ISO 5541-1:1986
(Main)Milk and milk products — Enumeration of coliforms — Part 1: Colony count technique at 30 degrees C
Milk and milk products — Enumeration of coliforms — Part 1: Colony count technique at 30 degrees C
Specifies a method for enumerating bacteria which, at 30 degrees centigrade, form characteristic colonies and which can ferment lactose with the production of gas under the operational conditions described. The method described is applicable to milk and liquid milk products, dried milk, dried sweet whey, dried buttermilk, lactose, acid casein, lactic casein, rennet casein, caseinate, dried acid whey, cheese and processed cheese, butter, frozen milk products, custard, desserts, and cream. Is to be preferred for samples in which large numbers of coliforms are suspected (more than 100 per gram or 10 per millimetre).
Lait et produits laitiers — Dénombrement des coliformes — Partie 1: Technique par comptage des colonies à 30 degrés C
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
International Standard
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDlZATIONWlEXAYHAPOA~Afl OPrAHM3AWR I-IO CTAHAAPT~3AUMM~ORGANISATlON INTERNATIONALE DE NORMALISATION
Milk and milk products - Enumeration of coliforms -
Part 1: Colony count technique at 30 *C
Lait et produits laitiers - Denombremen t des coliformes - Partie I : Technique par camptage des colonies 4 30 OC
First edition - 1986-12-01
Ref. No. ISO 5541/1-1986 (E)
UDC 637.V.3 : 637.075
determination, coliform bacteria.
agricultural products, dairy products, milk, tests, microbiological analysis,
Descriptors :
Price based on 7 pages
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Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of
national Standards bodies (ISO member bodies). The work of preparing International
Standards is normally carried out through ISO technical committees. Esch member
body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, govern-
mental and non-governmental, in liaison with ISO, also take patt in the work.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to
the member bodies for approval before their acceptance as International Standards by
the ISO Council. They are approved in accordance with ISO procedures requiring at
least 75 % approval by the member bodies voting.
International Standard ISO 5541/1 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34,
Agricultural food products,
NOTE - The method specified in this International Standard has been developed jointly with the
International Dairy Federation (IDF) and the Association of Official Analytical Chemists (AOAC)
and will also be published by these Organkations.
tJsers should note that all International Standards undergo revision from time to time
and that any reference made herein to any other International Standard implies its
latest edition, unless otherwise stated.
@ International Organkation for Standardkation, 1986 l
Printed in Switzerland
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO ml/l-1986 (E)
INTERNATIONAL STANDARD
Enumeration of coliforms -
ilk and milk products -
Part 1: Colony count technique at 30 *C
4.2 Incubation at 30 OC for 24 h.
1 Scope and field of application
This part of ISO 5541 specifies a method for the enumeration of
4.3 Counting of the characteristic colonies and, if needed,
coliforms by means of the colony count technique at 30 OC.
confirmation of colonies by fermentation of lactose, shown by
gas production.
The method is applicable to
-
milk, and liquid milk products;
4.4 Calculation of the number of coliforms per millilitre or per
gram of the original Sample.
- dried milk, dried sweet whey, dried buttermilk, and
lactose;
-
acid casein, lactic casein and rennet casein;
5 Diluents and media
- caseinate and dried acid whey;
5.1 Basic materials
-
cheese and processed cheese;
In Order to improve the reproducibility of the results, it is
- butter;
recommended that, for the preparation of diluents and culture
media, dehydrated basic components or complete dehydrated
- frozen milk products (including edible ices);
media should be used. The manufacturer’s instructions shall be
rigorously followed.
-
custard, desserts and cream.
The Chemical products used shall be of recognized analytical
This method is to be preferred for samples in which large
quality.
numbers of coliforms (more than 100 per gram or 10 per
millilitre) are suspected.
The water used shall be distilled from glass apparatus or shall
be deionized water. lt shall be free from substances that might
NOTE - For samples with smaller numbers of coliforms (less than 100
influence the growth of micro-organisms under the test con-
per gram or 10 per millilitre) see ISO 5541/2.
ditions. This shall be periodically checked, particularly in the
case of deionized water.
2 Reference
Solutions of sodium hydroxide and hydrochloric acid (approx-
ISO 707, Milk and milk products - Methods of sampling. imately 0,l mol/litre) should be used to adjust the pH of
diluents and media.
3 Definition
5.2 Diluents for general use
For the purpose of this patt of ISO 5541, the following defini-
tion applies.
5.2.1 Peptonehaline solution
coliforms: Bacteria which, at 30 OC, form characteristic col-
NOTE - Peptonekaline Solution is the diluent selected by ISO $or
onies and which tan ferment lactose with the production of gas
general use.
under the operational conditions described.
Composition
4 Principle
Peptone
Mixing a defined test Portion or a series of decimal dilu-
4.1 Sodium chloride (NaCI)
8,5 g
Gons of the Sample with the culture medium in Petri dishes, and
Water
covering with a layer of the same medium. 1 000 ml
1
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ISO 5541/1-1986 (EI
Prepara tion
Prepara tion
Dissolve the salt in th e water by heating at 45 to 50 OC.
Dissolve the components in water, heating if necessary. Adjust Adjust
the pH so that, after sterilization, it is 7,5 + 0,l at 25 OC.
the pH so that, after sterilization, it is 7,0 & 0,l at 25 OC.
5.2.2 Quarter-strength Ringer’s Solution
5.3.2 Dipotassium hydrogenphosphate solution (for
cheese, processed cheese, casein, acid casein, dried lactic
Composition
caseins, rennet casein, caseinates, dried acid whey and roller-
dried milk).
Sodium chloride (NaCI)
2,25 g
Composition
Potassium chloride (KCI) 0,105 g
Calcium chloride, anhydrous (CaCl$
06 g Dipotassium hydrogenphosphate (K2HP0,)
20 Cl
Sodium hydrogencarbonate (NaHC03)
0,05 g
Water 1 000 ml
Water 10OOml
Prepara tion
Prepara tion
Dissolve the salt in the water by heating at 45 to 50 OC. Adjust
the pH. For primary dilution of acid casein and lactic casein, the
Dissolve the salts in the water. Adjust the pH so that, after
pH after sterilization should be 8,4 + 0,l at 25 OC. For casein-
sterilization, it is 6,9 & 0,l at 25 OC.
ates, cheese, processed cheese, dried acid whey and roller-
dried milk, it should be 7,5 & 0,l at 25 OC.
5.2.3 Peptone solution
Composition
5.4 Distribution, sterilization and storage
of diluent
Peptone
lt0 g
Dispense the diluent (5.2 or 5.3) for the primary dilution into
Water 1 OOOml
flasks or bottles (6.4). Dispense the diluent for further decimal
dilutions (5.2) into test tubes or bottles (6.6). The quantities dis-
Prepara tion
pensed shall be such that, after sterilization, each flask or bottle
(6.4) contains 90 ml of diluent or a multiple of 90 ml, and each
Dissolve the peptone in the water. Adjust the pH so that, after
sterilization, it is 7,0 + 0,l at 25 OC. test tube or bottle (6.6) contains 9,0 ml of diluent or a multiple
of 9,0 ml (or other required quantities). Stopper the test tubes,
flasks or bottles.
5.2.4 Phosphate buffer Solution
Sterilize by autoclaving at 121 + l°C for 15 min (a longer
Composition
period may be necessary for larger volumes). If the diluent is
not to be used immediately, store it in the dark at 0 to 5 OC, for
Potassium dihydrogenphosphate (KH2P04)
423 g
no longer than one month, in conditions which do not allow
any Change in its volume or composition.
Water 1 000 ml
Prepara tion
5.5 Culture media
Dissolve the salt in 500 ml of water. Adjust the pH so that, after
sterilization, it is 7,2 rt 0,l at 25 OC. Dilute to 1 000 ml. Store
5.5.1 Violet red bile WRBL) solid selective
agar,
this stock Solution at 0 to 5 OC.
medium
Add 1,OO ml of this Solution to 1 000 ml of water.
Composition
Peptone
70 g
5.3 Diluents for special purposes
Yeast extract
3,O g
5.3.1 Sodium citrate Solution (for cheese, processed
cheese and roller-dried milk).
Lactose (C12H~O11~H20)
10 g
Composition
Sodium chloride (NaCI)
Trisodium citrate dihydrate
Bile salts
1,5 g
(Na&H,O7*2H,O)
20 Cl
Neutral red
Water 1000 ml 0,03 g
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ISO 5541/1-1986 (El
6 Apparatus and glassware
Crystal violet
NOTE - Disposable apparatus is an acceptabe alternative to re-usable
12 to 18 g”
Agar
glassware if it has suitable specifications. Re-usable glassware should
be capable of undergoing repeated sterilization and should be
1 000 ml
Water
chemically inert.
Prepara tion
Usual microbiological laboratory equipment and in particular :
to conserve the selective power and
Proceed as follows in Order
specificity of the medium.
6.1 Apparatus for dry sterilization (oven) or wet
sterilization (autoclave) (autoclave operating either separ-
Dissolve the components or the dehydrated complete medium
ately or as part of an apparatus for preparing and distributing
in the water and leave to stand for several minutes. Then mix
media). Apparatus that will come into contact with the diluent,
vigorously and adjust the pH so that, after boiling, it is
the test Sample, or the dilutions, except for apparatus that is
7,4 + - 0,l at 25 OC. Bring to the boil, swirling from time to
supplied sterile (plastic bags, plastic pipettes, etc.) shall be
time.
sterilized by one of the following methods:
Allow to boil for 2 min. Dispense the medium in 100 to 150 ml
a) by being kept at 170 to 175 OC for not less than 1 h in an
quantities into sterile flasks (6.5). Immediately cool the medium
oven ;
to 45 + 1 OC, in a water bath (6.159.
b) by being kept at 121 + 1 OC for not less than 20 min in
Avoid overheating the medium or heating it for too long (or
an autoclave.
reheating it). Consequently, do not sterilize in the autoclave,
and check the sterility of the medium at the time of use
(sec 8.5.1).
6.2 Blending equipment
Use the medium within 3 h of its preparation.
One of the following shall be used:
a) a rotary blender, operating at a rotational frequency
5.5.2 Lactose bile brilliant green broth, confirmatory
between 8 000 and 45 000 min -l, with glass or metal bowls
medium
fitted with lids, resistant to the conditions of sterilization;
Composition
peristaltic-type sterile
b9 a (stomacher), with
plastic bags;
Peptone 10 g
mortar with pestle.
c9
Lactose (C12H~01t~H~0)
10 g
NOTE - The bowls, plastic bags or mortar should have sufficient
Dehydrated ox bile 20 g
capacity to allow the Sample to be properly mixed with the appropriate
amount of diluent. In general, the volume of the Container should be
Brilliant green 0,013 3 g
equal to about twice the volume of the test Sample plus diluent.
1 000 ml
Water
6.3 Mixer, capable of mixing 1 or 2 ml of the test Sample (in
Prepara tion
the case of liquid products), or the decimal dilutions, in a tube
of adequate dimensions with 9 or 18 ml of diluent, in Order to
components or the dehydrated complete medium
Dissolve the
obtain a homogeneous Suspension, and working on the prin-
in the water by boiling.
ciple of eccentric rotation of the contents of the test tube
(Vortex mixer).
If necessary, adjust the pH so that, after sterilization, it is
7,2 + 0,l at 25 OC.
6.4 Flasks or bottles, of sufficient capacity to contain the
Dispense the medium, in quantities of 10 ml, in test tubes (6.7)
90 ml of diluent used for the initial Suspension, or multiples of
containing Durharn tubes (6.8).
90 ml, and leave adequate head-space for mixing.
Sterilize in an autoclave (6.1) at 121 + l°C for 15 min.
tu bes shall not contain air bu after steriliza-
The Durharn 6.5 Flasks, of capacity 150 to 250 ml, to hold the violet red
tion.
bile lactose agar (5.5.19.
instructions.
1) According to the manufacturer’s
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ISO 5541/1-1986 (EI
8.1 Preparation of the test Portion and primary
6.6 Test tubes (or flask or bottles), of sufficient capacity to
contain, and leave adequate head-space for mixing, 10 ml (or a dilution
multiple of 10 ml, if necessary) of the test Sample (if it is liquid)
Prepare dilutio ns so as to obtain plates wi th colony counts of
or of the Primat-y dilution (in other cases) or further decimal
more than 10, if possi ble, and fewer than 150.
dilutions.
To avoid damaging the micro-organisms by sudden changes in
6.7 Test tubes, of capacity 20 ml, to hold the lactose bile
temperature, the temperature of the diluent during the opera-
brilliant green broth (5.5.2).
tions described below shall be approximately the same as that
of the test Sample, unless prescribed otherwise.
dimensions for use with
68 Durharn tubes, of appropriate
8.1.1 Milk, and liquid milk products
the test tubes (6.79.
Agitate the test Sample thoroughly so that the micro-organisms
with cotton wo019 , of nominal ca- are distributed as evenly as possible, by rapidly inverting the
6.9 Pipettes t plugged
Sample Container 25 times. Foaming should be avoided or foam
pacity 1 ml and having an outlet sf diameter 2 to 3 mm.
allowed to disperse. The interval between mixing and removing
the test Portion should not exceed 3 min.
NOTE - Use only pipettes with unbroken tips and, when appropriate,
having graduations distinctly marked to contrast sharply with the
Remove 1 ml of the test Sample with a pipette and add to 9 ml
contents.
of diluent (5.2) (or 10 ml of test Sample to 90 ml of diluent o
...
Norme internationale
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION.ME)K~YHAPO~HAR OPTAHM3AlJMR IlO CTAH~APTt43A~klkI~ORGANlSATlON INTERNATIONALE DE NORMALISATION
Lait et produits laitiers - Dénombrement des coliformes -
Partie 1: Technique par comptage des colonies à 30 OC
- Part 7: Colony coun t technique at 30 OC
MiJk and miJk products - Enumeration of coliforms
Première édition - 1986-12-01
CL
Y
CDU 637X3 : 637.075 Réf. n* : ISO 5541/1-1986 (F)
I
Descripteurs : produit agricole, produit laitier, lait, essai, analyse microbiologique, détermination, bactérie coliforme.
r”
Prix basé sur 7 pages
---------------------- Page: 1 ----------------------
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale
d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de I’ISO). L’élaboration
des Normes internationales est confiée aux comités techniques de I’ISO. Chaque
comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité technique
créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouverne-
mentales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis
aux comités membres pour approbation, avant leur acceptation comme Normes inter-
nationales par le Conseil de I’ISO. Les Normes internationales sont approuvées confor-
mément aux procédures de I’ISO qui requièrent l’approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La Norme internationale ISO 5541 /l a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34,
Produits agricoles alimentaires.
NOTE - La méthode spécifiée dans la présente Norme internationale a été élaborée conjointe-
ment avec la Fédération internationale de laiterie (FIL) et l’Association des chimistes analytiques
(AOAC) et sera également publiée par ces organisations.
L’attention des utilisateurs est attirée sur le fait que toutes les Normes internationales
sont de temps en temps soumises à révision et que toute référence faite à une autre
Norme internationale dans le présent document implique qu’il s’agit, sauf indication
contraire, de la dernière édition.
Organisation internationale de normalisation, 1986
Imprimé en Suisse
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ISO 5541/1-1986 (F)
NORME INTERNATIONALE
Dénombrement des coliformes -
Lait et produits laitiers -
Partie 1: Technique par comptage des colonies à 30 OC
4 Principe
1 Objet et domaine d’application
La présente partie de I’ISO 5541 spécifie une méthode pour le
4.1 Ensemencement des boîtes de Petri avec une quantité
dénombrement des coliformes par comptage des colonies à
déterminée de la prise d’essai ou d’une série de dilutions déci-
30 OC.
males de l’échantillon. Mélange avec un milieu sélectif (ense-
mencement dans la masse) et recouvrement avec une couche
La méthode est applicable
de même milieu.
-
au lait et aux produits laitiers liquides;
4.2 Incubation des boîtes à 30 OC pendant 24 h.
-
au lait sec, à la poudre de lactosérum sucré, au
babeurre en poudre et au lactose;
4.3 Comptage des colonies caractéristiques et, si nécessaire,
confirmation des colonies par un test de fermentation du lac-
tose (avec production de gaz).
- à la caséine acide, à la caséine lactique et à la caséine
présure;
4.4 Calcul du nombre de coliformes par millilitre ou par
-
au caséinate et à la poudre de lactosérum acide;
gramme d’échantillon.
-
au fromage et au fromage fondu;
5 Diluants et milieux de culture
-
au beurre;
- 5.1 Composants de base
aux produits laitiers congelés (y compris les glaces de
consommation) ;
Pour améliorer la reproductibilité des résultats, il est recom-
mandé d’utiliser pour la préparation des diluants et des milieux
-
aux flans, aux desserts et à la créme.
de culture, des composants de base déshydratés ou des milieux
complets déshydratés. Les instructions du fabricant doivent
Cette méthode doit être préférée pour des échantillons suspec-
être suivies rigoureusement.
tés contenir de grands nombres de coliformes (plus de 100 par
gramme ou 10 par millilitre).
Les produits chimiques doivent être de qualité analytique
reconnue.
NOTE - Pour les échantillons de petits nombres de coliformes (moins
de 100 par gramme ou 10 par millilitre), voir I’ISO 5541/2.
L’eau utilisée doit être de l’eau distillée avec un appareil en
verre, ou de l’eau déminéralisée. Elle doit être exempte de subs-
tances susceptibles d’inhiber la croissance des micro-
organismes dans les conditions de l’essai. Cela doit être con-
2 Référence
trôlé périodiquement, en particulier dans le cas de l’eau déminé-
ralisée.
I SO 707, Lait et produits laitiers - Jl& thode d’échan tiJJonnage,
Des solutions d’hydroxyde de sodium et d’acide chlorhydrique
(environ 0,l mol/litre) doivent être utilisées pour ajuster le pH
des diluants et des milieux.
3 Définition
5.2 Diluants d’emploi général
Dans le cadre dé la présente partie de I’ISO 5541, la définition
suivante est applicable.
52.1 Solution peptone-sel
coliformes : Bactéries qui forment des colonies caractéristi-
ques à 30 OC et qui peuvent fermenter le lactose avec produc-
NOTE - La solution peptone-sel a été retenue par I’ISO comme diluant
tion de gaz dans les conditions opératoires décrites. d’emploi général.
1
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IsO 5541/1-1986 (FI
Composition
Composition
Peptone
LO g Citrate trisodique dihydraté
(Na&H,O,.2H,O)
20,o g
Chlorure de sodium (NaCI)
815 g
1000 ml
Eau
Eau 1 000 ml
Préparation
Préparation
Dissoudre le sel dans l’eau en chauffant à 45-50 OC. Ajuster le
pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de 7,5 + 0,l à 25 OC.
en chauffant si néces-
stérilisation, il soit de
5.3.2 Solution de monohydrogénophosphate de potas-
sium (pour le fromage, le fromage fondu, la caséine, la caséine
acide, la poudre de caséine lactique, la caséine présure, les
5.2.2 Solution de Ringer diluée au quart
caséinates, la poudre de sérum acide et la poudre de lait hatma-
ker).
Composition
Composition
Chlorure de sodium (NaCI)
2,25 g
Chlorude de potassium (KCI)
0,105 g Monohydrogénophosphate de potassium
U$HPO,) 20 9
Chlorure de calcium, anhydre (CaCl$
0,06 g
1000 ml
Eau
Hydrogénocarbonate de sodium ( NaHUIs)
0105 g
Préparation
Eau 1 000 ml
Dissoudre le sel dans l’eau en chauffant à 45-50 OC. Ajuster le
Préparation
pH. Pour la dilution primaire de la caséine acide et de la caséine
lactique, le pH, après stérilisation, doit être de 8,4 * 0,l à
Dissoudre les sels dans l’eau. Ajuster le pH de sorte qu’après
25 OC. Pour les caséinates, le fromage, le fromage fondu, la
stérilisation, il soit de 6,9 + 0,l à 25 OC.
poudre acide de sérum et la poudre de lait hatmaker, il doit être
de 7,5 + 0,l à 25 OC.
5.2.3 Solution de peptone
Composition 5.4 Répartition, stérilisation et conservation du
diluant
Peptone
LO g
Répartir le diluant (5.2 ou 5.3) pour la dilution primaire dans des
Eau 1000 ml
fioles (6.4). Répartir le diluant pour les dilutions décimales sui-
vantes (5.2) dans des tubes à essais ou dans des fioles (6.6).
Préparation
Les quantités ainsi réparties doivent être telles qu’après stérili-
sation, chaque fiole ou tube à essais (6.4) contienne 90 ml de
Dissoudre la peptone dans I ‘eau. Ajuster le pH de sorte
diluant ou un multiple de 90 ml (ou tout autre quantité requise)
soit de
qu’après stérilisation, il 7,0 k- 0,l à 25 OC.
et que chaque fiole ou tube à essais (6.6) contienne 9,0 ml
de diluant ou un multiple de 9,0 ml (ou tout autre quantité
5.2.4 Solution tampon de phosphate
requise). Boucher les tubes à essais et les fioles.
Composition
Stériliser à l’autoclave à 121 + IOC durant 15 min (un temps
plus long peut être nécessaire pour les volumes plus grands).
Dihydrogénophosphate de potassium (KH,PO,) 42,5 g
Si le diluant n’est pas utilisé extemporanément, le conserver à
Eau 1 000 ml
l’obscurité entre 0 et 5 OC pendant 1 mois au maximum, dans
des conditions évitant toute modification de son volume ou de
Préparation
sa composition.
Dissoudre le sel dans 500 ml d’eau. Ajuster le pH de sorte
5.5 Milieux de culture
qu’après stérilisation, il soit de 7,2 t 0,l à 25 OC. Diluer à
1 060 ml. Conserver cette solution mère entre 0 et + 5 OC.
lutre, à la bile et au
5.5.1 C%lose au violet, au rouge ne
Ajouter 1,O ml de cette solution à 1 000 ml d’eau.
lactose (VR B L), milieu sélectif solide.
Composition
5.3 Diluants d’emploi particulier
Peptone 7,O g
5.3.1 Solution de citrate de sodium (pour le fromage, le
Extrait de levure 3,O g
fromage fondu et la poudre de lait hatmaker).
2
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 5541/1-1986 (FI
Lactose (CI~HzO11~H20) 6 Appareillage et verrerie
10 9
Chlorure de sodium (NaCI)
5’0 g
NOTE - Le matériel à usage unique est acceptable au même titre que
la verrerie réutilisable, si ses spécifications sont convenables. La verre-
Sels biliaires
1’5 g
rie réutilisable doit être capable de résister à des stérilisations répétées
Rouge neutre
0’03 g
et être chimiquement inerte.
Cristal violet 0,002 g
Matériel courant de laboratoire de microbiologie et notamment:
12 à 18 g”
Agar-agar
Eau 1000 ml
6.1 Appareils pour la stérilisation en chaleur sèche
(four) ou en chaleur humide (autoclave) (autoclave auto-
Préparation
nome ou faisant partie d’un appareillage pour préparer et répar-
tir les milieux).
Opérer comme suit pour conserver au milieu son pouvoir sélec-
tif et sa spécificité.
Le matériel en contact avec le diluant, l’échantillon pour essai,
les dilutions, sauf s’il est livré stérile (sacs en plastique, pipettes
Dissoudre dans l’eau les composants ou le milieu complet dés-
en plastique, etc.) doit être stérilisé par l’une des méthodes
hydraté et laisser reposer quelques minutes. Mélanger ensuite
suivantes:
énergiquement et ajuster le pH de sorte qu’après ébullition, il
soit de 7,4 + 0,l à 25 OC. Porter à ébullition en agitant de
a) soit au four, en le maintenant à une température de 170
temps en temps le récipient à l’aide d’un mouvement rotatif.
à 175 OC pendant au moins 1 h;
Laisser bouillir durant 2 min. Répartir le milieu par quantités de
b) soit à l’autoclave, en le maintenant à une température
100 à 150 ml dans des fioles stériles (6.5). Refroidir immédiate-
de 121 + 1 OC pendant au moins 20 min.
ment le milieu au bain d’eau (6.15) à 45 Z!I 1 OC.
Éviter le surchauffage du milieu ou un chauffage trop prolongé
6.2 Appareillage pour l’homogénéisation
(ou des chauffages répétés). En conséquence, ne pas stériliser
à l’autoclave et contrôler la stérilité du milieu au moment de
Un des appareils suivants doit être utilisé:
l’emploi (voir 8.5.1).
a) un homogénéisateur rotatif, dont la fréquence de rota-
Utiliser le milieu dans les 3 h qui suivent sa préparation.
tion est comprise entre 8 000 et 45 000 min - t, avec des
bols en verre ou en métal, munis de préférence de couver-
5.5.2 Bouillon lactosé bili6 au vert brillant, milieu de con- cles, résistant aux conditions de stérilisation ;
firmation
b) un homogénéisateur de type pé ristaltique (stomacher),
Composition
avec des sacs stériles en plastique;
Peptone 10 g c) un mortier avec pilon.
Lactose KI~H~OI1~H~O)
10 g
NOTE - Les bols, les sacs en plastique ou le mortier doivent avoir une
Bile de boeuf déshydratée capacité suffisante pour permettre de mélanger correctement I’échan-
20 g
tillon avec la quantité appropriée de diluant. En général, le volume du
Vert brillant 0,013 3 g
récipient doit être environ le double du volume de l’échantillon pour
essai additionné du diluant.
Eau 1000 ml
Préparation
6.3 Agitateur, capable de mélanger 1 ou 2 ml de I’échantil-
Ion pour essai (cas des produits liquides) ou des dilutions déci-
Dissoudre dans l’eau les composan ts ou le milieu complet
males, dans un tube de dimensions suffisantes, avec 9 ou 18 ml
déshydraté en portant à ébullition.
f
de diluant, afin d’obtenir une suspension homogène, et dont le
principe de fonctionnement est basé sur un mouvement de rota-
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’aprés stérilisation, il soit
tion excentré du contenu des tubes à essais (agitateur Vortex).
de 7,2 + 0,l à 25 OC.
Répartir le milieu, par quantités de 10 ml dans des tubes à
6.4 Fioles, de capacité suffisante pour contenir les 90 ml de
essais (6.7) contenant les cloches de Durham (6.8).
diluant utilisés pour la suspension-mère, ou des multiples de
90 ml, en laissant un espace suffisant pour l’agitation.
Stériliser à l’autoclave (6.1) a 121 + IOC pendant 15 min.
Les cloches de Durham ne doivent pas contenir de d’air 6.5 Fioles, de 150 à 250 ml de capacité, pour contenir la
après stérilisation.
gélose au violet, au rouge neutre, à la bile et au lactose (5.5.1).
Selon les instructions du fabricant.
---------------------- Page: 5 ----------------------
SO 5541/1-1986 (FI
6.6 Tubes à essais, ou fioles, de capacité suffisante pour 8.1 Préparation de l’échantillon pour essai et de
contenir 10 ml (ou un multiple de 10 ml, si nécessaire) de la dilution primaire
l’échantillon pour essai (s’il est liquide) ou de la dilution primaire
(autre cas) ou des dilutions décimales suivantes et laisser un Préparer des dilutions de facon à obtenir des boîtes contenant
espace libre adéquat pour permettre une agitation convenable. plus de 10 et moins de 150 colonies.
Pour éviter d’endommager les micro-organismes par de brus-
6.7 Tubes à essais, de 20 ml de pacité, pour contenir le
ques changements de température, la température du diluant
bouillon lactosé bilié au vert brillant 5.2).
pendant les opérations décrites ci-après doit être du même
ordre que celle de l’échantillon pour essai, sauf prescriptions
contraires.
68 C loches de Durham, de dimensions appropriées en vue
de le ur utilisation dans les tubes à essais (6.7).
8.1.1 Lait et produits laitiers liquides
6.9 Pipettes (bouchées avec du coton), de 1 ml de capacité
Agiter vigoureusement l’échantillon pour essai, afin d’assurer
nominale et ayant un orifice d’écoulement de 2 à 3 mm de
une répartition aussi uniforme que possible des micro-
diamètre.
organismes, en inversant rapidement 25 fois le récipient conte-
nant l’échantillon. II faut éviter la formation de mousse ou bien
NOTE - N’utiliser que des pipettes non ébréchées et, quand cela est
la laisser se disperser. L’intervalle entre le mélange et le prélève-
nécessaire, avec des graduations bien marquées pour les distinguer
ment de la prise d’essai ne doit pas dépasser 3 min.
nettement du contenu.
Prélever 1 ml de l’échantillon pour essai à la pipette et l’ajouter
6.10 Pipettes graduée
...
Norme internationale
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION.ME)K~YHAPO~HAR OPTAHM3AlJMR IlO CTAH~APTt43A~klkI~ORGANlSATlON INTERNATIONALE DE NORMALISATION
Lait et produits laitiers - Dénombrement des coliformes -
Partie 1: Technique par comptage des colonies à 30 OC
- Part 7: Colony coun t technique at 30 OC
MiJk and miJk products - Enumeration of coliforms
Première édition - 1986-12-01
CL
Y
CDU 637X3 : 637.075 Réf. n* : ISO 5541/1-1986 (F)
I
Descripteurs : produit agricole, produit laitier, lait, essai, analyse microbiologique, détermination, bactérie coliforme.
r”
Prix basé sur 7 pages
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Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale
d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de I’ISO). L’élaboration
des Normes internationales est confiée aux comités techniques de I’ISO. Chaque
comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité technique
créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouverne-
mentales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis
aux comités membres pour approbation, avant leur acceptation comme Normes inter-
nationales par le Conseil de I’ISO. Les Normes internationales sont approuvées confor-
mément aux procédures de I’ISO qui requièrent l’approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La Norme internationale ISO 5541 /l a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34,
Produits agricoles alimentaires.
NOTE - La méthode spécifiée dans la présente Norme internationale a été élaborée conjointe-
ment avec la Fédération internationale de laiterie (FIL) et l’Association des chimistes analytiques
(AOAC) et sera également publiée par ces organisations.
L’attention des utilisateurs est attirée sur le fait que toutes les Normes internationales
sont de temps en temps soumises à révision et que toute référence faite à une autre
Norme internationale dans le présent document implique qu’il s’agit, sauf indication
contraire, de la dernière édition.
Organisation internationale de normalisation, 1986
Imprimé en Suisse
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ISO 5541/1-1986 (F)
NORME INTERNATIONALE
Dénombrement des coliformes -
Lait et produits laitiers -
Partie 1: Technique par comptage des colonies à 30 OC
4 Principe
1 Objet et domaine d’application
La présente partie de I’ISO 5541 spécifie une méthode pour le
4.1 Ensemencement des boîtes de Petri avec une quantité
dénombrement des coliformes par comptage des colonies à
déterminée de la prise d’essai ou d’une série de dilutions déci-
30 OC.
males de l’échantillon. Mélange avec un milieu sélectif (ense-
mencement dans la masse) et recouvrement avec une couche
La méthode est applicable
de même milieu.
-
au lait et aux produits laitiers liquides;
4.2 Incubation des boîtes à 30 OC pendant 24 h.
-
au lait sec, à la poudre de lactosérum sucré, au
babeurre en poudre et au lactose;
4.3 Comptage des colonies caractéristiques et, si nécessaire,
confirmation des colonies par un test de fermentation du lac-
tose (avec production de gaz).
- à la caséine acide, à la caséine lactique et à la caséine
présure;
4.4 Calcul du nombre de coliformes par millilitre ou par
-
au caséinate et à la poudre de lactosérum acide;
gramme d’échantillon.
-
au fromage et au fromage fondu;
5 Diluants et milieux de culture
-
au beurre;
- 5.1 Composants de base
aux produits laitiers congelés (y compris les glaces de
consommation) ;
Pour améliorer la reproductibilité des résultats, il est recom-
mandé d’utiliser pour la préparation des diluants et des milieux
-
aux flans, aux desserts et à la créme.
de culture, des composants de base déshydratés ou des milieux
complets déshydratés. Les instructions du fabricant doivent
Cette méthode doit être préférée pour des échantillons suspec-
être suivies rigoureusement.
tés contenir de grands nombres de coliformes (plus de 100 par
gramme ou 10 par millilitre).
Les produits chimiques doivent être de qualité analytique
reconnue.
NOTE - Pour les échantillons de petits nombres de coliformes (moins
de 100 par gramme ou 10 par millilitre), voir I’ISO 5541/2.
L’eau utilisée doit être de l’eau distillée avec un appareil en
verre, ou de l’eau déminéralisée. Elle doit être exempte de subs-
tances susceptibles d’inhiber la croissance des micro-
organismes dans les conditions de l’essai. Cela doit être con-
2 Référence
trôlé périodiquement, en particulier dans le cas de l’eau déminé-
ralisée.
I SO 707, Lait et produits laitiers - Jl& thode d’échan tiJJonnage,
Des solutions d’hydroxyde de sodium et d’acide chlorhydrique
(environ 0,l mol/litre) doivent être utilisées pour ajuster le pH
des diluants et des milieux.
3 Définition
5.2 Diluants d’emploi général
Dans le cadre dé la présente partie de I’ISO 5541, la définition
suivante est applicable.
52.1 Solution peptone-sel
coliformes : Bactéries qui forment des colonies caractéristi-
ques à 30 OC et qui peuvent fermenter le lactose avec produc-
NOTE - La solution peptone-sel a été retenue par I’ISO comme diluant
tion de gaz dans les conditions opératoires décrites. d’emploi général.
1
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IsO 5541/1-1986 (FI
Composition
Composition
Peptone
LO g Citrate trisodique dihydraté
(Na&H,O,.2H,O)
20,o g
Chlorure de sodium (NaCI)
815 g
1000 ml
Eau
Eau 1 000 ml
Préparation
Préparation
Dissoudre le sel dans l’eau en chauffant à 45-50 OC. Ajuster le
pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de 7,5 + 0,l à 25 OC.
en chauffant si néces-
stérilisation, il soit de
5.3.2 Solution de monohydrogénophosphate de potas-
sium (pour le fromage, le fromage fondu, la caséine, la caséine
acide, la poudre de caséine lactique, la caséine présure, les
5.2.2 Solution de Ringer diluée au quart
caséinates, la poudre de sérum acide et la poudre de lait hatma-
ker).
Composition
Composition
Chlorure de sodium (NaCI)
2,25 g
Chlorude de potassium (KCI)
0,105 g Monohydrogénophosphate de potassium
U$HPO,) 20 9
Chlorure de calcium, anhydre (CaCl$
0,06 g
1000 ml
Eau
Hydrogénocarbonate de sodium ( NaHUIs)
0105 g
Préparation
Eau 1 000 ml
Dissoudre le sel dans l’eau en chauffant à 45-50 OC. Ajuster le
Préparation
pH. Pour la dilution primaire de la caséine acide et de la caséine
lactique, le pH, après stérilisation, doit être de 8,4 * 0,l à
Dissoudre les sels dans l’eau. Ajuster le pH de sorte qu’après
25 OC. Pour les caséinates, le fromage, le fromage fondu, la
stérilisation, il soit de 6,9 + 0,l à 25 OC.
poudre acide de sérum et la poudre de lait hatmaker, il doit être
de 7,5 + 0,l à 25 OC.
5.2.3 Solution de peptone
Composition 5.4 Répartition, stérilisation et conservation du
diluant
Peptone
LO g
Répartir le diluant (5.2 ou 5.3) pour la dilution primaire dans des
Eau 1000 ml
fioles (6.4). Répartir le diluant pour les dilutions décimales sui-
vantes (5.2) dans des tubes à essais ou dans des fioles (6.6).
Préparation
Les quantités ainsi réparties doivent être telles qu’après stérili-
sation, chaque fiole ou tube à essais (6.4) contienne 90 ml de
Dissoudre la peptone dans I ‘eau. Ajuster le pH de sorte
diluant ou un multiple de 90 ml (ou tout autre quantité requise)
soit de
qu’après stérilisation, il 7,0 k- 0,l à 25 OC.
et que chaque fiole ou tube à essais (6.6) contienne 9,0 ml
de diluant ou un multiple de 9,0 ml (ou tout autre quantité
5.2.4 Solution tampon de phosphate
requise). Boucher les tubes à essais et les fioles.
Composition
Stériliser à l’autoclave à 121 + IOC durant 15 min (un temps
plus long peut être nécessaire pour les volumes plus grands).
Dihydrogénophosphate de potassium (KH,PO,) 42,5 g
Si le diluant n’est pas utilisé extemporanément, le conserver à
Eau 1 000 ml
l’obscurité entre 0 et 5 OC pendant 1 mois au maximum, dans
des conditions évitant toute modification de son volume ou de
Préparation
sa composition.
Dissoudre le sel dans 500 ml d’eau. Ajuster le pH de sorte
5.5 Milieux de culture
qu’après stérilisation, il soit de 7,2 t 0,l à 25 OC. Diluer à
1 060 ml. Conserver cette solution mère entre 0 et + 5 OC.
lutre, à la bile et au
5.5.1 C%lose au violet, au rouge ne
Ajouter 1,O ml de cette solution à 1 000 ml d’eau.
lactose (VR B L), milieu sélectif solide.
Composition
5.3 Diluants d’emploi particulier
Peptone 7,O g
5.3.1 Solution de citrate de sodium (pour le fromage, le
Extrait de levure 3,O g
fromage fondu et la poudre de lait hatmaker).
2
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 5541/1-1986 (FI
Lactose (CI~HzO11~H20) 6 Appareillage et verrerie
10 9
Chlorure de sodium (NaCI)
5’0 g
NOTE - Le matériel à usage unique est acceptable au même titre que
la verrerie réutilisable, si ses spécifications sont convenables. La verre-
Sels biliaires
1’5 g
rie réutilisable doit être capable de résister à des stérilisations répétées
Rouge neutre
0’03 g
et être chimiquement inerte.
Cristal violet 0,002 g
Matériel courant de laboratoire de microbiologie et notamment:
12 à 18 g”
Agar-agar
Eau 1000 ml
6.1 Appareils pour la stérilisation en chaleur sèche
(four) ou en chaleur humide (autoclave) (autoclave auto-
Préparation
nome ou faisant partie d’un appareillage pour préparer et répar-
tir les milieux).
Opérer comme suit pour conserver au milieu son pouvoir sélec-
tif et sa spécificité.
Le matériel en contact avec le diluant, l’échantillon pour essai,
les dilutions, sauf s’il est livré stérile (sacs en plastique, pipettes
Dissoudre dans l’eau les composants ou le milieu complet dés-
en plastique, etc.) doit être stérilisé par l’une des méthodes
hydraté et laisser reposer quelques minutes. Mélanger ensuite
suivantes:
énergiquement et ajuster le pH de sorte qu’après ébullition, il
soit de 7,4 + 0,l à 25 OC. Porter à ébullition en agitant de
a) soit au four, en le maintenant à une température de 170
temps en temps le récipient à l’aide d’un mouvement rotatif.
à 175 OC pendant au moins 1 h;
Laisser bouillir durant 2 min. Répartir le milieu par quantités de
b) soit à l’autoclave, en le maintenant à une température
100 à 150 ml dans des fioles stériles (6.5). Refroidir immédiate-
de 121 + 1 OC pendant au moins 20 min.
ment le milieu au bain d’eau (6.15) à 45 Z!I 1 OC.
Éviter le surchauffage du milieu ou un chauffage trop prolongé
6.2 Appareillage pour l’homogénéisation
(ou des chauffages répétés). En conséquence, ne pas stériliser
à l’autoclave et contrôler la stérilité du milieu au moment de
Un des appareils suivants doit être utilisé:
l’emploi (voir 8.5.1).
a) un homogénéisateur rotatif, dont la fréquence de rota-
Utiliser le milieu dans les 3 h qui suivent sa préparation.
tion est comprise entre 8 000 et 45 000 min - t, avec des
bols en verre ou en métal, munis de préférence de couver-
5.5.2 Bouillon lactosé bili6 au vert brillant, milieu de con- cles, résistant aux conditions de stérilisation ;
firmation
b) un homogénéisateur de type pé ristaltique (stomacher),
Composition
avec des sacs stériles en plastique;
Peptone 10 g c) un mortier avec pilon.
Lactose KI~H~OI1~H~O)
10 g
NOTE - Les bols, les sacs en plastique ou le mortier doivent avoir une
Bile de boeuf déshydratée capacité suffisante pour permettre de mélanger correctement I’échan-
20 g
tillon avec la quantité appropriée de diluant. En général, le volume du
Vert brillant 0,013 3 g
récipient doit être environ le double du volume de l’échantillon pour
essai additionné du diluant.
Eau 1000 ml
Préparation
6.3 Agitateur, capable de mélanger 1 ou 2 ml de I’échantil-
Ion pour essai (cas des produits liquides) ou des dilutions déci-
Dissoudre dans l’eau les composan ts ou le milieu complet
males, dans un tube de dimensions suffisantes, avec 9 ou 18 ml
déshydraté en portant à ébullition.
f
de diluant, afin d’obtenir une suspension homogène, et dont le
principe de fonctionnement est basé sur un mouvement de rota-
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’aprés stérilisation, il soit
tion excentré du contenu des tubes à essais (agitateur Vortex).
de 7,2 + 0,l à 25 OC.
Répartir le milieu, par quantités de 10 ml dans des tubes à
6.4 Fioles, de capacité suffisante pour contenir les 90 ml de
essais (6.7) contenant les cloches de Durham (6.8).
diluant utilisés pour la suspension-mère, ou des multiples de
90 ml, en laissant un espace suffisant pour l’agitation.
Stériliser à l’autoclave (6.1) a 121 + IOC pendant 15 min.
Les cloches de Durham ne doivent pas contenir de d’air 6.5 Fioles, de 150 à 250 ml de capacité, pour contenir la
après stérilisation.
gélose au violet, au rouge neutre, à la bile et au lactose (5.5.1).
Selon les instructions du fabricant.
---------------------- Page: 5 ----------------------
SO 5541/1-1986 (FI
6.6 Tubes à essais, ou fioles, de capacité suffisante pour 8.1 Préparation de l’échantillon pour essai et de
contenir 10 ml (ou un multiple de 10 ml, si nécessaire) de la dilution primaire
l’échantillon pour essai (s’il est liquide) ou de la dilution primaire
(autre cas) ou des dilutions décimales suivantes et laisser un Préparer des dilutions de facon à obtenir des boîtes contenant
espace libre adéquat pour permettre une agitation convenable. plus de 10 et moins de 150 colonies.
Pour éviter d’endommager les micro-organismes par de brus-
6.7 Tubes à essais, de 20 ml de pacité, pour contenir le
ques changements de température, la température du diluant
bouillon lactosé bilié au vert brillant 5.2).
pendant les opérations décrites ci-après doit être du même
ordre que celle de l’échantillon pour essai, sauf prescriptions
contraires.
68 C loches de Durham, de dimensions appropriées en vue
de le ur utilisation dans les tubes à essais (6.7).
8.1.1 Lait et produits laitiers liquides
6.9 Pipettes (bouchées avec du coton), de 1 ml de capacité
Agiter vigoureusement l’échantillon pour essai, afin d’assurer
nominale et ayant un orifice d’écoulement de 2 à 3 mm de
une répartition aussi uniforme que possible des micro-
diamètre.
organismes, en inversant rapidement 25 fois le récipient conte-
nant l’échantillon. II faut éviter la formation de mousse ou bien
NOTE - N’utiliser que des pipettes non ébréchées et, quand cela est
la laisser se disperser. L’intervalle entre le mélange et le prélève-
nécessaire, avec des graduations bien marquées pour les distinguer
ment de la prise d’essai ne doit pas dépasser 3 min.
nettement du contenu.
Prélever 1 ml de l’échantillon pour essai à la pipette et l’ajouter
6.10 Pipettes graduée
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.