ISO/TS 10272-2:2006
(Main)Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. — Part 2: Colony-count technique
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. — Part 2: Colony-count technique
ISO/TS 10272-2:2006 describes a horizontal method for the enumeration of Campylobacter spp. It is applicable to products intended for human consumption or for the feeding of animals, and to environmental samples in the area of food production and food handling, subject to the limitations stated in the Introduction.
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de Campylobacter spp. — Partie 2: Technique par comptage des colonies
L'ISO/TS 10272-2:2006 décrit une méthode horizontale de dénombrement de Campylobacter spp. Elle est applicable aux produits destinés à la consommation humaine ou à l'alimentation des animaux ainsi que, compte tenu des limites indiquées en introduction, aux échantillons environnementaux dans le domaine de la production et de la manipulation des produits alimentaires.
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TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 10272-2
First edition
2006-01-15
Microbiology of food and animal
feeding stuffs — Horizontal method for
detection and enumeration of
Campylobacter spp. —
Part 2:
Colony-count technique
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche et
le dénombrement de Campylobacter spp. —
Partie 2: Technique par comptage des colonies
Reference number
ISO/TS 10272-2:2006(E)
©
ISO 2006
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ISO/TS 10272-2:2006(E)
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ISO/TS 10272-2:2006(E)
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 1
4 Principle. 2
4.1 Preparation of dilutions. 2
4.2 Enumeration . 2
5 Culture media and reagents . 2
5.1 General. 2
5.2 Diluent. 2
5.3 Modified charcoal cefoperazone desoxycholate agar (mCCD agar) . 3
5.4 Columbia blood agar . 4
5.5 Brucella broth. 5
5.6 Reagent for the detection of oxidase. 5
6 Apparatus and glassware . 5
7 Sampling. 6
8 Preparation of test sample. 6
9 Procedure . 7
9.1 Test portion, initial suspension and dilutions . 7
9.2 Inoculation and incubation . 7
9.3 Counting and selection of colonies for confirmation . 7
9.4 Confirmation of Campylobacter species. 7
10 Expression of results . 8
10.1 Count of Campylobacter colonies . 8
10.2 Method of calculation. 8
10.3 Precision. 10
11 Test report . 11
Annex A (normative) Confidence limits for the estimation of small numbers of colonies . 12
Bibliography . 13
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ISO/TS 10272-2:2006(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
In other circumstances, particularly when there is an urgent market requirement for such documents, a
technical committee may decide to publish other types of normative document:
— an ISO Publicly Available Specification (ISO/PAS) represents an agreement between technical experts in
an ISO working group and is accepted for publication if it is approved by more than 50 % of the members
of the parent committee casting a vote;
— an ISO Technical Specification (ISO/TS) represents an agreement between the members of a technical
committee and is accepted for publication if it is approved by 2/3 of the members of the committee casting
a vote.
An ISO/PAS or ISO/TS is reviewed after three years in order to decide whether it will be confirmed for a
further three years, revised to become an International Standard, or withdrawn. If the ISO/PAS or ISO/TS is
confirmed, it is reviewed again after a further three years, at which time it must either be transformed into an
International Standard or be withdrawn.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO/TS 10272-2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology.
This first edition of ISO/TS 10272-2, together with ISO 10272-1:2006, cancels and replaces ISO 10272:1995,
which has been technically revised.
ISO/TS 10272 consists of the following parts, under the general title Microbiology of food and animal feeding
stuffs — Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp.:
— Part 1: Detection method
— Part 2: Colony-count technique (Technical Specification)
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ISO/TS 10272-2:2006(E)
Introduction
Because of the large variety of food and feed products, this horizontal method may not be appropriate in every
detail for certain products, and for some other products it may be necessary to use different methods.
Nevertheless, it is hoped that in all cases every attempt will be made to apply this horizontal method as far as
possible and that deviations from this will only be made if absolutely necessary for technical reasons.
When this Technical Specification is next reviewed, account will be taken of all information then available
regarding the extent to which this horizontal method has been followed and the reasons for deviations from
this in the case of particular products. The harmonization of test methods cannot be immediate and, for certain
group of products, International Standards and/or national standards may already exist that do not comply
with this horizontal method. It is hoped that when such standards are reviewed they will be changed to comply
with this International Standard, so that eventually the only remaining departures from this horizontal method
will be those necessary for well-established technical reasons.
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TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 10272-2:2006(E)
Microbiology of food and animal feeding stuffs —
Horizontal method for detection and enumeration of
Campylobacter spp. —
Part 2:
Colony-count technique
1 Scope
This Technical Specification describes a horizontal method for the enumeration of Campylobacter spp.
It is applicable to products intended for human consumption or for the feeding of animals, and to
environmental samples in the area of food production and food handling, subject to the limitations stated in the
Introduction.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 6887 (all parts), Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial
suspension and decimal dilutions for microbiological examination
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General rules for microbiological examinations
ISO 8261, Milk and milk products — General guidance for the preparation of test samples, initial suspensions
and decimal dilutions for microbiological examinations
ISO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and production
of culture media — Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the
laboratory
ISO/TS 11133-2:2003, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and
production of culture media — Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
Campylobacter
microorganisms forming characteristic colonies on solid selective media when incubated micro-aerobically at
41,5 °C, but not at 25 °C, and which possess the characteristic motility and biochemical and growth properties
described when the tests are conducted in accordance with this Technical Specification
NOTE The most frequently encountered species are Campylobacter jejuni and Campylobacter coli. Other species
have, however, been described (Campylobacter lari, Campylobacter upsaliensis and some others).
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ISO/TS 10272-2:2006(E)
3.2
count of Campylobacter
number of Campylobacter found per millilitre or per gram of test sample when the test is conducted in
accordance with this Technical Specification
4 Principle
4.1 Preparation of dilutions
For the preparation of decimal dilutions from the test sample, see ISO 6887 and ISO 8261.
4.2 Enumeration
The solid selective medium, modified charcoal cefoperazone deoxycholate agar (mCCD agar), is inoculated
with a specified quantity of the test sample if the product is liquid, or of the initial suspension in the case of
other products.
Other plates are prepared under the same conditions, using decimal dilutions of the test sample or of the initial
suspension.
The plates are incubated at 41,5 °C in a micro-aerobic atmosphere for 40 h to 48 h.
The colonies presumed to be Campylobacter are subcultured on the non-selective agar medium, Columbia
blood agar, then confirmed by means of microscopic examination and appropriate biochemical and growth
tests.
The number of Campylobacter per millilitre or per gram of the test sample is calculated from the number of
confirmed typical colonies per plate.
5 Culture media and reagents
5.1 General
For current laboratory practice, see ISO 7218, ISO/TS 11133-1 and ISO/TS 11133-2.
5.2 Diluent
See ISO 6887.
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ISO/TS 10272-2:2006(E)
5.3 Modified charcoal cefoperazone desoxycholate agar (mCCD agar)
5.3.1 Basic medium
5.3.1.1 Composition
Meat extract 10,0 g
Enzymatic digest of animal tissues 10,0 g
Sodium chloride 5,0 g
Charcoal 4,0 g
Enzymatic digest of casein 3,0 g
Sodium desoxycholate 1,0 g
Iron(II) sulfate 0,25 g
Sodium pyruvate 0,25 g
a
Agar
8,0 g to 18,0 g
Water 1 000 ml
a
Depending on the gel strength of the agar.
5.3.1.2 Preparation
Dissolve the basic components or the dehydrated complete basic medium in the water, by bringing to the boil.
Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization it is 7,4 ± 0,2 at 25 °C. Dispense the basic medium into
flasks of suitable capacity. Sterilize in the autoclave (6.1) set at 121 °C for 15 min.
5.3.2 Antibiotic solution
5.3.2.1 Composition
Cefoperazone 0,032 g
Amphotericin B 0,01 g
Water 5 ml
5.3.2.2 Preparation
Dissolve the components in the water. Sterilize by filtration.
5.3.3 Complete medium
5.3.3.1 Composition
Basic medium (5.3.1) 1 000 ml
Antibiotic solution (5.3.2) 5 ml
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5.3.3.2 Preparation
Add the antibiotic solution to the basic medium, cooled down to 47 °C ± 2 °C, then mix carefully. Pour about
15 ml of the complete medium into sterile Petri dishes (6.8). Allow to solidify. Immediately before use, carefully
dry the agar plates, preferably with the lids off and the agar surface downwards, in a drying cabinet (6.2) for
30 min or until the agar surface is free of visible moisture. If they have been prepared in advance, the undried
agar plates shall be kept for not more than 4 h at ambient temperature, or in the dark at 5 °C ± 3 °C for not
more than 7 days.
5.3.3.3 Performance testing
For the definition of selectivity and productivity, refer to ISO/TS 11133-1. For the performance criteria, refer to
ISO/TS 11133-2:2003, Table B.5.
5.4 Columbia blood agar
5.4.1 Basic medium
5.4.1.1 Composition
Enzymatic digest of animal tissues 23,0 g
Starch 1,0 g
Sodium chloride 5,0 g
a
Agar
8,0 g to 18,0 g
Water 1 000 ml
a
Depending on the gel strength of the agar.
5.4.1.2 Preparation
Dissolve the basic components or the dehydrated complete medium in the water, by bringing to the boil.
Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization
...
SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 10272-2
Première édition
2006-01-15
Microbiologie des aliments — Méthode
horizontale pour la recherche et le
dénombrement de Campylobacter spp. —
Partie 2:
Technique par comptage des colonies
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for
detection and enumeration of Campylobacter spp. —
Part 2: Colony-count technique
Numéro de référence
ISO/TS 10272-2:2006(F)
©
ISO 2006
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ISO/TS 10272-2:2006(F)
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Publié en Suisse
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ISO/TS 10272-2:2006(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions. 1
4 Principe. 2
4.1 Préparation des dilutions. 2
4.2 Dénombrement. 2
5 Milieux de culture et réactifs . 2
5.1 Généralités . 2
5.2 Diluant. 2
5.3 Gélose modifiée déoxycholate céfopérazone charbon de bois (gélose mCCD). 3
5.4 Gélose au sang Columbia. 4
5.5 Bouillon Brucella . 5
5.6 Réactif pour détection de l'oxydase . 5
6 Appareillage et verrerie. 5
7 Échantillonnage . 6
8 Préparation de l'échantillon d'essai. 7
9 Mode opératoire . 7
9.1 Prise d'essai, suspension mère et dilutions . 7
9.2 Ensemencement et incubation. 7
9.3 Comptage et sélection des colonies pour confirmation. 7
9.4 Confirmation des espèces de Campylobacter. 7
10 Expression des résultats . 8
10.1 Comptage des colonies de Campylobacter . 8
10.2 Méthode de calcul. 9
10.3 Fidélité . 10
11 Rapport d'essai . 11
Annexe A (normative) Limites de confiance pour l'estimation des petits nombres de colonies . 12
Bibliographie . 13
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ISO/TS 10272-2:2006(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
Dans d'autres circonstances, en particulier lorsqu'il existe une demande urgente du marché, un comité
technique peut décider de publier d'autres types de documents normatifs:
— une Spécification publiquement disponible ISO (ISO/PAS) représente un accord entre les experts dans
un groupe de travail ISO et est acceptée pour publication si elle est approuvée par plus de 50 % des
membres votants du comité dont relève le groupe de travail;
— une Spécification technique ISO (ISO/TS) représente un accord entre les membres d'un comité technique
et est acceptée pour publication si elle est approuvée par 2/3 des membres votants du comité.
Une ISO/PAS ou ISO/TS fait l'objet d'un examen après trois ans afin de décider si elle est confirmée pour trois
nouvelles années, révisée pour devenir une Norme internationale, ou annulée. Lorsqu'une ISO/PAS ou
ISO/TS a été confirmée, elle fait l'objet d'un nouvel examen après trois ans qui décidera soit de sa
transformation en Norme internationale soit de son annulation.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO/TS 10272-2 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9,
Microbiologie.
Cette première édition de l'ISO/TS 10272-2, avec l'ISO 10272-1:2006, annule et remplace l'ISO 10272:1995,
qui a fait l'objet d'une révision technique.
L'ISO/TS 10272 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Microbiologie des
aliments — Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de Campylobacter spp.:
— Partie 1: Méthode de détection
— Partie 2: Technique par comptage des colonies (Spécification technique)
iv © ISO 2006 – Tous droits réservés
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ISO/TS 10272-2:2006(F)
Introduction
Compte tenu de la très grande variété des produits alimentaires, il est possible que cette méthode horizontale
ne soit pas applicable dans tous ses détails à certains d'entre eux ou que pour certains autres il soit
nécessaire d'utiliser des méthodes différentes. Néanmoins, tous les efforts doivent être faits dans tous les cas
pour appliquer cette méthode horizontale chaque fois que possible et ne lui apporter des amendements que
lorsque c'est absolument nécessaire.
Lors du réexamen périodique de la présente Spécification technique, il sera tenu compte de toutes les
évolutions intervenues depuis sa publication et, notamment, de la mesure dont cette méthode horizontale
aura été suivie ainsi que des raisons des dérogations dans le cas de produits particuliers. L'harmonisation des
méthodes d'essai ne peut être réalisée de façon immédiate; de ce fait, il peut déjà exister, pour certains
groupes de produits, des Normes internationales et/ou nationales qui ne concordent pas avec cette méthode
horizontale. Lorsque de telles normes viendront en révision, il sera souhaitable de les aligner avec la présente
Spécification technique et de ne conserver que les seules divergences justifiées indispensables pour des
raisons techniques démontrées.
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SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 10272-2:2006(F)
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la
recherche et le dénombrement de Campylobacter spp. —
Partie 2:
Technique par comptage des colonies
1 Domaine d'application
La présente Spécification technique décrit une méthode horizontale de dénombrement de Campylobacter spp.
Elle est applicable aux produits destinés à la consommation humaine ou à l'alimentation des animaux ainsi
que, compte tenu des limites indiquées en introduction, aux échantillons environnementaux dans le domaine
de la production et de la manipulation des produits alimentaires.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension
mère et des dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Règles générales pour les examens microbiologiques
ISO 8261, Lait et produits laitiers — Lignes directrices générales pour la préparation des échantillons pour
essai, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique
ISO/TS 11133-1, Microbiologie des aliments — Guide pour la préparation et la production des milieux de
culture — Partie 1: Guide général pour l'assurance de la qualité pour la préparation des milieux de culture en
laboratoire
ISO/TS 11133-2:2003, Microbiologie des aliments — Guide pour la préparation et la production des milieux de
culture — Partie 2: Guide général pour les essais de performance des milieux de culture
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
Campylobacter
microorganismes qui forment des colonies caractéristiques sur des milieux sélectifs solides lors d'une
incubation en microaérophilie à 41,5 °C mais pas à 25 °C et qui possèdent la mobilité, les propriétés
biochimiques et la croissance caractéristiques décrites lors des essais conduits conformément à la présente
Spécification technique
NOTE Les espèces les plus fréquemment rencontrées sont Campylobacter jejuni et Campylobacter coli. D'autres
espèces ont cependant été décrites (Campylobacter lari, Campylobacter upsaliensis et quelques autres).
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ISO/TS 10272-2:2006(F)
3.2
comptage de Campylobacter
nombre de Campylobacter comptés par millilitre ou par gramme d'échantillon d'essai lors d'un essai conduit
conformément à la présente Spécification technique
4 Principe
4.1 Préparation des dilutions
Pour la préparation des dilutions décimales de l'échantillon pour essai, voir l'ISO 6887 et l'ISO 8261.
4.2 Dénombrement
Ensemencement du milieu sélectif solide à base de gélose modifiée de déoxycholate, céfopérazone et
charbon de bois (gélose mCCD) par une quantité spécifiée d'échantillon pour essai si le produit est liquide ou
de la suspension mère dans le cas d'autres produits.
Préparation d'autres boîtes de gélose dans les mêmes conditions à partir de dilutions décimales de
l'échantillon d'essai ou de la suspension mère.
Incubation des boîtes à 41,5 °C sous atmosphère microaérobie pendant 40 h à 48 h.
Isolement des colonies présumées être des Campylobacter sur le milieu non sélectif de gélose au sang
Columbia, puis confirmation par examen au microscope et essais biochimiques ainsi que de croissance
adaptés.
Calcul du nombre de Campylobacter par millilitre ou par gramme d'échantillon d'essai à partir du nombre
confirmé de colonies caractéristiques par boîte.
5 Milieux de culture et réactifs
5.1 Généralités
Pour les méthodes courantes de laboratoire, se reporter à l'ISO 7218, l'ISO/TS 11133-1 et l'ISO/TS 11133-2.
5.2 Diluant
Voir l'ISO 6887.
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ISO/TS 10272-2:2006(F)
5.3 Gélose modifiée déoxycholate céfopérazone charbon de bois (gélose mCCD)
5.3.1 Milieu de base
5.3.1.1 Composition
Extrait de viande 10,0 g
Digestat enzymatique de tissus animaux 10,0 g
Chlorure de sodium 5,0 g
Charbon de bois 4,0 g
Digestat enzymatique de caséine 3,0 g
Déoxycholate de sodium 1,0 g
Sulfate de fer(II) 0,25 g
Pyruvate de sodium 0,25 g
a
Agar
8,0 g à 18,0 g
Eau 1 000 ml
a
En fonction du pouvoir gélifiant de l'agar.
5.3.1.2 Préparation
Dissoudre les composants de base ou le milieu de base complet déshydraté dans de l'eau et amener à
ébullition. Ajuster le pH, si nécessaire, de manière à le porter après stérilisation à 7,4 ± 0,2 à 25 °C. Répartir
le milieu de base dans des flacons de capacités appropriées. Stériliser à l'autoclave (6.1) à 121 °C pendant
15 min.
5.3.2 Solution antibiotique
5.3.2.1 Composition
Céfopérazone 0,032 g
Amphotéricine B 0,01 g
Eau 5 ml
5.3.2.2 Préparation
Dissoudre les composants dans de l'eau. Stériliser par filtration.
5.3.3 Milieu complet
5.3.3.1 Composition
Milieu de base (5.3.1) 1 000 ml
Solution antibiotique (5.3.2) 5 ml
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ISO/TS 10272-2:2006(F)
5.3.3.2 Préparation
Ajouter la solution antibiotique au milieu de base refroidi à 47 °C ± 2 °C, puis mélanger avec soin. Verser
environ 15 ml de milieu complet dans des boîtes de Petri stériles (6.8). Laisser se solidifier. Immédiatement
avant l'emploi, sécher soigneusement les boîtes de gélose, de préférence sans le couvercle et la surface
gélosée tournée vers le bas, dans une étuve (6.2) pendant 30 min ou jusqu'à ce que la surface gélosée soit
exempte d'humidité visible. Si elles ont été préparées à l'avance, ne pas conserver les boîtes de gélose non
séchées pendant plus de 4 h à température ambiante ou à l'abri de la lumière à 5 °C ± 3 °C pendant plus de
7 jours.
5.3.3.3 Contrôle de performances
Pour les définitions de sélectivité et de productivité, se reporter à l'ISO/TS 11133-1. Pour les critères de
performance, se référer à ISO/TS 11133-2:2003, Tableau B.5.
5.4 Gélose au sang Columbia
5.4.1 Milieu de base
5.4.1.1 Composition
Digestat enzymatique de tissus animaux 23,0 g
Amidon 1,0 g
Chlorure de sodium 5,0 g
a
Agar
8,0 g à 18,0 g
Eau 1 000 ml
a
En fonction du pouvoir gélifiant de l'agar.
5.4.1.2 Préparation
Dissoudre les composants de base ou le milieu de base complet déshydraté dans de l'eau et amener à
ébullition. Ajuster le pH, si nécessaire, de manière à le porter après stérilisation à 7,3 ± 0,2 à 25 °C. Répartir
le milieu de base dans des flacons de capacités appropriées. Stériliser à l'autoclave (6.1) à 121 °C pendant
15 min
...
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