ISO/TS 11133-2:2003
(Main)Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and production of culture media — Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and production of culture media — Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media
ISO/TS 11133-2:2003 sets criteria and methods for the performance testing of culture media. It applies to: commercial bodies producing and/or distributing ready-to-use or semi-finished reconstituted or dehydrated media to microbiological laboratories; non-commercial bodies supplying media to third parties; microbiological laboratories preparing culture media for their own use and evaluating the performance of these media.
Microbiologie des aliments — Guide pour la préparation et la production des milieux de culture — Partie 2: Guide général pour les essais de performance des milieux de culture
L'ISO/TS 11133-2:2003 définit des critères et des méthodes pour les essais de performance des milieux de culture. Elle s'applique: aux entités commerciales qui produisent des milieux prêts à l'emploi, semi-finis reconstitués ou déshydratés et/ou les distribuent aux laboratoires de microbiologie; aux entités non commerciales qui fournissent des milieux à des tiers; aux laboratoires de microbiologie qui préparent des milieux de culture pour leur propre usage et qui évaluent les performances de ces milieux.
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Relations
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Standards Content (Sample)
TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 11133-2
First edition
2003-12-15
Corrected version
2004-08-01
Microbiology of food and animal feeding
stuffs — Guidelines on preparation and
production of culture media —
Part 2:
Practical guidelines on performance
testing of culture media
Microbiologie des aliments — Guide pour la préparation et la production
des milieux de culture —
Partie 2: Guide général pour les essais de performance des milieux de
culture
Reference number
ISO/TS 11133-2:2003(E)
©
ISO 2003
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ISO/TS 11133-2:2003(E)
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ISO/TS 11133-2:2003(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
In other circumstances, particularly when there is an urgent market requirement for such documents, a
technical committee may decide to publish other types of normative document:
— an ISO Publicly Available Specification (ISO/PAS) represents an agreement between technical experts in
an ISO working group and is accepted for publication if it is approved by more than 50 % of the members
of the parent committee casting a vote;
— an ISO Technical Specification (ISO/TS) represents an agreement between the members of a technical
committee and is accepted for publication if it is approved by 2/3 of the members of the committee
casting a vote.
An ISO/PAS or ISO/TS is reviewed after three years in order to decide whether it will be confirmed for a
further three years, revised to become an International Standard, or withdrawn. If the ISO/PAS or ISO/TS is
confirmed, it is reviewed again after a further three years, at which time it must either be transformed into an
International Standard or be withdrawn.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO/TS 11133-2 was prepared by the European Committee for Standardization (CEN) in collaboration with
Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9, Microbiology, in accordance with the
Agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
ISO/TS 11133 consists of the following parts, under the general title Microbiology of food and animal feeding
stuffs — Guidelines on preparation and production of culture media:
— Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory
— Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media
This corrected version of ISO/TS 11133-2:2003 incorporates the following corrections:
4.2.3.1: addition of “a recently released batch”;
4.2.3.3: Note 1 is deleted;
5.1, last paragraph: “sensitivity” is replaced by “selectivity”;
5.2.1.1: subclause is replaced;
5.2.1.2: “per ml” is deleted;
5.4.2.2, a)-c): “should” is replaced by “shall”;
Annex B: “equivalent strains” is replaced by “same strains”.
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ISO/TS 11133-2:2003(E)
Contents Page
Foreword. v
Introduction . vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 1
4 Criteria for routine quality control. 1
5 Methods for use in performance testing of culture media . 4
6 Documentation of test results . 10
Annex A (informative) Example of card for recording test results of culture media prepared by the user
laboratory. 12
Annex B (normative) Recommended test microorganisms for commonly used culture media (giving
information on the culture medium, culture conditions, test microorganisms, culture
collection number of test organisms and the expected reactions). 13
Bibliography . 23
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ISO/TS 11133-2:2003(E)
Foreword
This document (CEN ISO/TS 11133-2:2003) has been prepared by Technical Committee CEN/TC 275 “Food
analysis - Horizontal methods”, the secretariat of which is held by DIN, in collaboration with Technical Committee
ISO/TC 34 “Food products”.
This document "Microbiology of food and animal feeding stuffs – Guidelines on preparation and production of
culture media" consist of two parts:
Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory
Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media
Annex A is informative. Annex B is normative.
This document includes a Bibliography.
According to the CEN/CENELEC Internal Regulations, the national standards organizations of the following
countries are bound to announce this Technical Specification: Austria, Belgium, Czech Republic, Denmark,
Finland, France, Germany, Greece, Hungary Iceland, Ireland, Italy, Luxembourg, Malta, Netherlands, Norway,
Portugal, Slovakia, Spain, Sweden, Switzerland and the United Kingdom.
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Introduction
It is essential to use culture media of proven quality to carry out microbiological analysis of food reliably. For all
media described in standardized methods it is essential to define the minimum acceptance criteria required to
ensure media reliability. It is recommended that in the determination of the performance characteristics of a culture
medium tests are carried out that conform with this Technical Specification. This applies to:
a) commercially prepared ready-to-use or dehydrated media;
b) culture media prepared from basic constituents in the user’s laboratory.
The establishment of widely accepted minimum performance criteria for media should lead to more consistent
quality of commercially made products and thus reduce the extent of testing necessary in the user’s laboratory.
Furthermore the minimum acceptance criteria measured by the methods defined in this Technical Specification can
be used by all microbiological laboratories to evaluate the productive, selective and/or elective properties of a
culture medium.
In the microbiological analysis of food and animal feeding stuffs the requirements of this Technical Specification
have priority in the assessment of media quality.
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ISO/TS 11133-2:2003(E)
1 Scope
This Technical Specification sets criteria and methods for the performance testing of culture media. This Technical
Specification applies to:
commercial bodies producing and/or distributing ready-to-use or semi-finished reconstituted or dehydrated
media to microbiological laboratories;
non-commercial bodies supplying media to third parties;
microbiological laboratories preparing culture media for their own use and evaluating the performance of these
media.
2 Normative references
This Technical Specification incorporates by dated or undated reference, provisions from other publications. These
normative references are cited at the appropriate places in the text and the publications are listed hereafter. For
dated references, subsequent amendments to or revisions of any of these publications apply to this Technical
Specification only when incorporated in it by amendment or revision. For undated references the latest edition of
the publication referred to applies (including amendments).
ENV ISO 11133-1:2000, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Guidelines on preparation and production
of culture media – Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the
laboratory (ISO/TR 11133-1:2000).
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ENV ISO 11133-1:2000 apply.
4 Criteria for routine quality control
4.1 General quality criteria
4.1.1 Quality of culture media
The quality of culture media depends on the quality of the basic ingredients, correct formulation, quality of
preparation procedures, elimination of contaminant microbial agents and appropriate packaging and storage
conditions (see ENV ISO 11133-1).
The manufacturer or producer in the laboratory shall comply with the physico-chemical characteristics of the culture
media as specified in the corresponding standard. Furthermore, quality assessment shall ensure that the culture
medium conforms to stated recommendations, including:
distributed quantity and/or thickness;
appearance, colour and homogeneity;
gel consistency;
moisture content;
pH value;
buffering capacity;
microbial contamination.
The individual components and any nutritive or selective supplements shall also undergo suitable quality
assessment procedures.
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4.1.2 Quality of basic media components
Culture media described in the International Standards were judged satisfactory; however, due to the variability of
their quality, it may be acceptable for media manufacturers to modify the concentration of some basic biological
ingredients, as listed below:
peptones and meat or yeast extracts variable in their nutritive properties;
agar variable in its gelling properties;
buffering substances;
bile salts, bile extract and desoxycholate, antibacterial dyes, depending on their selective properties;
antibiotics depending on their activity.
4.2 Microbiological quality criteria
4.2.1 General
The microbiological performance tests shall be carried out on a sample which is representative of a batch of end
product.
4.2.2 Microbial contamination
An appropriate quantity, depending on the size of the batch of culture medium, shall be tested for microbial
contamination by incubation under appropriate conditions. Target limits for the percentage of contaminated plates
or containers of liquid medium should be established for each medium or specified by the manufacturer.
Manufacturers should draw up specifications based on media components, processing limits and type of
packaging.
NOTE 1 The samples to be tested should be at least 1 plate or tube or 1 % of plates or tubes from the beginning and 1 plate
or tube or 1 % of plates or tubes from the end of a pouring or dispensing process. The plates or tubes should be incubated for at
least 18 h at 37ºC or under the incubation conditions which are used routinely for this medium according to the specific
standard.
NOTE 2 For statistical sampling plans refer to the ISO 2859-1:1999.
4.2.3 Growth
4.2.3.1 General
To evaluate each batch of complete culture medium, nutrient components or supplements, growth shall be
appropriately assessed by either:
a) quantitative; or
b) semi-quantitative; or
c) qualitative methods.
Quantitative, semi-quantitative or qualitative evaluations shall be performed by the methods described in this
Technical Specification or by another generally accepted technique. For interpretation of the results of testing, it is
necessary to compare the amount of growth on the test medium with that on a reference medium. The use of a
specific reference medium is therefore mandatory for quantitative methods (see the specific standard or Annex B)
For semi-quantitative or qualitative methods, the use of a specific reference medium (see corresponding specific
standard or Annex B) or a culture medium giving a "positive" reaction helps to interpret results. The reference
medium must be of known good quality chosen from a recently released batch, or, if comparing long term stability,
a recently released batch, a batch from another supplier, or a ready-to-use medium, etc.
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In addition, growth of the target strains shall be typical in appearance, size and morphology of the colonies and
growth of the non-target strains shall be partly or completely inhibited.
4.2.3.2 Productivity
Solid, semi-solid or liquid culture media shall be inoculated with an appropriate inoculum (5.2.1.1) of the working
culture of each of the defined test microorganisms using an appropriate device.
Productivity shall reach a defined minimum limit (see corresponding specific standard or Annex B).
For quantitative methods the Productivity Ratio P (1) is determined as follows:
R
N
S
P = (1)
R
N
O
where
N is the total colony count obtained on the culture medium under test (obtained from one or more plates);
s
N is the total colony count obtained on the defined reference culture medium obtained from one or more
o
plates, and shall be
NOTE The Productivity Ratio of a non selective medium is at least 0,7 for microorganisms that can grow easily on that
medium. The P of the target microorganisms on a selective medium should be at least 0,1. These values are generally
R
achievable, however less rigorous criteria can be accepted for certain combinations of media and test microorganisms (see
corresponding specific standard or Annex B)
For semi-quantitative methods, the scores of consecutive sectors of a plate inoculated by the ecometric technique
are summed to obtain the growth index G , which varies according to the culture medium. It is therefore important
I
to compare them with previous indices and/or G of a reference medium and to ensure that variations are not
I
excessive. The expected range of variations for each culture medium can also be established once sufficient
experience of the method has been gained.
Qualitative evaluations shall be carried out visually by allocating growth scores.
4.2.3.3 Selectivity
To assess selectivity quantitatively, selective culture media and a reference medium are inoculated with an
appropriate inoculum (5.2.1.2.) of the defined test microorganism using an appropriate device. Selectivity has to
reach defined values (see corresponding specific standard or Annex B).
The Selectivity Factor S (2), is calculated as follows:
F
S = D-D (2)
F O S
where
D is the highest dilution showing growth of at least 10 colonies on the reference medium;
O
D is the highest dilution showing comparable growth on the test medium.
S
S , D and D are expressed in log units.
F O S 10
NOTE The SF of non-target microorganisms on a selective medium should be at least 2. This value is generally achievable.
However, less rigorous criteria can be accepted for certain combinations of media and test microorganisms (see corresponding
specific standard or Annex B).
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ISO/TS 11133-2:2003(E)
For semi-quantitative and qualitative methods the growth of the non-target strain(s) shall be inhibited partly or
completely.
4.2.4 Biochemical and physiological characteristics (selectivity and specificity)
The colony morphology and the diagnostic features together with the degree of selectivity should be established in
order to obtain a complete picture of the performance of a medium.
The essential characteristics of specificity shall be defined and achieved. For differential media the quality of
biochemical / physiological characteristics of the target microorganism(s) and the degree of inhibition of non-target
microorganisms should be determined with an appropriate set of test strains.
4.2.5 Antimicrobial testing characteristics
The antimicrobial action of antibiotics depends upon their agar diffusion characteristics and any antagonistic effects
from the components present. Media for testing the presence or absence of antimicrobial substances in food
samples should conform to reference methods.
4.3 Performance evaluation and interpretation of results
A batch of culture medium performs satisfactorily if all the test microorganisms used perform according to the given
specifications. It shall be accepted if both general and microbiological quality criteria are met.
5 Methods for use in performance testing of culture media
5.1 General
Examples of quantitative, semi-quantitative and qualitative testing methods for solid culture media and liquid media
are described. In most cases in the user’s laboratory semi-quantitative and qualitative techniques will meet the
performance testing requirements of a batch of culture medium.
For special cases, e.g. evaluation of a new medium or a new manufacturer, etc., quantitative testing methods shall
be performed by the user’s laboratory.
Familiarity with general microbiological techniques is assumed and therefore the methods are not given in
exhaustive detail.
Suitable test microorganisms are listed in Annex B (see also ENV ISO 11133-1).
NOTE It is the intention in the future, that new and revised individual standards for detection or enumeration of specific
microorganisms or groups of microorganisms will describe the relevant test microorganisms to be used, together with the
acceptance criteria for each culture medium in the standard.
In liquid media the interactions leading to the successful growth of microorganisms are more complex, hence
defining performance testing methods is less straightforward than for solid media.
For the successful isolation of targeted microorganisms in a multistage method, for example detection of
Salmonella, several complex interactions take place at each growth stage. Here a control test using appropriate
samples, culture and reference materials should be set up, so that the productivity or the selectivity, respectively, of
the whole method is demonstrated. This is in addition to demonstrating that each component medium is fit for
purpose.
5.2 Test microorganisms
The appropriate reference strains of target (productivity) and non-target (selectivity) microorganisms for each
culture medium are given in Annex B. The test microorganisms should meet the requirements given in 5.2.2 of ENV
ISO 11133-1:2000, e.g. robust, weakly growing, biochemically unreactive or injured strains, as appropriate.
Guidance on the preservation and maintenance of reference strains is given in Annex B of ENV ISO 11133-1.
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ISO/TS 11133-2:2003(E)
5.2.1 Preparation of the working culture
Working cultures shall be prepared as a pure stationary phase culture in a non-selective broth from the reference
stock culture.
Different techniques may be used, but shall guarantee the purity of the inoculum, as well as its standardisation
which allows it to be used at a later stage.
NOTE Frozen inocula may be used if it can be shown that the microorganism can survive for the chosen period.
5.2.1.1 Working culture for productivity testing
2
For quantitative tests of plate media for wanted microorganisms, an inoculum level of approximately 10 cfu is used.
3 4
For semi-quantitative or qualitative tests of plate media, an inoculum level 10 -10 cfu is need.
For productivity tests of liquid media, an inoculum level 10-100 cfu is used.
5.2.1.2 Working culture for selectivity testing
4 6
For selectivity testing of culture media, a suspension of the non-target microorganism containing 10 cfu to 10 cfu
is inoculated onto the plate or into the tube of medium.
5.2.1.3 Incubation conditions
Incubate the inoculated culture media in accordance with the conditions described in the corresponding standard
and given in the appropriate tables in Annex B.
5.3 Methods for solid culture media
5.3.1 Quantitative plating method
5.3.1.1 General
This is a general method suitable for most solid culture media. It may not be suitable for testing some types of
moulds.
5.3.1.2 Procedure
Use working cultures as described in 5.2.1.
Select an appropriate number of plates representative of each batch to be tested and ensure the surface of
each plate is adequately dried. Plates of the reference medium should be similarly prepared (see 4.4.4 of ENV
ISO 11133-1:2000).
Spread onto the surface of the test and reference plates an inoculum of the diluted working culture to give
counts that fall within the recommended limits given in 5.2.1.
NOTE 1 The modified Miles-Misra surface drop method and other dropping systems or a spiral plater may also be used.
NOTE 2 The pour plate method may also be used for culture media normally used for enumeration in this way.
Incubate plates under appropriate conditions as defined in the individual standards.
Count the colonies present on each plate or from each drop as appropriate. Assess the size and appearance
of the colonies.
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5.3.1.3 Calculation
Based on the volume spread on the plates and the dilution factor, the mean count on the medium can be
calculated. In the case of dropping methods the number of drops and their volume must be considered.
5.3.1.4 Interpretation of results
To interpret the results, the Productivity Ratio P (4.2.3.2), and where appropriate the Selectivity Factor S (4.2.3.3),
R F
should be calculated.
5.3.2 Semi-quantitative streaking method based on ecometry
5.3.2.1 General
The streaking method is suitable for performance testing of solid and liquid culture media but the method is only
semi-quantitative. Growth indices are therefore only indicative and it can only be regarded as a supplementary test
for solid culture media.
When using this method the culture media tested should be dried to the same degree and the whole procedure
shall be standardized so that results of different batches can be compared.
5.3.2.2 Procedure
Agar plates are prepared in the usual manner with about 15 ml of agar. Media normally used for the pour plate
technique, for example Plate Count Agar (PCA), may also be tested by surface plating on solidified media.
Use working cultures as described in 5.2.1.
The plates are streaked as shown in Figure 1 using a 1 ml loop. Four parallel lines are drawn with the loop at
approximately 0,5 cm intervals over sector A. Streaking is repeated for sectors B and C and terminated in
sector D with a single line. A template can be used beneath the plate to facilitate accurate streaking.
The incubation times and temperatures stated in the standard methods are used.
NOTE Only the loop, not the wire, should be dipped in the culture. The loop should be completely filled with the culture.
Excess liquid should be removed by pressing the wider part of the loop three times against the edge of the container. When
streaking plates the angle between the loop and agar surface should be 20° to 30°. The pressure of the loop on the agar surface
and the rapidity of streaking must be consistent throughout. Dipping the loop in the culture whilst foam and/or bubbles are on
the surface of the broth should be avoided.
Normally the same loop is used for streaking all sectors from A to D without flaming the loop between streaks. In
some cases where a lower growth index G is expected to demonstrate distinct differences, changing or sterilising
I
the loop between streaking sectors A and B may be appropriate.
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ISO/TS 11133-2:2003(E)
Figure 1 — Pattern of inoculation by modified streaking method and angle of loop
5.3.2.3 Calculation
After incubation, the appearance, colony size and intensity of growth are assessed and the growth index G
I
calculated. Each streaking line showing growth is scored with 1. The maximum score per plate is 16. The streak is
scored as 0,5 if growth only occurs along half of its length. A streak without growth or with scanty growth (less than
half the length), is scored as 0. The scores are summed to obtain the G . For example, if growth was obtained in
I
sectors A and B and in half of sector C the G would be 10.
I
5.3.2.4 Interpretation of results
The growth index G given by a target strain should be at least 6 in order to conclude that the medium is
I
acceptable. In the case of non selective media the G is normally higher.
I
In addition, growth of the target strain shall be typical, and growth of non-target strains shall be partly or completely
inhibited.
5.3.3 Qualitative streaking method
5.3.3.1 General
The method is suitable for supplementary performance testing of solid culture media.
The method is only qualitative and scores are therefore only indicative.
5.3.3.2 Procedure
Agar plates are prepared in the usual manner with about 15 ml of agar. Media normally used for the pour plate
technique, for example Plate Count Agar (PCA), may also be tested by surface plating on solidified media.
Use working cultures as described in 5.2.1.
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ISO/TS 11133-2:2003(E)
The test microorganisms are streaked in parallel straight lines with a 1 ml loop on the surface of the test
medium. Several test microorganisms can be streaked on the same plate without crossing.
NOTE Other standardized streaking techniques can be used.
The incubation times and temperatures stated in the standard methods are used.
5.3.3.3 Interpretation of results
The growth on the plates after incubation is assessed as:
0 corresponds to zero growth,
1 corresponds to weak growth, and
2 corresponds to good growth.
Target microorganisms shall score 2 and have typical appearance, size and colony morphology. The growth of
non-target microorganisms shall be partly or completely inhibited (0 or 1).
5.4 Methods for liquid culture media
5.4.1 General
To determine the productivity of a liquid medium an appropriate inoculum shall be used. The quantitative,
semi-quantitative and qualitative methods described below assess productivity and selectivity. The proposed
methods record the quantity of growth after appropriate incubation by plating or streaking from the liquid media
onto agar media and enumerating colony forming units (cfu) or calculating scores from the liquid medium. For
qualitative methods in liquid media the characteristic reactions are assessed visually.
5.4.2 Quantitative dilution method for target and non-target microorganisms
The method is also appropriate for evaluation of new culture media or diluents.
5.4.2.1 Procedure
Select an appropriate number of tubes or 10
...
SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 11133-2
Première édition
2003-12-15
Version corrigée
2004-08-01
Microbiologie des aliments — Guide pour
la préparation et la production des
milieux de culture —
Partie 2:
Guide général pour les essais de
performance des milieux de culture
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on
preparation and production of culture media —
Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media
Numéro de référence
ISO/TS 11133-2:2003(F)
©
ISO 2003
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Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
Dans d'autres circonstances, en particulier lorsqu'il existe une demande urgente du marché, un comité
technique peut décider de publier d'autres types de documents:
⎯ une Spécification publiquement disponible ISO (ISO/PAS) représente un accord entre les experts dans
un groupe de travail ISO et est acceptée pour publication si elle est approuvée par plus de 50 % des
membres votants du comité dont relève le groupe de travail;
⎯ une Spécification technique ISO (ISO/TS) représente un accord entre les membres d'un comité technique
et est acceptée pour publication si elle est approuvée par 2/3 des membres votants du comité.
Une ISO/PAS ou ISO/TS fait l'objet d'un examen après trois ans afin de décider si elle est confirmée pour trois
nouvelles années, révisée pour devenir une Norme internationale, ou annulée. Lorsqu'une ISO/PAS ou
ISO/TS a été confirmée, elle fait l'objet d'un nouvel examen après trois ans qui décidera soit de sa
transformation en Norme internationale soit de son annulation.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO/TS 11133-2 a été élaborée par le Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec le
comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie, conformément à
l'Accord de coopération technique entre l'ISO et le CEN (Accord de Vienne).
L'ISO/TS 11133 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Microbiologie des
aliments — Guide pour la préparation et la production des milieux de culture:
⎯ Partie 1: Guide général pour l'assurance de la qualité pour la préparation des milieux de culture en
laboratoire
⎯ Partie 2: Guide général pour les essais de performance des milieux de culture
La présente édition en français correspond à la version corrigée de l'ISO/TS 11133-2:2003, publiée en anglais
en 2004.
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ISO/TS 11133-2:2003(F)
Sommaire Page
Avant-propos. v
Introduction . vi
1 Domaine d'application.1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions.1
4 Critères de contrôle systématique de la qualité.2
5 Méthodes pour les essais de performance des milieux de culture.5
6 Documentation des résultats d'essai .12
Annexe A (informative) Exemple de carte de contrôle pour enregistrer les résultats des essais
des milieux de culture préparés au laboratoire par l'utilisateur.13
Annexe B (normative) Micro-organismes pour essai recommandés pour les milieux de culture les
plus usuels (fournissant des informations sur le milieu de culture, les conditions de
culture, les micro-organismes pour essai, le numéro de collection des souches pour
essai et les réactions attendues) .14
Bibliographie .25
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ISO/TS 11133-2:2003(F)
Avant-propos
Le présent document (CEN ISO/TS 11133-2:2003) a été élaboré par le Comité Technique CEN/TC 275
«Analyse des produits alimentaires - Méthodes horizontales», dont le secrétariat est tenu par le DIN, en
collaboration avec le Comité Technique ISO/TC 34 «Produits alimentaires».
Le présent document «Microbiologie des aliments — Guide pour la préparation et la production des milieux de
culture» comporte deux parties:
⎯ Partie 1: Guide général pour l'assurance de la qualité pour la préparation des milieux de culture en
laboratoire
⎯ Partie 2: Guide général pour les essais de performance des milieux de culture
L'Annexe A est informative. L'Annexe B est normative.
Le présent document comporte une Bibliographie.
Selon le Règlement Intérieur du CEN/CENELEC, les instituts de normalisation nationaux des pays suivants
sont tenus d'annoncer cette Spécification technique: Allemagne, Autriche, Belgique, Danemark, Espagne,
Finlande, France, Grèce, Hongrie, Irlande, Islande, Italie, Luxembourg, Malte, Norvège, Pays-Bas, Portugal,
République Tchèque, Royaume-Uni, Slovaquie, Suède et Suisse.
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ISO/TS 11133-2:2003(F)
Introduction
Pour effectuer des analyses microbiologiques des aliments fiables, il est essentiel d'utiliser des milieux de
culture de qualité reconnue. Pour tous les milieux décrits dans les méthodes normalisées, il est indispensable
de définir les critères de conformité minimaux nécessaires pour garantir la fiabilité des milieux. Il est
recommandé, pour la détermination des caractéristiques de performance d'un milieu de culture, de procéder à
des essais conformes à la présente Spécification technique. Cette recommandation s'applique:
a) aux milieux déshydratés ou prêts à l'emploi disponibles dans le commerce;
b) aux milieux de culture préparés à partir des composants de base dans le laboratoire où ils sont utilisés.
Il convient que l'établissement de critères de performance minimaux largement acceptés pour les milieux
conduise à l'apparition de produits du commerce de qualité plus homogène, et réduise ainsi le nombre des
essais nécessaires dans les laboratoires où ils sont utilisés.
En outre, les critères de conformité minimaux mesurés à l'aide des méthodes définies dans la présente
Spécification technique peuvent être utilisés par tous les laboratoires de microbiologie pour évaluer le
caractère productif, sélectif et/ou électif d'un milieu de culture.
Les exigences relatives à l'analyse microbiologique des aliments contenues dans la présente Spécification
Technique sont prioritaires dans l'évaluation de la qualité des milieux.
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SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 11133-2:2003(F)
Microbiologie des aliments — Guide pour la préparation et la
production des milieux de culture —
Partie 2:
Guide général pour les essais de performance des milieux de
culture
1 Domaine d'application
La présente Spécification technique définit des critères et des méthodes pour les essais de performance des
milieux de culture. La présente Spécification technique s'applique:
⎯ aux entités commerciales qui produisent des milieux prêts à l'emploi, semi-finis reconstitués ou
déshydratés et/ou les distribuent aux laboratoires de microbiologie;
⎯ aux entités non commerciales qui fournissent des milieux à des tiers;
⎯ aux laboratoires de microbiologie qui préparent des milieux de culture pour leur propre usage et qui
évaluent les performances de ces milieux.
2 Références normatives
Les documents normatifs suivants contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui y est faite,
constituent des dispositions valables pour la présente Spécification technique. Pour les références datées, les
amendements ultérieurs ou les révisions de ces publications ne s'appliquent pas. Toutefois, les parties
prenantes aux accords fondés sur la présente Spécification technique sont invitées à rechercher la possibilité
d'appliquer les éditions les plus récentes des documents normatifs indiqués ci-après. Pour les références non
datées, la dernière édition du document normatif en référence s'applique (y compris les éventuels
amendements).
ENV ISO 11133-1:2000, Microbiologie des aliments — Guide pour la préparation et la production des milieux
de culture — Partie 1: Guide général pour l'assurance de la qualité pour la préparation des milieux de culture
en laboratoire (ISO/TS 11133-1:2000)
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l'ENV ISO 11133-1:2000
s'appliquent.
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ISO/TS 11133-2:2003(F)
4 Critères de contrôle systématique de la qualité
4.1 Critères de qualité généraux
4.1.1 Qualité des milieux de culture
La qualité des milieux dépend de la qualité de leurs ingrédients de base, de leur bonne formulation, de la
qualité des modes opératoires de préparation, de l'élimination des agents microbiens contaminants et de
l'adéquation de l'emballage et des conditions de stockage (voir l'ENV ISO 11133-1).
Le fabricant ou le producteur au laboratoire doit se conformer aux caractéristiques physico-chimiques des
milieux de culture spécifiées dans la norme applicable. En outre, le système qualité doit permettre de garantir
la conformité des milieux de culture aux recommendations établies, telles que:
⎯ la quantité répartie et/ou l'épaisseur;
⎯ l'aspect, la couleur et l'homogénéité;
⎯ la consistance du gel;
⎯ le taux d'humidité;
⎯ la valeur du pH;
⎯ le pouvoir tampon;
⎯ la contamination microbienne.
Les composants individuels et les compléments nutritifs ou sélectifs doivent également être soumis à des
contrôles d'assurance qualité appropriés.
4.1.2 Qualité des composants de base des milieux
Les milieux de culture décrits dans les Normes internationales sont jugés satisfaisants. Néanmoins, du fait de
la variabilité de leur qualité, il peut être admis que les fabricants de milieux modulent la concentration de
certains ingrédients biologiques de base, comme indiqués ci-dessous:
⎯ les peptones et les extraits de viande ou de levure en fonction de leurs propriétés nutritives;
⎯ l'agar en fonction de son pouvoir gélifiant;
⎯ les substances tampons;
⎯ les sels biliaires, l'extrait de bile et le désoxycholate, les colorants antibactériens, en fonction de leur
propriétés sélectives;
⎯ les antibiotiques en fonction de leur activité.
4.2 Critères de qualité microbiologique
4.2.1 Généralités
Les essais de performance microbiologique doivent être effectués sur un échantillon représentatif d'un lot de
produits finis.
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ISO/TS 11133-2:2003(F)
4.2.2 Contamination microbienne
Une quantité de chaque lot de milieu de culture adaptée à sa taille doit être soumise à essai pour évaluer la
contamination microbienne par incubation dans des conditions appropriées. Il convient que les limites cibles
pour le pourcentage de boîtes ou de récipients de milieu liquide contaminés soient déterminées pour chaque
milieu ou spécifiées par le fabricant. Il convient que les fabricants établissent des spécifications fondées sur
les composants des milieux, les limites liées aux procédés et les types d'emballage.
NOTE 1 Pour les essais, il convient de prélever au moins une boîte ou un tube ou 1 % de boîtes ou de tubes du début
de la répartition et une boîte ou un tube ou 1 % de boîtes ou de tubes de la fin de la répartition. Il convient que les boîtes
ou les tubes soient incubés pendant au moins 18 h à 37 °C ou dans les conditions d'incubation habituellement utilisées
pour ce milieu conformément à la norme applicable.
NOTE 2 Pour les plans d'échantillonnage statistique se référer à l'ISO 2859-1:1999.
4.2.3 Croissance
4.2.3.1 Généralités
Pour le contrôle par lot des milieux de culture complets, des ingrédients nutritifs ou des suppléments pour
milieux de culture, la croissance doit être évaluée par des méthodes:
a) quantitatives, ou
b) semi-quantitatives ou
c) qualitatives.
Les évaluations quantitatives, semi-quantitatives ou qualitatives doivent être effectuées selon les méthodes
décrites dans la présente Spécification technique ou selon une autre méthode reconnue. Pour l'interprétation
des résultats, il est nécessaire de comparer la croissance sur le milieu d'essai avec celle obtenue sur le milieu
de référence. Pour les méthodes quantitatives, il est donc obligatoire d'utiliser un milieu spécifique comme
milieu de référence (voir la norme applicable ou l'Annexe B).
Pour les méthodes semi-quantitatives ou qualitatives, l'utilisation d'un milieu de référence spécifique (voir la
norme applicable ou l'Annexe B) ou d'un milieu de culture donnant une réaction positive facilite l'interprétation
des résultats. Le milieu de référence doit être choisi dans un lot antérieur récemment accepté et reconnu de
bonne qualité, ou, pour comparer la stabilité à long terme, dans un lot récemment contrôlé, dans un lot d'un
autre fournisseur, dans un milieu prêt à l'emploi, etc.
En outre, la croissance des souches désirées doit présenter un aspect, une taille et une morphologie des
colonies caractéristiques, et la croissance des souches indésirables doit être partiellement ou complètement
inhibée.
4.2.3.2 Productivité
À l'aide d'un instrument adapté et de micro-organismes pour essai définis, des milieux de culture solides,
semi-solides ou liquides doivent être ensemencés avec un inoculum approprié (5.2.1.1) de la culture de travail
de chacun des micro-organismes à soumettre à essai.
La productivité doit atteindre une limite minimale fixée (voir la norme applicable ou l'Annexe B).
Pour les méthodes quantitatives, le rapport de productivité P (1) est déterminé comme suit:
R
N
s
P = (1)
R
N
o
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ISO/TS 11133-2:2003(F)
où
N est le nombre total de colonies obtenu sur le milieu de culture soumis à essai (obtenu sur une ou
s
plusieurs boîtes);
N est le nombre total de colonies obtenu sur le milieu de culture de référence défini obtenu sur une ou
o
plusieurs boîtes, mais doit être W 100 ufc.
NOTE Le rapport de productivité d'un milieu non sélectif est au moins égal à 0,7 pour les micro-organismes qui se
développent facilement sur ce milieu. Il convient que le P des micro-organismes pour essai sur un milieu sélectif soit au
R
moins de 0,1. Ces valeurs sont généralement réalisables. Néanmoins, pour certaines combinaisons de milieux et de
micro-organismes pour essai, des critères moins stricts peuvent être adoptés (voir la norme applicable ou l'Annexe B).
Pour les méthodes semi-quantitatives, les scores obtenus sur différents secteurs consécutifs d'une boîte
ensemencée selon une technique écométrique sont additionnés pour obtenir l'indice de croissance G . G
I I
varie suivant les milieux de culture. Il est donc important de les comparer avec les indices précédents et/ou G
I
d'un milieu de référence et de vérifier que les variations ne sont pas excessives. La plage de variation
spécifique d'un milieu de culture peut également être déterminée une fois qu'une expérience suffisante de la
méthode est acquise.
Les évaluations qualitatives doivent être effectuées visuellement en attribuant des scores de croissance.
4.2.3.3 Sélectivité
Pour l'évaluation de la sélectivité par des méthodes quantitatives à l'aide d'un instrument adapté et de micro-
organismes pour essai définis, des milieux de culture sélectifs et un milieu de culture de référence sont
ensemencés avec un inoculum approprié (5.2.1.2.) de ces micro-organismes. La sélectivité doit atteindre des
valeurs définies (voir la norme applicable ou l'Annexe B).
Le facteur de sélectivité S (2) est calculé comme suit:
F
SD=−D (2)
FO S
où
D est la dilution la plus élevée présentant une croissance d'au moins 10 colonies sur le milieu de
O
référence;
D est la dilution la plus élevée présentant une croissance comparable sur le milieu soumis à essai.
S
S , D et D sont exprimés en log à base 10.
F O S
NOTE Il convient que le S des micro-organismes indésirables sur un milieu sélectif soit au moins de 2. Cette valeur
F
est généralement réalisable. Néanmoins, pour certaines combinaisons de milieux et de micro-organismes pour essai, des
critères moins stricts peuvent être adoptés (voir la norme applicable ou l'Annexe B).
Pour les méthodes semi-quantitatives et qualitatives, la croissance de souches indésirables doit être
partiellement ou complètement inhibée.
4.2.4 Caractéristiques biochimiques et physiologiques (sélectivité et spécificité)
Il convient que la morphologie des colonies, leurs caractéristiques, de même que le degré de sélectivité,
soient déterminés afin d'obtenir une représentation complète des performances d'un milieu.
Les caractéristiques essentielles de la spécificité doivent être définies et atteintes. Dans le cas des milieux de
différenciation, la qualité des caractéristiques biochimiques/physiologiques des micro-organismes recherchés
et le degré d'inhibition des micro-organismes indésirables doivent être déterminés à l'aide d'un panel de
souches d'essai.
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ISO/TS 11133-2:2003(F)
4.2.5 Caractéristiques antimicrobiennes
L'action antimicrobienne des antibiotiques dépend de leur propriété de diffusion de la gélose et des possibles
effets antagonistes. Il convient que les milieux utilisés pour effectuer des essais visant à déterminer la
présence ou l'absence de substances antimicrobiennes dans les échantillons alimentaires soient conformes
aux méthodes de référence.
4.3 Évaluation de performance et interprétation des résultats
Un lot de milieu de culture est satisfaisant si tous les micro-organismes pour essai se comportent
conformément aux spécifications données. Il doit être accepté si à la fois les critères de qualité généraux et
les critères de qualité microbiologiques sont remplis.
5 Méthodes pour les essais de performance des milieux de culture
5.1 Généralités
Des méthodes d'essai quantitatives, semi-quantitatives et qualitatives pour les milieux de culture solides et
liquides sont données à titre d'exemple. Dans la plupart des laboratoires où elles seront utilisées, les
techniques semi-quantitatives et qualitatives répondront aux exigences relatives aux essais de performance
pour un lot de milieu de culture.
Pour les cas particuliers, par exemple pour l'évaluation d'un nouveau milieu ou d'un nouveau fournisseur, etc.,
des méthodes d'essai quantitatives doivent être réalisées par les laboratoires utilisateurs.
Les techniques microbiologiques générales sont supposées connues; les méthodes ne sont donc pas décrites
de façon exhaustive.
Des micro-organismes pour essai adaptés sont listés en Annexe B (voir également l'ENV ISO 11133-1).
NOTE À l'avenir, l'objectif est qu'une norme (nouvelle ou révisée) pour la détection ou le dénombrement de micro-
organismes spécifiques, ou groupes de micro-organismes, devra décrire les micro-organismes pour essais appropriés
ainsi que les critères de performance de chaque milieu de culture décrit dans cette norme.
Les interactions conduisant à la croissance de micro-organismes sur des milieux sélectifs liquides sont plus
complexes. C'est pourquoi il est plus difficile de définir des méthodes d'essai de performance pour ces milieux
que pour les milieux solides.
Pour parvenir à isoler les micro-organismes ciblés dans une méthode en plusieurs étapes, par exemple pour
la détection de Salmonella, plusieurs interactions complexes ont lieu à chaque étape de la croissance. Il
convient alors de mettre en place un essai de contrôle en utilisant des échantillons, une culture et des
matériaux de référence appropriés afin de démontrer la productivité ou la sélectivité, respectivement, de la
méthode dans son ensemble. Cela s'ajoute à la démonstration que chaque milieu est approprié.
5.2 Micro-organismes pour essai
Les souches de référence appropriées correspondant aux micro-organismes désirés (productivité) et
indésirables (sélectivité) pour chaque milieu de culture sont indiquées en Annexe B. Il convient que les micro-
organismes pour essai répondent aux exigences stipulées en 5.2.2 de l'ENV ISO 11133-1:2000, par exemple
souches robustes, à faible croissance, biochimiquement non réactives ou stressées, selon le cas.
Des recommandations concernant la conservation et l'entretien des souches de référence figurent dans
l'Annexe B de l'ENV ISO 11133-1.
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ISO/TS 11133-2:2003(F)
5.2.1 Préparation de la culture de travail
Les cultures de travail doivent être préparées comme une culture pure en phase stationnaire dans un bouillon
non sélectif provenant de la culture mère de référence.
Différentes techniques peuvent être utilisées, mais la pureté de l'inoculum doit être garantie et l'inoculum doit
être normalisé, ce qui permet de l'utiliser ultérieurement.
NOTE Des inoculums congelés peuvent être utilisés s'il peut être démontré que les micro-organismes survivent
pendant la période choisie.
5.2.1.1 Culture de travail pour les essais de productivité
Pour les essais quantitatifs des milieux en boîtes vis-à-vis d'un micro-organisme déterminé, un inoculum
2
d'environ 10 ufc est utilisé.
3
Pour les essais semi-quantitatifs et qualitatifs des milieux en boîtes, utiliser des inoculums de 10 ufc à
4
10 ufc.
Pour les essais de productivité sur les milieux de culture liquides, un inoculum de 10 ufc à 100 ufc est utilisé.
5.2.1.2 Culture de travail pour les essais de sélectivité
Pour évaluer la sélectivité d'un milieu de culture, une suspension du micro-organisme indésirable contenant
4 6
10 ufc à 10 ufc est utilisée pour ensemencer les boîtes ou les tubes.
5.2.1.3 Conditions d'incubation
Incuber les milieux de culture ensemencés conformément aux conditions décrites dans la norme
correspondante et indiquée dans les tableaux appropriés en Annexe B.
5.3 Méthodes pour les milieux de culture solides
5.3.1 Méthode quantitative d'ensemencement
5.3.1.1 Généralités
Il s'agit d'une méthode générale appropriée à la plupart des milieux de culture solides. Dans certains cas, elle
ne convient pas pour les moisissures.
5.3.1.2 Mode opératoire
⎯ Utiliser des cultures de travail comme décrit en 5.2.1.
⎯ Sélectionner un nombre adéquat de boîtes représentatives de chaque lot à soumettre à essai et vérifier
que la surface de chaque boîte est correctement séchée. Il convient de préparer de même des boîtes de
milieu de référence (voir 4.4.4 de l'ENV ISO 11133-1:2000).
⎯ Étaler à la surface des boîtes pour essai et des boîtes de référence un inoculum de la culture de travail
diluée de façon que le dénombrement des colonies se situe dans les limites recommandées données en
5.2.1.
NOTE 1 Il est également possible d'utiliser la méthode de Miles-Misra modifiée et d'autres systèmes d'ensemencement
par gouttes ou un ensemencement par spirales.
NOTE 2 La méthode d'ensemencement en profondeur peut aussi être utilisée pour les milieux de culture normalement
utilisés pour le dénombrement par cette méthode.
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ISO/TS 11133-2:2003(F)
⎯ Incuber les boîtes dans les conditions appropriées, comme défini dans les normes individuelles.
⎯ Dénombrer les colonies présentes dans la boîte ou dans chaque goutte, selon le cas. Évaluer la taille et
l'aspect des colonies.
5.3.1.3 Calcul
Il est possible de calculer la moyenne pondérée sur le milieu en fonction du volume étalé sur les boîtes et du
facteur de dilution. Dans le cas des méthodes d'ensemencement par gouttes, le nombre de gouttes et leur
volume doivent être pris en compte.
5.3.1.4 Interprétation des résultats
Pour interpréter les résultats, il convient de calculer le rapport de productivité P (4.2.3.2) et, le cas échéant,
R
le facteur de sélectivité S (4.2.3.3).
F
5.3.2 Méthodes semi-quantitatives d'ensemencement en stries basées sur l'écométrie
5.3.2.1 Généralités
La méthode d'ensemencement en stries est adaptée aux essais de performance des milieux de culture
solides et liquides, mais il s'agit d'une méthode seulement semi-quantitative. Les indices de croissance sont
par conséquent donnés à titre indicatif et la méthode est utilisée uniquement comme essai complémentaire
pour les milieux de culture solides.
Lorsque cette méthode est utilisée, il convient que les milieux de cultures soumis à essai soient toujours dans
le même état de séchage, et l'ensemble du mode opératoire doit être normalisé pour que les résultats des
différents lots puissent être comparés.
5.3.2.2 Mode opératoire
⎯ Des boîtes gélosées sont préparées de la façon habituelle avec approximativement 15 ml de gélose. Les
milieux normalement ensemencés par la méthode en profondeur, par exemple le milieu PCA (Plate
Count Agar), peuvent également être soumis à essai selon la technique d'étalement en surface sur des
milieux solidifiés.
⎯ Utiliser des cultures de travail comme décrit en 5.2.1.
⎯ Les boîtes sont ensemencées en stries comme indiqué à la Figure 1 à l'aide d'une anse de 1 µl. Quatre
stries parallèles sont réalisées à l'aide de l'anse à intervalles à 0,5 cm sur le secteur A. L'opération
d'ensemencement en stries est répétée pour les secteurs B et C et se termine dans le secteur D avec
une seule strie. Un modèle peut être placé sous la boîte pour faciliter la réalisation des stries.
⎯ Les temps et les températures d'incubation spécifiés dans les méthodes normalisées sont utilisés.
NOTE Il convient de tremper seulement l'anse, et pas le fil, dans la culture. Il convient que l'anse soit complètement
rempli
...
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