ISO 12966-2:2017
(Main)Animal and vegetable fats and oils — Gas chromatography of fatty acid methyl esters — Part 2: Preparation of methyl esters of fatty acids
Animal and vegetable fats and oils — Gas chromatography of fatty acid methyl esters — Part 2: Preparation of methyl esters of fatty acids
ISO 12966-2:2017 specifies methods of preparing the methyl esters of fatty acids. It includes methods for preparing fatty acid methyl esters from animal and vegetable fats and oils, fatty acids and soaps. To cover different requirements, four methylation methods are specified, namely: a) a "rapid" transmethylation procedure under alkaline conditions; b) a "general" transmethylation/methylation procedure under sequential alkaline and acid conditions; c) a BF3 transmethylation procedure; d) an alternative procedure using acid-catalysed transmethylation of glycerides. Methyl esters so produced are used in various analytical procedures requiring such derivatives, e.g. gas-liquid chromatography (GLC), thin-layer chromatography (TLC) and infrared spectrometry (IR). Milk and milk products (or fat coming from milk and milk products) are excluded from the scope of this document.
Corps gras d'origines animale et végétale — Chromatographie en phase gazeuse des esters méthyliques d'acides gras — Partie 2: Préparation des esters méthyliques d'acides gras
ISO 12966-2:2017 spécifie des méthodes de préparation des esters méthyliques d'acides gras. Il comprend des méthodes de préparation des esters méthyliques d'acides gras à partir de corps gras d'origines animale et végétale, d'acides gras et de savons. Afin de répondre à différentes exigences, quatre méthodes de méthylation sont spécifiées, à savoir: a) une méthode de transméthylation «rapide» en conditions alcalines; b) une méthode de transméthylation/méthylation «générale» en conditions alcalines et acides séquentielles; c) une méthode de transméthylation au BF3; d) une méthode alternative reposant sur la transméthylation par catalyse acide de glycérides. Les esters méthyliques ainsi obtenus sont utilisés dans diverses méthodes d'analyse exigeant des produits dérivés de ce type, par exemple la chromatographie gaz-liquide (CGL), la chromatographie sur couche mince (CCM) et la spectrométrie infrarouge (IR). Le lait et les produits laitiers (ou les matières grasses provenant du lait et des produits laitiers) ne font pas partie du domaine d'application du présent document.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 12966-2
Second edition
2017-03
Animal and vegetable fats and oils —
Gas chromatography of fatty acid
methyl esters —
Part 2:
Preparation of methyl esters of fatty
acids
Corps gras d’origines animale et végétale — Chromatographie en
phase gazeuse des esters méthyliques d’acides gras —
Partie 2: Préparation des esters méthyliques d’acides gras
Reference number
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ISO 2017
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ISO 12966-2:2017(E)
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ISO 12966-2:2017(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Reactions . 1
5 Methodology . 2
5.1 Preparation of test sample . 2
5.2 Rapid method . 2
5.2.1 Applicability . 2
5.2.2 Principle . 2
5.2.3 Reagents . 3
5.2.4 Apparatus . 3
5.2.5 Procedure . 3
5.3 General method . 4
5.3.1 Applicability . 4
5.3.2 Principle . 4
5.3.3 Reagents . 4
5.3.4 Apparatus and materials . 5
5.3.5 Procedure . 5
5.4 Transmethylation using boron trifluoride (BF ) catalyst . 6
3
5.4.1 Principle . 6
5.4.2 Applicability . 6
5.4.3 Reagents . 6
5.4.4 Apparatus . 7
5.4.5 Procedure . 8
5.5 Acid-catalysed transmethylation of glycerides . 9
5.5.1 Principle . 9
5.5.2 Reagents . 9
5.5.3 Apparatus .10
5.5.4 Preparation of test sample .10
5.5.5 Procedure .10
Annex A (informative) Thin-layer chromatography method for testing the completeness
of derivatization .11
Bibliography .15
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ISO 12966-2:2017(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following
URL: w w w . i s o .org/ iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 11,
Animal and vegetable fats and oils.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 12966-2:2011), of which it constitutes a
minor revision.
The changes compared to the previous edition are as follows:
— milk and milk fat products have been excluded from the scope.
A list of all the parts in the ISO 12966 series can be found on the ISO website.
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ISO 12966-2:2017(E)
Introduction
General
Oils and fats (i.e. liquid and solid lipids) are predominantly composed of fatty acid esters of glycerol
(triacylglycerols, TAGs), with smaller amounts of fatty acid esters of sterols and long chain of aliphatic
alcohols. Due to the high molecular mass of the TAGs and their consequent low volatility, they are
difficult to analyse directly by gas chromatography (GC), especially if a detailed analysis of unsaturated
fatty acids is required. Fatty acids themselves do not chromatograph well (except for short-chain-length
fatty acids, e.g. butanoic and pentanoic acids). It is therefore better practice to form fatty acid esters,
usually the fatty acid methyl esters (FAMEs), prior to GC.
The analysis of oils and fats has been extensively reviewed in Reference [9].
The formation of FAMEs is a critical stage in the analysis of fatty acids. Non-quantitative conversion
of fatty acids to FAMEs, modification of the structure of fatty acids (e.g. changes in positional and
geometric isomers present) and formation of non-FAME artefacts may all affect the quantitative
determination of fatty acid composition.
Transesterification is one mechanism which can be employed to form FAMEs from fatty acid esters in
fats (i.e. triacylglycerol). Alkali- or acid-catalysed transesterification procedures can be used to form
FAMEs in a methanolic medium; the procedure can be termed transmethylation. Transmethylation is
a reversible process and a large excess of methanol is required to maintain an equilibrium position
which favours formation of the FAMEs. Water can prevent the reaction going to completion, and its
presence should therefore be minimized. Alkali-catalysed procedures do not produce FAMEs from free
fatty acids, due to the formation of soaps.
Esterification is an acid-catalysed mechanism which can be employed to form FAMEs from fatty acids.
It is possible that the fatty acids are naturally present in the sample of fat under examination. Formation
of FAMEs by this mechanism is commonly termed methylation. Again, an excess of methanol and the
absence of water are preconditions for the quantitative formation of FAMEs.
This document provides guidelines for the preparation of fatty acid methyl esters. In support of these
guidelines, various procedures to prepare fatty acid methyl esters are specified. These include the
following:
a) “rapid” transmethylation under alkaline conditions;
b) “general” transmethylation/methylation under sequential alkaline and acid conditions;
c) boron trifluoride (BF ) transmethylation/methylation.
3
“Rapid” transmethylation method under alkali-catalysed conditions
This method is applicable to the routine analysis of edible fats and oils containing fatty acids down to
butanoic acid (C4:0) and/or for the determination of butanoic acid or hexanoic acid (C6:0) by GC using
an internal standard.
Alkaline catalysts transesterify neutral lipids in the presence of anhydrous methanol (transmethylation)
more rapidly than acid catalysts. The disadvantages of such alkali-catalysed procedures are that free
fatty acids are not esterified, and the presence of water may prevent the transmethylation going to
completion (hydrolysis of the FAMEs to free fatty acids). The most commonly used reagents are
potassium and sodium hydroxide and sodium methoxide in the presence of anhydrous methanol.
“General” transmethylation/methylation under sequential alkaline and acid conditions
This method under sequential alkali- and acid-catalysed conditions is applicable to all oils and fats
including distillate and acid oils, but is not recommended for lauric oils. Short-chain fatty acid methyl
esters are easily lost during reflux. For lauric acid oils, the “rapid” transmethylation method is
recommended.
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ISO 12966-2:2017(E)
During methylation, substances containing the following configurations can be totally or partially
decomposed:
a) keto, epoxy, hydroxyl, hydroperoxy groups;
b) cyclopropyl and cyclopropenyl groups;
c) acetylenic fatty acids.
Boron trifluoride (BF ) transmethylation/methylation
3
Owing to the toxicity of BF it is recommended that this method only be used in extremis.
3
The BF method is applicable for most oils, fats and derivatives (fatty acids, soaps) with the exception of
3
milk fats and fats containing fatty acids with specific groups.
During methylation, substances containing the following configurations can be totally or partially
decomposed:
a) keto, epoxy, hydroxyl, hydroperoxy groups;
b) cyclopropyl and cyclopropenyl groups;
c) acetylenic fatty acids.
If the fatty matter contains such substances in only very small amounts (e.g. cottonseed oil), the method
can be applied; otherwise, the “rapid” or “general” transmethylation/methylation methods should be
followed.
For GC, the optimum recovery of the methyl esters from the reaction mixture is obtained by using
isooctane (2,2,4-trimethylpentane). However, only about 75 % of the methyl caproate present is
recovered.
Boron trifluoride is a strong Lewis acid, and in the form of its coordination complex with methanol, under
reflux conditions, it can rapidly methylate fatty acids. Methanolic boron trifluoride does transmethylate
fatty acid esters (e.g. triglyceride), but the rate of reaction is slower than the methylation of fatty acids.
Methanolic boron trifluoride solution is commercially available, which enhances the attractiveness of
this acid catalyst, but there are potential disadvantages associated with the use of this reagent.
a) It has been reported that high concentrations of boron trifluoride (50 % mass fraction) produce
methoxy artefacts from unsaturated fatty acids.
b) The reagent has a limited shelf-life at ambient temperature and should be kept refrigerated.
c) Aged reagent can produce artefacts and therefore, it is recommended that each new batch
purchased be tested before use and periodically during its lifetime.
d) Methanolic boron trifluoride is an acidic reagent and therefore can produce derivatives of fatty
acids containing labile groups which can give rise to spurious peaks on FAME chromatograms.
Additional information
Much attention has been given to the preparation and analysis of esters of short-chain fatty acids by GC,
largely because of their occurrence in milk fats. Short-chain fatty acids, in the free state or esterified to
glycerol, can be converted completely to methyl esters by any of the reagents described in the preceding
paragraphs, but quantitative recovery from the reaction medium may not be achieved unless special
precautions are taken. Losses can occur at several stages in any procedure. Short-chain fatty acid esters
(methyl especially) are volatile and may be lost selectively on refluxing the esterification medium;
they are more soluble in water than longer-chain esters and can be lost in an aqueous extraction step
or they may be distilled off when the extracting solvent is evaporated. Selective losses can also occur
if non-saponifiable impurities have to be removed by sublimation or thin-layer chromatography (TLC)
purification. The best esterification procedures for short-chain fatty acids are those in which heating of
the reagents is avoided and in which stages involving aqueous extraction and solvent removal are absent.
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ISO 12966-2:2017(E)
Injection of reaction media containing basic and acidic esterification catalysts directly on to GC
columns shortens their working lives. The top few centimetres of packed columns can be replenished
periodically, while lengths of deactivated tubing or “retention gaps” ahead of capillary columns protect
them. This can be a small price to pay for the speed, simplicity and accuracy of these procedures.
Additionally, this document gives a simple TLC procedure to check the effectiveness of the
transmethylation/methylation. This procedure may also be used to check the generic composition of an
oil or fat before transmethylation/methylation is undertaken.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 12966-2:2017(E)
Animal and vegetable fats and oils — Gas chromatography
of fatty acid methyl esters —
Part 2:
Preparation of methyl esters of fatty acids
1 Scope
This document specifies methods of preparing the methyl esters of fatty acids.
It includes methods for preparing fatty acid methyl esters from animal and vegetable fats and oils, fatty
acids and soaps. To cover different requirements, four methylation methods are specified, namely:
a) a “rapid” transmethylation procedure under alkaline conditions;
b) a “general” transmethylation/methylation procedure under sequential alkaline and acid conditions;
c) a BF transmethylation procedure;
3
d) an alternative procedure using acid-catalysed transmethylation of glycerides.
Methyl esters so produced are used in various analytical procedures requiring such derivatives, e.g.
gas-liquid chromatography (GLC), thin-layer chromatography (TLC) and infrared spectrometry (IR).
Milk and milk products (or fat coming from milk and milk products) are excluded from the scope of this
document.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 661, Animal and vegetable fats and oils — Preparation of test sample
3 Terms and definitions
No terms and definitions are listed in this document.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: available at http:// www .iso .org/ obp
4 Reactions
The determination of the fatty acid composition of oils and fats is one of the fundamental analyses
within the fats and oils sector and has been extensively reviewed in Reference [9]. For this purpose, the
fatty acid components of lipids are usually converted to methyl esters followed by GC analysis.
The “rapid” method (5.2) does not derivatize free fatty acids (FFAs) present in oil to fatty acid methyl
esters (FAMEs). If FFAs are present, the assumption is usually made that the FFAs have the same fatty
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ISO 12966-2:2017(E)
acid distribution as the triglycerides. This is usually true for crude oils, but less so for fractionated or
refined oils. Except for some cold-pressed oils, as a general rule, oils with <0,5 % mass fraction FFAs
have probably been refined; oils above can be assumed to be crude. The tolerable concentration of FFAs
in oil depends on the particular oil being analysed and also the intended use of the FAME data generated.
The presence of FFAs in oil might introduce additional peaks on the final gas chromatogram and make
the identification of FAMEs synthesized using the “rapid” transmethylation procedure problematic.
The “general” (5.3) procedure derivatizes both FFAs and glyceryl esters to FAMEs (see 5.3.1).
It is up to the analyst to decide whether the use of either the “rapid” or “general” procedure is
appropriate based on the nature of the oil being analysed. This notwithstanding, as a general rule,
use of the “rapid” method is suggested only if the FFA content is ≤0,5 % mass fraction. The “general”
method (5.3) is suggested for oils with an FFA content >0,5 % mass fraction. Alternatively, if a partially
hydrolysed fat is to be converted to FAMEs, the acid-catalysed transmethylation procedure specified in
5.5 may be used.
Owing to the toxicity of BF , it is recommended that the BF method (5.4) be used only in extremis.
3 3
5 Methodology
WARNING — The method specified involves the use of potentially hazardous reagents. Normal
precautions shall be taken for eye protection and for protection from the dangers of corrosive
chemical burns. Methanolic potassium hydroxide solution is poisonous.
5.1 Preparation of test sample
The test sample shall be liquid, dry and clear. Proceed in accordance with ISO 661, but heat the sample
to just above the melting point.
5.2 Rapid method
5.2.1 Applicability
This rapid transmethylation method, under alkali-catalysed conditions, is applicable to the routine
analysis of edible fats and oils containing fatty acids down to butanoic acid (C4:0) and/or for the
determination of butanoic acid or hexanoic acid (C6:0) by GC using an internal standard.
This procedure does not derivatize FFAs to FAMEs. The analyst should note that the presence of FFAs in
the final solution can affect the quality of subsequent gas chromatography.
[8]
NOTE According to COI/T.20/Doc. No. 24:2001 , a similar procedure can be applied directly to samples of
the following oil categories:
a) virgin olive oil with an acidity less than 3,3 %;
b) refined olive oil;
c) olive oil (blend of virgin and refined olive oil);
d) refined olive-pomace oil;
e) olive-pomace oil (blend of virgin olive oil and refined olive-pomace oil).
5.2.2 Principle
Methyl esters are formed by transmethylation with methanolic potassium hydroxide. Free fatty acids
are not esterified by this procedure.
2 © ISO 2017 – All rights reserved
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ISO 12966-2:2017(E)
5.2.3 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified.
The reagents shall not produce peaks which interfere with those of the fatty acid methyl esters during
GC. Any new batch of reagent or solvent should be checked by using it to prepare the methyl ester of
pure oleic acid. If any extra, unexpected peaks appear during the final GC analysis, the reagent should
be rejected.
5.2.3.1 Methanol, containing not more than 0,5 % mass fraction water.
[3]
5.2.3.2 Water, complying with ISO 3696 , grade 3.
5.2.3.3 Sodium hydrogensulfate, anhydrous.
5.2.3.4 Isooctane (2,2,4-trimethylpentane), chromatographic quality.
WARNING — Isooctane is flammable and a fire risk. Explosive volume fraction limits in air are
1,1 % to 6,0 %. It is toxic by ingestion and inhalation. Use a properly operating ventilated hood
when working with this solvent.
5.2.3.5 Potassium hydroxide, methanolic solution, amount of substance concentration
c approximately 2 mol/l.
Dissolve, with gentle heating, 13,1 g of potassium hydroxide (mass fraction w = 85 g/100 g) in 100 ml of
absolute methanol.
5.2.3.6 Internal standard stock solution, for butanoic and/or hexanoic acid determination only.
Weigh 250 mg (to the nearest 0,1 mg) of valeric acid methyl ester (methyl pentanoate) into a 50 ml one-
mark volumetric flask (5.2.4.4). Use isooctane to dissolve the sample and make up to the mark with the
same solvent.
5.2.3.7 Internal standard reference solution, for butanoic and/or hexanoic acid determination only.
Add (5.2.4.2) 10 ml of stock solution to a 100 ml volumetric flask (5.2.4.4) and make up to the mark with
isooctane. Calculate the concentration of this reference solution.
5.2.3.8 Sodium chloride solution, dissolve 40 g of sodium chloride in 100 ml of water.
5.2.4 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
5.2.4.1 Screw-top test tubes, 10 ml, with cap fitted with a PTFE-joint.
[6]
5.2.4.2 Pipettes, capacities 0,1 ml, 2 ml and 10 ml, ISO 8655-2 .
5.2.4.3 Glass sample vials, 3 ml.
[2]
5.2.4.4 One-mark volumetric flasks, capacities 50 ml and 100 ml, ISO 1042 class A.
5.2.5 Procedure
In a 10 ml screw-top test tube (5.2.4.1), weigh approximately 0,1 g of the test sample (5.1). If fatty acids
are to be determined quantitatively by GC using an internal standard(s), it is essential to weigh the
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ISO 12966-2:2017(E)
test portion accurately, i.e. to the nearest 0,1 mg. The results are then expressed as percentage mass
fractions of the fatty acid in the fat or oil. These results do not necessarily agree with results obtained
by internal normalization.
Add (5.2.4.2) 2 ml of isooctane (5.2.3.4) and shake. In certain instances, it may not be possible to use the
specified 0,1 g sample size, in which case, the amount of isooctane added to the test portion should be
changed proportionately.
For butanoic and/or hexanoic acid determination, pipette (5.2.4.2) 2 ml of reference solution (5.2.3.7)
instead of isooctane. In certain instances, it may be necessary to analyse fats and oils that contain low
amounts of these fatty acids. In this instance, the volume of reference solution added to the test sample
may be reduced proportionately.
Add (5.2.4.2) 0,1 ml of 2 mol/l methanolic potassium hydroxide solution (5.2.3.5), immediately
put on the cap fitted with a PTFE-joint, tighten the cap and shake vigorously for 1 min. The solution
becomes clear and then shortly afterwards becomes cloudy again as glycerol separates. Allow to
stand for approximately 2 min. Add approximately 2 ml of sodium chloride solution and shake briefly.
Draw off the isooctane layer and transfer to a sample vial (5.2.4.3). Add approximately 1 g of sodium
hydrogensulfate (5.2.3.3) and shake the solution.
The isooctane solution is suitable for analysis using GC in accordance with ISO 12966-4.
NOTE The effectiveness of derivatization using the “rapid” procedure can be determined by TLC as described
in Annex A.
5.3 General method
5.3.1 Applicability
This general transmethylation/methylation method, under sequential alkali- and acid-catalysed
conditions, is applicable to all oils and fats including distillate and acid oils, but not recommended for
lauric oils. Short-chain fatty acid methyl esters are easily lost during reflux. For lauric oils, the method
specified in 5.2 is recommended.
During methylation, substances containing the following configurations can be totally or partially
decomposed:
a) keto, epoxy, hydroxyl, hydroperoxy groups;
b) cyclopropyl and cyclopropenyl groups;
c) acetylenic fatty acids.
[8]
NOTE According to COI/T.20/Doc. No. 24:2001 , this method can be applied directly to samples of the
following oil categories:
a) virgin olive oil with an acidity greater than 3,3 %;
b) crude olive-pomace oil.
5.3.2 Principle
The alkaline reagent causes transmethylation of glyceryl esters to fatty acid methyl esters; free fatty
acids are converted to soaps. The acid catalyst converts the soaps to fatty acid methyl esters.
CAUTION — Methylation shall be done under a ventilated hood.
5.3.3 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade. The reagents shall not produce peaks which interfere
with those of the fatty acid methyl esters during GC. Any new batch of reagent or solvent should be
4 © ISO 2017 – All rights reserved
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...
NORME ISO
INTERNATIONALE 12966-2
Deuxième édition
2017-03
Corps gras d’origines animale et
végétale — Chromatographie en
phase gazeuse des esters méthyliques
d’acides gras —
Partie 2:
Préparation des esters méthyliques
d’acides gras
Animal and vegetable fats and oils — Gas chromatography of fatty
acid methyl esters —
Part 2: Preparation of methyl esters of fatty acids
Numéro de référence
ISO 12966-2:2017(F)
©
ISO 2017
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ISO 12966-2:2017(F)
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ISO 12966-2:2017(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Réactions . 2
5 Méthodologie . 2
5.1 Préparation de l’échantillon pour essai . 2
5.2 Méthode rapide . 2
5.2.1 Applicabilité . 2
5.2.2 Principe . 3
5.2.3 Réactifs . 3
5.2.4 Appareillage . 4
5.2.5 Mode opératoire . 4
5.3 Méthode générale . 4
5.3.1 Applicabilité . 4
5.3.2 Principe . 5
5.3.3 Réactifs . 5
5.3.4 Appareillage et matériaux. 5
5.3.5 Mode opératoire . 6
5.4 Transméthylation à l’aide d’un catalyseur au trifluorure de bore (BF ). 6
3
5.4.1 Principe . 6
5.4.2 Applicabilité . 7
5.4.3 Réactifs . 7
5.4.4 Appareillage . 8
5.4.5 Mode opératoire . 8
5.5 Transméthylation par catalyse acide des glycérides .10
5.5.1 Principe .10
5.5.2 Réactifs .10
5.5.3 Appareillage .10
5.5.4 Préparation de l’échantillon pour essai .11
5.5.5 Mode opératoire .11
Annexe A (informative) Méthode de chromatographie sur couche mince pour vérifier l’état
complet de la dérivatisation .12
Bibliographie .16
© ISO 2017 – Tous droits réservés iii
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ISO 12966-2:2017(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
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spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: w w w . i s o .org/ iso/ fr/ avant -propos .html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 11, Corps gras d’origines animale et végétale.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 12966-2:2011), qui a fait l’objet
d’une révision mineure.
Les modifications par rapport à l’édition précédente sont les suivants:
— le lait et les matières grasses laitières ne font pas partie du domaine d’application.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 12966 est disponible sur le site web de l’ISO.
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ISO 12966-2:2017(F)
Introduction
Généralités
Les corps gras (c’est-à-dire les lipides liquides et solides) sont essentiellement composés d’esters d’acides
gras de glycérol (triacylglycérols, ou TAG), avec des quantités moindres d’esters d’acides gras de stérols
et d’alcools aliphatiques à longue chaîne. Du fait de leur masse moléculaire élevée et leur très faible
volatilité, les TAG sont difficiles à analyser directement par chromatographie en phase gazeuse (CG),
en particulier si une analyse détaillée des acides gras insaturés est requise. Les acides gras eux-mêmes
ne réagissent pas bien à la chromatographie (à l’exception des acides gras à chaîne courte tels que les
acides butyrique et valérique). La pratique recommandée consiste donc à former des esters d’acides
gras, généralement des esters méthyliques d’acides gras (EMAG), avant la CG.
L’analyse des corps gras a été étudiée de manière approfondie dans la Référence [9].
La formation d’EMAG constitue une phase essentielle de l’analyse des acides gras. La conversion non
quantitative des acides gras en EMAG, la modification de la structure des acides gras (par exemple les
changements dans les isomères géométriques et de position présents) et la formation d’artéfacts non-
EMAG peuvent toutes affecter la détermination quantitative de la composition en acides gras.
La transestérification est l’un des mécanismes qui peuvent être employés pour former des EMAG à
partir des esters d’acides gras présents dans des corps gras (triacylglycérol, par exemple). Des méthodes
de transestérification par catalyse alcaline ou acide peuvent être utilisées pour former des EMAG dans
un milieu méthanolique — cette méthode porte le nom de transméthylation. La transméthylation est
un processus réversible et de grandes quantités de méthanol sont nécessaires pour maintenir un état
d’équilibre favorisant la formation d’EMAG. La présence d’eau peut empêcher la réaction d’aller à son
terme, et il convient donc de la réduire au minimum. Les méthodes par catalyse alcaline ne produisent
pas d’EMAG à partir d’acides gras, en raison de la formation de savons.
L’estérification est un mécanisme à catalyse acide qu’il est possible d’employer pour former des EMAG
à partir d’acides gras. Les acides gras peuvent être naturellement présents dans l’échantillon de corps
gras analysé. La formation d’EMAG à l’aide de ce mécanisme est communément appelée méthylation.
À nouveau, une grande quantité de méthanol et l’absence d’eau sont des conditions préalables à la
formation quantitative d’EMAG.
Le présent document fournit des lignes directrices pour la préparation d’esters méthyliques d’acides
gras. Diverses méthodes de préparation d’esters méthyliques d’acides gras sont spécifiées en
complément de ces lignes directrices. Celles-ci comprennent:
a) la transméthylation «rapide» en conditions alcalines;
b) la transméthylation/méthylation «générale» en conditions alcalines et acides séquentielles;
c) la transméthylation/méthylation au trifluorure de bore (BF ).
3
Transméthylation «rapide» en conditions de catalyse alcalines
Cette méthode s’applique à l’analyse de routine des matières grasses alimentaires contenant des acides
gras à partir de l’acide butyrique (C4:0) et/ou pour la détermination de l’acide butyrique ou de l’acide
hexanoïque (C6:0) par CG à l’aide d’un étalon interne.
Les catalyseurs alcalins transestérifient les lipides neutres en présence de méthanol anhydre
(transméthylation) plus rapidement que les catalyseurs acides. Les inconvénients liés à ces méthodes
par catalyse alcaline tiennent au fait que les acides gras libres ne sont pas estérifiés et que la présence
d’eau peut empêcher la transméthylation d’aller jusqu’à son terme (hydrolyse des EMAG en acides gras
libres). Les réactifs les plus couramment utilisés sont l’hydroxyde de potassium et de sodium, ainsi que
le méthoxyde de sodium en présence de méthanol anhydre.
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ISO 12966-2:2017(F)
Transméthylation/méthylation «générale» en conditions alcalines et acides séquentielles
Cette méthode en conditions de catalyse alcaline et acide séquentielles est applicable à tous les corps
gras, y compris les huiles distillées et acides, mais n’est pas recommandée pour les huiles lauriques. Les
esters méthyliques d’acides gras à chaîne courte sont facilement perdus lors du reflux. Pour les huiles
lauriques, la méthode de transméthylation «rapide» est recommandée.
Au cours de la méthylation, les substances contenant les configurations suivantes peuvent être
totalement ou partiellement décomposées:
a) les groupes cétone, époxy, hydroxyle, hydroperoxy;
b) les groupes cyclopropyle et cyclopropényle;
c) les acides gras acétyléniques.
Transméthylation/méthylation au trifluorure de bore (BF )
3
En raison de la toxicité du BF , il est recommandé de n’utiliser cette méthode qu’en dernier recours.
3
La méthode au BF est applicable à la plupart des huiles, graisses et substances dérivées (acides gras,
3
savons) à l’exception des matières grasses laitières et des graisses contenant des acides gras de types
spécifiques.
Au cours de la méthylation, les substances contenant les configurations suivantes peuvent être
totalement ou partiellement décomposées:
a) les groupes cétone, époxy, hydroxyle, hydroperoxy;
b) les groupes cyclopropyle et cyclopropényle;
c) les acides gras acétyléniques.
La méthode peut s’appliquer si la matière grasse contient des substances de ce type en très petites
quantités seulement (huile de coton, par exemple); sinon, il convient de suivre la méthode de
transméthylation/méthylation «rapide» ou «générale».
Pour la CG, la récupération optimale des esters méthyliques du mélange réactionnel est obtenue en
utilisant de l’isooctane (2,2,4-triméthylpentane). Cependant, seulement 75 % environ du caproate de
méthyle présent sont récupérés.
Le trifluorure de bore est un acide de Lewis fort et, sous la forme de son complexe de coordination avec
le méthanol, il peut méthyler rapidement les acides gras en conditions de reflux. Le trifluorure de bore
méthanolique transméthyle bien les esters d’acides gras (triglécyride, par exemple), mais la vitesse de
réaction est plus lente que la méthylation des acides gras. Une solution méthanolique de trifluorure
de bore est disponible dans le commerce, ce qui renforce l’attrait de ce catalyseur acide, mais son
utilisation présente des inconvénients potentiels.
a) Il a été signalé que de fortes concentrations de trifluorure de bore (50 % fraction massique)
produisent des artéfacts méthoxy à partir d’acides gras insaturés.
b) Le réactif a une durée de conservation limitée à température ambiante et il convient de le conserver
au frais.
c) Un réactif vieilli peut produire des artéfacts, c’est pourquoi il est recommandé d’essayer chaque
nouveau lot acheté avant utilisation, ainsi que périodiquement sur la durée de vie.
d) Le trifluorure de bore méthanolique est un réactif acide et peut donc produire des dérivés
d’acides gras contenant des groupes labiles pouvant entraîner l’apparition de pics parasites sur les
chromatogrammes d’EMAG.
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ISO 12966-2:2017(F)
Informations complémentaires
Une attention particulière a été portée à la préparation et l’analyse des esters d’acides gras à chaîne
courte par CG, en grande partie en raison de leur occurrence dans les matières grasses laitières. Les
acides gras à chaîne courte, à l’état libre ou estérifié en glycérol, peuvent être convertis complètement
en esters méthyliques par n’importe lequel des réactifs décrits dans les alinéas précédents, mais
la récupération quantitative à partir du milieu réactionnel ne peut être réalisée sans prendre de
précautions spéciales. Des pertes peuvent se produire à plusieurs stades dans toute méthode. Les
esters d’acides gras à chaîne courte (méthyle notamment) sont volatils et peuvent subir des pertes
sélectives lors du reflux du milieu d’estérification; ils sont plus solubles dans l’eau que les esters à
plus longue chaîne et peuvent être perdus lors d’une phase d’extraction aqueuse; ou ils peuvent être
éliminés par distillation lors de l’évaporation du solvant d’extraction. Des pertes sélectives peuvent
également se produire lorsque des impuretés non saponifiables doivent être éliminées par sublimation
ou purification par chromatographie sur couche mince (CCM). Les meilleures méthodes d’estérification
pour les acides gras à chaîne courte sont celles où le chauffage des réactifs est évité et où les phases
d’extraction aqueuse ou d’élimination de solvant sont absentes.
L’injection de milieux réactionnels contenant des catalyseurs d’estérification basiques et acides
directement sur les colonnes de CG réduit leur durée de vie. Les quelques centimètres supérieurs des
colonnes remplies peuvent être regarnis périodiquement, tandis que l’utilisation de longueurs de tubes
désactivés ou «précolonnes de rétention» à l’avant des colonnes capillaires les protège. Il s’agit là de
bien peu de choses pour assurer vitesse, simplicité et précision de ces méthodes.
En outre, le présent document décrit une méthode simple de CCM pour vérifier l’efficacité de la
transméthylation/méthylation. Cette méthode peut également être utilisée pour vérifier la composition
générique d’un corps gras avant d’entreprendre la transméthylation/méthylation.
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NORME INTERNATIONALE ISO 12966-2:2017(F)
Corps gras d’origines animale et végétale —
Chromatographie en phase gazeuse des esters méthyliques
d’acides gras —
Partie 2:
Préparation des esters méthyliques d’acides gras
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie des méthodes de préparation des esters méthyliques d’acides gras.
Il comprend des méthodes de préparation des esters méthyliques d’acides gras à partir de corps gras
d’origines animale et végétale, d’acides gras et de savons. Afin de répondre à différentes exigences,
quatre méthodes de méthylation sont spécifiées, à savoir:
a) une méthode de transméthylation «rapide» en conditions alcalines;
b) une méthode de transméthylation/méthylation «générale» en conditions alcalines et acides
séquentielles;
c) une méthode de transméthylation au BF ;
3
d) une méthode alternative reposant sur la transméthylation par catalyse acide de glycérides.
Les esters méthyliques ainsi obtenus sont utilisés dans diverses méthodes d’analyse exigeant des
produits dérivés de ce type, par exemple la chromatographie gaz-liquide (CGL), la chromatographie sur
couche mince (CCM) et la spectrométrie infrarouge (IR).
Le lait et les produits laitiers (ou les matières grasses provenant du lait et des produits laitiers) ne font
pas partie du domaine d’application du présent document.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements
ISO 661, Corps gras d’origines animale et végétale — Préparation de l’échantillon pour essai
3 Termes et définitions
Aucun terme et définitions ne sont listés dans le présent document.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http:// www .iso .org/ obp
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ISO 12966-2:2017(F)
4 Réactions
La détermination de la composition en acides gras des huiles et des graisses est l’une des analyses
fondamentales dans le secteur des corps gras et a été étudiée de manière approfondie dans la
Référence [9]. À cette fin, les composants acides gras des lipides sont généralement convertis en esters
méthyliques avant analyse par CG.
La méthode «rapide» (5.2) ne dérive pas les acides gras libres (AGL) présents dans l’huile en esters
méthyliques d’acides gras (EMAG). Si des AGL sont présents, il est généralement supposé que ces
AGL ont la même distribution d’acides gras que les triglycérides. Cela est généralement vrai pour les
huiles brutes, mais moins pour les huiles fractionnées ou raffinées. À l’exception de certaines huiles
de pression à froid, la règle générale est que les huiles avec moins de 0,5 % (fraction massique) d’AGL
ont probablement été raffinées; les huiles se situant au-delà peuvent être considérées comme étant
brutes. La concentration acceptable d’AGL dans l’huile dépend de l’huile particulière analysée, ainsi que
de l’utilisation prévue des données EMAG générées. La présence d’AGL dans l’huile peut introduire des
pics supplémentaires sur le chromatogramme final et rendre problématique l’identification des EMAG
synthétisés à l’aide de la méthode de transméthylation «rapide».
La méthode «générale» (5.3) dérive à la fois les AGL et les esters glycériques en EMAG (voir 5.3.1).
Il revient à l’analyste de décider s’il est préférable d’utiliser la méthode «rapide» ou «générale» selon la
nature de l’huile analysée. Il n’en demeure pas moins, en règle générale, que l’utilisation de la méthode
«rapide» est envisagée uniquement si la teneur en AGL est inférieure ou égale à 0,5 % (fraction massique).
La méthode «générale» (5.3) est conseillée pour les huiles dont la teneur en AGL est supérieure à 0,5 %
(fraction massique). En alternative, la méthode de transméthylation par catalyse spécifiée en 5.5 peut
être utilisée si un corps gras partiellement hydrolysé doit être converti en EMAG.
En raison de la toxicité du BF , il est recommandé de n’utiliser la méthode au BF (5.4) qu’en dernier
3 3
recours.
5 Méthodologie
AVERTISSEMENT — La méthode spécifiée implique l’utilisation de réactifs potentiellement
dangereux. Des précautions d’usage doivent être prises pour la protection des yeux et contre les
risques de brûlures chimiques corrosives. La solution méthanolique d’hydroxyde de potassium
est toxique.
5.1 Préparation de l’échantillon pour essai
L’échantillon pour essai doit être liquide, sec et limpide. Procéder conformément à l’ISO 661, mais en
chauffant l’échantillon juste au-dessus du point de fusion.
5.2 Méthode rapide
5.2.1 Applicabilité
La méthode de transméthylation rapide en conditions de catalyse alcalines peut s’employer pour
l’analyse de routine des matières grasses alimentaires contenant des acides gras à partir de l’acide
butyrique (C4:0) et/ou pour la détermination de l’acide butyrique ou de l’acide hexanoïque (C6:0) par
CG à l’aide d’un étalon interne.
Cette méthode ne dérive pas les AGL en EMAG. L’analyste doit noter que la présence d’AGL dans la
solution finale pourrait affecter la qualité de la chromatographie en phase gazeuse qui s’ensuit.
[8]
NOTE Selon le COI/T.20/Doc. N° 24:2001 , une méthode similaire peut être appliquée directement sur des
échantillons des catégories d’huile suivantes:
a) huile d’olive vierge avec une acidité inférieure à 3,3 %;
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b) huile d’olive raffinée;
c) huile d’olive (mélange d’huile d’olive vierge et raffinée);
d) huile de grignons d’olive raffinée;
e) huile de grignons d’olive (mélange d’huile d’olive vierge et d’huile de grignons d’olive raffinée).
5.2.2 Principe
Les esters méthyliques sont formés par transméthylation avec de l’hydroxyde de potassium
méthanolique. Les acides gras libres ne sont pas estérifiés par cette méthode.
5.2.3 Réactifs
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
Les réactifs ne doivent pas produire de pics qui interfèrent avec ceux des esters méthyliques d’acides
gras pendant la CG. Il convient de vérifier tout nouveau lot de réactif ou de solvant en l’utilisant pour
préparer l’ester méthylique de l’acide oléique pur. Si des pics supplémentaires apparaissent de façon
intempestive au cours de l’analyse CG finale, il convient de rejeter le réactif concerné.
5.2.3.1 Méthanol, ne contenant pas plus de 0,5 % d’eau (fraction massique).
[3]
5.2.3.2 Eau, conforme à la qualité 3 de l’ISO 3696 .
5.2.3.3 Hydrogénosulfate de sodium, anhydre.
5.2.3.4 Isooctane (2,2,4-triméthylpentane), de qualité chromatographique.
AVERTISSEMENT — L’isooctane est un liquide inflammable qui présente des risques d’incendie.
Les limites d’explosivité dans l’air sont de 1,1 % à 6,0 % (fraction volumique). Il est toxique par
ingestion et inhalation. Utiliser une hotte ventilée en bon état de marche pour travailler avec ce
solvant.
5.2.3.5 Hydroxyde de potassium en solution méthanolique, concentration en quantité de matière
c ≈ 2 mol/l.
Dissoudre en réchauffant lentement 13,1 g d’hydroxyde de potassium (fraction massique w = 85 g/100 g)
dans 100 ml de méthanol absolu.
5.2.3.6 Solution mère d’étalon interne, pour la détermination de l’acide butyrique et/ou hexanoïque
uniquement.
Peser 250 mg (à 0,1 mg près) d’ester méthylique de l’acide valérique (pentanoate de méthyle) dans une
fiole jaugée de 50 ml (5.2.4.4). Utiliser de l’isooctane pour dissoudre l’échantillon et compléter jusqu’au
trait avec le même solvant.
5.2.3.7 Solution de référence d’étalon interne, pour la détermination de l’acide butyrique et/ou
hexanoïque uniquement.
Introduire (5.2.4.2) 10 ml de solution mère dans une fiole jaugée de 100 ml (5.2.4.4) et compléter
jusqu’au trait avec de l’isooctane. Calculer la concentration de cette solution de référence.
5.2.3.8 Solution de chlorure de sodium, dissoudre 40 g de chlorure de sodium dans 100 ml d’eau.
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ISO 12966-2:2017(F)
5.2.4 Appareillage
Matériel de laboratoire courant et, en particulier, ce qui suit.
5.2.4.1 Tubes à essai à bouchon à vis, 10 ml, avec bouchon muni d’un joint en
polytétrafluororéthylène (PTFE).
[6]
5.2.4.2 Pipettes, de capacité 0,1 ml, 2 ml et 10 ml, ISO 8655-2 .
5.2.4.3 Flacons à échantillon en verre, 3 ml.
[2]
5.2.4.4 Fioles jaugées à un trait, de capacité 50 ml et 100 ml, ISO 1042 classe A.
5.2.5 Mode opératoire
Peser environ 0,1 g de l’échantillon pour essai (5.1) dans un tube à essai à bouchon à vis de 10 ml
(5.2.4.1). Dans le cas où la détermination quantitative des acides gras par CG doit se faire en utilisant
un ou des étalons internes, il est impératif de peser la prise d’essai avec précision, c’est-à-dire à 0,1 mg
près. Les résultats sont ensuite exprimés en pourcentage, sous forme de fractions massiques d’acide
...
Questions, Comments and Discussion
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