ISO 15163:2012
(Main)Milk and milk products — Calf rennet and adult bovine rennet — Determination by chromatography of chymosin and bovine pepsin contents
Milk and milk products — Calf rennet and adult bovine rennet — Determination by chromatography of chymosin and bovine pepsin contents
ISO 15163:2012 specifies a reference method for the determination of the amounts of chymosin and bovine pepsin present in a test sample of calf rennet and adult bovine rennet. In addition, it can be used for mixtures of calf/bovine rennet with fermentation-produced bovine chymosin (FPC).
Lait et produits laitiers — Présure de veau et coagulant issu de bovin adulte — Détermination des teneurs en chymosine et en pepsine bovine par chromatographie
L'ISO 15163|FIL 110:2012 spécifie une méthode de référence pour la détermination des quantités de chymosine et de pepsine bovines présentes dans un échantillon pour essai de présure de veau et de coagulant issu de bovin adulte. De plus, elle peut être utilisée pour des mélanges de présure de veau/coagulant d'origine bovine contenant de la chymosine bovine produite par fermentation (FPC).
General Information
Buy Standard
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 15163
IDF
110
First edition
2012-05-15
Milk and milk products — Calf rennet and
adult bovine rennet — Determination by
chromatography of chymosin and bovine
pepsin contents
Lait et produits laitiers — Présure de veau et coagulant issu de bovin
adulte — Détermination des teneurs en chymosine et en pepsine
bovine par chromatographie
Reference numbers
ISO 15163:2012(E)
IDF 110:2012(E)
ISO and IDF 2012
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 15163:2012(E)
IDF 110:2012(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO and IDF 2012
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO or IDF at the respective
address below.ISO copyright office International Dairy Federation
Case postale 56 CH-1211 Geneva 20 Silver Building Boulevard Auguste Reyers 70/B B-1030 Brussels
Tel. + 41 22 749 01 11 Tel. + 32 2 733 98 88Fax + 41 22 749 09 47 Fax + 32 2 733 04 13
E-mail copyright@iso.org E-mail info@fil-idf.org
Web www.iso.org Web www.fil-idf.org
Published in Switzerland
ii © ISO and IDF 2012 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 15163:2012(E)
IDF 110:2012(E)
Contents Page
Foreword ............................................................................................................................................................ iv
Foreword ............................................................................................................................................................. v
Introduction ........................................................................................................................................................ vi
1 Scope ...................................................................................................................................................... 1
2 Normative references ............................................................................................................................ 1
3 Principle ................................................................................................................................................. 1
4 Reagents ................................................................................................................................................ 2
5 Apparatus ............................................................................................................................................... 3
6 Sampling ................................................................................................................................................ 4
7 Procedure ............................................................................................................................................... 4
7.1 Check ...................................................................................................................................................... 4
7.2 Preparation of a fresh column with Fractogel .................................................................................... 4
7.3 Regeneration and equilibration of the Fractogel resin in the column ............................................. 4
7.4 Storage of the column with Fractogel ................................................................................................. 5
7.5 Preparation of test sample ................................................................................................................... 5
7.6 Analysis of the desalted rennet ........................................................................................................... 6
7.7 Determination of the clotting times ..................................................................................................... 7
8 Calculation and expression of results ................................................................................................ 8
8.1 Calculation of the activity of chymosin and pepsin, expressed as a percentage .......................... 8
8.2 Calculation of active chymosin and active bovine pepsin, in milligrams per litre ......................... 9
8.3 Expression of results .......................................................................................................................... 10
9 Precision .............................................................................................................................................. 10
9.1 Interlaboratory test .............................................................................................................................. 10
9.2 Repeatability ........................................................................................................................................ 10
9.3 Reproducibility .................................................................................................................................... 11
10 Test report ............................................................................................................................................ 11
Annex A (informative) Qualitative determination by double immunodiffusion of milk-coagulating
enzymes in commercial coagulants .................................................................................................. 12
Annex B (informative) Interlaboratory test ..................................................................................................... 17
Bibliography ...................................................................................................................................................... 19
© ISO and IDF 2012 – All rights reserved iii---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 15163:2012(E)
IDF 110:2012(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has
been established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 15163IDF 110 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5,
Milk and milk products and the International Dairy Federation (IDF). It is being published jointly by IDF and
ISO.This first edition of ISO 15163IDF 110 cancels and replaces IDF 110B:1997, which has been technically
revised.iv © ISO and IDF 2012 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 15163:2012(E)
IDF 110:2012(E)
Foreword
IDF (the International Dairy Federation) is a non-profit organization representing the dairy sector worldwide.
IDF membership comprises National Committees in every member country as well as regional dairy
associations having signed a formal agreement on cooperation with IDF. All members of IDF have the right to
be represented on the IDF Standing Committees carrying out the technical work. IDF collaborates with ISO in
the development of standard methods of analysis and sampling for milk and milk products.
The main task of Standing Committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the Standing Committees are circulated to the National Committees for endorsement prior to
publication as an International Standard. Publication as an International Standard requires approval by at least
50 % of IDF National Committees casting a vote.Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 15163IDF 110 was prepared by the International Dairy Federation (IDF) and Technical Committee
ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk products. It is being published jointly by IDF
and ISO.All work was carried out by an ISO-IDF Project Group on Chymosin and bovine pepsin determination, of the
Standing Committee on Analytical methods for processing aids and indicators, under the aegis of its project
leader, Prof. A. Andrén (SE).This first edition of ISO 15163IDF 110 cancels and replaces IDF 110B:1997, which has been technically
revised.© ISO and IDF 2012 – All rights reserved v
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 15163:2012(E)
IDF 110:2012(E)
Introduction
Calf rennet and adult bovine rennet preparations contain both chymosin and bovine pepsin in various amounts
as main clotting enzymes. The proportion of chymosin decreases relative to pepsin in the abomasum (the
fourth “true” stomach) with age and at weaning of the calf.The ratio of abomasa from young cattle to that of old cattle in the raw material for rennet production thus
highly influences the composition of chymosin and pepsin in the final rennet. The higher the abomasa from
[5][6]young milk-fed calves, the higher the proportion of chymosin and vice versa .
Both chymosin and pepsin have special characteristics relevant to milk-clotting activity and suitability for
cheese making. The milk-clotting activity of pepsin is, for example, much more pH-dependent than chymosin
and pepsin also has a more general proteolytic activity than chymosin.Therefore, it is very important to analyse the content of chymosin and pepsin in addition to the strength (total
[6][7]milk-clotting activity) of the rennet .
vi © ISO and IDF 2012 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 15163:2012(E)
INTERNATIONAL STANDARD
IDF 110:2012(E)
Milk and milk products — Calf rennet and adult bovine rennet —
Determination by chromatography of chymosin and bovine
pepsin contents
1 Scope
This International Standard specifies a reference method for the determination of the amounts of chymosin
and bovine pepsin present in a test sample of calf rennet and adult bovine rennet. In addition, it can be used
for mixtures of calf/bovine rennet with fermentation-produced bovine chymosin (FPC).
2 Normative referencesThe following referenced document is indispensable for the application of this document. For dated references,
only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced document (including
any amendments) applies.ISO 11815IDF 157:2007, Milk — Determination of total milk-clotting activity of bovine rennets
3 PrincipleAs a first step, the rennet sample is desalted and the enzymes chymosin and bovine pepsin separated on an
[8][9]anion exchange column . In a second step, the milk-clotting activity of each of the separated two enzymes
is determined by ISO 11815IDF 157 (reconstituted milk with pH 6,5). The enzymatic composition of the
rennet sample is expressed in percentage chymosin activity and percentage pepsin activity of the sum of the
activities in International Milk-Clotting Units (IMCU) of both components, or the results are expressed in
milligrams per litre of active chymosin and milligrams per litre of active pepsin.
The total milk-clotting activity of the first batch of calf rennet reference standard powder and the first batch of
adult bovine rennet reference standard powder has once and for all been set at 1 000 IMCU/g. Future
preparations of reference standards shall be set relative to the previous reference standards (see
ISO 11815IDF 157).This International Standard specifies both a manual set-up of the anion exchange chromatography and an
alternative automated set-up.This is a reference method and changes may therefore only be made if confirmed to give the same result, and
repeatability and reproducibility at least as high as the original standard method. Any change to what is stated
in this International Standard method shall also be mentioned in the test report (see Clause 10).
© ISO and IDF 2012 – All rights reserved 1---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 15163:2012(E)
IDF 110:2012(E)
4 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and distilled or demineralized
water or water of equivalent purity.® 1) ®
4.1 Resin, Fractogel EMD DEAE (M) (Merck cat. no. 1.16883) or Mono Q 1 ml prepacked column
(HR 5/5 or 5/50 GL from GE Healthcare) or equivalent resin.® ®
NOTE 1 Fractogel EMD DEAE (M) is a suitable resin for manual chromatography and Mono Q is suitable for the
automated chromatography.NOTE 2 If the Fractogel or Mono Q resins are substituted by another resin, it will most likely be necessary to change
the buffers in 4.12, resulting in a need to re-evaluate the method.4.2 Piperazine hexahydrate (C H N6H O).
4 10 2 2
4.3 Sodium chloride (NaCl).
4.4 Thymol, optional preservative.
4.5 Sodium hydroxide (NaOH).
4.6 Hydrochloric acid solution, c(HCl) 1 mol/l.
4.7 Ethanol (C H OH), with a volume fraction of at least 96 %.
2 5
4.8 Ethanol (C H OH), with an approximate volume fraction of at least 20 %.
2 5
Add 105 ml ethanol 96 % (4.7) to 400 ml water and mix. If a sterile filtration is desired, filter the water before
mixing it with the ethanol.4.9 Urea, c(N H CO) 8 mol/l.
2 4
Dissolve 48 g urea in water and fill to a total volume of 100 ml.
4.10 Dialysis tubing, of diameter approximately 1 cm (Union Carbide) or equivalent (optional).
NOTE The quality of the dialysis tubing is not critical.4.11 Desalting columns, Bio-Rad – Econopac 10DG (cat. no. 732-2010) or equivalent (optional).
Use either the dialysis tubing (4.10) or the desalting columns for desalting the rennet.
4.12 Buffer solutions4.12.1 Buffer solution I, piperazine [(CH ) (NH) ], c[(CH ) (NH) ] = 0,025 mol/l.
2 4 2 2 4 21) Fractogel EMD DEAE (M) is an example of a suitable product available commercially. This information is given for
the convenience of the users of this document and does not constitute an endorsement of the product by ISO or IDF.
2) Mono Q 1 ml prepacked column is an example of a suitable product available commercially. This information is given
for the convenience of the users of this document and does not constitute an endorsement of the product by ISO or IDF.
3) Union Carbide is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the
convenience of users of this document and does not constitute an endorsement of the product by ISO and IDF.
4) Bio–RAD - Econopac 10DG is an example of a suitable product available commercially. This information is given for
the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement of the product by ISO or IDF.
2 © ISO and IDF 2012 – All rights reserved---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 15163:2012(E)
IDF 110:2012(E)
Weigh 4,85 g of piperazine (4.2) and 42,8 g of hydrochloric acid solution (4.6) in a beaker and mix. Transfer
quantitatively the contents of beaker to a 1 000 ml one-mark volumetric flask (5.5), dilute with water to the
1 000 ml mark, and mix. The pH shall be 5,30 0,05. If not, adjust with piperazine or hydrochloric acid. Before
use, degas and preserve the buffer solution as described in 4.12.5.4.12.2 Buffer solution II, c(NaCl) 0,25 mol/l.
Weigh 14,6 g of NaCl into a 1 000 ml one-mark volumetric flask (5.5). Add the buffer solution I (4.12.1) to the
1 000 ml mark and mix. Do not adjust the pH. Buffer solution II is used only for the manual method. Before
use, degas and preserve the buffer solution as described in 4.12.5.4.12.3 Buffer solution III, c(NaCl) 0,50 mol/l.
Weigh 29,2 g of NaCl into a 1 000 ml one-mark volumetric flask (5.5). Add buffer solution I (4.12.1) to the
1 000 ml mark and mix. Do not adjust the pH. Buffer solution III is used only for the manual version. Before
use, degas and preserve the buffer solution as described in 4.12.5.4.12.4 Buffer solution IV, c(NaCl) 1,0 mol/l.
Weigh 58,4 g of NaCl into a 1 000 ml one-mark volumetric flask (5.5). Add buffer solution I (4.12.1) to the
1 000 ml mark and mix. Do not adjust the pH. Before use, degas and preserve the buffer solution as described
in 4.12.5.4.12.5 Degassing and preservation
Before use, degas the buffer solutions I to IV (4.12.1 to 4.12.4) under vacuum or by use of an ultrasound
water bath. Preserve buffer solutions I to IV for use in the manual method by adding a few thymol crystals and
in the automated method by sterile filtering using a filter of 0,2 µm.Buffer solutions I to IV can be kept for at least 5 days at room temperature or for 2 months in a refrigerator.
5 ApparatusUsual laboratory apparatus and, in particular, the following.
5.1 Multiway peristaltic pump or other suitable pump (for manual set-up only).
5.2 pH-meter, of sensitivity 0,01 pH unit.
5.3 Chromatographic column, of diameter ~1,0 cm and length 10 cm, with one flow adaptor or equivalent
column suitable for a gel bed height of ~5 cm (for manual set-up only).5.4 Magnetic stirrer.
[2]
5.5 One-mark volumetric flasks, of the capacities required, ISO 1042 .
®5) ®6)
5.6 FPLC , ÄKTA or HPLC equipment, suitable for the purpose, used for the automatic set-up only.
5.7 Laboratory equipment, for the determination of the clotting time (see ISO 11815IDF 157).
5) FPLC is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of
users of this document and does not constitute an endorsement of the product by ISO or IDF.
6) ÄKTA is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of
users of this document and does not constitute an endorsement of the product by ISO or IDF.
© ISO and IDF 2012 – All rights reserved 3---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 15163:2012(E)
IDF 110:2012(E)
6 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling method
[1]is given in ISO 707IDF 50 .
NOTE 1 Sampling of liquid rennet is given in ISO 707IDF 50:2008, Clause 9, and of powdered rennet in
ISO 707IDF 50:2008, Clause 13.A representative sample should be sent to the laboratory. It should not be damaged or changed during
transport or storage.NOTE 2 Powdered products can separate rapidly.
Store samples in the dark at a temperature between 0 °C and 5 °C.
7 Procedure
7.1 Check
Prior to determination, check the rennet for absence of main milk-clotting enzymes of non-bovine origin by
using a suitable method (see Annex A). However, checking can be skipped if the rennet is known to contain
chymosin and pepsin of bovine origin only.7.2 Preparation of a fresh column with Fractogel
After degassing under vacuum, pour a suspension of the ready-to-use Fractogel resin (4.1) directly from the
supplier's bottle, or by use of an ultrasound water bath, into the column (5.3), fixed in a vertical position, with
the outlet open, until the layer of settled Fractogel resin is 4,5 cm to 5,5 cm high. The gel bed shall not run dry
during the whole operation.Close the outlet tube. Immerse the end of the intake tube of the peristaltic pump into a beaker containing
buffer solution I (4.12.1). Connect the tube of the adaptor to the exit tube of the pump. Adjust the flow rate to
(1,3 0,1) ml/min. Fill the tube of the adaptor with buffer solution I (4.12.1), not exceeding a total internal
tubing volume of 1,5 ml.Close the column with the adaptor, as described by the supplier of the column. Compress the gel bed a few
millimetres with the adaptor in order to avoid free space above the gel bed. Avoid any air bubble entering the
column. Rinse the column with buffer solution I (4.12.1) for 5 min at a flow rate of 1,3 ml/min.
7.3 Regeneration and equilibration of the Fractogel resin in the columnAfter the preparation of a new column and after each run, regenerate and equilibrate the Fractogel resin (4.1)
in the column by the following procedure.Regenerate the Fractogel resin in the column at a flow rate of 1,3 ml/min using at least 15 ml of buffer
solution IV (4.12.4) (11,5 min). Equilibrate the column with at least 40 ml of buffer solution I (4.12.1)
(30 min). The column is now ready for loading the test sample.The same column can be used over 20 times. Regenerate the column more extensively after frequent use by
rinsing with 0,1 mol/l NaOH for 10 min followed by water for 10 min. Then follow the normal regeneration and
equilibration procedure as described in the preceding.4 © ISO and IDF 2012 – All rights reserved
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 15163:2012(E)
IDF 110:2012(E)
7.4 Storage of the column with Fractogel
If the column has to be stored for more than 1 week, rinse it with at least 15 ml of 20 % ethanol (4.8) with the
help of the peristaltic pump (5.1). Store the column with the inlet and the outlet tubes tightly closed.
The column can be stored for several months at room temperature avoiding direct sunlight.
7.5 Preparation of test sample7.5.1 General
Liquid samples may be used as they are; just proceed to 7.5.2.
A powder rennet sample is prepared as follows. Dissolve a powder rennet sample so as to give, for example,
200 IMCU/ml in a suitable amount of buffer solution I (4.12.1) or by using a buffer solution with pH 5,5
(see ISO 11815IDF 157) before desalting.Determine the clotting time of the dissolved rennet sample in accordance with ISO 11815IDF 157 before
desalting. Make a rough estimate of the strength of the sample, in IMCU/ml, by measuring it relative to the calf
rennet reference standard in order to determine the amount of sample to apply on to the column (7.6.1 or
7.6.2).If the results are expressed in milligrams per litre, determine the clotting time of the rennet sample at least
twice in accordance with ISO 11815IDF 157. In this case, measure the clotting times simultaneously or in
rapid succession “before” and "after" desalting.Before applying the test sample on to the column, desalt it by dialysis (7.5.2) or by gel filtration (7.5.3).
7.5.2 Desalting by dialysisImmerse the dialysis tubing (4.10) in boiling water for about 5 min and rinse the inside and the outside of the
tubing with water.Dialyse 5 ml of the prepared test sample (7.5) under examination (~900 IMCU) against 500 ml of buffer
solution I (4.12.1) at 4 °C for at least 5 h but no longer than 20 h. Compress the dialysis tubing very firmly by
hand on closing it in order to reduce the dilution, which occurs during dialysis. Stir the buffer with a magnetic
stirrer (5.4) during the dialysis.If the results are expressed in milligrams per litre, determine the clotting time of the dialysed rennet sample at
least twice in accordance with ISO 11815IDF 157.7.5.3 Desalting by gel filtration
Follow the instructions of the supplier.
Equilibrate the desalting column (4.11) with buffer solution I (4.12.1). Apply 3,3 ml of the prepared test sample
(7.5) on to the column. Elute the sample with 4,0 ml of buffer solution I (4.12.1).
For test samples with a low amount of either chymosin or pepsin, it is sometimes necessary to run the
aforementioned procedure twice in order to have enough activity to be able to determine the low component
adequately.If the results are expressed in milligrams per litre, determine the clotting time of the gel-filtered rennet sample
at least twice in accordance with ISO 11815IDF 157.© ISO and IDF 2012 – All rights reserved 5
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 15163:2012(E)
IDF 110:2012(E)
7.5.4 Column lifetime
In order to prolong the lifetime of the columns and to avoid clog-up, the following procedure is recommended
for regular cleaning of the desalting columns.After each day of use, rinse the whole column in clean tap or distilled water. Apply approximately 5 ml of
8 mol/l urea on the column and drain. Rinse the column once in tap water and equilibrate by letting a full
reservoir volume of buffer solution I (4.12.1) run through the column.Store equilibrated columns in a cool place with some buffer above the gel surface. For long storage, it is
recommended that the column be stored in buffer or distilled water with preservative added (see supplier's
instruction). When following this procedure, each column can be used for up to 2 years or until the flow rate
reduces considerably.7.6 Analysis of the desalted rennet
7.6.1 Separation of chymosin and pepsin by ordinary column — Manual set-up
After equilibration of the column in 7.3, introduce on to the column a known amount of desalted test sample
(7.5.2 or 7.5.3) using the pump (5.1), by immersing the end of the intake tube of the pump into the sample test
tube. Set the flow rate at 1,3 ml/min.The amount of test sample should be sufficient to give, after separation, a clotting time for the weakest fraction
of 350 s to 550 s whenever possible, but not so much that activity can be detected in the intermediate fraction
or in the eluate after the second fraction. A volume of 3 ml up to a maximum of 5 ml of test sample after
desalting is sufficient in most cases. However, the total amount of IMCU applied on the column shall not
exceed 900 IMCU. If the results are expressed in milligrams per litre, it is necessary to know exactly the
amount added to the column. This is not necessary if the results are expressed as percentages only.
When the sample has entered the intake tube almost completely, wash the test tube with 1 ml of buffer
solution II (4.12.2). Avoid any air bubbles entering the tube. Repeat the washing procedure when the first
wash has entered the intake tube.Immerse the end of the intake tube into a beaker containing at least 50 ml of buffer solution II (4.12.2). Collect
the first elution fraction in a 50 ml one-mark volumetric flask (5.5). Collect either exactly to the 50 ml mark or,
for convenience, to a volume of about 47 ml. In the latter case, make up to the 50 ml mark with buffer
solution II (4.12.2).Then collect an amount of 3 ml in a small beaker, which is designated as the intermediate fraction.
Subsequently, immerse the end of the intake tube of the peristaltic pump (5.1) into a beaker containing at
least 50 ml buffer solution III (4.12.3). Collect the second elution fraction in another 50 ml one-mark volumetric
flask (5.5). Collect either exactly to the 50 ml mark or, for convenience, to a volume of about 47 ml. In the
latter case, make up to the 50 ml mark with buffer solution III (4.12.3).Then collect again an amount of 3 ml in a small beaker, which is designated as the after-fraction.
NOTE The first elution fraction contains the chymosin. The intermediate fraction is used to check that the separation
of the two enzymes has been correctly achieved. The second elution fraction contains the bovine pepsin. The
after-fraction is used to check whether all pepsin has been eluted.If the sample is known to contain a very low amount of chymosin or pepsin, elution fractions 1 and 2 can be
collected in smaller volumetric flasks, for example of 25 ml.® ®
7.6.2 Separation of chymosin and pepsin by FPLC /ÄKTA /HPLC — Automatic set-up
7.6.2.1 Follow the general instructions for the equipment (5.6) and column Mono Q (4.1) using buffer
solutions I (4.12.1) and IV (4.12.4) only.6 © ISO and IDF 2012 – All rights reserved
---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 15163:2012(E)
IDF 110:2012(E)
Draw up a programme for the analysis. Check the correctness of the separation and whether the results
obtained are in line with the manual reference method. In the automatic set-up, the chromatography is scaled
down by a factor of 5, meaning 10 ml fractions are collected instead of the 50 ml fractions collected in the
manual method. Further, it is not necessary to collect the intermediate fraction, because the chromatogram
shows whether the chymosin and pepsin are fully separated into fractions with one enzyme in each.
If the column has not been used during the last 24 h, perform a blind run using buffer I (4.12.1) as test sample.
7.6.2.2 The following guidelines for a programme are suitable for the application of 0,5 ml or 1,0 ml of test
sample.a) Start (at 0,0 ml buffer) with 100 % of buffer I (4.12.1) using a flow rate of 2 ml/min and record at 280 nm.
Inject the sample, which was pre-injected into a loop of 0,500 ml or 1,000 ml, on to the column.
b) After 0,60 ml of buffer I (4.12.1) has been eluted, start collecting fraction 1 (chymosin fraction).
c) After 1,50 ml of buffer I has been eluted, change buffer I to a buffer mixture of 80 % of buffer I (4
...NORME ISO
INTERNATIONALE 15163
FIL
110
Première édition
2012-05-15
Version corrigée
2012-08-01
Lait et produits laitiers — Présure de
veau et coagulant issu de bovin adulte —
Détermination des teneurs en chymosine
et en pepsine bovine par
chromatographie
Milk and milk products — Calf rennet and adult bovine rennet —
Determination by chromatography of chymosin and bovine pepsin
contents
Numéros de référence
ISO 15163:2012(F)
FIL 110:2012(F)
ISO et FIL 2012
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 15163:2012(F)
FIL 110:2012(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO et FIL 2012
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous
quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit
soit de l'ISO soit de la FIL, à l'une ou l'autre des adresses ci-après.ISO copyright office Fédération Internationale du Lait
Case postale 56 CH-1211 Geneva 20 Silver Building Boulevard Auguste Reyers 70/B B-1030 Bruxelles
Tel. + 41 22 749 01 11 Tel. + 32 2 733 98 88Fax + 41 22 749 09 47 Fax + 32 2 733 04 13
E-mail copyright@iso.org E-mail info@fil-idf.org
Web www.iso.org Web www.fil-idf.org
Publié en Suisse
ii © ISO et FIL 2012 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 15163:2012(F)
FIL 110:2012(F)
Sommaire Page
Avant-propos ..................................................................................................................................................... iv
Avant-propos ...................................................................................................................................................... v
Introduction ........................................................................................................................................................ vi
1 Domaine d'application .......................................................................................................................... 1
2 Références normatives ......................................................................................................................... 1
3 Principe .................................................................................................................................................. 1
4 Réactifs ................................................................................................................................................... 2
5 Appareillage ........................................................................................................................................... 3
6 Échantillonnage ..................................................................................................................................... 4
7 Mode opératoire ..................................................................................................................................... 4
7.1 Contrôle .................................................................................................................................................. 4
7.2 Préparation d'une nouvelle colonne de Fractogel ............................................................................. 4
7.3 Régénération et équilibrage de la résine Fractogel dans la colonne .............................................. 5
7.4 Stockage de la colonne de Fractogel .................................................................................................. 5
7.5 Préparation de l'échantillon pour essai .............................................................................................. 5
7.6 Analyse du coagulant d'origine bovine dessalé ................................................................................ 6
7.7 Détermination des temps de coagulation ........................................................................................... 8
8 Calcul et expression des résultats ...................................................................................................... 9
8.1 Calcul de l'activité de la chymosine et de la pepsine, exprimée en pourcentage .......................... 9
8.2 Calcul de la concentration en chymosine active et en pepsine bovine active en
milligrammes par litre ........................................................................................................................... 9
8.3 Expression des résultats .................................................................................................................... 10
9 Fidélité .................................................................................................................................................. 10
9.1 Essai interlaboratoires ........................................................................................................................ 10
9.2 Répétabilité .......................................................................................................................................... 11
9.3 Reproductibilité ................................................................................................................................... 11
10 Rapport d'essai .................................................................................................................................... 11
Annexe A (informative) Dosage qualitatif des enzymes de coagulation du lait dans des
coagulants commerciaux par immunodiffusion double ................................................................. 13
Annexe B (informative) Essai interlaboratoires ............................................................................................. 18
Bibliographie ..................................................................................................................................................... 20
© ISO et FIL 2012 – Tous droits réservés iii---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 15163:2012(F)
FIL 110:2012(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.L'ISO 15163FIL 110 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération Internationale du Lait (FIL). Elle est publiée conjointement par
l'ISO et la FIL.Cette première édition de l'ISO 15163FIL 110 annule et remplace la FIL 110B:1997, qui a fait l'objet d'une
révision technique.La présente version corrigée de l'ISO 15163FIL 110:2012 incorpore les corrections suivantes:
l’expression «coagulant issu de bovin adulte» a été remplacée par «coagulant d’origine bovine», dans la
dernière phrase de l’Article 1; le terme «présure» a été remplacé par «coagulant d’origine bovine» en 4.11, 7.5.3, 7.6 et A.1.
iv © ISO et FIL 2012 – Tous droits réservés---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 15163:2012(F)
FIL 110:2012(F)
Avant-propos
La FIL (Fédération Internationale du Lait) est une organisation sans but lucratif représentant le secteur
laitier mondial. Les membres de la FIL se composent des Comités Nationaux dans chaque pays membre et
des associations laitières régionales avec lesquelles la FIL a signé des accords de coopération. Tout membre
de la FIL a le droit de faire partie des Comités permanents de la FIL auxquels sont confiés les travaux
techniques. La FIL collabore avec l'ISO pour l'élaboration de méthodes normalisées d'analyse et
d'échantillonnage pour le lait et les produits laitiers.La tâche principale des Comités permanents est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de
Normes internationales adoptés par les Comités permanents sont soumis aux Comités Nationaux pour
approbation avant publication en tant que Norme internationale. La publication comme Norme internationale
requiert l'approbation de 50 % au moins des Comités Nationaux de la FIL votants.L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.L'ISO 15163FIL 110 a été élaborée par la Fédération Internationale du Lait (FIL) et le comité technique
ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers. Elle est publiée conjointement
par la FIL et l'ISO.L'ensemble des travaux a été effectué par une équipe de projet ISO-FIL sur la Détermination des teneurs en
chymosine et en pepsine bovine, du comité permanent sur les Méthodes d'analyse pour les adjuvants et
indicateurs de traitement, sous la direction de son chef de projet, le professeur A. Andrén (SE).
Cette première édition de l'ISO 15163FIL 110 annule et remplace la FIL 110B:1997, qui a fait l'objet d'une
révision technique.La présente version corrigée de l'ISO 15163FIL 110:2012 incorpore les corrections suivantes:
l’expression «coagulant issu de bovin adulte» a été remplacée par «coagulant d’origine bovine», dans la
dernière phrase de l’Article 1; le terme «présure» a été remplacé par «coagulant d’origine bovine» en 4.11, 7.5.3, 7.6 et A.1.
© ISO et FIL 2012 – Tous droits réservés v---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 15163:2012(F)
FIL 110:2012(F)
Introduction
Les préparations à base de présure de veau et de coagulant issu de bovin adulte contiennent toutes deux
comme enzymes coagulantes de la chymosine et de la pepsine bovine en quantités variables. La proportion
de chymosine diminue par rapport à la pepsine dans la caillette (quatrième compartiment de l'estomac) en
fonction de l'âge du veau et au moment de son sevrage.Pour la production de coagulants d’origine bovine, le rapport des volumes de la caillette d'un bovin jeune et
d'un bovin âgé influence ainsi considérablement la composition de la chymosine et de la pepsine du
coagulant final. Plus le volume de la caillette des jeunes veaux nourris au lait est important, plus la proportion
[5][6]de chymosine est élevée, et inversement .
La chymosine et la pepsine présentent toutes deux des caractéristiques spéciales aussi bien en ce qui
concerne l'activité de coagulation du lait que l'utilisation en fromagerie. Par exemple, l'activité de coagulation
du lait de la pepsine dépend plus du pH que celle de la chymosine. Par ailleurs, la pepsine présente
également une activité protéolytique plus générale que celle de la chymosine.Par conséquent, il est très important d'analyser la teneur en chymosine et en pepsine en plus de la force
[6][7](activité totale de coagulation du lait) du coagulant d'origine bovine .
vi © ISO et FIL 2012 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 15163:2012(F)
NORME INTERNATIONALE
FIL 110:2012(F)
Lait et produits laitiers — Présure de veau et coagulant issu de
bovin adulte — Détermination des teneurs en chymosine et en
pepsine bovine par chromatographie
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de référence pour la détermination des quantités de
chymosine et de pepsine bovines présentes dans un échantillon pour essai de présure de veau et de
coagulant issu de bovin adulte. De plus, elle peut être utilisée pour des mélanges de présure de
veau/coagulant d’origine bovine contenant de la chymosine bovine produite par fermentation (FPC).
2 Références normativesLe document de référence suivant est indispensable pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).ISO 11815FIL 157:2007, Lait — Détermination de l'activité totale de coagulation du lait dans la présure de
bovins3 Principe
Dans un premier temps, l'échantillon de coagulant d'origine bovine est dessalé puis les enzymes chymosine
[8][9]et pepsine bovine sont séparées sur une colonne échangeuse d'anions . Dans un deuxième temps,
l'activité de coagulation du lait de chacune des deux enzymes séparées est déterminée selon
l'ISO 11815FIL 157 (lait reconstitué à pH 6,5). La composition enzymatique de l'échantillon de coagulant
d'origine bovine est exprimée soit en pourcentage d'activité de la chymosine et en pourcentage d'activité de la
pepsine de la somme des activités en unités internationales de coagulation du lait (IMCU) des deux
composants, soit en milligrammes par litre de chymosine active et en milligrammes par litre de pepsine active.
L'activité totale coagulante du lait du premier lot de poudre étalon de référence de présure de veau et du
premier lot de poudre étalon de référence de coagulant issu de bovin adulte a été établie une fois pour toutes
à 1 000 IMCU/g. Les préparations ultérieures d'étalons de référence doivent être effectuées d'après les
étalons de référence précédents (voir l'ISO 11815FIL 157).La présente Norme internationale spécifie une méthode manuelle de chromatographie d'échange d'anions et
une autre méthode automatique.Il s'agit d'une méthode de référence. Par conséquent, des modifications peuvent être apportées uniquement
s’il a été confirmé qu’elles donnent le même résultat et une répétabilité et une reproductibilité au moins aussi
élevées que celles obtenues avec la méthode normalisée originale. Toute modification apportée à la méthode
décrite dans la présente Norme internationale doit également être mentionnée dans le rapport d'essai (voir
Article 10).© ISO et FIL 2012 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 15163:2012(F)
FIL 110:2012(F)
4 Réactifs
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue ainsi que de l'eau
distillée ou déminéralisée ou de l'eau de pureté équivalente.® 1) ®
4.1 Résine, Fractogel EMD DEAE (M) (cat. Merck n° 1.16883) ou colonne pré-remplie de 1 ml Mono Q
(HR 5/5 ou 5/50 GL de GE Healthcare) ou résine équivalente.® ®
NOTE 1 Fractogel EMD DEAE (M) est une résine adaptée à la chromatographie manuelle et Mono Q convient à la
chromatographie automatique.® ®
NOTE 2 Si les résines Fractogel ou Mono Q sont remplacées par une autre résine, il peut s'avérer nécessaire de
changer les tampons en 4.12 et en conséquence de réévaluer la méthode.4.2 Pipérazine hexahydratée (C H N , 6H O).
4 10 2 2
4.3 Chlorure de sodium (NaCl).
4.4 Thymol, conservateur facultatif.
4.5 Hydroxyde de sodium (NaOH).
4.6 Solution d'acide chlorhydrique, c(HCl) = 1 mol/l.
4.7 Éthanol (C H OH), à au moins 96 % (fraction volumique).
2 5
4.8 Éthanol (C H OH), à environ 20 % (fraction volumique).
2 5
Ajouter 105 ml d'éthanol à 96 % (4.7) à 400 ml d'eau et mélanger. Si une filtration stérile est souhaitée, filtrer
l'eau avant de la mélanger avec l'éthanol.4.9 Urée, c(N H CO) = 8 mol/l.
2 4
Dissoudre 48 g d'urée dans de l'eau et compléter à 100 ml.
4.10 Boudin de dialyse, d'un diamètre d'environ 1 cm (Union Carbide) ou équivalent (facultatif).
NOTE La qualité du tube de dialyse n'est pas un paramètre critique.4.11 Colonnes de dessalement, Bio-Rad – Econopac 10DG (cat. n° 732-2010) ou équivalent (facultatif).
Utiliser soit le boudin de dialyse (4.10), soit les colonnes de dessalement pour dessaler le coagulant d'origine
bovine.1) Fractogel EMD DEAE (M) est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est
donnée à l'intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO ou la FIL approuvent ou
recommandent l'emploi exclusif du produit ainsi désigné.2) La colonne pré-remplie de 1 ml Mono Q est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette
information est donnée à l'intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO ou la FIL
approuvent ou recommandent l'emploi exclusif du produit ainsi désigné.3) Exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs du
présent document et ne signifie nullement que l'ISO ou la FIL approuvent ou recommandent l'emploi exclusif du produit
ainsi désigné.4) Bio–RAD - Econopac 10DG est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est
donnée à l'intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO ou la FIL approuvent ou
recommandent l'emploi exclusif du produit ainsi désigné.2 © ISO et FIL 2012 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 15163:2012(F)
FIL 110:2012(F)
4.12 Solutions tampons
4.12.1 Solution tampon I, pipérazine [(CH ) (NH) ], c[(CH ) (NH) ] = 0,025 mol/l.
2 4 2 2 4 2Peser 4,85 g de pipérazine (4.2) et 42,8 g de solution d'acide chlorhydrique (4.6) dans un bécher et mélanger.
Transférer quantitativement le contenu du bécher dans une fiole jaugée de 1 000 ml à un trait (5.5).
Compléter à 1 000 ml avec de l'eau et mélanger. Le pH doit être de 5,30 0,05. Si ce n'est pas le cas, ajuster
avec de la pipérazine ou de l'acide chlorhydrique. Avant toute utilisation, dégazer et conserver la solution
tampon comme indiqué en 4.12.5.4.12.2 Solution tampon II, c(NaCl) = 0,25 mol/l.
Peser 14,6 g de NaCl dans une fiole jaugée de 1 000 ml à un trait (5.5). Compléter à 1 000 ml avec la solution
tampon I (4.12.1) et mélanger. Ne pas ajuster le pH. Utiliser la solution tampon II uniquement pour la méthode
manuelle. Avant toute utilisation, dégazer et conserver la solution tampon comme indiqué en 4.12.5.
4.12.3 Solution tampon III, c(NaCl) = 0,50 mol/lPeser 29,2 g de NaCl dans une fiole jaugée de 1 000 ml à un trait (5.5). Compléter à 1 000 ml avec la solution
tampon I (4.12.1) et mélanger. Ne pas ajuster le pH. Utiliser la solution tampon III uniquement pour la
méthode manuelle. Avant toute utilisation, dégazer et conserver la solution tampon comme indiqué en 4.12.5.
4.12.4 Solution tampon IV, c(NaCl) = 1,0 mol/lPeser 58,4 g de NaCl dans une fiole jaugée de 1 000 ml à un trait (5.5). Compléter à 1 000 ml avec la solution
tampon I (4.12.1) et mélanger. Ne pas ajuster le pH. Avant toute utilisation, dégazer et conserver la solution
tampon comme indiqué en 4.12.5.4.12.5 Dégazage et conservation.
Avant toute utilisation, dégazer les solutions tampons I à IV (4.12.1 à 4.12.4) sous vide ou en utilisant un bain
à ultrasons. Conserver les solutions tampons I à IV en vue de les utiliser dans le cadre de la méthode
manuelle en ajoutant quelques cristaux de thymol. En ce qui concerne la conservation relative à la méthode
automatique, elle s'effectue par filtration stérile à l'aide d'un filtre de 0,2 µm.
Les solutions tampons I à IV peuvent être conservées pendant au moins 5 jours à température ambiante ou
2 mois au réfrigérateur.5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
5.1 Pompe péristaltique multicanaux ou toute autre pompe appropriée (pour la méthode manuelle
uniquement).5.2 pH-mètre, d'une sensibilité de 0,01 unité pH.
5.3 Colonne de chromatographie, d'environ 1,0 cm de diamètre et 10 cm de long, avec régulateur de
débit ou colonne équivalente adaptée à une hauteur de gel d'environ 5 cm (pour la méthode manuelle
uniquement).5.4 Agitateur magnétique.
[2]
5.5 Fioles jaugées à un trait, de capacités requises, ISO 1042 .
© ISO et FIL 2012 – Tous droits réservés 3
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 15163:2012(F)
FIL 110:2012(F)
® 5 ) ® 6 )
5.6 Appareil FPLC ÄKTA ou CLHP, adapté à l'objectif, utilisé uniquement pour la méthode
automatique.5.7 Matériel de laboratoire, pour la détermination du temps de coagulation (voir l'ISO 11815FIL 157).
6 ÉchantillonnageL'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Une
[1]méthode d'échantillonnage recommandée est indiquée dans l'ISO 707FIL 50 .
NOTE 1 L'échantillonnage du coagulant d'origine bovine liquide est décrit dans l'ISO 707FIL 50:2008, Article 9 et celui
du coagulant d'origine bovine en poudre dans l'ISO 707FIL 50:2008, Article 13.Il convient d'envoyer un échantillon représentatif au laboratoire. Il est recommandé qu'il n'ait pas été
endommagé ou modifié pendant le transport ou le stockage.NOTE 2 Les produits en poudre peuvent se séparer rapidement.
Conserver les échantillons à l'abri de la lumière, à une température comprise entre 0 °C et 5 °C.
7 Mode opératoire7.1 Contrôle
Avant la détermination, vérifier que le coagulant d'origine bovine ne contient pas d'enzymes coagulantes
d'origine non bovine en utilisant une méthode appropriée (voir l'Annexe A). Toutefois, ce contrôle peut être
omis si le coagulant d'origine bovine est connu pour contenir uniquement de la chymosine et de la pepsine
d'origine bovine.7.2 Préparation d'une nouvelle colonne de Fractogel
Après dégazage sous vide, verser une suspension de la résine Fractogel (4.1) prête à l'emploi, directement
depuis le flacon du fabricant, ou en utilisant un bain à ultrasons, dans la colonne (5.3), en position verticale et
orifice ouvert, jusqu'à ce que la couche de résine Fractogel déposée atteigne une hauteur de 4,5 cm à 5,5 cm.
La couche de gel ne doit pas sécher pendant toute la durée de l'opération.Fermer le tube de sortie. Immerger l'extrémité du tube d'entrée de la pompe péristaltique dans un bécher
contenant la solution tampon I (4.12.1). Raccorder le tube de l'adaptateur au tube de sortie de la pompe.
Ajuster le débit à (1,3 0,1) ml/min. Remplir le tube de l'adaptateur avec la solution tampon I (4.12.1) sans
dépasser le volume interne total du tube de 1,5 ml.Fermer la colonne avec l'adaptateur, conformément aux instructions du fabricant de la colonne. À l'aide de
l'adaptateur, comprimer la couche de gel de quelques millimètres pour éviter la formation d'espaces libres
au-dessus de la couche de gel. Éviter l'entrée de bulles d'air dans la colonne. Rincer la colonne avec la
solution tampon I (4.12.1) pendant 5 min à un débit de 1,3 ml/min.5) FPLC est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention des
utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO ou la FIL approuvent ou recommandent l'emploi
exclusif du produit ainsi désigné.6) ÄKTA est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention des
utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO ou la FIL approuvent ou recommandent l'emploi
exclusif du produit ainsi désigné.4 © ISO et FIL 2012 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 15163:2012(F)
FIL 110:2012(F)
7.3 Régénération et équilibrage de la résine Fractogel dans la colonne
Après préparation d'une nouvelle colonne et après chaque passage, régénérer et équilibrer la résine
Fractogel (4.1) présente dans la colonne en procédant comme suit.Régénérer la résine Fractogel présente dans la colonne à un débit de 1,3 ml/min en utilisant au moins 15 ml
de solution tampon IV (4.12.4) (environ 11,5 min). Équilibrer la colonne avec au moins 40 ml de solution
tampon I (4.12.1) (environ 30 min). La colonne est désormais prête à accueillir l'échantillon pour essai.
La même colonne peut être utilisée plus de 20 fois. En cas d'utilisations fréquentes, régénérer la colonne de
façon plus poussée en la rinçant avec du NaOH à 0,1 mol/l pendant 10 min puis avec de l'eau pendant 10 min.
Ensuite, suivre le mode opératoire normal de régénération et d'équilibrage décrit précédemment.
7.4 Stockage de la colonne de FractogelSi la colonne doit être stockée pendant plus d'une semaine, la rincer avec au moins 15 ml d'éthanol à
20 % (4.8) à l'aide de la pompe péristaltique (5.1). Stocker la colonne en veillant à ce que les tubes d'entrée et
de sortie soient hermétiquement fermés.La colonne peut être stockée pendant plusieurs mois à température ambiante et à l'abri de la lumière directe
du soleil.7.5 Préparation de l'échantillon pour essai
7.5.1 Généralités
Les échantillons liquides peuvent être utilisés tels quels; il suffit de procéder à 7.5.2.
Un échantillon de coagulant d'origine bovine en poudre est préparé de la façon suivante. Avant d'effectuer le
dessalement, dissoudre un échantillon de coagulant d'origine bovine en poudre de façon à obtenir, par
exemple, 200 IMCU/ml, dans une quantité appropriée de solution tampon I (4.12.1) ou en utilisant une
solution tampon à pH 5,5 (voir l'ISO 11815FIL 157).Avant d'effectuer le dessalement, déterminer le temps de coagulation de l'échantillon de coagulant d'origine
bovine reconstitué conformément à l'ISO 11815FIL 157. Faire une estimation approximative de la force de
l'échantillon, en IMCU/ml, en le mesurant par rapport à l'étalon de référence de présure de veau, cela afin de
déterminer la quantité d'échantillon à appliquer sur la colonne (7.6.1 ou 7.6.2).
Si les résultats sont exprimés en milligrammes par litre, déterminer au moins deux fois le temps de
coagulation de l'échantillon de coagulant d'origine bovine, conformément à l'ISO 11815FIL 157. Dans ce cas,
mesurer les temps de coagulation simultanément ou dans une succession rapide, «avant» et «après» le
dessalement.Avant d'appliquer l'échantillon pour essai sur la colonne, le dessaler par dialyse (7.5.2) ou par filtration sur gel
(7.5.3).7.5.2 Dessalement par dialyse
Immerger le boudin de dialyse (4.10) dans de l'eau bouillante pendant environ 5 min et rincer l'intérieur et
l'extérieur du boudin avec de l'eau.Dialyser 5 ml de l'échantillon pour essai préparé (7.5) (environ 900 IMCU) avec 500 ml de solution tampon I
(4.12.1) à 4 °C pendant au moins 5 h, mais pas au-delà de 20 h. Comprimer fermement le boudin de dialyse à
la main pour le fermer, afin de réduire la dilution qui se produit au cours de la dialyse. Pendant la dialyse,
agiter le tampon avec un agitateur magnétique (5.4).© ISO et FIL 2012 – Tous droits réservés 5
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 15163:2012(F)
FIL 110:2012(F)
Si les résultats sont exprimés en milligrammes par litre, déterminer au moins deux fois le temps de
coagulation de l'échantillon de coagulant d'origine bovine dialysé, conformément à l'ISO 11815FIL 157.
7.5.3 Dessalement par filtration sur gelSuivre les instructions du fabricant.
Équilibrer la colonne de dessalement (4.11) avec la solution tampon I (4.12.1). Appliquer 3,3 ml d'échantillon
pour essai préparé (7.5) sur la colonne. Éluer l'échantillon avec 4,0 ml de solution tampon I (4.12.1).
Dans le cas d'échantillons pour essai contenant une petite quantité de chymosine ou de pepsine, il est parfois
nécessaire d'effectuer deux fois le mode opératoire susmentionné, afin que l'activité soit suffisante pour
pouvoir déterminer correctement le composant en faible quantité.Si les résultats sont exprimés en milligrammes par litre, déterminer au moins deux fois le temps de
coagulation de l'échantillon de coagulant d'origine bovine filtré sur gel, conformément à l'ISO 11815FIL 157.
7.5.4 Durée de vie de la colonneAfin de prolonger la durée de vie des colonnes et pour éviter qu'elles ne s'encrassent, le mode opératoire
suivant est recommandé pour le nettoyage régulier des colonnes de dessalement.Après chaque jour d'utilisation, rincer toute la colonne dans de l'eau du robinet ou distillée propre. Appliquer
environ 5 ml d'urée à 8 mol/l sur la colonne et purger. Rincer une fois la colonne dans de l'eau du robinet et
l'équilibrer en laissant couler un volume normal de retenue de solution tampon I (4.12.1) dans la colonne.
Stocker les colonnes équilibrées dans un endroit frais et de façon qu'une partie du tampon se trouve au-
dessus de la surface du gel. Pour un stockage de longue durée, il est recommandé de stocker la colonne
dans un tampon ou de l'eau distillée et d'ajouter un conservateur (voir les instructions du fabricant). En suivant
ce mode opératoire, chaque colonne peut être utilisée pendant deux ans ou jusqu'à ce que son débit réduise
considérablement.7.6 Analyse du coagulant d'origine bovine dessalé
7.6.1 Séparation de la chymosine et de la pepsine avec une colonne ordinaire — Méthode manuelle
Aprè...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.