ISO 15163:2012

Milk and milk products — Calf rennet and adult bovine rennet — Determination by chromatography of chymosin and bovine pepsin contents

ISO 15163:2012 specifies a reference method for the determination of the amounts of chymosin and bovine pepsin present in a test sample of calf rennet and adult bovine rennet. In addition, it can be used for mixtures of calf/bovine rennet with fermentation-produced bovine chymosin (FPC).

Lait et produits laitiers — Présure de veau et coagulant issu de bovin adulte — Détermination des teneurs en chymosine et en pepsine bovine par chromatographie

L'ISO 15163|FIL 110:2012 spécifie une méthode de référence pour la détermination des quantités de chymosine et de pepsine bovines présentes dans un échantillon pour essai de présure de veau et de coagulant issu de bovin adulte. De plus, elle peut être utilisée pour des mélanges de présure de veau/coagulant d'origine bovine contenant de la chymosine bovine produite par fermentation (FPC).

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 14-May-2012
• ICS: 67.100.01 - Milk and milk products in general
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Completion Date: 05-Jun-2018

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 15163
IDF
110
First edition
2012-05-15
Milk and milk products — Calf rennet and
adult bovine rennet — Determination by
chromatography of chymosin and bovine
pepsin contents
Lait et produits laitiers — Présure de veau et coagulant issu de bovin
adulte — Détermination des teneurs en chymosine et en pepsine
bovine par chromatographie
Reference numbers
ISO 15163:2012(E)
IDF 110:2012(E)
ISO and IDF 2012
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COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO and IDF 2012

All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,

electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO or IDF at the respective

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Contents Page

Foreword ............................................................................................................................................................ iv

Foreword ............................................................................................................................................................. v

Introduction ........................................................................................................................................................ vi

1  Scope ...................................................................................................................................................... 1

2  Normative references ............................................................................................................................ 1

3  Principle ................................................................................................................................................. 1

4  Reagents ................................................................................................................................................ 2

5  Apparatus ............................................................................................................................................... 3

6  Sampling ................................................................................................................................................ 4

7  Procedure ............................................................................................................................................... 4

7.1  Check ...................................................................................................................................................... 4

7.2  Preparation of a fresh column with Fractogel .................................................................................... 4

7.3  Regeneration and equilibration of the Fractogel resin in the column ............................................. 4

7.4  Storage of the column with Fractogel ................................................................................................. 5

7.5  Preparation of test sample ................................................................................................................... 5

7.6  Analysis of the desalted rennet ........................................................................................................... 6

7.7  Determination of the clotting times ..................................................................................................... 7

8  Calculation and expression of results ................................................................................................ 8

8.1  Calculation of the activity of chymosin and pepsin, expressed as a percentage .......................... 8

8.2  Calculation of active chymosin and active bovine pepsin, in milligrams per litre ......................... 9

8.3  Expression of results .......................................................................................................................... 10

9  Precision .............................................................................................................................................. 10

9.1  Interlaboratory test .............................................................................................................................. 10

9.2  Repeatability ........................................................................................................................................ 10

9.3  Reproducibility .................................................................................................................................... 11

10  Test report ............................................................................................................................................ 11

Annex A (informative) Qualitative determination by double immunodiffusion of milk-coagulating

enzymes in commercial coagulants .................................................................................................. 12

Annex B (informative) Interlaboratory test ..................................................................................................... 17

Bibliography ...................................................................................................................................................... 19

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Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through

ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has

been established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental

and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the

International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.

International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.

The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards

adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an

International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent

rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.

ISO 15163IDF 110 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5,

Milk and milk products and the International Dairy Federation (IDF). It is being published jointly by IDF and

ISO.

This first edition of ISO 15163IDF 110 cancels and replaces IDF 110B:1997, which has been technically

revised.
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IDF 110:2012(E)
Foreword

IDF (the International Dairy Federation) is a non-profit organization representing the dairy sector worldwide.

IDF membership comprises National Committees in every member country as well as regional dairy

associations having signed a formal agreement on cooperation with IDF. All members of IDF have the right to

be represented on the IDF Standing Committees carrying out the technical work. IDF collaborates with ISO in

the development of standard methods of analysis and sampling for milk and milk products.

The main task of Standing Committees is to prepare International Standards. Draft International Standards

adopted by the Standing Committees are circulated to the National Committees for endorsement prior to

publication as an International Standard. Publication as an International Standard requires approval by at least

50 % of IDF National Committees casting a vote.

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent

rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.

ISO 15163IDF 110 was prepared by the International Dairy Federation (IDF) and Technical Committee

ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk products. It is being published jointly by IDF

and ISO.

All work was carried out by an ISO-IDF Project Group on Chymosin and bovine pepsin determination, of the

Standing Committee on Analytical methods for processing aids and indicators, under the aegis of its project

leader, Prof. A. Andrén (SE).

This first edition of ISO 15163IDF 110 cancels and replaces IDF 110B:1997, which has been technically

revised.
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IDF 110:2012(E)
Introduction

Calf rennet and adult bovine rennet preparations contain both chymosin and bovine pepsin in various amounts

as main clotting enzymes. The proportion of chymosin decreases relative to pepsin in the abomasum (the

fourth “true” stomach) with age and at weaning of the calf.

The ratio of abomasa from young cattle to that of old cattle in the raw material for rennet production thus

highly influences the composition of chymosin and pepsin in the final rennet. The higher the abomasa from

[5][6]
young milk-fed calves, the higher the proportion of chymosin and vice versa .

Both chymosin and pepsin have special characteristics relevant to milk-clotting activity and suitability for

cheese making. The milk-clotting activity of pepsin is, for example, much more pH-dependent than chymosin

and pepsin also has a more general proteolytic activity than chymosin.

Therefore, it is very important to analyse the content of chymosin and pepsin in addition to the strength (total

[6][7]
milk-clotting activity) of the rennet .
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INTERNATIONAL STANDARD
IDF 110:2012(E)
Milk and milk products — Calf rennet and adult bovine rennet —
Determination by chromatography of chymosin and bovine
pepsin contents
1 Scope

This International Standard specifies a reference method for the determination of the amounts of chymosin

and bovine pepsin present in a test sample of calf rennet and adult bovine rennet. In addition, it can be used

for mixtures of calf/bovine rennet with fermentation-produced bovine chymosin (FPC).

2 Normative references

The following referenced document is indispensable for the application of this document. For dated references,

only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced document (including

any amendments) applies.

ISO 11815IDF 157:2007, Milk — Determination of total milk-clotting activity of bovine rennets

3 Principle

As a first step, the rennet sample is desalted and the enzymes chymosin and bovine pepsin separated on an

[8][9]

anion exchange column . In a second step, the milk-clotting activity of each of the separated two enzymes

is determined by ISO 11815IDF 157 (reconstituted milk with pH 6,5). The enzymatic composition of the

rennet sample is expressed in percentage chymosin activity and percentage pepsin activity of the sum of the

activities in International Milk-Clotting Units (IMCU) of both components, or the results are expressed in

milligrams per litre of active chymosin and milligrams per litre of active pepsin.

The total milk-clotting activity of the first batch of calf rennet reference standard powder and the first batch of

adult bovine rennet reference standard powder has once and for all been set at 1 000 IMCU/g. Future

preparations of reference standards shall be set relative to the previous reference standards (see

ISO 11815IDF 157).

This International Standard specifies both a manual set-up of the anion exchange chromatography and an

alternative automated set-up.

This is a reference method and changes may therefore only be made if confirmed to give the same result, and

repeatability and reproducibility at least as high as the original standard method. Any change to what is stated

in this International Standard method shall also be mentioned in the test report (see Clause 10).

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IDF 110:2012(E)
4 Reagents

Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and distilled or demineralized

water or water of equivalent purity.
® 1) ®

4.1 Resin, Fractogel EMD DEAE (M) (Merck cat. no. 1.16883) or Mono Q 1 ml prepacked column

(HR 5/5 or 5/50 GL from GE Healthcare) or equivalent resin.
® ®

NOTE 1 Fractogel EMD DEAE (M) is a suitable resin for manual chromatography and Mono Q is suitable for the

automated chromatography.

NOTE 2 If the Fractogel or Mono Q resins are substituted by another resin, it will most likely be necessary to change

the buffers in 4.12, resulting in a need to re-evaluate the method.
4.2 Piperazine hexahydrate (C H N6H O).
4 10 2 2
4.3 Sodium chloride (NaCl).
4.4 Thymol, optional preservative.
4.5 Sodium hydroxide (NaOH).
4.6 Hydrochloric acid solution, c(HCl)  1 mol/l.
4.7 Ethanol (C H OH), with a volume fraction of at least 96 %.
2 5
4.8 Ethanol (C H OH), with an approximate volume fraction of at least 20 %.
2 5

Add 105 ml ethanol 96 % (4.7) to 400 ml water and mix. If a sterile filtration is desired, filter the water before

mixing it with the ethanol.
4.9 Urea, c(N H CO)  8 mol/l.
2 4
Dissolve 48 g urea in water and fill to a total volume of 100 ml.

4.10 Dialysis tubing, of diameter approximately 1 cm (Union Carbide) or equivalent (optional).

NOTE The quality of the dialysis tubing is not critical.

4.11 Desalting columns, Bio-Rad – Econopac 10DG (cat. no. 732-2010) or equivalent (optional).

Use either the dialysis tubing (4.10) or the desalting columns for desalting the rennet.

4.12 Buffer solutions

4.12.1 Buffer solution I, piperazine [(CH ) (NH) ], c[(CH ) (NH) ] = 0,025 mol/l.

2 4 2 2 4 2

1) Fractogel EMD DEAE (M) is an example of a suitable product available commercially. This information is given for

the convenience of the users of this document and does not constitute an endorsement of the product by ISO or IDF.

2) Mono Q 1 ml prepacked column is an example of a suitable product available commercially. This information is given

for the convenience of the users of this document and does not constitute an endorsement of the product by ISO or IDF.

3) Union Carbide is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the

convenience of users of this document and does not constitute an endorsement of the product by ISO and IDF.

4) Bio–RAD - Econopac 10DG is an example of a suitable product available commercially. This information is given for

the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement of the product by ISO or IDF.

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Weigh 4,85 g of piperazine (4.2) and 42,8 g of hydrochloric acid solution (4.6) in a beaker and mix. Transfer

quantitatively the contents of beaker to a 1 000 ml one-mark volumetric flask (5.5), dilute with water to the

1 000 ml mark, and mix. The pH shall be 5,30  0,05. If not, adjust with piperazine or hydrochloric acid. Before

use, degas and preserve the buffer solution as described in 4.12.5.
4.12.2 Buffer solution II, c(NaCl)  0,25 mol/l.

Weigh 14,6 g of NaCl into a 1 000 ml one-mark volumetric flask (5.5). Add the buffer solution I (4.12.1) to the

1 000 ml mark and mix. Do not adjust the pH. Buffer solution II is used only for the manual method. Before

use, degas and preserve the buffer solution as described in 4.12.5.
4.12.3 Buffer solution III, c(NaCl)  0,50 mol/l.

Weigh 29,2 g of NaCl into a 1 000 ml one-mark volumetric flask (5.5). Add buffer solution I (4.12.1) to the

1 000 ml mark and mix. Do not adjust the pH. Buffer solution III is used only for the manual version. Before

use, degas and preserve the buffer solution as described in 4.12.5.
4.12.4 Buffer solution IV, c(NaCl)  1,0 mol/l.

Weigh 58,4 g of NaCl into a 1 000 ml one-mark volumetric flask (5.5). Add buffer solution I (4.12.1) to the

1 000 ml mark and mix. Do not adjust the pH. Before use, degas and preserve the buffer solution as described

in 4.12.5.
4.12.5 Degassing and preservation

Before use, degas the buffer solutions I to IV (4.12.1 to 4.12.4) under vacuum or by use of an ultrasound

water bath. Preserve buffer solutions I to IV for use in the manual method by adding a few thymol crystals and

in the automated method by sterile filtering using a filter of 0,2 µm.

Buffer solutions I to IV can be kept for at least 5 days at room temperature or for 2 months in a refrigerator.

5 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
5.1 Multiway peristaltic pump or other suitable pump (for manual set-up only).
5.2 pH-meter, of sensitivity 0,01 pH unit.

5.3 Chromatographic column, of diameter ~1,0 cm and length 10 cm, with one flow adaptor or equivalent

column suitable for a gel bed height of ~5 cm (for manual set-up only).
5.4 Magnetic stirrer.
[2]
5.5 One-mark volumetric flasks, of the capacities required, ISO 1042 .
®5) ®6)

5.6 FPLC , ÄKTA or HPLC equipment, suitable for the purpose, used for the automatic set-up only.

5.7 Laboratory equipment, for the determination of the clotting time (see ISO 11815IDF 157).

5) FPLC is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of

users of this document and does not constitute an endorsement of the product by ISO or IDF.

6) ÄKTA is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of

users of this document and does not constitute an endorsement of the product by ISO or IDF.

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6 Sampling

Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling method

[1]
is given in ISO 707IDF 50 .

NOTE 1 Sampling of liquid rennet is given in ISO 707IDF 50:2008, Clause 9, and of powdered rennet in

ISO 707IDF 50:2008, Clause 13.

A representative sample should be sent to the laboratory. It should not be damaged or changed during

transport or storage.
NOTE 2 Powdered products can separate rapidly.
Store samples in the dark at a temperature between 0 °C and 5 °C.
7 Procedure
7.1 Check

Prior to determination, check the rennet for absence of main milk-clotting enzymes of non-bovine origin by

using a suitable method (see Annex A). However, checking can be skipped if the rennet is known to contain

chymosin and pepsin of bovine origin only.
7.2 Preparation of a fresh column with Fractogel

After degassing under vacuum, pour a suspension of the ready-to-use Fractogel resin (4.1) directly from the

supplier's bottle, or by use of an ultrasound water bath, into the column (5.3), fixed in a vertical position, with

the outlet open, until the layer of settled Fractogel resin is 4,5 cm to 5,5 cm high. The gel bed shall not run dry

during the whole operation.

Close the outlet tube. Immerse the end of the intake tube of the peristaltic pump into a beaker containing

buffer solution I (4.12.1). Connect the tube of the adaptor to the exit tube of the pump. Adjust the flow rate to

(1,3  0,1) ml/min. Fill the tube of the adaptor with buffer solution I (4.12.1), not exceeding a total internal

tubing volume of 1,5 ml.

Close the column with the adaptor, as described by the supplier of the column. Compress the gel bed a few

millimetres with the adaptor in order to avoid free space above the gel bed. Avoid any air bubble entering the

column. Rinse the column with buffer solution I (4.12.1) for 5 min at a flow rate of 1,3 ml/min.

7.3 Regeneration and equilibration of the Fractogel resin in the column

After the preparation of a new column and after each run, regenerate and equilibrate the Fractogel resin (4.1)

in the column by the following procedure.

Regenerate the Fractogel resin in the column at a flow rate of 1,3 ml/min using at least 15 ml of buffer

solution IV (4.12.4) (11,5 min). Equilibrate the column with at least 40 ml of buffer solution I (4.12.1)

(30 min). The column is now ready for loading the test sample.

The same column can be used over 20 times. Regenerate the column more extensively after frequent use by

rinsing with 0,1 mol/l NaOH for 10 min followed by water for 10 min. Then follow the normal regeneration and

equilibration procedure as described in the preceding.
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7.4 Storage of the column with Fractogel

If the column has to be stored for more than 1 week, rinse it with at least 15 ml of 20 % ethanol (4.8) with the

help of the peristaltic pump (5.1). Store the column with the inlet and the outlet tubes tightly closed.

The column can be stored for several months at room temperature avoiding direct sunlight.

7.5 Preparation of test sample
7.5.1 General
Liquid samples may be used as they are; just proceed to 7.5.2.

A powder rennet sample is prepared as follows. Dissolve a powder rennet sample so as to give, for example,

200 IMCU/ml in a suitable amount of buffer solution I (4.12.1) or by using a buffer solution with pH 5,5

(see ISO 11815IDF 157) before desalting.

Determine the clotting time of the dissolved rennet sample in accordance with ISO 11815IDF 157 before

desalting. Make a rough estimate of the strength of the sample, in IMCU/ml, by measuring it relative to the calf

rennet reference standard in order to determine the amount of sample to apply on to the column (7.6.1 or

7.6.2).

If the results are expressed in milligrams per litre, determine the clotting time of the rennet sample at least

twice in accordance with ISO 11815IDF 157. In this case, measure the clotting times simultaneously or in

rapid succession “before” and "after" desalting.

Before applying the test sample on to the column, desalt it by dialysis (7.5.2) or by gel filtration (7.5.3).

7.5.2 Desalting by dialysis

Immerse the dialysis tubing (4.10) in boiling water for about 5 min and rinse the inside and the outside of the

tubing with water.

Dialyse 5 ml of the prepared test sample (7.5) under examination (~900 IMCU) against 500 ml of buffer

solution I (4.12.1) at 4 °C for at least 5 h but no longer than 20 h. Compress the dialysis tubing very firmly by

hand on closing it in order to reduce the dilution, which occurs during dialysis. Stir the buffer with a magnetic

stirrer (5.4) during the dialysis.

If the results are expressed in milligrams per litre, determine the clotting time of the dialysed rennet sample at

least twice in accordance with ISO 11815IDF 157.
7.5.3 Desalting by gel filtration
Follow the instructions of the supplier.

Equilibrate the desalting column (4.11) with buffer solution I (4.12.1). Apply 3,3 ml of the prepared test sample

(7.5) on to the column. Elute the sample with 4,0 ml of buffer solution I (4.12.1).

For test samples with a low amount of either chymosin or pepsin, it is sometimes necessary to run the

aforementioned procedure twice in order to have enough activity to be able to determine the low component

adequately.

If the results are expressed in milligrams per litre, determine the clotting time of the gel-filtered rennet sample

at least twice in accordance with ISO 11815IDF 157.
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7.5.4 Column lifetime

In order to prolong the lifetime of the columns and to avoid clog-up, the following procedure is recommended

for regular cleaning of the desalting columns.

After each day of use, rinse the whole column in clean tap or distilled water. Apply approximately 5 ml of

8 mol/l urea on the column and drain. Rinse the column once in tap water and equilibrate by letting a full

reservoir volume of buffer solution I (4.12.1) run through the column.

Store equilibrated columns in a cool place with some buffer above the gel surface. For long storage, it is

recommended that the column be stored in buffer or distilled water with preservative added (see supplier's

instruction). When following this procedure, each column can be used for up to 2 years or until the flow rate

reduces considerably.
7.6 Analysis of the desalted rennet
7.6.1 Separation of chymosin and pepsin by ordinary column — Manual set-up

After equilibration of the column in 7.3, introduce on to the column a known amount of desalted test sample

(7.5.2 or 7.5.3) using the pump (5.1), by immersing the end of the intake tube of the pump into the sample test

tube. Set the flow rate at 1,3 ml/min.

The amount of test sample should be sufficient to give, after separation, a clotting time for the weakest fraction

of 350 s to 550 s whenever possible, but not so much that activity can be detected in the intermediate fraction

or in the eluate after the second fraction. A volume of 3 ml up to a maximum of 5 ml of test sample after

desalting is sufficient in most cases. However, the total amount of IMCU applied on the column shall not

exceed 900 IMCU. If the results are expressed in milligrams per litre, it is necessary to know exactly the

amount added to the column. This is not necessary if the results are expressed as percentages only.

When the sample has entered the intake tube almost completely, wash the test tube with 1 ml of buffer

solution II (4.12.2). Avoid any air bubbles entering the tube. Repeat the washing procedure when the first

wash has entered the intake tube.

Immerse the end of the intake tube into a beaker containing at least 50 ml of buffer solution II (4.12.2). Collect

the first elution fraction in a 50 ml one-mark volumetric flask (5.5). Collect either exactly to the 50 ml mark or,

for convenience, to a volume of about 47 ml. In the latter case, make up to the 50 ml mark with buffer

solution II (4.12.2).

Then collect an amount of 3 ml in a small beaker, which is designated as the intermediate fraction.

Subsequently, immerse the end of the intake tube of the peristaltic pump (5.1) into a beaker containing at

least 50 ml buffer solution III (4.12.3). Collect the second elution fraction in another 50 ml one-mark volumetric

flask (5.5). Collect either exactly to the 50 ml mark or, for convenience, to a volume of about 47 ml. In the

latter case, make up to the 50 ml mark with buffer solution III (4.12.3).

Then collect again an amount of 3 ml in a small beaker, which is designated as the after-fraction.

NOTE The first elution fraction contains the chymosin. The intermediate fraction is used to check that the separation

of the two enzymes has been correctly achieved. The second elution fraction contains the bovine pepsin. The

after-fraction is used to check whether all pepsin has been eluted.

If the sample is known to contain a very low amount of chymosin or pepsin, elution fractions 1 and 2 can be

collected in smaller volumetric flasks, for example of 25 ml.
® ®
7.6.2 Separation of chymosin and pepsin by FPLC /ÄKTA /HPLC — Automatic set-up

7.6.2.1 Follow the general instructions for the equipment (5.6) and column Mono Q (4.1) using buffer

solutions I (4.12.1) and IV (4.12.4) only.
6 © ISO and IDF 2012 – All rights reserved
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Draw up a programme for the analysis. Check the correctness of the separation and whether the results

obtained are in line with the manual reference method. In the automatic set-up, the chromatography is scaled

down by a factor of 5, meaning 10 ml fractions are collected instead of the 50 ml fractions collected in the

manual method. Further, it is not necessary to collect the intermediate fraction, because the chromatogram

shows whether the chymosin and pepsin are fully separated into fractions with one enzyme in each.

If the column has not been used during the last 24 h, perform a blind run using buffer I (4.12.1) as test sample.

7.6.2.2 The following guidelines for a programme are suitable for the application of 0,5 ml or 1,0 ml of test

sample.

a) Start (at 0,0 ml buffer) with 100 % of buffer I (4.12.1) using a flow rate of 2 ml/min and record at 280 nm.

Inject the sample, which was pre-injected into a loop of 0,500 ml or 1,000 ml, on to the column.

b) After 0,60 ml of buffer I (4.12.1) has been eluted, start collecting fraction 1 (chymosin fraction).

c) After 1,50 ml of buffer I has been eluted, change buffer I to a buffer mixture of 80 % of buffer I (4

...

NORME ISO
INTERNATIONALE 15163
FIL
110
Première édition
2012-05-15
Version corrigée
2012-08-01
Lait et produits laitiers — Présure de
veau et coagulant issu de bovin adulte —
Détermination des teneurs en chymosine
et en pepsine bovine par
chromatographie
Milk and milk products — Calf rennet and adult bovine rennet —
Determination by chromatography of chymosin and bovine pepsin
contents
Numéros de référence
ISO 15163:2012(F)
FIL 110:2012(F)
ISO et FIL 2012
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ISO 15163:2012(F)
FIL 110:2012(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO et FIL 2012

Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous

quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit

soit de l'ISO soit de la FIL, à l'une ou l'autre des adresses ci-après.
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Sommaire Page

Avant-propos ..................................................................................................................................................... iv

Avant-propos ...................................................................................................................................................... v

Introduction ........................................................................................................................................................ vi

1  Domaine d'application .......................................................................................................................... 1

2  Références normatives ......................................................................................................................... 1

3  Principe .................................................................................................................................................. 1

4  Réactifs ................................................................................................................................................... 2

5  Appareillage ........................................................................................................................................... 3

6  Échantillonnage ..................................................................................................................................... 4

7  Mode opératoire ..................................................................................................................................... 4

7.1  Contrôle .................................................................................................................................................. 4

7.2  Préparation d'une nouvelle colonne de Fractogel ............................................................................. 4

7.3  Régénération et équilibrage de la résine Fractogel dans la colonne .............................................. 5

7.4  Stockage de la colonne de Fractogel .................................................................................................. 5

7.5  Préparation de l'échantillon pour essai .............................................................................................. 5

7.6  Analyse du coagulant d'origine bovine dessalé ................................................................................ 6

7.7  Détermination des temps de coagulation ........................................................................................... 8

8  Calcul et expression des résultats ...................................................................................................... 9

8.1  Calcul de l'activité de la chymosine et de la pepsine, exprimée en pourcentage .......................... 9

8.2  Calcul de la concentration en chymosine active et en pepsine bovine active en

milligrammes par litre ........................................................................................................................... 9

8.3  Expression des résultats .................................................................................................................... 10

9  Fidélité .................................................................................................................................................. 10

9.1  Essai interlaboratoires ........................................................................................................................ 10

9.2  Répétabilité .......................................................................................................................................... 11

9.3  Reproductibilité ................................................................................................................................... 11

10  Rapport d'essai .................................................................................................................................... 11

Annexe A (informative) Dosage qualitatif des enzymes de coagulation du lait dans des

coagulants commerciaux par immunodiffusion double ................................................................. 13

Annexe B (informative) Essai interlaboratoires ............................................................................................. 18

Bibliographie ..................................................................................................................................................... 20

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FIL 110:2012(F)
Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux

de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général

confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire

partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non

gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec

la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.

Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,

Partie 2.

La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes

internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur

publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres

votants.

L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne

pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.

L'ISO 15163FIL 110 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité

SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération Internationale du Lait (FIL). Elle est publiée conjointement par

l'ISO et la FIL.

Cette première édition de l'ISO 15163FIL 110 annule et remplace la FIL 110B:1997, qui a fait l'objet d'une

révision technique.

La présente version corrigée de l'ISO 15163FIL 110:2012 incorpore les corrections suivantes:

 l’expression «coagulant issu de bovin adulte» a été remplacée par «coagulant d’origine bovine», dans la

dernière phrase de l’Article 1;

 le terme «présure» a été remplacé par «coagulant d’origine bovine» en 4.11, 7.5.3, 7.6 et A.1.

iv © ISO et FIL 2012 – Tous droits réservés
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FIL 110:2012(F)
Avant-propos

La FIL (Fédération Internationale du Lait) est une organisation sans but lucratif représentant le secteur

laitier mondial. Les membres de la FIL se composent des Comités Nationaux dans chaque pays membre et

des associations laitières régionales avec lesquelles la FIL a signé des accords de coopération. Tout membre

de la FIL a le droit de faire partie des Comités permanents de la FIL auxquels sont confiés les travaux

techniques. La FIL collabore avec l'ISO pour l'élaboration de méthodes normalisées d'analyse et

d'échantillonnage pour le lait et les produits laitiers.

La tâche principale des Comités permanents est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de

Normes internationales adoptés par les Comités permanents sont soumis aux Comités Nationaux pour

approbation avant publication en tant que Norme internationale. La publication comme Norme internationale

requiert l'approbation de 50 % au moins des Comités Nationaux de la FIL votants.

L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour responsable de ne

pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.

L'ISO 15163FIL 110 a été élaborée par la Fédération Internationale du Lait (FIL) et le comité technique

ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers. Elle est publiée conjointement

par la FIL et l'ISO.

L'ensemble des travaux a été effectué par une équipe de projet ISO-FIL sur la Détermination des teneurs en

chymosine et en pepsine bovine, du comité permanent sur les Méthodes d'analyse pour les adjuvants et

indicateurs de traitement, sous la direction de son chef de projet, le professeur A. Andrén (SE).

Cette première édition de l'ISO 15163FIL 110 annule et remplace la FIL 110B:1997, qui a fait l'objet d'une

révision technique.

La présente version corrigée de l'ISO 15163FIL 110:2012 incorpore les corrections suivantes:

 l’expression «coagulant issu de bovin adulte» a été remplacée par «coagulant d’origine bovine», dans la

dernière phrase de l’Article 1;

 le terme «présure» a été remplacé par «coagulant d’origine bovine» en 4.11, 7.5.3, 7.6 et A.1.

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FIL 110:2012(F)
Introduction

Les préparations à base de présure de veau et de coagulant issu de bovin adulte contiennent toutes deux

comme enzymes coagulantes de la chymosine et de la pepsine bovine en quantités variables. La proportion

de chymosine diminue par rapport à la pepsine dans la caillette (quatrième compartiment de l'estomac) en

fonction de l'âge du veau et au moment de son sevrage.

Pour la production de coagulants d’origine bovine, le rapport des volumes de la caillette d'un bovin jeune et

d'un bovin âgé influence ainsi considérablement la composition de la chymosine et de la pepsine du

coagulant final. Plus le volume de la caillette des jeunes veaux nourris au lait est important, plus la proportion

[5][6]
de chymosine est élevée, et inversement .

La chymosine et la pepsine présentent toutes deux des caractéristiques spéciales aussi bien en ce qui

concerne l'activité de coagulation du lait que l'utilisation en fromagerie. Par exemple, l'activité de coagulation

du lait de la pepsine dépend plus du pH que celle de la chymosine. Par ailleurs, la pepsine présente

également une activité protéolytique plus générale que celle de la chymosine.

Par conséquent, il est très important d'analyser la teneur en chymosine et en pepsine en plus de la force

[6][7]
(activité totale de coagulation du lait) du coagulant d'origine bovine .
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NORME INTERNATIONALE
FIL 110:2012(F)
Lait et produits laitiers — Présure de veau et coagulant issu de
bovin adulte — Détermination des teneurs en chymosine et en
pepsine bovine par chromatographie
1 Domaine d'application

La présente Norme internationale spécifie une méthode de référence pour la détermination des quantités de

chymosine et de pepsine bovines présentes dans un échantillon pour essai de présure de veau et de

coagulant issu de bovin adulte. De plus, elle peut être utilisée pour des mélanges de présure de

veau/coagulant d’origine bovine contenant de la chymosine bovine produite par fermentation (FPC).

2 Références normatives

Le document de référence suivant est indispensable pour l'application du présent document. Pour les

références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du

document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).

ISO 11815FIL 157:2007, Lait — Détermination de l'activité totale de coagulation du lait dans la présure de

bovins
3 Principe

Dans un premier temps, l'échantillon de coagulant d'origine bovine est dessalé puis les enzymes chymosine

[8][9]

et pepsine bovine sont séparées sur une colonne échangeuse d'anions . Dans un deuxième temps,

l'activité de coagulation du lait de chacune des deux enzymes séparées est déterminée selon

l'ISO 11815FIL 157 (lait reconstitué à pH 6,5). La composition enzymatique de l'échantillon de coagulant

d'origine bovine est exprimée soit en pourcentage d'activité de la chymosine et en pourcentage d'activité de la

pepsine de la somme des activités en unités internationales de coagulation du lait (IMCU) des deux

composants, soit en milligrammes par litre de chymosine active et en milligrammes par litre de pepsine active.

L'activité totale coagulante du lait du premier lot de poudre étalon de référence de présure de veau et du

premier lot de poudre étalon de référence de coagulant issu de bovin adulte a été établie une fois pour toutes

à 1 000 IMCU/g. Les préparations ultérieures d'étalons de référence doivent être effectuées d'après les

étalons de référence précédents (voir l'ISO 11815FIL 157).

La présente Norme internationale spécifie une méthode manuelle de chromatographie d'échange d'anions et

une autre méthode automatique.

Il s'agit d'une méthode de référence. Par conséquent, des modifications peuvent être apportées uniquement

s’il a été confirmé qu’elles donnent le même résultat et une répétabilité et une reproductibilité au moins aussi

élevées que celles obtenues avec la méthode normalisée originale. Toute modification apportée à la méthode

décrite dans la présente Norme internationale doit également être mentionnée dans le rapport d'essai (voir

Article 10).
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4 Réactifs

Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue ainsi que de l'eau

distillée ou déminéralisée ou de l'eau de pureté équivalente.
® 1) ®

4.1 Résine, Fractogel EMD DEAE (M) (cat. Merck n° 1.16883) ou colonne pré-remplie de 1 ml Mono Q

(HR 5/5 ou 5/50 GL de GE Healthcare) ou résine équivalente.
® ®

NOTE 1 Fractogel EMD DEAE (M) est une résine adaptée à la chromatographie manuelle et Mono Q convient à la

chromatographie automatique.
® ®

NOTE 2 Si les résines Fractogel ou Mono Q sont remplacées par une autre résine, il peut s'avérer nécessaire de

changer les tampons en 4.12 et en conséquence de réévaluer la méthode.
4.2 Pipérazine hexahydratée (C H N , 6H O).
4 10 2 2
4.3 Chlorure de sodium (NaCl).
4.4 Thymol, conservateur facultatif.
4.5 Hydroxyde de sodium (NaOH).
4.6 Solution d'acide chlorhydrique, c(HCl) = 1 mol/l.
4.7 Éthanol (C H OH), à au moins 96 % (fraction volumique).
2 5
4.8 Éthanol (C H OH), à environ 20 % (fraction volumique).
2 5

Ajouter 105 ml d'éthanol à 96 % (4.7) à 400 ml d'eau et mélanger. Si une filtration stérile est souhaitée, filtrer

l'eau avant de la mélanger avec l'éthanol.
4.9 Urée, c(N H CO) = 8 mol/l.
2 4
Dissoudre 48 g d'urée dans de l'eau et compléter à 100 ml.

4.10 Boudin de dialyse, d'un diamètre d'environ 1 cm (Union Carbide) ou équivalent (facultatif).

NOTE La qualité du tube de dialyse n'est pas un paramètre critique.

4.11 Colonnes de dessalement, Bio-Rad – Econopac 10DG (cat. n° 732-2010) ou équivalent (facultatif).

Utiliser soit le boudin de dialyse (4.10), soit les colonnes de dessalement pour dessaler le coagulant d'origine

bovine.

1) Fractogel EMD DEAE (M) est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est

donnée à l'intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO ou la FIL approuvent ou

recommandent l'emploi exclusif du produit ainsi désigné.

2) La colonne pré-remplie de 1 ml Mono Q est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette

information est donnée à l'intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO ou la FIL

approuvent ou recommandent l'emploi exclusif du produit ainsi désigné.

3) Exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs du

présent document et ne signifie nullement que l'ISO ou la FIL approuvent ou recommandent l'emploi exclusif du produit

ainsi désigné.

4) Bio–RAD - Econopac 10DG est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est

donnée à l'intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO ou la FIL approuvent ou

recommandent l'emploi exclusif du produit ainsi désigné.
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FIL 110:2012(F)
4.12 Solutions tampons

4.12.1 Solution tampon I, pipérazine [(CH ) (NH) ], c[(CH ) (NH) ] = 0,025 mol/l.

2 4 2 2 4 2

Peser 4,85 g de pipérazine (4.2) et 42,8 g de solution d'acide chlorhydrique (4.6) dans un bécher et mélanger.

Transférer quantitativement le contenu du bécher dans une fiole jaugée de 1 000 ml à un trait (5.5).

Compléter à 1 000 ml avec de l'eau et mélanger. Le pH doit être de 5,30  0,05. Si ce n'est pas le cas, ajuster

avec de la pipérazine ou de l'acide chlorhydrique. Avant toute utilisation, dégazer et conserver la solution

tampon comme indiqué en 4.12.5.
4.12.2 Solution tampon II, c(NaCl) = 0,25 mol/l.

Peser 14,6 g de NaCl dans une fiole jaugée de 1 000 ml à un trait (5.5). Compléter à 1 000 ml avec la solution

tampon I (4.12.1) et mélanger. Ne pas ajuster le pH. Utiliser la solution tampon II uniquement pour la méthode

manuelle. Avant toute utilisation, dégazer et conserver la solution tampon comme indiqué en 4.12.5.

4.12.3 Solution tampon III, c(NaCl) = 0,50 mol/l

Peser 29,2 g de NaCl dans une fiole jaugée de 1 000 ml à un trait (5.5). Compléter à 1 000 ml avec la solution

tampon I (4.12.1) et mélanger. Ne pas ajuster le pH. Utiliser la solution tampon III uniquement pour la

méthode manuelle. Avant toute utilisation, dégazer et conserver la solution tampon comme indiqué en 4.12.5.

4.12.4 Solution tampon IV, c(NaCl) = 1,0 mol/l

Peser 58,4 g de NaCl dans une fiole jaugée de 1 000 ml à un trait (5.5). Compléter à 1 000 ml avec la solution

tampon I (4.12.1) et mélanger. Ne pas ajuster le pH. Avant toute utilisation, dégazer et conserver la solution

tampon comme indiqué en 4.12.5.
4.12.5 Dégazage et conservation.

Avant toute utilisation, dégazer les solutions tampons I à IV (4.12.1 à 4.12.4) sous vide ou en utilisant un bain

à ultrasons. Conserver les solutions tampons I à IV en vue de les utiliser dans le cadre de la méthode

manuelle en ajoutant quelques cristaux de thymol. En ce qui concerne la conservation relative à la méthode

automatique, elle s'effectue par filtration stérile à l'aide d'un filtre de 0,2 µm.

Les solutions tampons I à IV peuvent être conservées pendant au moins 5 jours à température ambiante ou

2 mois au réfrigérateur.
5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.

5.1 Pompe péristaltique multicanaux ou toute autre pompe appropriée (pour la méthode manuelle

uniquement).
5.2 pH-mètre, d'une sensibilité de 0,01 unité pH.

5.3 Colonne de chromatographie, d'environ 1,0 cm de diamètre et 10 cm de long, avec régulateur de

débit ou colonne équivalente adaptée à une hauteur de gel d'environ 5 cm (pour la méthode manuelle

uniquement).
5.4 Agitateur magnétique.
[2]
5.5 Fioles jaugées à un trait, de capacités requises, ISO 1042 .
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® 5 ) ® 6 )

5.6 Appareil FPLC ÄKTA ou CLHP, adapté à l'objectif, utilisé uniquement pour la méthode

automatique.

5.7 Matériel de laboratoire, pour la détermination du temps de coagulation (voir l'ISO 11815FIL 157).

6 Échantillonnage

L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Une

[1]
méthode d'échantillonnage recommandée est indiquée dans l'ISO 707FIL 50 .

NOTE 1 L'échantillonnage du coagulant d'origine bovine liquide est décrit dans l'ISO 707FIL 50:2008, Article 9 et celui

du coagulant d'origine bovine en poudre dans l'ISO 707FIL 50:2008, Article 13.

Il convient d'envoyer un échantillon représentatif au laboratoire. Il est recommandé qu'il n'ait pas été

endommagé ou modifié pendant le transport ou le stockage.
NOTE 2 Les produits en poudre peuvent se séparer rapidement.

Conserver les échantillons à l'abri de la lumière, à une température comprise entre 0 °C et 5 °C.

7 Mode opératoire
7.1 Contrôle

Avant la détermination, vérifier que le coagulant d'origine bovine ne contient pas d'enzymes coagulantes

d'origine non bovine en utilisant une méthode appropriée (voir l'Annexe A). Toutefois, ce contrôle peut être

omis si le coagulant d'origine bovine est connu pour contenir uniquement de la chymosine et de la pepsine

d'origine bovine.
7.2 Préparation d'une nouvelle colonne de Fractogel

Après dégazage sous vide, verser une suspension de la résine Fractogel (4.1) prête à l'emploi, directement

depuis le flacon du fabricant, ou en utilisant un bain à ultrasons, dans la colonne (5.3), en position verticale et

orifice ouvert, jusqu'à ce que la couche de résine Fractogel déposée atteigne une hauteur de 4,5 cm à 5,5 cm.

La couche de gel ne doit pas sécher pendant toute la durée de l'opération.

Fermer le tube de sortie. Immerger l'extrémité du tube d'entrée de la pompe péristaltique dans un bécher

contenant la solution tampon I (4.12.1). Raccorder le tube de l'adaptateur au tube de sortie de la pompe.

Ajuster le débit à (1,3  0,1) ml/min. Remplir le tube de l'adaptateur avec la solution tampon I (4.12.1) sans

dépasser le volume interne total du tube de 1,5 ml.

Fermer la colonne avec l'adaptateur, conformément aux instructions du fabricant de la colonne. À l'aide de

l'adaptateur, comprimer la couche de gel de quelques millimètres pour éviter la formation d'espaces libres

au-dessus de la couche de gel. Éviter l'entrée de bulles d'air dans la colonne. Rincer la colonne avec la

solution tampon I (4.12.1) pendant 5 min à un débit de 1,3 ml/min.

5) FPLC est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention des

utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO ou la FIL approuvent ou recommandent l'emploi

exclusif du produit ainsi désigné.

6) ÄKTA est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention des

utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO ou la FIL approuvent ou recommandent l'emploi

exclusif du produit ainsi désigné.
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7.3 Régénération et équilibrage de la résine Fractogel dans la colonne

Après préparation d'une nouvelle colonne et après chaque passage, régénérer et équilibrer la résine

Fractogel (4.1) présente dans la colonne en procédant comme suit.

Régénérer la résine Fractogel présente dans la colonne à un débit de 1,3 ml/min en utilisant au moins 15 ml

de solution tampon IV (4.12.4) (environ 11,5 min). Équilibrer la colonne avec au moins 40 ml de solution

tampon I (4.12.1) (environ 30 min). La colonne est désormais prête à accueillir l'échantillon pour essai.

La même colonne peut être utilisée plus de 20 fois. En cas d'utilisations fréquentes, régénérer la colonne de

façon plus poussée en la rinçant avec du NaOH à 0,1 mol/l pendant 10 min puis avec de l'eau pendant 10 min.

Ensuite, suivre le mode opératoire normal de régénération et d'équilibrage décrit précédemment.

7.4 Stockage de la colonne de Fractogel

Si la colonne doit être stockée pendant plus d'une semaine, la rincer avec au moins 15 ml d'éthanol à

20 % (4.8) à l'aide de la pompe péristaltique (5.1). Stocker la colonne en veillant à ce que les tubes d'entrée et

de sortie soient hermétiquement fermés.

La colonne peut être stockée pendant plusieurs mois à température ambiante et à l'abri de la lumière directe

du soleil.
7.5 Préparation de l'échantillon pour essai
7.5.1 Généralités

Les échantillons liquides peuvent être utilisés tels quels; il suffit de procéder à 7.5.2.

Un échantillon de coagulant d'origine bovine en poudre est préparé de la façon suivante. Avant d'effectuer le

dessalement, dissoudre un échantillon de coagulant d'origine bovine en poudre de façon à obtenir, par

exemple, 200 IMCU/ml, dans une quantité appropriée de solution tampon I (4.12.1) ou en utilisant une

solution tampon à pH 5,5 (voir l'ISO 11815FIL 157).

Avant d'effectuer le dessalement, déterminer le temps de coagulation de l'échantillon de coagulant d'origine

bovine reconstitué conformément à l'ISO 11815FIL 157. Faire une estimation approximative de la force de

l'échantillon, en IMCU/ml, en le mesurant par rapport à l'étalon de référence de présure de veau, cela afin de

déterminer la quantité d'échantillon à appliquer sur la colonne (7.6.1 ou 7.6.2).

Si les résultats sont exprimés en milligrammes par litre, déterminer au moins deux fois le temps de

coagulation de l'échantillon de coagulant d'origine bovine, conformément à l'ISO 11815FIL 157. Dans ce cas,

mesurer les temps de coagulation simultanément ou dans une succession rapide, «avant» et «après» le

dessalement.

Avant d'appliquer l'échantillon pour essai sur la colonne, le dessaler par dialyse (7.5.2) ou par filtration sur gel

(7.5.3).
7.5.2 Dessalement par dialyse

Immerger le boudin de dialyse (4.10) dans de l'eau bouillante pendant environ 5 min et rincer l'intérieur et

l'extérieur du boudin avec de l'eau.

Dialyser 5 ml de l'échantillon pour essai préparé (7.5) (environ 900 IMCU) avec 500 ml de solution tampon I

(4.12.1) à 4 °C pendant au moins 5 h, mais pas au-delà de 20 h. Comprimer fermement le boudin de dialyse à

la main pour le fermer, afin de réduire la dilution qui se produit au cours de la dialyse. Pendant la dialyse,

agiter le tampon avec un agitateur magnétique (5.4).
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Si les résultats sont exprimés en milligrammes par litre, déterminer au moins deux fois le temps de

coagulation de l'échantillon de coagulant d'origine bovine dialysé, conformément à l'ISO 11815FIL 157.

7.5.3 Dessalement par filtration sur gel
Suivre les instructions du fabricant.

Équilibrer la colonne de dessalement (4.11) avec la solution tampon I (4.12.1). Appliquer 3,3 ml d'échantillon

pour essai préparé (7.5) sur la colonne. Éluer l'échantillon avec 4,0 ml de solution tampon I (4.12.1).

Dans le cas d'échantillons pour essai contenant une petite quantité de chymosine ou de pepsine, il est parfois

nécessaire d'effectuer deux fois le mode opératoire susmentionné, afin que l'activité soit suffisante pour

pouvoir déterminer correctement le composant en faible quantité.

Si les résultats sont exprimés en milligrammes par litre, déterminer au moins deux fois le temps de

coagulation de l'échantillon de coagulant d'origine bovine filtré sur gel, conformément à l'ISO 11815FIL 157.

7.5.4 Durée de vie de la colonne

Afin de prolonger la durée de vie des colonnes et pour éviter qu'elles ne s'encrassent, le mode opératoire

suivant est recommandé pour le nettoyage régulier des colonnes de dessalement.

Après chaque jour d'utilisation, rincer toute la colonne dans de l'eau du robinet ou distillée propre. Appliquer

environ 5 ml d'urée à 8 mol/l sur la colonne et purger. Rincer une fois la colonne dans de l'eau du robinet et

l'équilibrer en laissant couler un volume normal de retenue de solution tampon I (4.12.1) dans la colonne.

Stocker les colonnes équilibrées dans un endroit frais et de façon qu'une partie du tampon se trouve au-

dessus de la surface du gel. Pour un stockage de longue durée, il est recommandé de stocker la colonne

dans un tampon ou de l'eau distillée et d'ajouter un conservateur (voir les instructions du fabricant). En suivant

ce mode opératoire, chaque colonne peut être utilisée pendant deux ans ou jusqu'à ce que son débit réduise

considérablement.
7.6 Analyse du coagulant d'origine bovine dessalé

7.6.1 Séparation de la chymosine et de la pepsine avec une colonne ordinaire — Méthode manuelle

Aprè
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