ISO 3890-2:2000
(Main)Milk and milk products — Determination of residues of organochlorine compounds (pesticides) — Part 2: Test methods for crude extract purification and confirmation
Milk and milk products — Determination of residues of organochlorine compounds (pesticides) — Part 2: Test methods for crude extract purification and confirmation
Lait et produits laitiers — Détermination des résidus de composés organochlorés (pesticides) — Partie 2: Méthodes d'essai pour la purification des extraits bruts et tests de confirmation
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STANDARD 3890-2
First edition
2000-08-01
Milk and milk products — Determination of
residues of organochlorine compounds
(pesticides) —
Part 2:
Test methods for crude extract purification
and confirmation
Lait et produits laitiers — Détermination des résidus de composés
organochlorés (pesticides) —
Partie 2: Méthodes d'essai pour la purification des extraits bruts et tests de
confirmation
Reference number
ISO 3890-2:2000(E)
©
ISO 2000
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ISO 3890-2:2000(E)
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ii © ISO 2000 – All rights reserved
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ISO 3890-2:2000(E)
Contents Page
Foreword.v
1 Scope .1
2 Normative reference .1
3 Method A: Liquid-liquid partitioning with acetonitrile and clean-up on a Florisil column
(see reference [3]).1
3.1 Principle.1
3.2 Reagents.1
3.3 Apparatus .3
3.4 Procedure .3
3.5 Gas chromatography.4
4 Method B: Liquid-liquid partitioning with dimethylformamide (DMF) and clean-up on an
alumina column (see references [4], [5]) .4
4.1 Principle.4
4.2 Reagents.4
4.3 Apparatus .5
4.4 Procedure .5
4.5 Gas chromatography.6
5 Method C: Liquid-liquid partitioning with dimethylformamide (DMF) and clean-up on a Florisil
column (see reference [6]).6
5.1 Principle.6
5.2 Reagents.6
5.3 Apparatus .7
5.4 Procedure .7
5.5 Gas chromatography.8
6 Method D: Column chromatography on aluminium oxide of precisely defined activity
(see reference [7]).8
6.1 Principle.8
6.2 Reagents.8
6.3 Apparatus .9
6.4 Procedure .9
6.5 Gas chromatography.10
7 Method E: Column chromatography on alumina column (see reference [8]).10
7.1 Principle.10
7.2 Reagents.10
7.3 Apparatus .11
7.4 Procedure .11
7.5 Gas chromatography.12
8 Method F: Column chromatography on partially deactivated Florisil
(see references [9], [10], [11]).12
8.1 Principle.12
8.2 Reagents.12
8.3 Apparatus .12
8.4 Procedure .13
8.5 Gas chromatography.14
9 Method G: Column chromatography on partially deactivated silica gel (see reference [12]).14
9.1 Principle.14
9.2 Reagents.14
9.3 Apparatus .14
© ISO 2000 – All rights reserved iii
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ISO 3890-2:2000(E)
9.4 Procedure .15
9.5 Gas chromatography.16
10 Method H: Gel-permeation chromatography .16
10.1 Principle.16
10.2 Reagents.16
10.3 Apparatus .16
10.4 Procedure .17
10.5 Gas chromatography.17
11 Confirmatory tests and additional clean-up procedure.17
11.1 Confirmatory test A: Determination of organochlorine compounds with glass-capillary gas
chromatography (see references [14], [15], [16]) .17
11.2 Confirmatory test B: Thin-layer chromatography of organochlorine compounds
(see reference [9]).19
11.3 Confirmatory test C: Chemical modifications (see references [17], [18], [19], [20], [21]).21
11.4 Confirmatory test D: Photochemical modifications (see reference [22]) .25
12 Additional clean-up procedure.25
12.1 Principle.26
12.2 Reagents.26
12.3 Apparatus .26
12.4 Procedure .26
Bibliography .27
iv © ISO 2000 – All rights reserved
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ISO 3890-2:2000(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this part of ISO 3890 may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
International Standard ISO 3890-2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Agricultural food products,
Subcommittee SC 5, Milk and milk products, in collaboration with the International Dairy Federation (IDF) and
AOAC International, and will also be published by these organizations.
ISO 3890 consists of the following parts, under the general title Milk and milk products — Determination of residues
of organochlorine compounds (pesticides):
— Part 1: General considerations and extraction methods
— Part 2: Test methods for crude extract purification and confirmation
© ISO 2000 – All rights reserved v
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 3890-2:2000(E)
Milk and milk products — Determination of residues of
organochlorine compounds (pesticides) —
Part 2:
Test methods for crude extract purification and confirmation
WARNING — The use of this part of ISO 3890 may involve hazardous materials, operations and equipment.
This standard does not purport to address all the safety problems associated with its use. It is the
responsibility of the user of this standard to establish safety and health practices and determine the
applicability of regulatory limitations prior to use.
1 Scope
This part of ISO 3890 specifies test methods for the purification of the crude extracts obtained by the general
methods given in ISO 3890-1. It also gives recommended methods for the determination of the residues of
organochlorine compounds in milk and milk products, together with confirmatory tests and clean-up procedures.
2 Normative reference
The following normative document contains provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this part of ISO 3890. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, this publication do not
apply. However, parties to agreement based on this part of ISO 3890 are encouraged to investigate the possibility
of applying the most recent edition of the normative document indicated below. For undated references, the latest
edition of the normative document referred to applies. Members of ISO and IEC maintain registers of currently valid
International Standards.
ISO 3890-1:2000, Milk and milk products — Determination of residues of organochlorine compounds (pesticides) —
Part 1: General considerations and extraction methods.
3 Method A: Liquid-liquid partitioning with acetonitrile and clean-up on a Florisil
column (see reference [3])
3.1 Principle
The organochlorine compounds, together with the fat, are extracted from the sample by one of the procedures
described in ISO 3890-1. The extract is concentrated almost to dryness, then redissolved in light petroleum and the
organochlorine compounds are partitioned into acetonitrile. After mixing the acetonitrile with an excess of water, the
organochlorine compounds are partitioned into light petroleum. This organic phase is purified chromatographically
on a Florisil column using light petroleum/diethyl ether as eluting solvent. The eluates are concentrated then
examined by GLC.
A special method is described for cheese.
3.2 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and distilled or demineralized water
or water of equivalent purity.
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ISO 3890-2:2000(E)
3.2.1 Light petroleum, boiling range 40�Cto60�C.
Distil over potassium hydroxide or sodium hydroxide pellets.
3.2.2 Acetonitrile (CH CN), saturated with light petroleum.
3
To purify, mix 4 l of acetonitrile with 1 ml of orthophosphoric acid and 30 g of phosphorus pentoxide in a round-
bottomed glass flask. Add glass beads and distil at a temperature of between 81 �C and 82 �C. Do not allow the
temperature to exceed 82�C.
Mix the purified acetonitrile with light petroleum until phase separation just occurs.
3.2.3 Diethyl ether (C H OC H ), peroxide-free.
2 5 2 5
Distil and stabilize with 2,0 % of its volume of absolute ethanol (C H OH).
2 5
3.2.4 Eluting solvent A: mixture of diethyl ether (3.2.3) and light petroleum (3.2.1) (6:94 by volume).
Dry over 10 g to 25 g of anhydrous sodium sulfate (3.2.6).
3.2.5 Eluting solvent B: mixture of diethyl ether (3.2.3) and light petroleum (3.2.1) (15:85 by volume).
Dry over 10 g to 25 g of anhydrous sodium sulfate (3.2.6).
3.2.6 Sodium sulfate (Na SO ), granular, anhydrous.
2 4
Heat at 500�C� 25 °C for 4 h. Cool and store in a stoppered bottle.
1)
3.2.7 Adsorbent: Florisil (Floridin Co ), 60 to 100 mesh.
Activate by heating at 650�C� 25 °C for 4 h and immediately pour the adsorbent into well-stoppered bottles and
store in the dark. Before use, heat to 130�C for at least 5 h.
The adsorbent should be stored either at 130�C� 2 °C or at room temperature in a desiccator. In the latter case it
should, however, be heated to 130�C� 2 °C every 2 days.
Each batch of adsorbent should be checked from time to time as follows.
Pass 1 ml of a standard hexane solution containing 0,1 mg/l of lindane, heptachlor epoxide, aldrin and dieldrin, and
0,3 mg/l of endrin through the adsorption column (see ISO 3890-1:2000, 9.3). Elute and concentrate as described
in 3.4.3. Determine by gas chromatography.
The adsorbent is satisfactory if lindane, heptachlor, aldrin and heptachlor epoxide are found quantitatively in the
eluting solvent A (3.2.4) and dieldrin and endrin in the eluting solvent B (3.2.5).
3.2.8 Sodium chloride solution (NaCl), 2 % solution.
Heat solid sodium chloride at 500�C� 25 °C for 4 h before making up the solution.
3.2.9 Ethanol (C H OH), absolute.
2 5
3.2.10 Sodium oxalate (Na C O )or potassium oxalate (K C O )
2 2 4 2 2 4
1) Floridin Co is an example of suitable a product available commercially. This information is given for the convenience of
users of this part of ISO 3890 and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
2 © ISO 2000 – All rights reserved
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ISO 3890-2:2000(E)
3.3 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
3.3.1 Chromatographic columns, of internal diameter 20 mm and length 300 mm, and with PTFE stopcocks
and sintered glass discs or glass wool plugs.
2)
3.3.2 Rotary evaporator (Kuderna-Danish or equivalent), with flask of capacity 500 ml, and with graduated
tube attached.
3.3.3 High-speed blender
3.3.4 Separating funnels, of capacities 125 ml and 1 000 ml.
3.4 Procedure
3.4.1 Extraction of fat and organochlorine compounds
3.4.1.1 General methods.
See ISO 3890-1:2000, annex A.
3.4.1.2 Special method for cheese
Place enough diced sample (to provide 3 g of fat), about 2 g of sodium or potassium oxalate (3.2.10) and 100 ml of
ethanol (3.2.9) in a high-speed blender (3.3.3) and blend for 2 min to 3 min. (If experience with the product
indicates that emulsions will not be broken by centrifuging, add 1 ml of water per 2 g of sample before blending.)
Pour the homogenized slurry into a 500 ml centrifuge bottle, add 50 ml of diethyl ether (3.2.3), and shake
vigorously for 1 min. Add 50 ml of light petroleum (3.2.1) and shake vigorously for 1 min to 2 min (or divide between
two 250 ml bottles and extract each by shaking vigorously for 1 min to 2 min with 25 ml of light petroleum. Proceed
as in ISO 3890-1:2000, A.6.3.3.
3.4.2 Liquid-liquid partitioning
Weigh, to the nearest 0,01 g, 1 g to 3 g of the extracted fat into a 125 ml separating funnel (3.3.4) and dissolve in
15 ml of light petroleum (3.2.1). Add 30 ml of acetonitrile saturated with light petroleum (3.2.2) and shake vigorously
for 1 min to 2 min. After phase separation, run the lower acetonitrile layer into a 1 000 ml separating funnel (3.3.4)
containing 700 ml of sodium chloride solution (3.2.8) and 100 ml of light petroleum (3.2.1). Vigorously shake the
light petroleum layer left in the 125 ml separating funnel three times with 30 ml portions of the acetonitrile (3.2.2).
Combine the acetonitrile extracts in the 1 000 ml separating funnel and then shake carefully. Drain the lower,
aqueous phase into a second 1000 ml separating funnel and shake it for 12 s with 100 ml of light petroleum.
Combine the light petroleum phases from the two 1 000 ml separating funnels. Wash twice with 100 ml portions of
water or the sodium chloride solution (3.2.8). Dry over sodium sulfate (3.2.6) and filter into the 500 ml rotary
evaporator flask (3.3.2) with attached graduated tube. Rinse the sodium sulfate three times with 10 ml portions of
light petroleum (3.2.1). Then concentrate the light petroleum solution to 10 ml using the rotary evaporator (3.3.2).
3.4.3 Clean-up on Florisil
Add to a chromatographic column (3.3.1) a 100 mm layer of adsorbent (3.2.7). Cover with a 10 mm layer of sodium
sulfate (3.2.6) and rinse with 40 ml to 50 ml of light petroleum (3.2.1). Pipette 10 ml of the light petroleum
concentrate (3.4.2) onto the column (3.3.1), rinsing the container twice with approximately 5 ml portions of light
petroleum. Elute into an evaporator flask (3.3.2) with attached graduated tube, using 200 ml of the eluting solvent A
(3.2.4). The elution rate should not exceed 5 ml/min. Change the receivers and elute in the same way using 200 ml
of the eluting solvent B (3.2.5).
2) Kuderna-Danish is an example of suitable equipment available commercially. This information is given for the convenience
of users of this part of ISO 3890 and does not constitute an endorsement by ISO of this equipment.
© ISO 2000 – All rights reserved 3
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ISO 3890-2:2000(E)
Concentrate the two eluates separately to the required small volume using the rotary evaporator (3.3.2). Examine
each eluate by GLC. Should further purification be necessary, this can be carried out on a second, freshly prepared
adsorbent column or as in ISO 3890-1:2000, annex A.
The first eluate contains any HCB, the HCH isomers, heptachlor, heptachlor epoxide, aldrin, DDE, TDE and DDT.
The second eluate contains dieldrin and endrin.
3.5 Gas chromatography
See ISO 3890-1:2000, 6.2. For preliminary tests, etc., see ISO 3890-1:2000, clauses 10 to 14.
4 Method B: Liquid-liquid partitioning with dimethylformamide (DMF) and clean-up on
an alumina column (see references [4], [5])
4.1 Principle
The organochlorine compounds, together with the fat, are extracted from the test sample by the procedure
described in ISO 3890-1:2000, clause A.6, then the residues are partitioned with dimethylformamide. After addition
of sodium sulfate solution, the organochlorine compounds are further partitioned into n-hexane. The organic phase
is purified by chromatography on neutral aluminium oxide using n-hexane as the eluting solvent. The eluate is
concentrated then examined by GLC.
Special methods are described for milk and butter.
4.2 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and distilled or demineralized water
or water of equivalent purity.
4.2.1 n-Hexane [CH (CH ) CH ], boiling range 68�Cto70�C.
3 2 4 3
Examine for gas chromatographic purity under working column conditions. Distil over potassium hydroxide, if
necessary.
4.2.2 Acetone (CH COCH ), general-purpose, reagent grade.
3 3
4.2.3 Dimethylformamide (DMF)
Examine an n-hexane extract of a dilute aqueous solution for interference peaks by GLC. Redistil the solvent, if
necessary, and collect the fraction with boiling range 152�Cto154�C.
4.2.4 n-Hexane, saturated with dimethylformamide.
4.2.5 Dimethylformamide, saturated with n-hexane.
4.2.6 Sand, acid washed.
Heat at 500�C for 4 h, then cool and store in a stoppered bottle.
4.2.7 Sodium sulfate (Na SO ), granular, anhydrous.
2 4
Heat at 500�C for 4 h, then cool and store in a stoppered bottle.
4.2.8 Aluminium oxide (Al O ), neutral, activated.
2 3
4 © ISO 2000 – All rights reserved
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ISO 3890-2:2000(E)
Heat aluminium oxide to 500�C for 4 h, then cool. Carefully add 7 parts of water to 93 parts of aluminium oxide
(mass fraction) and mix the solid thoroughly in a closed vessel for at least 90 min. Keep the vessel well stoppered
and use the aluminium oxide within 10 days.
4.2.9 Sodium sulfate solution, 2 % solution.
4.3 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
4.3.1 Soxhlet extraction apparatus
2)
4.3.2 Rotary evaporator (Kuderna-Danish or equivalent), with flask of capacity 500 ml, and with graduated
tube attached.
4.3.3 High-speed blender
4.3.4 Chromatographic columns, of internal diameter 12 mm and length 300 mm, with PTFE stopcocks.
3)
4.3.5 Micro-Snyder columns
4.4 Procedure
4.4.1 Extraction of fat and organochlorine compounds
4.4.1.1 General methods
See ISO 3890-1:2000, annex A.
4.4.1.2 Special methods
a) Milk
Transfer in the following order, 40 ml of well-mixed milk, 80 ml of acetone (4.2.2) and 80 ml of n-hexane (4.2.1)
to a 250 ml vortex beaker. Homogenize the mixture for 3 min. Transfer it immediately to a 250 ml centrifuge
tube, washing the mixer blades with 10 ml of n-hexane, then with 5 ml of water, and add the washings to the
tube.
–1
Spin the tube in a centrifuge at a rotational frequency of 2 500 min for 5 min. Separate the n-hexane solvent
layer and pass it through a short column of anhydrous sodium sulfate (4.2.7). Wash the contents of the tube
with two successive 25 ml portions of n-hexane and run the washings through the column. Reduce the
combined extracts to about 15 ml in the rotary evaporator (4.3.2). Transfer the solution to a 100 ml separating
funnel graduated at 25 ml and adjust the volume to 25 ml. [See also method E, 7.4.1.2 b) for milk.]
b) Butter
Dissolve 5 g of clarified butterfat (melted and decanted through a filter) in 10 ml of n-hexane. Transfer the
solution to a 100 ml separating funnel using three successive 5 ml portions of n-hexane.
4.4.2 DMF-partitioning of fat and organochlorine compounds
Extract the fat from the 25 ml of hexane solution (4.4.1) with 10 ml of dimethylformamide (DMF) saturated with n-
hexane (4.2.5), by shaking in a separating funnel. After 2 min to 3 min, run the lower DMF layer into a second
3) Micro-Snyder is an example of suitable equipment available commercially. This information is given for the convenience of
users of this part of ISO 3890 and does not constitute an endorsement by ISO of this equipment.
© ISO 2000 – All rights reserved 5
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ISO 3890-2:2000(E)
100 ml separating funnel (retaining any interfacial emulsion in the first separating funnel). Repeat the extraction of
the n-hexane solution with two further 10 ml portions of DMF (4.2.5). Combine the DMF extracts and wash them
with 10 ml of n-hexane saturated with DMF (4.2.4).
Separate the 10 ml of n-hexane and wash with a further 10 ml of DMF (4.2.5). Reject the n-hexane and add the
washings to the original 30 ml of DMF extract in a 500 ml (or preferably 350 ml) separating funnel. Add 6 ml of
n-hexane (4.2.1) and shake vigorously for 2 min with 200 ml of sodium sulfate solution (4.2.9).
Allow to stand for 20 min to separate. Collect the n-hexane phase by gentle swirling. Drain the aqueous layer to
waste, dry the separating funnel with filter paper and drain the n-hexane into a graduated tube with a ground-glass
neck which will hold 15 ml of solvent. Rinse the separating funnel with small quantities of n-hexane and add these
to the tube.
Fit the tube with a micro-Snyder column (4.3.5) and concentrate the n-hexane extract to about 2 ml.
4.4.3 Clean-up on aluminium oxide with n-hexane
Pour a slurry of 5 g of prepared aluminium oxide (4.2.8) in n-hexane (4.2.1) into a chromatographic column (4.3.4)
containing a solvent-washed cotton wool plug (ISO 3890-1:2000, A.5.15). Allow the aluminium oxide to settle and
cover it with a 30 mm layer of anhydrous sodium sulfate (4.2.7). Drain the n-hexane until the meniscus reaches the
top of the sodium sulfate layer. Add the n-hexane extract (4.4.2) and wash into the column with 2 ml portions of
n-hexane.
Elute at a flow r
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 3890-2
Première édition
2000-08-01
Lait et produits laitiers — Détermination
des résidus de composés organochlorés
(pesticides) —
Partie 2:
Méthodes d’essai pour la purification des
extraits bruts et tests de confirmation
Milk and milk products — Determination of residues of organochlorine
compounds (pesticides) —
Part 2: Test methods for crude extract purification and confirmation
Numéro de référence
ISO 3890-2:2000(F)
©
ISO 2000
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ISO 3890-2:2000(F)
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ISO 3890-2:2000(F)
Sommaire Page
Avant-propos.v
1 Domaine d'application.1
2Référence normative .1
3Méthode A: Séparation liquide-liquide à l'aide d'acétonitrile et purification sur colonne de
Florisil (voir référence [3]).1
3.1 Principe.1
3.2 Réactifs .2
3.3 Appareillage .3
3.4 Mode opératoire.3
3.5 Chromatographie en phase gazeuse.4
4Méthode B: Séparation liquide-liquide à l'aide de diméthylformamide (DMF) et purification sur
colonne d'alumine (voir références [4� et [5�) .4
4.1 Principe.4
4.2 Réactifs .4
4.3 Appareillage .5
4.4 Mode opératoire.5
4.5 Chromatographie en phase gazeuse.6
5Méthode C: Séparation liquide-liquide à l'aide de diméthylformamide (DMF) et purification sur
colonne de Florisil (voir référence [6]) .7
5.1 Principe.7
5.2 Réactifs .7
5.3 Appareillage .7
5.4 Mode opératoire.8
5.5 Chromatographie en phase gazeuse.8
6Méthode D: Chromatographie sur colonne d'oxyde d'aluminium d'activité définie avec
précision (voir référence [7]) .8
6.1 Principe.8
6.2 Réactifs .9
6.3 Appareillage .10
6.4 Mode opératoire.10
6.5 Chromatographie en phase gazeuse.11
7Méthode E: Chromatographie sur colonne d'oxyde d'aluminium (voir référence [8]) .11
7.1 Principe.11
7.2 Réactifs .11
7.3 Appareillage .12
7.4 Mode opératoire.12
7.5 Chromatographie en phase gazeuse.13
8Méthode F: Chromatographie sur colonne de Florisil partiellement désactivé
(voir références [9], [10], [11]).13
8.1 Principe.13
8.2 Réactifs .13
8.3 Appareillage .13
8.4 Mode opératoire.14
8.5 Chromatographie en phase gazeuse.15
9Méthode G: Chromatographie sur colonne de gel de silice partiellement désactivé
(voir référence [12]).15
9.1 Principe.15
9.2 Réactifs .15
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ISO 3890-2:2000(F)
9.3 Appareillage.16
9.4 Mode opératoire .16
9.5 Chromatographie en phase gazeuse .17
10 Méthode H: Chromatographie par perméation de gel.17
10.1 Principe.17
10.2 Réactifs .17
10.3 Appareillage.18
10.4 Mode opératoire .18
10.5 Chromatographie en phase gazeuse .18
11 Tests de confirmation et procédé supplémentaire de purification.19
11.1 Test de confirmation A: Dosage des composés organochlorés par chromatographie en phase
gazeuse sur colonne capillaire (voir références [14], [15], [16]) .19
11.2 Test de confirmation B: Chromatographie en couche mince des composés organochlorés
(voir référence [9]).20
11.3 Test de confirmation C: Modifications chimiques (voir références [17], [18], [19], [20], [21]).23
11.4 Test de confirmation D: Modifications photochimiques (voir référence �22�) .27
12 Procédé supplémentaire de purification .27
12.1 Principe.27
12.2 Réactifs .27
12.3 Appareillage.28
12.4 Mode opératoire .28
Bibliographie .29
iv © ISO 2000 – Tous droits réservés
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ISO 3890-2:2000(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiéeaux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude aledroit de faire partie ducomité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 3.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments delaprésente partie de l’ISO 3890 peuvent faire
l’objet de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
La Norme internationale ISO 3890-2 a étéélaboréepar le comité technique ISO/TC 34, Produits agricoles
alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers, en collaboration avec la Fédération internationale de
laiterie (FIL) et l'AOAC International (Association des chimistes analytiques officiels); elle sera également publiée
par ces deux organisations.
L'ISO 3890 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Lait et produits laitiers —
Détermination des résidus de composés organochlorés (pesticides):
— Partie 1: Considérations générales et méthodes d'extraction
— Partie 2: Méthodes d'essai pour la purification des extraits bruts et tests de confirmation
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NORME INTERNATIONALE ISO 3890-2:2000(F)
Lait et produits laitiers — Détermination des résidus de composés
organochlorés (pesticides) —
Partie 2:
Méthodes d'essai pour la purification des extraits bruts et tests de
confirmation
AVERTISSEMENT — L’utilisation de la présente partie de l’ISO 3890 peut impliquer l’emploi de produits,
d’opérations et d’équipements à caractère dangereux. La présente partie de l’ISO 3890 ne prétend pas
aborder tous les problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à
l’utilisateur d’établir des pratiques appropriées en matière d’hygiène et de sécurité,et des’assurer du
respect delaréglementation nationale en vigueur.
1 Domaine d'application
La présente partiedel'ISO3890spécifie des méthodes d'essai pour la purification des extraits bruts obtenus avec
les méthodes générales données dans l'ISO 3890-1. Elle donne également des méthodes recommandées pour la
détermination des résidus de composés organochlorés dans le lait et les produits laitiers ainsi que des tests de
confirmation et des techniques de purification.
2Référence normative
Le document normatif suivant contient des dispositions qui, par suite de la référence qui y est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente partie de l'ISO 3890. Pour les références datées, les amendements
ultérieurs ou les révisions de ces publications ne s’appliquent pas. Toutefois, les parties prenantes aux accords
fondés sur la présente partie de l'ISO 3890 sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer l’édition la plus
récente du document normatif indiqué ci-après. Pour les références non datées, la dernière édition du document
normatif en référence s’applique. Les membres de l'ISO et de la CEI possèdent le registre des Normes
internationales en vigueur.
ISO 3890-1:2000, Lait et produits laitiers — Détermination des résidus de composés organochlorés (pesticides) —
Partie 1: Considérations générales et méthodes d'extraction.
3Méthode A: Séparation liquide-liquide à l'aide d'acétonitrile et purification sur
colonne de Florisil (voir référence [3])
3.1 Principe
Extraction des composés organochlorésainsi quedela matière grasse d'un échantillon par l'une des méthodes
décrites dans l'ISO 3890-1. Concentration de l'extrait presque jusqu'à sec, puis dissolution dans l'éther de pétrole
et séparation des composés organochlorés dans l'acétonitrile. Aprèsmélange de l'acétonitrile avec un excèsd'eau,
séparation des composés organochlorés dans l'éther de pétrole. Purification de la phase organique par
chromatographie sur une colonne de Florisil en utilisant comme éluant un mélange d'éther de pétrole et d'oxyde
d’éthyle. Concentration des éluats pour examen par chromatographie en phase gazeuse.
Une méthode particulière est décrite pour les échantillons de fromage.
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ISO 3890-2:2000(F)
3.2 Réactifs
Sauf indication différente, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l'eau distilléeou
déminéralisée, ou de l'eau de puretééquivalente.
3.2.1 Éther de pétrole, ayant un point d'ébullition compris entre 40 °Cet60 °C.
Distiller sur pastilles d'hydroxyde de potassium ou de sodium.
3.2.2 Acétonitrile (CH CN), saturé d'éther de pétrole.
3
Pour la purification, mélanger 4 l d'acétonitrile avec 1 ml d'acide orthophosphorique et 30 g de pentoxyde de
phosphore dans un ballon en verre à fond rond. Ajouter des billes en verre et distiller à une température comprise
entre 81 °Cet82 °C. La température ne doit pas dépasser 82 °C.
Mélanger l'acétonitrile avec suffisamment d'éther de pétrole pour qu'une séparation des phases se produise.
3.2.3 Oxyde d’éthyle (C H OC H ), exempt de peroxydes.
2 5 2 5
Distiller et stabiliser avec 2,0 % de son volume d'éthanol absolu (C H OH).
2 5
3.2.4 Solvant d'élution A: mélange d’oxyde d’éthyle (3.2.3) et d’éther de pétrole (3.2.1) (6:94 en volume).
Sécher sur 10 g à 25 g de sulfate de sodium anhydre (3.2.6).
3.2.5 Solvant d'élution B: mélange d’oxyde d’éthyle (3.2.3) et d’éther de pétrole (3.2.1) (15:85 en volume).
Sécher sur 10 g à 25 g de sulfate de sodium anhydre (3.2.6).
3.2.6 Sulfate de sodium (Na SO ), en granulés, anhydre.
2 4
Chauffer à 500 °C � 25 °C pendant 4 h. Laisser refroidir et conserver dans un flacon bouché.
1)
3.2.7 Adsorbant: Florisil (Floridin Co ), 60 mesh à 100 mesh.
Activer l'adsorbant par chauffage à 650 °C� 25 °C pendant 4 h, le verser immédiatement dans des flacons bien
bouchés et le conserver dans l'obscurité. Avant usage, chauffer à 130 °C pendant au moins 5 h.
Il convient de conserver l'adsorbant soit à 130 °C � 2 °C, soit à la température ambiante dans un dessiccateur.
Dans ce dernier cas, cependant, il est recommandé de le chauffer à 130 °C � 2 °C tous les 2 jours.
Il convient que chaque lot d'adsorbant soit contrôlé de temps en temps de la façon suivante.
Faire passer 1 ml d'une solution hexanique étalon contenant 0,1 mg/l de lindane, d’heptachlore époxyde, d'aldrine
et de dieldrine et 0,3 mg/l d'endrine à travers la colonne d'absorption (voir l’ISO 3890-1:2000, 9.3). Éluer et
concentrer comme décrit en 3.4.3. Déterminer la récupération par chromatographie en phase gazeuse.
L'adsorbant est satisfaisant si le lindane, l'heptachlore, l'aldrine et l'heptachlore époxyde sont trouvés
quantitativement dans le solvant d'élution A (3.2.4) et la dieldrine et l'endrine dans le solvant d'élution B (3.2.5).
3.2.8 Chlorure de sodium (NaCl), solution aqueuse à 2%.
Chauffer le chlorure de sodium à 500 °C � 25 °C pendant 4 h avant de préparer la solution.
1) Floridine Co est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention des
utilisateurs de la présente partie de l'ISO 3890 et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du
produit ainsi désigné.
2 © ISO 2000 – Tous droits réservés
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ISO 3890-2:2000(F)
3.2.9 Éthanol (C H OH), absolu.
2 5
3.2.10 Oxalate de sodium (Na C O )ou oxalate de potassium (K C O ).
2 2 4 2 2 4
3.3 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
3.3.1 Colonnes de chromatographie, ayant un diamètre intérieur de 20 mm et une longueur de 300 mm,
munies de robinets en PTFE et de disques en verre fritté ou de tampons de laine de verre.
2)
3.3.2 Évaporateur rotatif (appareil de Kuderna-Danish ou équivalent), avec fiole d’évaporation de 500 ml de
capacité,etreliéà un tube gradué.
3.3.3 Mélangeur à grande vitesse.
3.3.4 Ampoules à décanter, ayant une capacité de 125 ml et 1 000 ml.
3.4 Mode opératoire
3.4.1 Extraction de la matière grasse et des composés organochlorés
3.4.1.1 Méthodes générales
Voir l'ISO 3890-1:2000, annexe A.
3.4.1.2 Méthode particulière pour le fromage
Placer dans un mélangeur à grande vitesse (3.3.3) une quantité suffisante d'échantillon coupé en morceau (pour
obtenir 3 g de matière grasse), 2 g environ d'oxalate de sodium ou d'oxalate de potassium (3.2.10) et 100 ml
d'éthanol (3.2.9) et mélanger pendant 2 min à 3min.(Si,par expérience, on sait qu'avec tel ou tel type de produit
les émulsions ne sont pas cassées par la centrifugation, ajouter 1 ml d'eau pour 2 g d'échantillon avant de
mélanger.) Verser la suspension homogénéisée dans un flacon à centrifuger de 500 ml, ajouter 50 ml d'oxyde
d’éthyle (3.2.3) et secouer vigoureusement pendant 1 min. Ajouter 50 ml d'éther de pétrole (3.2.1) et secouer
vigoureusement pendant 1 min à 2min (ou répartir le mélange dans deux flacons de 250 ml et extraire chacun par
agitation vigoureuse pendant 1 min à 2 min avec 25 ml d'éther de pétrole). Procéder comme décrit dans
l'ISO 3890-1:2000, A.6.3.3.
3.4.2 Séparation liquide-liquide
Peser, à 0,01 g près, 1 g à 3g de la matière grasse extraite dans une ampoule à décanter de 125 ml (3.3.4) et
dissoudre dans 15 ml d'éther de pétrole (3.2.1). Ajouter 30 ml d'acétonitrile saturé d'éther de pétrole (3.2.2) et
agiter vigoureusement pendant 1 min à 2min. Aprèsséparation des phases, faire couler la couche inférieure
d'acétonitrile dans une ampoule à décanter de 1 000 ml (3.3.4) contenant 700 ml d'une solution de chlorure de
sodium (3.2.8) et 100 ml d'éther de pétrole (3.2.1). Secouer vigoureusement la couche d'éther de pétrole restée
dans l'ampoule à décanter de 125 ml par trois fois avec des portions de 30 ml d'acétonitrile saturé d'éther de
pétrole (3.2.2).
Rassembler les extraits acétonitrile dans l'ampoule à décanter de 1 000 ml, puis secouer avec précaution. Soutirer
la phase aqueuse inférieure dans une seconde ampoule à décanter de 1 000 ml et la secouer pendant 12 s avec
100 ml d'éther de pétrole. Rassembler les phases éther de pétrole provenant des deux ampoules à décanter de
1 000 ml. Laver deux fois avec des portions de 100 ml d'eau ou de solution de chlorure de sodium (3.2.8). Sécher
2) L’évaporateur rotatif de Kuderna-Danish est un exemple d’appareil approprié disponible sur le marché. Cette information
est donnée à l'intention des utilisateurs de la présente partie de l'ISO 3890 et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou
recommande l'emploi exclusif du produit ainsi désigné.
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ISO 3890-2:2000(F)
sur sulfate de sodium (3.2.6) et filtrer dans la fiole d’évaporation de 500 ml de l’évaporateur rotatif (3.3.2), muni
d'un tube gradué. Rincer la colonne de sulfate de sodium trois fois avec des portions de 10 ml d'éther de pétrole
(3.2.1). Ensuite, concentrer la solution d'éther de pétrole jusqu'à 10 ml à l'aide de l'évaporateur rotatif (3.3.2).
3.4.3 Purification sur colonne de Florisil
Placer dans une colonne chromatographique (3.3.1) une couche d'adsorbant (3.2.7) de 100 mm. Couvrir d'une
couche de 10 mm de sulfate de sodium (3.2.6) et rincer le tout avec 40 ml à 50 ml d'éther de pétrole (3.2.1).
Introduire sur la colonne (3.3.1), à la pipette, les 10 ml de l'extrait concentré dans l'éther de pétroleobtenuen3.4.2
et rincer le récipient deux fois avec des portions d'environ 5 ml d'éther de pétrole. Éluer ensuite dans une fiole
d’évaporation (3.3.2) munie d'un tube gradué en utilisant 200 ml du solvant d'élution A (3.2.4). Il convient que la
vitesse d'élution ne dépasse pas 5 ml/min. Changer les fioles de réception et éluer de la même façon en utilisant
200 ml du solvant d'élution B (3.2.5).
Concentrer les deux éluats séparément jusqu'au petit volume désiré en utilisant l'évaporateur rotatif (3.3.2).
Examiner chaque éluat par chromatographie en phase gazeuse. Si une purification supplémentaire se révèle
nécessaire, celle-ci peut être conduite sur une seconde colonne d'adsorbant récemment préparé ou comme
indiqué dans l'ISO 3890-1:2000, annexe A.
Le premier éluat contient un peu d'HCB, les isomères HCH, l'heptachlore, l'heptachlore époxyde, l'aldrine, le DDE,
le TDE et le DDT. Le second éluat contient la dieldrine et l'endrine.
3.5 Chromatographie en phase gazeuse
Voir l'ISO 3890-1:2000, 6.2. Pour les essais préliminaires, etc., voir l'ISO 3890-1:2000, articles 10 à 14.
4Méthode B: Séparation liquide-liquide à l'aide de diméthylformamide (DMF) et
purification sur colonne d'alumine (voir références [4� et [5�)
4.1 Principe
Extraction des composés organochlorésainsi quedela matière grasse d’un échantillon par la méthode décrite
dans l'ISO 3890-1:2000, article A.6, puis séparation des résidus dans la diméthylformamide. Après addition d'une
solution de sulfate de sodium, séparation des composés organochlorés dans le n-hexane. Chromatographie de la
phase organique sur oxyde d'aluminium neutre en utilisant comme éluant le n-hexane. Concentration de l'éluat
pour examen par chromatographie en phase gazeuse.
Des méthodes particulières sont décrites pour les échantillons de lait et de beurre.
4.2 Réactifs
Sauf indication différente, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l'eau distilléeou
déminéralisée, ou de l'eau de puretééquivalente.
4.2.1 n-Hexane [CH (CH ) CH ], ayant un point d'ébullition compris entre 68 °Cet70 °C.
3 2 4 3
Vérifier la pureté par chromatographie en phase gazeuse dans les conditions de travail de la colonne. Si
nécessaire, distiller sur hydroxyde de potassium.
4.2.2 Acétone (CH COCH ), d'utilisation courante.
3 3
4.2.3 Diméthylformamide (DMF).
Examiner un extrait au n-hexane d'une solution aqueuse diluée pour déceler les pics susceptibles d'interférer lors
de l'analyse par chromatographie en phase gazeuse. Redistiller le solvant, si nécessaire, et recueillir la fraction
dont le point d'ébullition est compris entre 152 °C et 154 °C.
4 © ISO 2000 – Tous droits réservés
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ISO 3890-2:2000(F)
4.2.4 n-Hexane, saturé de diméthylformamide.
4.2.5 Diméthylformamide, saturéede n-hexane.
4.2.6 Sable,lavé aux acides.
Chauffer pendant 4 h à 500 °C, puis refroidir et conserver dans un flacon bouché.
4.2.7 Sulfate de sodium (Na SO ), en granulés, anhydre.
2 4
Chauffer pendant 4 h à 500 °C, puis refroidir et conserver dans un flacon bouché.
4.2.8 Oxyde d'aluminium (Al O ), neutre, activé.
2 3
Chauffer l'oxyde d'aluminium pendant 4 h à 500 °C, puis refroidir. Ajouter avec précaution 7 parties d'eau à
93 parties d'oxyde d'aluminium (fraction massique) et mélanger soigneusement dans un récipient fermé pendant
au moins 90 min. Maintenir le récipient bien bouché et utiliser l'oxyde d'aluminium dans les 10 jours qui suivent.
4.2.9 Sulfate de sodium, solution aqueuse à 2%.
4.3 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
4.3.1 Appareil d'extraction Soxhlet.
2)
4.3.2 Évaporateur rotatif (appareil de Kuderna-Danish ou équivalent), avec fiole d’évaporation de 500 ml de
capacité,etreliéà un tube gradué.
4.3.3 Mélangeur à grande vitesse.
4.3.4 Colonnes de chromatographie, ayant un diamètre intérieur de 12 mm et une longueur de 300 mm,
munies de robinets en PTFE.
3)
4.3.5 Microcolonnes Snyder .
4.4 Mode opératoire
4.4.1 Extraction de la matière grasse et des composés organochlorés
4.4.1.1 Méthodes générales
Voir l'ISO 3890-1:2000, annexe A.
4.4.1.2 Méthodes particulières
a) Lait
Introduire, dans l'ordre, 40 ml de lait bien mélangé,80mld'acétone (4.2.2) et 80 ml de n-hexane (4.2.1), dans
un bécher vortex de 250 ml. Homogénéiser ce mélange pendant 3 min. Le transférer immédiatement dans un
tube à centrifuger de 250 ml en lavant les lames du mixer avec 10 ml de n-hexane, puis avec 5 ml d'eau, et
ajouter les lavages dans le tube.
3) La microcolonne Snyder est un exemple d’appareil approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à
l'intention des utilisateurs de la présente partie de l'ISO 3890 et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande
l'emploi exclusif du produit ainsi désigné.
© ISO 2000 – Tous droits réservés 5
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