfate heptahydrate
nominal concentrations may be used in the estimation of the (MgSO4.7H2O) in water and dilute to 1 litre.
LC50. Where such analyses show that the concentrations pre-
sent remain relatively constant but are less than about 80 % of
c) Sodium hydrogen carbonate solution
the nominal values, then the analytical values shall be used in
estimating the LC50. Where evidence is not available to show
Dissolve 2,s g of sodium hydrogen carbonate (NaHC03) in
that the test concentrations remained at an acceptable level
water and dilute to 1 litre.
throughout the test period or where it is known (or suspected)
that the concentrations of the test chemical have declined
significantly at any stage during the test then irrespective of
di Potassium chloride solution
whether or not chemical analytical data are available the LC50
cannot be defined, using this test method. In these cases the
Dissolve 0,23 g of potassium chloride (KCI) in water and
test is not necessarily invalidated but it can only be stated that
dilute to 1 litre.
the LC50 of the substance is < x mg/l, the value, x, given
being estimated from the nominal concentrations used.
Mix 25 ml of each of these four solutions and dilute to 1 litre
with water.
3 Test organism and reagents
Aerate the dilution water until the concentration of dissolved
The reagents shall be of recognized analytical grade. The water
oxygen reaches its air saturation value (ASV) and the pH value
used for the preparation of solutions shall be glass-distilled
is constant at 7,8 f 0,2. If necessary, adjust the pH of the
water or deionized water of at least equivalent purity.
solution by adding sodium hydroxide solution or hydrochloric
acid. The dilution water thus prepared shall receive no further
forced aeration before use in the tests.
3.1 Test organism
The test species shall be Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan 3.3 Stock solutions of test substances
(Teleostei, Cyprinidae), commonly known as the zebra fish.
Each test fish shall have a total length of 30 f 5 mm and a
A stock solution of the test substance should be prepared by
mass of 0,3 f 0,l g. They shall be selected from a population
dissolving a known amount of test substance in a defined
of a single stock. This stock should have been acclimated and,
volume of dilution water, deionized water or glass-distilled
in any case, maintained for at least 2 weeks prior to the test in
water. The stock solution should be prepared daily except
dilution water, continuously aerated (using bubbled air) (see
where it is known that the material is stable in solution, in
3.21, under conditions of water quality and illumination similar
which case sufficient solution for use over 2 days may be
to those used in the test. They shall be fed as normal up to the
prepared. To enable stock solutions to be prepared and to
24 h period immediately preceding the test.
assist in their transfer to the test vessels, substances of low
aqueous solubility may be dissolved or dispersed by suitable
Test fish shall be free of overt disease or visible malformation.
means, including ultrasonic devices and using organic solvents
They shall not receive treatment for disease during the test or in
of low toxicity to fish. If any such organic solvent is used, its
the 2 weeks preceding the test.
concentration in the test solution shall not exceed 0,l mVI, and
two sets of controls, one containing solvent at the maximum
Environmental conditions for the maintenance and breeding of
concentration used in any test vessel and one without solvent
zebra fish are given in annex A.
or test substance, shall be included.
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IS0 7346/3-1984 (E)
3.4 Test solutions Take care to avoid any unwanted disturbance that may change
the behaviour of the fish. All tests should be carried out under
normal laboratory illumination with a daily photoperiod of
Test solutions are prepared by adding appropriate amounts of
12 to 16 h.
the stock solution of the test substance to the dilution water to
give the required concentrations. It is recommended that when
a stock solution is prepared in distilled or deionized water, no
6 Procedure
more than 100 ml of stock solution should be added per 10 I of
dilution water.
6.1 Condition of the fish
Whenever there is a change of stock population, a toxicity test
4 Apparatus
using the method specified in this part of IS0 7346 should be
carried out using a suitable reference substance. The results of
All materials which may come into contact with any liquid into
such tests shall be in reasonable agreement with results ob-
which the fish are to be placed, or with which they may come
tained previously in the same laboratory.
into contact, shall be inert and should not absorb the test
substance significantly.
6.2 Preliminary test
Usual laboratory equipment [including a dip-net, made of nylon
or of another chemically inert material, for the control vessels 6.2.1 If possible, the flow-through method should be used for
and another for all the test vessels (4.111, and
the preliminary test, adopting the same range of concen-
trations, number of fish per test solution concentration and
method of observation of the fish as described in 6.2.2 for the
4.1 Test vessels
alternative, preliminary static test.
Test vessels shall be either multiple angle neck, round-bottom
6.2.2 Add at least 2,5 I, preferably 5 I, of standard dilution
glass flasks, of capacity 1 or 2 I, having ground-glass joints (see
water (3.2) to each of six vessels and aerate if necessary to
figure 1) or similar glass vessels. When 1 litre flasks are used,
restore the concentration of dissolved oxygen to its air satura-
only five fish can be used per flask and two flasks shall be used
tion value. Prepare test solutions by adding appropriate
for each test solution concentration. With the multiple-neck
amounts of stock solution of the test substance (3.3) to five of
flask, one of the necks should have a standard inlet tube and
the vessels in order to obtain an adequate range of concentra-
the second, that is used for the outlet, should preferably be fit-
tions, for example 1 000; 100; IO; 1; and 0,l mg/l. Nothing is
ted with a screen.
added to the sixth vessel, which serves as a control. The sol-
utions should be adjusted to and maintained at 23 I 1 OC.
Before use, new test vessels shall be carefully washed and then
rinsed successively with water and the dilution water. At the
Place five fish in each vessel.
end of the test, the flasks shall be emptied, cleaned by
appropriate means, rinsed with water to remove all traces of
At least twice a day for a suitable period, note the numbers of
the test substance and cleaning aid, and dried.
dead fish and the dissolved oxygen concentration in each
vessel. Remove dead fish.
Test flasks shall be rinsed with dilution water just before use.
If there are insufficient data for establishing the range of con-
centrations required for the final test, repeat this preliminary
4.2 Temperature control equipment
test with alternative ranges of concentrations.
The temperature of the test solutions and the water in the stock
tanks shall be regulated to 23 I 1 OC by a suitable method.
6.3 Final test
Select at least five concentrations, forming an approximately
4.3 Solution replacement equipment
geometric series, for example 8; 4; 2; 1 ; and 0,5 mg/l, be-
tween, but including, the lowest concen
...
Norme internationale @ 7346/3
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATIONOME~AYHAPO~HAR OPrAHH3AUHR no CTAHAAPTH3AUHM*ORGANlSATlON INTERNATIONALE DE NORMALISATION
Qualité de l'eau - Détermination de la toxicité aiguë
létale de substances vis-à-vis d'un poisson d'eau douce
[Brach ydanio rerio Ha m i I to n- B u c ha na n
(Teleostei, Cyprinidaell -
Partie 3: Méthode avec renouvellement continu
Water quality - Determination of the acute lethai toxicity of substances to a freshwater fish [Brachydanio rerio Hamilton-
Buchanan (Teleostei, Cyprinidaell - Pari 3: Flow-through method
Première édition - 1984-12-01
CDU 574.63/.64 Réf. no : IS0 7346/3-1984 (FI
Descripteurs : eau, qualité., essai, détermination, toxicité, substance toxique, eau douce, poisson.
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Avant- propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale
d'organismes nationaux de normalisation (comités membres de I'ISO). L'élaboration
des Normes internationales est confiée aux comités techniques de I'ISO. Chaque
comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité technique
créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouverne-
mentales, en liaison avec I'ISO, participent également aux travaux.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis
aux comités membres pour approbation, avant leur acceptation comme Normes inter-
nationales par le Conseil de 1'1S0. Les Normes internationales sont approuvées confor-
mément aux procédures de I'ISO qui requièrent l'approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La Norme internationale IS0 7346/3 a été élaborée par le comité technique
ISO/TC 147, Qualité de l'eau.
0 Organisation internationale de normalisation, 1984 O
Imprimé en Suisse
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IS0 7346/3-1984 (FI
N O R M E I N TE R N AT1 O NA LE
Qualité de l’eau - Détermination de la toxicité aiguë
létale de substances vis-à-vis d’un poisson d‘eau douce
[ Brach ydanio rerio Ha m i It on- Bu cha na n
(Teleostei, Cyprinidaell -
Partie 3 : Méthode avec renouvellement continu
O Introduction pendant la durée de l’essai. La méthod semi-statique peut être
utilisée pour expérimenter des substances dont les concentra-
tions peuvent être maintenues constantes de facon satisfai-
Les trois parties de I’ISO 7346 décrivent des procédures d‘essais
e
sante tout au long de l’essai par le renouvellement des solutions
pour déterminer la toxicité aiguë létale de substances vis-à-vis
toutes les 24 h.
du poisson zèbre, Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan, mais
il faut souligner que l’emploi recommandé du poisson zèbre
n‘exclut pas l’utilisation d’autres espèces. Les méthodologies
Pour aider dans la préparation et le maintien en solution de
présentées ici peuvent être aussi utilisées pour d‘autres espèces
substances dont les concentrations létales sont supérieures à
de poissons d’eaux douces, d‘eaux de mer ou d‘eaux saumâ-
leur solubilité dans l’eau, il est possible d‘utiliser un faible
tres, avec les modifications appropriées de la qualité de l‘eau de
volume de solvant, comme indiqué dans les méthodes.
dilution ou des conditions de température de l’essai, par exem-
de.
1 Objet et domaine d’application
Parmi les trois parties de la Norme, un choix peut être fait entre
les méthodes statique, semi-statique et avec renouvellement
La présente partie de I‘ISO 7346 spécifie une méthode avec
continu. L‘essai statique décrit dans la partie 1, dans lequel la
renouvellement continu pour la détermination dans une eau de
solution n‘est pas renouvelée, a l’avantage de ne nécessiter
qualité donnée, de la toxicité aiguë létale d’une substance,
qu’un appareillage simple, quoique la substance puisse s’épui-
soluble dans l’eau dans les conditions de l’essai, vis-à-vis d’un
ser dans le récipient d’essai au cours de l‘essai et la qualité glo-
poisson d‘eau douce [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan
bale de l’eau se détériorer. La méthode avec renouvellement
(Téléostei, Cyprinidae) - nom commun, poisson zèbre].
continu, décrite dans la partie 3, dans laquelle la solution
d’essai est renouvelée de facon presque continue, évite de tels
Pour chaque substance à expérimenter, le mode opératoire est
problèmes mais nécessite l’emploi d‘un appareillage plus com-
applicable pour donner une idée globale de la toxicité aiguë
plexe. Dans la méthode semi-statique, décrite dans la partie 2,
0
létale vis-à-vis du Brachydanio rerio, dans les conditions de
les solutions d‘essais sont renouvelées chaque jour, offrant
l’essai.
ainsi un compromis entre les deux.
Les résultats sont en eux-mêmes insuffisants pour définir des
La méthode avec renouvellement continu peut être utilisée pour
normes de qualité d’eau en vue de la protection de I’environne-
la plupart des types de substances, y compris celles qui sont
ment.
instables dans l‘eau, mais les concentrations de la substance à
expérimenter sont déterminées chaque fois que possible. La
méthode statique est limitée à l’étude des substances dont les La méthode est également applicable à certaines autres espèces
concentrations expérimentales restent relativement constantes de poissons d‘eaux douces comme organismes d’essais.
1) Les espèces suivantes de poissons d‘eaux douces peuvent être utilisées, en SUS de Brachydanio rerio, sans modification de la présente partie de
I‘ISO 7346:
- Cichlasoma nigrofasciatum (Téléostei, Cichlidae)
- Lepomis macrochirus (Téléostei, Centrarchidael
- Oryzias latipes (Téléostei, Poeciliidae)
- Pimephales promeias (Téléostei, Cyprinidae)
- Poecilia reticulata (Téléostei, Poeciliidae)
Néanmoins, les résultats des essais obtenus avec une espèce ne peuvent être extrapolés aux autres espèces.
1
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IS0 7346/3-1984 (FI
La méthode peut être adaptée à d'autres poissons d'eaux dou-
des conditions de qualité de l'eau et d'éclairement semblables à
ces, marines ou saumâtres avec des modifications appropriées celles utilisées pour l'essai. Ils doivent être nourris normalement
des conditions d'essais, concernant notamment la quantité et
jusqu'aux 24 h précédant immédiatement l'essai.
la qualité de l'eau de dilution et la température.
Les poissons pour essai doivent être exempts de maladies ou de
malformations visibles. Ils ne doivent subir aucun traitement
pendant l'essai ou pendant les 2 semaines précédant l'essai.
2 Principe
Les conditions d'environnement pour la maintenance et I'éle-
Détermination, dans des conditions définies, des concentra-
vage du Brachydanio rerio sont données dans l'annexe A.
tions auxquelles une substance est létale pour 50 % d'une
population d'essai de Brachydanio rerio, après des périodes
d'exposition de 24; 48; 72 et 96 h à cette substance dans l'eau
3.2 Eau de dilution normalisée
ambiante. Ces concentrations moyennes létales sont désignées
par CL 50 - 24 h; CL 50 - 48 h; CL 50 - 72 et CL 50 - 96 h.
L'eau de dilution normalisée fraîchement préparée doit avoir un
pH de 7,8 f 0,2, une durée calcique d'environ 250 mg/l expri-
mée en carbonate de calcium et doit être préparée de la façon
L'essai est réalisé en deux étapes:
suivante.
a) un essai préliminaire qui donne une indication approxi-
Préparer les solutions suivantes, en utilisant de l'eau distillée ou
mative des concentrations moyennes aiguës létales et sert à
déionisée :
déterminer la gamme des concentrations pour l'essai défini- e
tif:
a) Solution de chlorure de calcium.
b) un essai définitif dont seuls les résultats sont retenus.
Dissoudre 11,76 g de chlorure de calcium dihydraté
(CaC1,.2H20) dans l'eau et diluer à 1 litre.
S'il est manifeste que les concentrations restent relativement
constantes (par exemple s'écartant au plus de 20 % de la valeur
Solution de sulfate de magnésium.
b)
nominale) pendant l'essai, les concentrations nominales ou
mesurées peuvent être utilisées pour l'estimation de la CL 50.
Dissoudre 4,93 g de sulfate de magnésium heptahydraté
Si des analyses montrent que les concentrations réelles restent
(MgSO4.7H2O) dans l'eau et diluer à 1 litre.
relativement constantes, mais à moins de 80 % des valeurs
nominales, les valeurs analytiques doivent être utilisées pour
c) Solution d'hydrogénocarbonate de sodium.
l'estimation de la CL 50. S'il n'est pas manifeste que les con-
centrations d'essais restent à un niveau acceptable pendant la
Dissoudre 2,59 g d'hydrogénocarbonate de sodium
durée de l'essai ou s'il est connu (ou suspecté) que les concen- (NaHC03) dans l'eau et diluer à 1 litre.
trations de la substance d'essai ont décru significativement à
d) Solution de chlorure de potassium.
un certain stade de l'essai, alors, sans tenir compte des don-
nées analytiques disponibles ou non, la CL 50 ne peut être
Dissoudre 0,23 g de chlorure de potassium (KCI) dans l'eau
déterminée en utilisant la présente méthode d'essai. Dans ce
et diluer à 1 litre.
cas, l'essai n'est pas nécessairement invalidé, mais il ne peut
seulement être établi que la CL 50 de la substance est
Mélanger 25 ml de chacune des solutions ai à di et compléter à
< x mg/l, la valeur, x, donnée étant estimée à partir des con-
a
1 litre avec de l'eau.
centrations nominales utilisées.
Aérer l'eau de dilution jusqu'à ce que la concentration en oxy-
gène dissous atteigne la valeur de saturation dans l'air et
3 Organismes pour essai et réactifs
jusqu'à stabilisation du pH à 7,8 f 0,2. Si nécessaire, ajuster le
pH de la solution en ajoutant une solution d'hydroxyde de
Les réactifs chimiques doivent être de qualité analytique recon-
sodium ou de l'acide chlorhydrique. L'eau de dilution ainsi pré-
nue. L'eau utilisée pour la préparation des solutions de réactif
parée ne doit recevoir aucune aération supplémentaire avant
doit être distillée dans un appareil en verre, ou déionisée, d'une
emploi dans les essais.
pureté au moins équivalente.
3.3 Solution mère de la substance à expérimenter
3.1 Organisme pour essai
Une solution mère de la substance à expérimenter doit &re pré-
L'espèce utilisée pour l'essai doit être le Brachydanio rerio
parée par dissolution d'une quantité connue de la substance
Hamilton-Buchanan (Téléostei, Cyprinidae), appelé communé-
dans un volume défini d'eau de dilution, d'eau déionisée ou
ment «poisson zèbre)). Chaque poisson pour essai doit avoir
d'eau distillée dans un appareil en verre. La solution mère doit
une longueur totale de 30 k 5 mm et une masse de
être préparée le jour de l'emploi à moins que la stabilité du
0,3 $: 0,l g.
matériau en solution soit connue, auquel cas la solution mère
peut être préparée en quantité suffisante pour 2 jours. Afin de
Ils doivent être sélectionnés à partir d'une population d'un
permettre la préparation des solutions mères et d'aider à leur
stock unique. Ce stock doit avoir été acclimaté et, dans tous les transfert dans les récipients d'essai, les substances de faible
cas, maintenu au moins 2 semaines avant l'essai, dans l'eau de solubilité aqueuse peuvent être solubilisées ou dispersées par
dilution, aérée de manière continue par barbotage d'air, dans des moyens adéquats tels que des dispositifs à ultrasons et des
2
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IS0 7346/3-1984 (FI
5 Environnement de l’essai
solvants organiques de faible toxicité vis-à-vis du poisson.
Lorsqu’un solvant organique est employé, sa concentration
La préparation et la conservation des solutions, la conservation
dans la solution d‘essai ne doit pas excéder 0,l ml/l, et deux
des poissons et l‘ensemble des manipulations et des essais doi-
jeux d’essais témoins, l’un contenant le solvant à la concentra-
vent être réalisés dans des locaux dont l‘atmosphère est
tion maximale utilisée dans les récipients d’essai et l’autre sans
exempte de contaminants de l’air à des concentrations nocives.
solvant ni substance à expérimenter, doivent être inclus.
Éviter soigneusement toute perturbation indésirable susceptible
3.4 Solutions d’essais
de modifier le comportement des poissons. Les essais doivent
être réalisés sous un éclairement normal de laboratoire et un
Les solutions d’essais sont préparées par ajout des quantités
photopériodisme de 12 à 16 h d’éclairement.
appropriées de la solution mère de la substance à expérimenter
à l’eau de dilution pour obtenir les concentrations nécessaires.
II est recommandé, lorsqu’une solution mère est préparée dans
6 Mode opératoire
de l‘eau déionisée ou de l‘eau distillée, de ne pas ajouter plus de
100 ml de la solution mère pour 10 I d‘eau de dilution.
6.1 État des poissons
En cas de changement de la population mère, un essai de toxi-
4 Appareillage
cité selon la méthode définie dans la présente partie de
1’1S0 7346 doit être effectué en utilisant une substance de réfé-
0
Tout matériau qui est susceptible d’entrer en contact avec tout
rence appropriée. Les résultats de tels essais doivent être en
liquide dans lequel les poissons sont placés ou avec lequel ils
accord raisonnable avec les résultats obtenus précédemment
sont mis en contact, doit être inerte et ne doit pas adsorber
par le même laboratoire.
significativement la substance à expérimenter.
6.2 Essai préliminaire
Matériel courant de laboratoire [y compris un filet en nylon ou
en autre matériau chimiquement inerte pour les récipients de
6.2.1 Lorsque cela est possible, la méthode avec renouvelle-
contrôle et un autre pour tous les récipients pour essai (4.1 11, et
ment continu doit être utilisée pour l‘essai préliminaire, en
adoptant la même gamme de concentrations, le même nombre
4.1 Récipients pour essai
de poissons par concentration et la même période d’observa-
tion que ceux décrits en 6.2.2 pour un essai préliminaire stati-
Les récipients pour essai doivent être soit des ballons en verre à
que.
fond rond, à cols multiples, de 1 ou 2 litres de capacité, munis
de joints en verre rodé (voir figure I), soit des récipients similai-
6.2.2 Placer au moins 2,5 I, de préférence 5 I, d’eau de dilu-
res. Lorsqu’on utilise des ballons de 1 litre, n’introduire que
tion normalisée (3.2) dans six récipients et les aérer si néces-
cinq poissons par ballon et prévoir deux ballons par concentra-
saire pour restituer la concentration de l’oxygène dissous à sa
tion. Dans le flacon à cols multiples, l‘un des cols doit recevoir
valeur de saturation en air.
un tube d’entrée normalisé, un second, utilisé pour la sortie,
doit de préférence être équipé d’une grille.
Préparer les solutions d’essai par addition des quantités appro-
priées de la solution mère de la substance à expérimenter (3.3)
Avant emploi, les récipients pour essai neufs doivent être soi-
dans cinq des récipients afin d’obtenir un domaine de concen-
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gneusement lavés puis rincés successivement avec de l’eau et tration adéquat, par exemple 1 000; 100; IO; 1 et 0,l mg/l. Ne
de l’eau de dilution. À la fin de l’essai, les récipients doivent être rien ajouter au sixième récipient qui tient lieu de témoin. Les
vidés, nettoyés par des moyens appropriés, rincés à l‘eau pour solutions doivent être amenées et maintenues à 23 k 1 OC.
éliminer toutes traces de la substance expérimentée et de
Placer cinq poissons dans chaque récipient.
l’agent de lavage, et séchés convenablement.
Au moins une fois par jour pendant la période qui convient,
Les récipients pour essai doivent être rincés avec de l’eau de
noter le nombre de poissons morts et la concentration en oxy-
dilution juste avant emploi.
gène dissous dans chaque récipient. Retirer les poissons morts.
4.2 Dispositif de contrôle de la température
Si les données sont insuffisantes pour établir la gamme de con-
centrations nécessaires à la réalisation de l’essai définitif, répéter
La température des solutions d‘essais et de l‘eau dans les réci-
l‘essai préliminaire, avec une autre gamme de concentrations.
pients de stockage doit être régulée à 23 f 1 OC à l’aide d’une
méthode appropriée.
6.3 Essai définitif
4.3 Dispositif de renouvellement des solutions Choisir au moins cinq concentrations formant approximative-
me
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