Soil quality — Determination of the effects of pollutants on soil flora — Leaf fatty acid composition of plants used to assess soil quality

This document describes a method to compare the quality of soils by determining the fatty acid composition of the leaves of plant species grown in these soils. This method does not make it possible to determine an optimal value of the Omega-3 index and, therefore, cannot be used to determine the intrinsic quality of a soil from a specific area (regarded as homogeneous). The method can only be used to compare the quality of soils between various areas. This method is applicable to: — soils from contaminated sites; — amended soils; — soils after remediation; ? soil with waste products (e.g. slurry, manure, sludge or composts). Alternatively, the quality of soils can be assessed by determining the Omega-3 index of Lactuca sativa seedlings grown in these soils under controlled conditions (i.e. phytotronic chamber) and by comparing these values to those obtained from control soils (see Annex B).

Qualité du sol — Détermination des effets des polluants sur la flore du sol — Composition en acides gras foliaires des plantes utilisées pour évaluer la qualité du sol

Le présent document décrit une méthode visant à comparer la qualité des sols en déterminant la composition en acides gras des feuilles d'espèces végétales poussant sur ces sols. Cette méthode ne permet pas de déterminer une valeur optimale de l'indice Oméga-3 et ne peut donc pas être utilisée pour déterminer la qualité intrinsèque d'un sol d'une zone spécifique (considérée homogène). La méthode peut être utilisée uniquement pour comparer la qualité des sols entre plusieurs zones. Cette méthode est applicable à: — des sols provenant de sites contaminés; — des sols amendés; — des sols après remédiation; — des sols contenant des produits résiduaires (par exemple lisier, fumier, boues ou composts). La qualité des sols peut aussi être évaluée en déterminant l'indice Oméga-3 de plantules de Lactuca sativa poussant dans ces sols dans des conditions contrôlées (c'est-à-dire, enceinte phytotronique) et en comparant ces valeurs avec celles obtenues à partir de sols témoins (voir l'Annexe B).

General Information

Status
Published
Publication Date
04-Jun-2019
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
05-Jun-2019
Completion Date
05-Jun-2019
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ISO 21479:2019 - Soil quality -- Determination of the effects of pollutants on soil flora -- Leaf fatty acid composition of plants used to assess soil quality
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ISO 21479:2019 - Qualité du sol -- Détermination des effets des polluants sur la flore du sol -- Composition en acides gras foliaires des plantes utilisées pour évaluer la qualité du sol
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21479
First edition
2019-06
Soil quality — Determination of the
effects of pollutants on soil flora —
Leaf fatty acid composition of plants
used to assess soil quality
Qualité du sol — Détermination des effets des polluants sur la flore du
sol — Composition en acides gras foliaires des plantes utilisées pour
évaluer la qualité du sol
Reference number
ISO 21479:2019(E)
ISO 2019
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ISO 21479:2019(E)
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Published in Switzerland
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ISO 21479:2019(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms, definitions and abbreviated terms ................................................................................................................................ 1

3.1 Terms and definitions ....................................................................................................................................................................... 1

3.2 Abbreviated terms ............................................................................................................................................................................... 2

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

5 Apparatus and reagents ................................................................................................................................................................................ 2

5.1 Apparatus .................................................................................................................................................................................................... 2

5.2 Reagents........................................................................................................................................................................................................ 3

6 Sampling strategies ........................................................................................................................................................................................... 3

7 Sampling of leaf tissues ................................................................................................................................................................................. 3

8 Obtaining, extraction and analyses of FAMES ......................................................................................................................... 4

8.1 Contamination control ..................................................................................................................................................................... 4

8.2 Obtaining and extraction of FAMES from plant leaves ......................................................................................... 4

8.3 Analysis of FAMES ................................................................................................................................................................................ 4

9 Test report ................................................................................................................................................................................................................... 6

9.1 A reference to this document, i.e. ISO 21479 ................................................................................................................ 6

9.2 Description of the site and areas analysed ..................................................................................................................... 6

9.3 Leaf sampling ........................................................................................................................................................................................... 6

9.4 Fatty acid composition ..................................................................................................................................................................... 6

9.5 Conclusion ................................................................................................................................................................................................... 6

Annex A (informative) Results of the ring test ........................................................................................................................................... 7

Annex B (informative) Assessment of soil quality by determining the Omega-3 index of

Lactuca sativa seedlings grown ex situ under controlled conditions .........................................................14

Annex C (informative) Plant species previously successfully used to assess soils of

contaminated sites (organic and/or metals) .......................................................................................................................16

Annex D (informative) Variation of the Omega-3 index as function of harvest time, plant

size and leaf development .......................................................................................................................................................................17

Annex E (informative) Effect of the quantity of foliar tissues on the FAMES composition ........................19

Annex F (informative) Example of chromatogram obtained after the FAMES analysis of

foliar tissues ...........................................................................................................................................................................................................20

Annex G (informative) Recommended mathematical method to rate soils of areas when

some sampled plant species are not found in all areas ............................................................................................21

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................23

© ISO 2019 – All rights reserved iii
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ISO 21479:2019(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following

URL: www .iso .org/iso/foreword .html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,

Biological characterization.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
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ISO 21479:2019(E)
Introduction

Among the more than 150 ISO standards on soil quality that have been developed, less than 40 address

living organisms, and among them only five address higher plants. This is despite the importance of

monitoring the adverse effects of soil quality on living organisms.
[1]

One of these five standards addresses genotoxicity , and four of them address emergence and/or

[2-5]

growth inhibition . It therefore appears that these International Standards are focused either on a

very specific effect (genotoxicity), or on effects great enough to induce developmental (and, therefore,

visible) phenotypes (emergence or growth inhibition of young seedlings) in soils sampled in the field.

Hence, more sensitive/earlier bio-indicators of the adverse effects of pollutants on plants, such as the

“Omega-3 index”, are needed.

The assessment of soil contaminant effects by the Omega-3 index is based on the leaf fatty acid

composition of angiosperm species grown in sites of concern. The use of the Omega-3 index has proven

to be appropriate for highlighting the presence of metallic and organic contaminants (herbicides, etc.)

in the soils. With this aim, physical and chemical properties (pH, N/P/K content) of soils should also be

[12]

determined because plant fatty acid composition may vary as a function of nutrient content and pH

may influence chemical compound bioavailability. It should be noted that this bio-indicator has proved

to be more sensitive (i.e. responding to lower doses of contaminants) than the biometric parameters of

[6][14]

rate of germination and biomass . Hence, this makes it possible to gain evidence of adverse effects

of soils on plants that could not be highlighted by the rate of germination or biomass. Additionally, for in

situ assessment purposes, it can be difficult to observe evident effects on the rate of germination and/

or biomass of plants.

It should be noted that from a practical point of view, especially with plant species harvested in the

field, and in comparison with other bio-indicators, the Omega-3 index presents several advantages.

— For fatty acid analysis, only 20 mg to 50 mg of fresh leaf tissues per sample are needed. Hence, this

is not destructive for plants, and there is not a problem with getting enough tissues of one species

from a given area.

— Samples of plant tissues can be stored in methanol for several days at room temperature prior to

analyses.

— It is not necessary to find a particular species at a site, and that a priori any species (often chosen

among the most representative) can be sampled (Clause 6).

The results of a ring test performed by six individual laboratories to assess the reproducibility and the

repeatability of the method are shown in Annex A. The results obtained by the same investigator with

the same sample and the same measuring instrument over a short period of time are shown in Annex B.

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INTERNATIONAL STANDARD ISO 21479:2019(E)
Soil quality — Determination of the effects of pollutants on
soil flora — Leaf fatty acid composition of plants used to
assess soil quality

WARNING — Contaminated soils can contain unknown mixtures of toxic, mutagenic, or

otherwise harmful chemicals or infectious micro-organisms. Occupational health risks can

arise from dust or evaporated chemicals. Furthermore, plants might take up chemicals from the

soil and safety measures should also be considered when handling the test plants.

1 Scope

This document describes a method to compare the quality of soils by determining the fatty acid

composition of the leaves of plant species grown in these soils.

This method does not make it possible to determine an optimal value of the Omega-3 index and,

therefore, cannot be used to determine the intrinsic quality of a soil from a specific area (regarded as

homogeneous). The method can only be used to compare the quality of soils between various areas.

This method is applicable to:
— soils from contaminated sites;
— amended soils;
— soils after remediation;
— soil with waste products (e.g. slurry, manure, sludge or composts).

Alternatively, the quality of soils can be assessed by determining the Omega-3 index of Lactuca sativa

seedlings grown in these soils under controlled conditions (i.e. phytotronic chamber) and by comparing

these values to those obtained from control soils (see Annex B).
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms, definitions and abbreviated terms
3.1 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1.1
Omega-3 index
% C18:3/(%C18:0 + % C18:1 + % C18:2)
Note 1 to entry: The Omega-3 index has no unit.
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ISO 21479:2019(E)
3.2 Abbreviated terms
For the purposes of this document, the following abbreviated term applies.

FAME(s) Fatty Acid Methyl Ester(s); C16:0: palmitic acid methyl ester; C16:1: palmitoleic methyl

ester; C18:0: stearic acid methyl ester; C18:1: oleic acid methyl ester; C18:2: linoleic acid

methyl ester; C18:3: linolenic acid methyl ester.
4 Principle

The method is used to assess the quality of soils by determining the fatty acid composition of the leaves

of angiosperm species (see Annex C and [9-14][18]) grown on these soils. After sampling leaf tissues,

their fatty acid composition is determined. For this, transesterification is carried out on the foliar

tissues and the fatty acid methyl esters obtained are analysed by gas chromatography. After analysis,

the % C18:3 / (% C18:0 + % C18:1 + % C18:2) ratio is calculated. The lower this ratio, the higher the

adverse effects on plants induced by soils is [6][9-14][18].
5 Apparatus and reagents
5.1 Apparatus

In addition to the standard laboratory equipment, the following apparatus are required.

5.1.1 Scissors to cut leaves.

5.1.2 Graduated glass pipette, to add sulfuric acid (H SO ) to methanol, pipettes to dispense the

2 4

mixture into glass culture tubes (1 ml/tube), and Pasteur pipettes for recovering hexane after extraction

of FAMEs.

5.1.3 Glass culture tubes (e.g. 1,3 × 10 cm) with polytetrafluoroethylene seal screw caps. These culture

tubes were numbered on adhesive tape (and not directly on the glass, to prevent any risk of erasing).

Tubes were checked to ensure they were not chipped (in order to guarantee their leak-tight seal).

5.1.4 System (e.g. heating block) for heating the tubes to 80 °C.

5.1.5 Benchtop centrifuge for centrifuging the tubes to 200 g to 300 g and separating the aqueous

phase from hexane.

5.1.6 Gas chromatograph vials with inserts and screws caps with a polytetrafluoroethylene septum.

5.1.7 Gas chromatograph equipped with a Flame Ionisation Detector (FID) and a capillary column for

separating and quantifying methyl esters of fatty acids with 12 carbon atoms to 22 carbon atoms, and for

each aliphatic chain length to separate the saturated, mono-, di- and tri-unsaturated esters.

Note 1 Most of the time, the studies that led to the preparation of this document were carried out using a gas

chromatograph (Hewlett Packard 5890 series II or Hewlett Packard 7890A) on a Carbowax 1,2 micron, 0,53 mm

diameter, 15 m long capillary column (Altech, Deerfield, IL., USA) or on a DB-WAX 1 micron, 0,53 mm diameter,

15 m long capillary column (Agilent, Santa Clara, CA., USA), helium being the carrier gas .

1) This information is given for the convenience of users of this standard and does not constitute an endorsement

by ISO of these products.
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ISO 21479:2019(E)
5.2 Reagents

5.2.1 Methanol (99 %) and sulfuric acid (H SO ), components of the transesterification solution.

2 4
5.2.2 Distilled water and hexane (99 %) for extracting the FAMEs.
6 Sampling strategies

Because plant fatty acid composition can vary as a function of climatic conditions, the compared areas

should share the same climatic conditions (humidity, temperature, sunlight). In addition, because the

Omega-3 index is an early indicator, its measurement is not relevant when a strong visual phenotype

(highly reduced biomass, high leaf chlorosis, etc.) is detected for plants having grown in one area, and

not detected in another area.

Depending on the aim of the study, one or several angiosperm species can be sampled from each area

of interest. For most of the studies, even if only one species can be used for the assessment of a given

site (a metallurgic landfill soil for example), it is recommended to use several species (if possible three

to eight). By using only one species, it is possible to serendipitously sample a highly resistant (or

sensitive) species. In addition, the larger the number of species sampled, the more representative the

results will be of a “soil quality” for the overall phytocoenosis. Hence, in this case, the various areas

of the site are first prospected, and species to sample are chosen among the most representative

examples, common to all areas to the extent possible. One leaf (or a piece of a leaf when whole leaves are

too large to be entirely immerged in 1 ml of methanol/H SO , see 8.2) from four to eight individuals per

2 4

species should be sampled per area. Some plant species previously successfully used to assess the soils

of contaminated sites (by organic compounds and/or metals) are indicated in Annex C.

When it is not possible to sample the same species in all the areas, it remains possible to determine

the Omega-3 index but, in this case: (i) all the species sampled in a given area should be present and

sampled on at least one other area and (ii) all pairs of areas should share at least one species to be

sampled.

Note that for the assessment of agricultural practices, the only plant species to sample is usually the

only one of interest, namely the cultivated crop. When only one species is sampled, the leaf (or a piece of

leaf) of 6 to 12 individuals per area is harvested.
7 Sampling of leaf tissues

The following recommendations should be followed to sample leaf tissues suitable for subsequent

analysis:

— as the transesterification response involves obtaining fatty acid methyl esters from biological

samples, and the presence of water leads to hydrolysis of the esters formed, the presence of external

water on the biological samples must be avoided. Hence, if leaves are wet, before sampling, it is

necessary to remove water from their surface by the use of an absorbent paper;

— do not sample leaves under hydric (drought) or biotic (pathogens) stress. Only green leaves should

be harvested;

— harvest leaves on plants of similar size. Consequently, harvest of leaves from small plants in one

area and leaves from tall plants in another should not be undertaken to measure the Omega-3 index

(see Annex D and [12]);

— as a precautionary measure, we recommend harvesting only mature leaves and to disregard

developing ones (see Annex D);

— when only a part of the leaves from a given species is sampled, harvest the same part of the leaves

(the distal part for example) for all individuals;
© ISO 2019 – All rights reserved 3
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ISO 21479:2019(E)

— as a precautionary measure, it is recommended to harvest all the plants within 2 h to 3 h (see Annex D).

8 Obtaining, extraction and analyses of FAMES
8.1 Contamination control

To prevent contamination, it is necessary to avoid any contact between the solutions with plastic, parafilm

or glue, etc. To ensure the absence of contaminations (e.g. protocol errors, contaminated solutions, etc.),

a test should be performed before each series of analyses by following the same protocol described in 8.2

and 8.3, but without biological tissues in the culture tubes. After GC analyses, with the exception of the

peak corresponding to hexane, the profile of the gas chromatogram should not display peaks.

Avoid any contact of the solutions with plastic: this recommendation does not apply to the pipette tips

used for collecting the solution of methanol/H SO (40/1) or hexane.
2 4
8.2 Obtaining and extraction of FAMES from plant leaves

Introduce the foliar tissues (approximately 1 cm × 1 cm) into the culture tubes (see 5.1.3) containing

1 ml of a solution of methanol/H SO (40/1). Seal the tubes using a screw cap equipped with a

2 4

polytetrafluoroethylene seal. Heat them for 1 h at 80 °C. With the methanol boiling at 72 °C at a pressure

of 1 atmosphere, it is mandatory to avoid any evaporation so as to cause saturation vapour pressure in

the tubes. It is, therefore, important that they are perfectly plugged. It is also necessary to visually

check (every 5 min for 20 min, then every 10 min) that the solution of methanol/H SO does not boil

2 4

for the duration of the heating. If during the heating the contents of the tube boil, lower the tube into

the ice to cool it then completely unscrew and retighten the cap. Readjust the volume, if necessary, to

1 ml by adding methanol. If the contents are still boiling afterwards, take another tube and another cap

and transfer into it the contents of the defective tube. The fatty acid composition of tissues in the tubes

where the solution of methanol/H SO has (almost) totally evaporated during the heating should not be

2 4
analysed.

After 1 h of heating at 80 °C, cool the tubes (e.g. put them on ice). First add 750 µl of 99 % hexane,

then 1,5 ml of H O. Shake vigorously by hand for 20 sec. The use of a vortex should be avoided.

Centrifuge the tubes at 200 g to 300 g for 5 min to 10 min to obtain two phases. Using a Pasteur pipette,

transfer 200 µl to 400 µl of hexane (upper phase) into a CG vial equipped with an insert. Close the vial

using a screw-opening cap equipped with a silicone septum. Collecting the lower phase should absolutely

be avoided because the water irreversibly damages the column used for the gas chromatography.

Note that following this protocol, the leaf fatty acid composition does not depend on the amount of

foliar tissues put in the tube (see Annex E).
8.3 Analysis of FAMES

Carry out the gas chromatography analysis with a capillary column for separating and quantifying fatty

acid methyl esters with 14 carbon atoms to 22 carbon atoms, and for each aliphatic chain length for

separating the saturated, mono-, di- and tri-unsaturated esters. The FAMEs are identified by comparing

retention times with standard of C16:0; C16:1; C16:3 C18:0; C18:1; C18:2 and C18:3 methyl esters.

After the gas chromatography analysis (see Annex F), consider the surface of the peaks of the

chromatograph corresponding to C16:0, C16:1, C16:3 (when present), C18:0, C18:1, C18:2 and C18:3.

Express the results as a percentage for each FAME F . The percentage is calculated by dividing the

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ISO 21479:2019(E)

surface S of the peak for the FAME F by the sum of the surfaces of the peaks corresponding to C16:0,

i i
C16:1, C16:3 (when present), C18:0, C18:1, C18:2 and C18:3, i.e.
% F = 100 × S /(S + S + S + S + S + S + S) (1)
i i C16:0 C16:1 C16:3 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3

The results of the analyses for which a contamination is suspected should be discarded. For example,

when the fatty acid composition deviates too far from the standard fatty acid composition for green

leaf tissues of angiosperms (see Annexes B, E, F and [6][9-14][18]).
— %C18:0, %C16:1 and %C18:1 should each be lower than 10 %;
— C16:0 and C18:2 each between 5 % and 30 %;
— C16:3 between 0 % and 30 %; and

— C18:3 higher than 40 % of the sum (%C16:0 +%C16:1 + %C16:3 + %C18:0 + %C18:1 + %C18:2 +

%C18:3).

Similarly do not consider results when (an) additional peak(s) that do(es) not correspond to C16:0,

C16:3, C18:0, C16:1, C18:1, C18:2 or C18:3 appear(s) in significant proportions, e.g. peak(s) displaying a

surface S higher than 0,15 × (S + S + S + S + S + S + S ).
C16:0 C16:1 C16:3 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3

One or several plant species can be sampled per area. When only one plant species is analysed or when

all plant species are found in all sampling areas, standard statistical procedures generally are sufficient

for analysis of results. The parametric analyses (e.g. t-test) for such data assume that the data are

normally distributed, that the treatments are independent and that the variance is homogenous among

the various treatments. These assumptions should be tested. If the data satisfy these assumptions,

results analysis may proceed. Otherwise, nonparametric tests should be used. Solely in cases of

statistically significant differences between areas, a rating is attributed to the soil of each area.

When only one species is analysed, and if significant differences between the means of the Omega-3

index by area are observed, the rating of an area should be defined as the mean of the Omega-3 index

on this area divided by the highest mean of the Omega-3 index measured on the whole site, all areas

included.

The Omega-3 index values may depend upon the plant species analysed. Therefore, when several plant

species are analysed together, standardised values of the Omega-3 index should be used. The X /X

p max

ratio is therefore calculated, where X represents the Omega-3 index measured for the individual plant

p and X represents the highest Omega-3 index obtained for the individuals of the same species at a

max
given site, all areas included.

When several plant species are analysed and all plant species were found in all sampling areas, and if

significant differences are observed between the means of the X /X ratio by area (all individuals

p max

of all species included), the rating of an area is defined as the mean of the X /X on this area (all

p max

individuals of all species included) divided by the highest mean of X /X measured at a given site, all

p max
areas included.

Note that it remains possible to rate and to rank areas when not all plant species under study were

found in all sampling areas when (i) all species sampled on a given area were present and sampled on

at least one other area, and (ii) all pairs of areas shared at least one of the same sampled species. The

method to calculate ratings of the areas in this case is fully described in [10] and explained in Annex G.

It should be noted that ratings are relative: for a given site, the area with the “best soil quality” is given

[6][9-14][18]

a rating of 1, other areas are given a lower rating. In view of our previous experience , we

usually distinguish the different adverse effects of soil on plants as follows: little or no effect (rating

≥0,93), medium (0,93> rating ≥0,85), high (0,85> rating ≥0,7) and very high adverse effect (0,7> rating),

relative to soil of the area with a reference rating of 1.
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ISO 21479:2019(E)
9 Test report
The test report should include the following information:
9.1 A reference to this document, i.e. ISO 21479
9.2 Description of the site and areas analysed

When available, a detailed map of the given site is joined to the test report. Mention area by area whether

few or many plant species were present, and the most abundant ones. Note that detailed information on

physical and chemical prop
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 21479
Première édition
2019-06
Qualité du sol — Détermination des
effets des polluants sur la flore du sol
— Composition en acides gras foliaires
des plantes utilisées pour évaluer la
qualité du sol
Soil quality — Determination of the effects of pollutants on soil flora
— Leaf fatty acid composition of plants used to assess soil quality
Numéro de référence
ISO 21479:2019(F)
ISO 2019
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ISO 21479:2019(F)
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ISO 21479:2019(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes, définitions et abréviations .................................................................................................................................................. 1

3.1 Termes et définitions ......................................................................................................................................................................... 1

3.2 Abréviations .............................................................................................................................................................................................. 2

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

5 Appareillage et réactifs .................................................................................................................................................................................. 2

5.1 Appareillage............................................................................................................................................................................................... 2

5.2 Réactifs ........................................................................................................................................................................................................... 3

6 Stratégies d’échantillonnage .................................................................................................................................................................... 3

7 Échantillonnage des tissus foliaires ................................................................................................................................................. 3

8 Obtention, extraction et analyses des FAME ............................................................................................................................ 4

8.1 Contrôle de la contamination ..................................................................................................................................................... 4

8.2 Obtention et extraction des FAME des feuilles de végétaux ............................................................................ 4

8.3 Analyse des FAME ................................................................................................................................................................................. 5

9 Rapport d'essai ...................................................................................................................................................................................................... 6

9.1 Référence au présent document, c’est-à-dire l'ISO 21479 ................................................................................ 6

9.2 Description du site et des zones analysées ..................................................................................................................... 6

9.3 Échantillonnage des feuilles ........................................................................................................................................................ 6

9.4 Composition en acides gras ......................................................................................................................................................... 6

9.5 Conclusion ................................................................................................................................................................................................... 6

Annexe A (informative) Résultats de l’essai interlaboratoires ................................................................................................. 7

Annexe B (informative) Évaluation de la qualité du sol par détermination de l’indice

Oméga-3 de plantules de Lactuca sativa cultivées ex situ dans des conditions contrôlées .14

Annexe C (informative) Espèces végétales utilisées précédemment avec succès pour

évaluer les sols de sites contaminés (par des composés organiques et/ou des métaux) .....16

Annexe D (informative) Variation de l’indice Oméga-3 en fonction de l’heure de récolte, de

la taille des végétaux et du développement foliaire .....................................................................................................17

Annexe E (informative) Effet de la quantité de tissus foliaires sur la composition en FAME..................19

Annexe F (informative) Exemple de chromatogramme obtenu après l'analyse FAME de

tissus foliaires ......................................................................................................................................................................................................20

Annexe G (informative) Méthode mathématique recommandée pour noter les sols de zones

lorsque certaines espèces végétales échantillonnées ne sont pas trouvées dans

toutes les zones ...................................................................................................................................................................................................21

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................24

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ISO 21479:2019(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/directives).

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, de la signification des termes et expressions

spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute autre information au sujet de

l’adhésion de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les

obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/iso/fr/avant -propos .html.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,

Caractérisation biologique.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
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ISO 21479:2019(F)
Introduction

Sur plus de 150 normes ISO élaborées relatives à la qualité du sol, moins de 40 concernent les organismes

vivants, et parmi celles-ci, seules cinq traitent des végétaux supérieurs, et ce malgré l’importance de la

surveillance des effets indésirables de la qualité du sol sur les organismes vivants.

[1]

L’une de ces cinq normes concerne la génotoxicité , et quatre d’entre elles, l’inhibition de l’émergence

[2-5]

et/ou de la croissance . Il semble donc que ces Normes internationales ciblent un effet très spécifique

(génotoxicité) ou des effets suffisamment importants pour induire des phénotypes développementaux

(et donc visibles): inhibition de l’émergence ou de la croissance de jeunes plantules poussant sur des

sols prélevés sur site. Dès lors, des biomarqueurs plus sensibles/précoces des effets indésirables des

polluants sur les végétaux, tels que «l’indice Oméga-3», sont nécessaires.

L'évaluation des effets d’une contamination du sol par l’indice Oméga-3 repose sur la composition en

acides gras foliaires d’angiospermes poussant sur les sites étudiés. L’utilisation de l’indice Oméga-3 s’est

révélée appropriée pour mettre en évidence la présence de contaminants métalliques et organiques

(herbicides, etc.) dans les sols. Dans cette perspective, il convient également de déterminer les

propriétés physiques et chimiques (pH, teneur en N/P/K) des sols car la composition en acides gras

[12]

foliaires peut varier en fonction de la teneur en nutriments , et le pH peut influencer la biodisponibilité

des composés chimiques. Il est à noter que ce biomarqueur s’est souvent avéré plus sensible (c’est-à-dire

répondant à de plus faibles doses de contaminants) que les paramètres biométriques que sont le taux

[6][14]

de germination et la biomasse . Il permet donc de mettre en évidence des effets indésirables des

sols sur les végétaux qui ne pourraient pas être démontrés par le taux de germination ou la biomasse.

De plus, pour l’évaluation in situ, il peut être difficile d’observer des effets visibles sur le taux de

germination et/ou la biomasse des plantes.

Il convient de noter que, d'un point de vue pratique, notamment avec les espèces végétales récoltées sur

site, et en comparaison d’autres biomarqueurs, l’indice Oméga-3 présente plusieurs avantages.

— Pour l’analyse des acides gras, seuls 20 mg à 50 mg de tissus foliaires frais par échantillon sont

nécessaires. Par conséquent, ceci n’est pas destructif pour les végétaux et il n’est pas difficile

d’obtenir suffisamment de tissus d’une espèce sur une zone donnée.

— Les tissus végétaux prélevés peuvent être conservés dans du méthanol pendant plusieurs jours à

température ambiante avant les analyses.

— Il n’est pas nécessaire de trouver des espèces particulières sur un site et, a priori, n’importe quelle

espèce (souvent choisie parmi les plus représentatives) peut être prélevée (Article 6).

Les résultats d’un essai interlaboratoires effectué par six laboratoires afin d’évaluer la reproductibilité

et la répétabilité de la méthode sont indiqués à l’Annexe A. Les résultats obtenus par le même

investigateur avec le même échantillon et le même instrument de mesure sur une courte période de

temps sont donnés à l’Annexe B
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NORME INTERNATIONALE ISO 21479:2019(F)
Qualité du sol — Détermination des effets des polluants
sur la flore du sol — Composition en acides gras foliaires
des plantes utilisées pour évaluer la qualité du sol

AVERTISSEMENT — Les sols contaminés peuvent contenir des mélanges inconnus de substances

chimiques toxiques, mutagènes ou autrement dangereuses ou des micro-organismes infectieux.

La poussière ou les produits chimiques évaporés peuvent entraîner des risques pour la santé

au travail. De plus, les végétaux peuvent absorber des substances chimiques présentes dans le

sol. Il convient donc de prendre les mesures de sécurité appropriées lors de la manipulation des

végétaux soumis à essai.
1 Domaine d’application

Le présent document décrit une méthode visant à comparer la qualité des sols en déterminant la

composition en acides gras des feuilles d’espèces végétales poussant sur ces sols.

Cette méthode ne permet pas de déterminer une valeur optimale de l’indice Oméga-3 et ne peut donc pas

être utilisée pour déterminer la qualité intrinsèque d’un sol d'une zone spécifique (considérée homogène).

La méthode peut être utilisée uniquement pour comparer la qualité des sols entre plusieurs zones.

Cette méthode est applicable à:
— des sols provenant de sites contaminés;
— des sols amendés;
— des sols après remédiation;

— des sols contenant des produits résiduaires (par exemple lisier, fumier, boues ou composts).

La qualité des sols peut aussi être évaluée en déterminant l’indice Oméga-3 de plantules de Lactuca

sativa poussant dans ces sols dans des conditions contrôlées (c’est-à-dire, enceinte phytotronique) et en

comparant ces valeurs avec celles obtenues à partir de sols témoins (voir l’Annexe B).

2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes, définitions et abréviations
3.1 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/
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ISO 21479:2019(F)
3.1.1
indice Oméga-3
rapport % C18:3/(% C18:0 + % C18:1 + % C18:2)
Note 1 à l'article: à l’Article L’indice Oméga-3 n’a pas d’unité.
3.2 Abréviations
Pour les besoins du présent document, l’abréviation suivante s’applique.

FAME Esters méthyliques d’acides gras; C16:0: ester méthylique d’acide palmitique; C16:1: ester

méthylique palmitoléique; C18:0: ester méthylique d’acide stéarique; C18:1: ester méthy-

lique d’acide oléique; C18:2: ester méthylique d’acide linoléique; C18:3: ester méthylique

d’acide linolénique.
4 Principe

La méthode est utilisée pour évaluer la qualité des sols en déterminant la composition en acides gras

des feuilles d’angiospermes (voir Annexe C et [9-14][18]) poussant sur ces sols. Après échantillonnage

des tissus foliaires, leur composition en acides gras est déterminée. Pour cela, une transestérification

est réalisée sur les tissus foliaires et les esters méthyliques d’acides gras obtenus sont analysés par

chromatographie en phase gazeuse. Après analyse, le rapport % C18:3 / (% C18:0 + % C18:1 + % C18:2)

est calculé. Plus ce rapport est faible, plus les effets indésirables induits par les sols sur les plantes sont

importants [6][9-14][18].
5 Appareillage et réactifs
5.1 Appareillage

En plus de l’équipement de laboratoire courant, l’appareillage suivant est nécessaire.

5.1.1 Ciseaux pour couper les feuilles.

5.1.2 Pipette graduée en verre, pour ajouter l’acide sulfurique (H SO ) au méthanol, pipettes pour

2 4

introduire le mélange dans des tubes de culture en verre (1 ml/tube) et pipettes Pasteur pour récupérer

l’hexane après l’extraction des FAME.

5.1.3 Tubes de culture en verre (par exemple 1,3 × 10 cm) avec bouchons à vis avec joint en

polytétrafluoroéthylène. Ces tubes de culture ont été numérotés sur ruban adhésif (et non pas directement

sur le verre, pour éviter tout risque d’effacement). Vérifier que les tubes n’ont pas été ébréchés (afin d’en

assurer l’étanchéité).

5.1.4 Système (par exemple bloc chauffant) permettant de chauffer les tubes à 80 °C.

5.1.5 Centrifugeuse de paillasse permettant de centrifuger les tubes entre 200 g et 300 g et de

séparer la phase aqueuse de l’hexane.

5.1.6 Fioles de chromatographe en phase gazeuse avec inserts CG et bouchons à vis munis d’un

septum en polytétrafluoroéthylène.

5.1.7 Chromatographe en phase gazeuse équipé d’un détecteur à ionisation de flamme (FID) et

d’une colonne capillaire permettant la séparation et la quantification des esters méthyliques d’acides

gras de 12 atomes de carbone à 22 atomes de carbone, et pour chaque longueur de chaîne aliphatique,

permettant de séparer les esters saturés, mono, di et tri-insaturés.
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ISO 21479:2019(F)

NOTE 1 La plupart du temps, les études qui ont conduit à l’élaboration du présent document ont été effectuées

à l’aide d’un chromatographe en phase gazeuse (Hewlett Packard 5890 série II ou Hewlett Packard 7890A) sur

une colonne capillaire Carbowax de 1,2 micron, 0,53 mm de diamètre et 15 m de longueur (Altech, Deerfield,

IL., États-Unis) ou sur une colonne capillaire DB-WAX de 1 micron, 0,53 mm de diamètre et 15 m de longueur

(Agilent, Santa Clara, CA., États-Unis), l’hélium étant le gaz vecteur .
5.2 Réactifs

5.2.1 Méthanol (99 %) et acide sulfurique (H SO ), composants de la solution de transestérification.

2 4
5.2.2 Eau distillée et hexane (99 %) pour extraire les FAME.
6 Stratégies d’échantillonnage

Étant donné que la composition en acides gras des végétaux peut varier en fonction des conditions

climatiques, il convient que les zones comparées partagent les mêmes conditions climatiques (humidité,

température, ensoleillement). De plus, étant donné que l’indice Oméga-3 est un indicateur précoce, sa

valeur n’est pas pertinente lorsqu’un fort phénotype visuel (biomasse hautement réduite, chlorose

foliaire élevée, etc.) est détecté dans les végétaux ayant poussé dans une zone, et n’est pas détecté dans

une autre zone.

Selon l’objectif de l’étude, une ou plusieurs angiospermes peuvent être échantillonnées sur chaque

zone d’intérêt. Pour la plupart des études, même si une seule espèce peut être utilisée pour l’évaluation

d’un site donné (le sol d’une décharge métallurgique par exemple), il est recommandé d’utiliser

plusieurs espèces (si possible, de trois à huit). En effet, en utilisant une seule espèce, il est possible

d’échantillonner fortuitement une espèce hautement résistante (ou sensible). De plus, plus le nombre

d’espèces échantillonnées est élevé, plus les résultats seront représentatifs de la «qualité du sol» pour

la phytocénose en général. Par conséquent, dans ce cas, les différentes zones du site sont d’abord

prospectées, et les espèces à échantillonner sont choisies parmi les exemples les plus représentatifs

et, dans la mesure du possible, communs à toutes les zones. Il convient d’échantillonner, par zone, une

feuille (ou un morceau de feuille lorsque les feuilles entières sont trop grandes pour être complètement

immergées dans 1 ml de méthanol/H SO , voir 8.2) de quatre à huit individus par espèce. L’Annexe C

2 4

répertorie certaines espèces végétales précédemment utilisées avec succès pour évaluer les sols de

sites contaminés (par des composés organiques et/ou des métaux).

Lorsqu’il est impossible d’échantillonner les mêmes espèces dans toutes les zones, il demeure possible

de déterminer l’indice Oméga-3, mais dans ce cas: (i) il convient que toutes les espèces échantillonnées

dans une zone donnée soient présentes et échantillonnées dans au moins une autre zone, et (ii) il

convient que toutes les paires de zones partagent au moins une espèce à échantillonner.

Noter que pour l’évaluation des pratiques agricoles, la seule espèce végétale à échantillonner est

généralement l’espèce d’intérêt, à savoir la plante cultivée. Lorsqu’une seule espèce est échantillonnée,

une feuille (ou un morceau de feuille) de 6 à 12 individus par zone est récoltée.

7 Échantillonnage des tissus foliaires

Il convient de respecter les recommandations suivantes pour échantillonner des tissus foliaires adaptés

à l’analyse ultérieure:

— la réaction de transestérification consistant à obtenir des esters méthyliques d’acides gras à partir

d’échantillons biologiques, et la présence d’eau entraînant l’hydrolyse des esters formés, la présence

d’eau externe sur les échantillons biologiques doit être évitée. Par conséquent, si des feuilles

sont mouillées, avant l’échantillonnage, il est nécessaire d’enlever l’eau de leur surface à l’aide d’un

papier absorbant;

1) Cette information est donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs de la présente norme et ne

saurait constituer un engagement de l'ISO à l’égard de ce produit.
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— ne pas échantillonner les feuilles souffrant de stress hydrique (sécheresse) ou biotique (pathogènes).

Il convient de récolter uniquement les feuilles vertes;

— récolter les feuilles sur des individus de taille similaire. Par conséquent, il convient de ne pas récolter

les feuilles de petits individus dans une zone et les feuilles de grands individus dans une autre zone

pour mesurer l’indice Oméga-3 (voir Annexe D et [12]);

— à titre de précaution, nous recommandons de ne récolter que les feuilles matures et de laisser celles

en développement (voir Annexe D);

— lorsque seule une partie des feuilles est échantillonnée à partir d’une espèce donnée, récolter la

même partie des feuilles (la partie distale par exemple) pour tous les individus;

— à titre de précaution, il est recommandé de récolter tous les végétaux dans un délai de 2 h à 3 h (voir

Annexe D).
8 Obtention, extraction et analyses des FAME
8.1 Contrôle de la contamination

Pour empêcher toute contamination, il est nécessaire d’éviter tout contact entre les solutions et

plastique, parafilm, colle, etc. Pour s’assurer de l’absence de contaminations (par exemple, erreurs de

protocole, solutions contaminées, etc.), il convient d’effectuer un essai avant chaque série d’analyses en

suivant le même protocole que celui décrit en 8.2 et 8.3, mais sans tissus biologiques dans les tubes de

culture. Après les analyses CG, à l’exception du pic correspondant à l’hexane, il convient que le profil du

chromatogramme en phase gazeuse ne présente pas de pics.

Éviter tout contact des solutions avec le plastique: cette recommandation ne s’applique pas aux pointes

de pipette utilisées pour prélever la solution de méthanol/H SO (40/1) ou l’hexane.

2 4
8.2 Obtention et extraction des FAME des feuilles de végétaux

Introduire les tissus foliaires (environ 1 cm × 1 cm) dans les tubes de culture (voir 5.1.3) contenant

1 ml d’une solution de méthanol/H SO (40/1). Fermer les tubes hermétiquement avec un bouchon à

2 4

vis muni d’un joint en polytétrafluoroéthylène. Les chauffer pendant 1 h à 80 °C. Sous la pression de

1 atmosphère, le méthanol bouillant à 72 °C, il est obligatoire d’éviter toute évaporation et d’engendrer

une pression de vapeur saturante dans les tubes. Il est donc important que ceux-ci soient parfaitement

bouchés. Il est aussi nécessaire de contrôler visuellement (toute les 5 min pendant 20 min, puis toutes

les 10 min) que la solution de méthanol/H SO ne bout pas pendant la durée du chauffage. Si, pendant

2 4

le chauffage, le contenu du tube bout, plonger le tube dans la glace pour le refroidir puis dévisser et

revisser complètement le bouchon. Réajuster le volume, si besoin, à 1 ml en ajoutant du méthanol. Si le

contenu bout encore après avoir remis le tube à chauffer, prendre un autre tube et un autre bouchon, y

transvaser le contenu du tube défectueux. Il convient de ne pas analyser la composition en acides gras

des tissus présents dans des tubes dont la solution de méthanol/H SO s’est (quasiment) totalement

2 4
évaporée lors du chauffage.

Après 1 h de chauffage à 80 °C, refroidir les tubes (les disposer sur de la glace par exemple). Ajouter

d’abord 750 μl d’hexane 99 % puis 1,5 ml d’H O. Agiter vigoureusement manuellement pendant 20 s.

Il convient d’éviter l’utilisation d’un vortex. Centrifuger les tubes entre 200 g et 300 g pendant 5 min

à 10 min pour obtenir deux phases. A l’aide d’une pipette Pasteur, transvaser entre 200 µl et 400 µl

d’hexane (phase supérieure) dans une fiole CG munie d’un insert. Fermer la fiole avec un bouchon à vis

muni d’un septum en silicone. Il convient d’absolument éviter de prélever de la phase inférieure car l’eau

détériore irréversiblement la colonne utilisée pour la chromatographie en phase gazeuse.

Noter qu’en respectant ce protocole, la composition en acides gras foliaires ne dépend pas de la quantité

de tissus foliaires placés dans le tube (voir Annexe E).
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8.3 Analyse des FAME

Réaliser l’analyse par chromatographie en phase gazeuse avec une colonne capillaire permettant de

séparer et de quantifier les esters méthyliques d’acides gras de 14 atomes de carbone à 22 atomes de

carbone, et pour chaque longueur de chaîne aliphatique, de séparer les esters saturés, mono, di et tri-

insaturés. Les FAME sont identifiés par comparaison des temps de rétention avec des étalons d’esters

méthyliques de C16:0; C16:1; C16:3; C18:0; C18:1; C18:2 et C18:3.

Après l’analyse par chromatographie en phase gazeuse (voir Annexe F), prendre en compte la surface

des pics du chromatogramme correspondant aux C16:0; C16:1; C16:3 (si présent); C18:0; C18:1; C18:2 et

C18:3. Exprimer les résultats en pourcentage de chaque FAME, F . Le pourcentage est calculé en divisant

la surface S du pic du FAME F par la somme des surfaces des pics correspondant aux C16:0, C16:1, C16:3

i i
(si présent), C18:0, C18:1, C18:2 et C18:3, c’est-à-dire:
% F = 100 × S /(S + S + S + S + S + S + S) (1)
i i C16:0 C16:1 C16:3 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3

Il convient d'éliminer les résultats des analyses pour lesquelles on suspecte une contamination. Par

exemple, lorsque la composition en acides gras s’éloigne trop de la composition en acides gras standard

pour les tissus des feuilles vertes d’angiospermes (voir Annexes B, E, F et [6][9-14][18]).

— il convient que % C18:0, % C16:1 et % C18:1 soient chacun inférieurs à 10 %;
— il convient que C16:0 et C18:2 soient chacun compris entre 5 % et 30 %;
— il convient que C16:3 soit compris entre 0 % et 30 %; et

— il convient que C18:3 soit supérieur à 40 % de la somme (% C16:0 + % C16:1 + % C16:3 + % C18:0 +

% C18:1 + % C18:2 + % C18:3).

De la même façon, ne pas tenir compte des résultats lorsqu’un ou plusieurs pic(s) supplémentaire(s) ne

correspondant pas aux C16:0, C16:3, C18:0, C16:1, C18:1, C18:2 ou C18:3 apparaît/apparaissent dans

des proportions significatives, par exemple un ou des pic(s) présentant une surface, S, supérieure à

0,15 × (S + S + S + S + S + S + S ).
C16:0 C16:1 C16:3 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3

Une ou plusieurs espèces végétales peuvent être échantillonnées par zone. Lorsqu’une seule espèce

végétale est analysée ou lorsque toutes les espèces végétales sont trouvées dans toutes les zones

d’échantillonnage, les modes opératoires statistiques standards sont suffisants pour effectuer l’analyse

des résultats. Les analyses paramétriques (par exemple test t) pour de telles données supposent que

les données sont normalement distribuées, que les traitements sont indépendants et que la variance

est homogène entre les différents traitements. Il convient de vérifier ces hypothèses. Si les données

satisfont
...

Questions, Comments and Discussion

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