ISO/TR 79:2015

Reference materials - Examples of reference materials for qualitative properties

ISO/TR 79:2015 summarizes the state of the art of the production and certification or characterization of qualitative property reference materials (RMs). The need for guidance documents for the production of RMs certified for qualitative properties was recognized by many experts. At the same time, the available information was found to be too immature to develop an internationally accepted guidance document. Additionally, the lack of an international vocabulary for terms and definitions for qualitative properties made it more difficult for the experts from various testing areas to communicate with each other. ISO/TR 79 summarizes the available expertise. It aims to contribute to the on-going discussion on nominal properties and the production of such RMs. The investigation of nominal properties is referred to differently in various specialized areas (examination, classification, identification, testing, observation, etc.). ISO/TR 79 tries to foster the future development of an internationally harmonized guidance document.

Matériaux de référence - Exemples de matériaux de référence pour les propriétés qualitatives

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 15-Apr-2015
• ICS: 71.040.30 - Chemical reagents
• Technical Committee: ISO/TC 334 - Reference materials
• Drafting Committee: ISO/TC 334 - Reference materials
• Current Stage: 9092 - International Standard to be revised
• Start Date: 06-Jun-2025
• Completion Date: 13-Dec-2025

Overview

ISO/TR 79:2015 - Reference materials - Examples of reference materials for qualitative properties - is an ISO Technical Report that summarizes the state of the art for producing, certifying and characterizing reference materials (RMs) used to support qualitative (nominal) properties. Rather than prescribing a single international guidance, ISO/TR 79:2015 collects practical examples and approaches from a range of producers and users to inform ongoing development of harmonized guidance on RMs for qualitative identification, classification and nominal properties.

Key examples presented in the report include:

• RMs certified for DNA sequence identity
• Organic chemicals characterized for identification
• Human biospecimens certified for qualitative properties
• A RM for darnel seed identity
• Colour classification of freshwater cultured pearls
• European Pharmacopoeia reference standards for qualitative analysis

Key topics and technical issues

ISO/TR 79:2015 highlights technical topics and pragmatic considerations that RM producers and users must address when dealing with qualitative properties:

• Processing and production approaches for different material types (DNA, biospecimens, organic compounds)
• Purity assessment and how it affects qualitative identification
• Characterization methods (e.g., sequencing, spectrometry) used to establish identity or classification
• Suitability, homogeneity and stability studies tailored to qualitative use
• Identification probability and expression of confidence in qualitative results
• Documentary and metrological traceability for qualitative RMs
• Challenges in defining uncertainty and expressing confidence for qualitative outcomes
• Terminology issues: varying use of “qualitative properties”, “nominal properties”, and how different fields treat order/ordinal properties

Practical applications and users

This Technical Report is useful to organizations involved in:

• Reference material producers and accreditation bodies
• Clinical and forensic laboratories, tissue banks and biorepositories
• Pharmaceutical quality control and pharmacopoeial authorities
• Food safety, agricultural testing and botanical identity labs
• Standardization committees and metrology bodies developing guidance for qualitative RMs

ISO/TR 79:2015 helps these users understand current best practices, methodological examples and open issues that must be resolved to create internationally harmonized guidance.

Related standards and initiatives

• ISO Guide 35 and ISO Guide 80 (principles commonly referenced)
• ISO Guide 34 and ISO/IEC 17020 (accreditation frameworks mentioned)
• JCGM/VIM work on extending the International Vocabulary of Metrology to nominal/qualitative properties
• AOAC International guidance on validation of qualitative binary chemistry methods

ISO/TR 79:2015 is a reference source for practitioners and policymakers working toward standardized, traceable, and fit‑for‑purpose reference materials for qualitative analysis.

Standards Content (Sample)

TECHNICAL ISO/TR
REPORT 79
First edition
2015-04-15
Reference materials - Examples of
reference materials for qualitative
properties
Matériaux de référence - Exemples de matériaux de référence pour les
propriétés qualitatives
Reference number
©
ISO 2015
© ISO 2015
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form
or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail [e-mail]
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2015 – All rights reserved

Contents Page
Foreword .v
Introduction .vi
1 Scope . 1
2 Reference materials certified for their DNA sequence . 1
2.1 General . 1
2.2 Selected examples of certified reference materials . 1
2.3 Certification approaches applied . 2
2.3.1 Processing of the materials . 2
2.3.2 Purity assessment . 3
2.3.3 Genomic DNA CRMs . 4
2.3.4 Characterization (leading to certified values) . 4
2.3.5 Additional characterization (leading to non-certified values) . 4
2.3.6 Suitability study . 4
2.3.7 Homogeneity study . 5
2.3.8 Minimum sample intake . 5
2.3.9 Short-term and long-term stability. 5
2.3.10 Identification probability . 6
2.3.11 Documentary and metrological traceability . 6
3 Organic reference materials for qualitative analysis . 6
3.1 General . 6
3.2 Verification of the identification of a marker for steroid abuse . 7
3.3 The added value of knowing the synthetic procedure. 9
4 Biospecimens of human origin, certified for qualitative properties .10
4.1 General .10
4.2 Selected human biospecimen examples of reference materials .10
4.3 Certification approaches applied .11
4.3.1 General.11
4.3.2 Processing of the materials .11
4.3.3 Purity assessment .11
4.3.4 Characterization .12
4.3.5 Suitability study .15
4.3.6 Homogeneity study .16
4.3.7 Stability study .16
4.4 Conclusion on biospecimens as reference material certified for qualitative properties .16
4.4.1 General.16
4.4.2 Documentary and metrological traceability .17
5 Reference material for darnel seed identity .17
5.1 General .17
5.2 Preparation of the reference materials .17
5.3 Intended use .18
5.4 Characterization .18
5.4.1 Qualitative property to be characterized .18
5.4.2 Principal of characterization .18
5.4.3 Characterization of the reference material for darnel seed identity .24
5.5 Homogeneity and stability study .28
5.6 Uncertainty .28
5.7 Expressing the qualitative property of the reference material .28
5.8 Traceability .28
6 Colour of freshwater cultured pearls .29
6.1 General .29
6.2 Homogeneity testing .29
7 European Pharmacopoeia reference standards for qualitative analysis.32
7.1 General .32
7.2 Examples .32
7.2.1 European Pharmacopoeia reference standards for confirmation of identity of a
substance for pharmaceutical use by infrared spectrophotometry .32
7.2.2 European Pharmacopoeia reference standards used for identification by nuclear
magnetic resonance spectrometry. .34
7.2.3 European Pharmacopoeia reference standards used for identification of
impurities by liquid chromatography .34
7.2.4 Establishment and production of European Pharmacopoeia reference standards
for qualitative use .35
Bibliography .36
iv © ISO 2015 – All rights reserved

Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of any
patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or on
the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical Barriers
to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/REMCO, Committee on reference materials.
Introduction
In 2007, ISO/REMCO created an ad hoc group (AHG) to investigate the need for guidance on the
production of Reference Material (RM) certified for a qualitative property. AHG 01 carried out a gap
analysis, contacting 12 organizations and bodies using qualitative RMs and reviewed 13 documents
referring to qualitative RMs. Based on this gap analysis, ISO/REMCO decided in 2008 to create a working
group (WG) and to entrust it with the drafting of an ISO document.
Due to the limited information submitted in the following years to WG13, the drafting of internationally
harmonized guidance turned out to be impossible. Instead, it was decided to focus on an ISO Technical
Report (TR), which summarizes the state of the art of the production of qualitative RMs. This TR lists
examples of RMs which are either certified for a qualitative property or which can be considered as
in-house RMs characterized for a qualitative property. Therefore, many of the RM examples listed here
[1] [2]
are based on the principles elaborated in ISO Guide 35 and ISO Guide 80. The examples represent
the experience gathered by various organizations and bodies and their interpretation of qualitative
properties, but did not undergo a consensus building process.
In this TR, the following six RM examples are presented:
[3]
a) the certification of RMs for their DNA sequences by an ISO Guide 34 accredited reference material
producer (RMP) (Clause 2);
b) the in-house characterization of organic chemicals as RMs for identification purposes by a
laboratory (Clause 3);
[4]
c) the identification of a RM biospecimen by an ISO/IEC 17020 accredited tissue bank (Clause 4);
d) the development of a reference material for darnel seed identity (Clause 5);
e) the classification and between-sample homogeneity testing of a freshwater cultured pearl (Clause 6);
f) European Pharmacopoeia reference standards for qualitative analysis (Clause 7).
The lack of international standardization in the area of qualitative properties has been recognized by
several groups. This includes WG 2 of the Joint Committee for Guides in Metrology (JCGM), officially
[5]
responsible for the International Vocabulary of Metrology (VIM), which investigates updating
and expanding the VIM to cover also qualitative properties. As these discussions are on-going, the
terminology used in the various examples presented in this TR may differ, e.g. some groups refer to
qualitative properties as nominal properties. Likewise, no agreement has yet been made on international
level if the term measurement is limited to quantitative properties or may as well be used for qualitative
properties. To foster the readability of this TR, the term qualitative property has been given preference
and the term measurement has been restricted to its use in conjunction with quantitative properties,
following the recommendations expressed by the majority of ISO/REMCO delegates during their 37th
annual meeting in 2014.
Due to the lack of common guidance on the production of RMs for qualitative properties, the
approaches and understanding of terms properly defined for quantitative properties (e.g. homogeneity
and traceability) are differently interpreted and applied for qualitative properties by the various
organizations and bodies which contributed to this collection of examples. Likewise, the border between
qualitative and quantitative properties is differently interpreted. Ordinal properties are perceived by
some groups to be restricted to quantitative properties, while others suggest distinguishing between
quantitative and qualitative order.
As the predominant aim of this TR is to contribute to the on-going discussion, these differences were on
purpose maintained.
vi © ISO 2015 – All rights reserved

During the writing of ISO/TR 79, ISO/REMCO WG 13 identified a number of discussion items, which
could not yet be answered with consensus, but which are considered to be crucial in case further efforts
will be made to transform this TR into a Guide.
— The expression of confidence related to identification is discussed and in the majority of the cases,
no uncertainty is estimated, although experts agree that the probability for a wrong identification
forms also part of the result. The identity of an object does not have an uncertainty; however,
the assessment of the identity of an object is related to the possibility for misclassification. Ways
to estimate the uncertainty of qualitative analysis are especially suggested in the area of DNA
[6]
sequencing. At the same time, several areas require an assessment uncertainty equaling zero,
[7]
like e.g. the classification of blood group values.
— Forward/backward DNA sequencing is considered by many experts as an orthogonal method or
method free of parameters influencing the result. At the same time, the question is asked what
makes DNA sequencing specific.
— Heterogeneity of materials used as RM for qualitative property identification does not necessarily ruin
the intended use. Ways are needed to check to which extend for instance inhomogeneity can be accepted.
— A working group at AOAC International developed internationally harmonized guidelines for the
[8]
validation of qualitative binary chemistry methods. The Guidelines for Validation of Qualitative
Binary Chemistry Methods approach the question from the view point of the method. The question
whether the RM used in presence/absence testing needs to be certified for a quantitative or
qualitative property has not been discussed in this working group so far.
TECHNICAL REPORT ISO/TR 79:2015(E)
Reference materials - Examples of reference materials for
qualitative properties
1 Scope
This Technical Report summarizes the state of the art of the production and certification or
characterization of qualitative property reference materials (RMs).
The need for guidance documents for the production of RMs certified for qualitative properties was
recognized by many experts. At the same time, the available information was found to be too immature
to develop an internationally accepted guidance document. Additionally, the lack of an international
vocabulary for terms and definitions for qualitative properties made it more difficult for the experts
from various testing areas to communicate with each other.
ISO/TR 79 summarizes the available expertise. It aims to contribute to the on-going discussion
on nominal properties and the production of such RMs. The investigation of nominal properties is
referred to differently in various specialized areas (examination, classification, identification, testing,
observation, etc.). ISO/TR 79 tries to foster the future development of an internationally harmonized
guidance document.
2 Reference materials certified for their DNA sequence
2.1 General
The following is a compilation of the certification approaches applied for three reference materials
which were certified for their DNA sequence by the Joint Research Centre of the European Commission,
Institute for Reference Materials and Reference Materials (IRMM, Geel, BE).
2.2 Selected examples of certified reference materials
[9]
CRM ERM-AD427 is composed of plasmid DNA certified to contain certain DNA fragments. It is used for
the quantification of Genetically Modified Organisms (GMOs) and the calibration of a defined quantitative
Polymerase Chain Reaction (PCR) method. The Certified Reference Material (CRM) contains a plasmid
carrying two defined 2’-deoxyribonucleic acid (DNA) fragments. The plasmid calibrant is certified by
DNA sequencing for containing two specific DNA targets per plasmid. The number ratio between the
two targets is equal to 1, allowing the use as calibrant for relative real-time PCR measurements. The
DNA sequence identity has been confirmed by dye terminator cycle sequencing with a negligible error
probability for the sequence identification.
[10]
CRM IRMM-448 is composed of genomic DNA extracted from a microorganism and certified for
its DNA identity (with the PCR region of interest verified by DNA sequencing). IRMM-448 is used as
positive control in a defined qualitative PCR method for food testing. The CRM consists of a purified and
freeze-dried genomic DNA (gDNA) of Campylobacter jejuni (NCTC11351). The identity of the gDNA was
confirmed by DNA sequence analysis of the ceuE gene, supporting the harmonization and validation of
PCR methods by their use as taxonomic controls in PCR reactions. An indicative value for the mass of
freeze-dried gDNA is given.
[11]
CRM IRMM/IFCC-490 is composed of plasmid DNA certified for its DNA sequence (whole sequence).
IRMM/IFCC-490 is intended to be used as positive control in quantitative PCR in the area of genetic
testing. The CRM consists of purified plasmid DNA (pDNA) pUC18 containing a specific fragment of
the human Factor II (prothrombin) gene sequence. It is intended to support the validation and the
harmonization of PCR-based methods used for the detection of the mutation in the human prothrombin
gene. In all cases, PCR amplification is followed either by restriction enzyme digestion, hybridization
protocols, single-strand conformation polymorphism analysis, melting curve analysis, denaturating
gradient gel analysis or sequencing.
2.3 Certification approaches applied
2.3.1 Processing of the materials
[3]
2.3.1.1 Processing can be carried out fulfilling the requirements laid down in ISO Guide 34. Detailed
knowledge and understanding of the individual processing steps are for the production of qualitative RMs
of outmost importance as the knowledge about the raw material used is one way to ensure the desired
identity. Likewise, meaningful processing controls are important.
An example is the use of extracted genomic DNA for the RM preparation. Genomic DNA from the desired
microorganism strain can be obtained from culture collection centres together with a certificate of
analysis confirming the identity of the material. The issuing of the certificate for genomic DNA of a
particular microorganism strain is typically based on biochemical-, morphological- and microbiological
information. Likewise, this approach of controlled origin can be applied for DNA fragments which will
be selected for cloning.
2.3.1.2 Verification of the desired DNA sequence of fragments includes techniques such as:
a) purification of DNA fragment prior to ligation of the amplification product with e.g. PCR fragment
purification kit;
b) control of the correct length of the DNA amplicons by agarose gel electrophoresis by comparison to
a DNA molecular mass ladder;
c) melting temperature investigation of the qPCR products obtained with defined primers and probes
to further confirm the identity of the DNA sequence;
d) assessment of the DNA sequence identity by DNA sequence analysis of the fragment inserted
into the vector.
2.3.1.3 For cloning, the conditions should be selected in such a way that the cloning of other fragments
than the desired one is prohibited. The following should be considered.
a) The synthetic vectors used for cloning should be a high copy vector from the same incompatibility
group. As a result, the transformed bacterial clones can only bear one single plasmid and not a
mixture of different plasmids.
b) By repeated plating, it should be ensured that only a single colony is cultivated.
2.3.1.4 The outcome of cloning can be checked by:
a) endonuclease restriction analysis to control correct cloning and to check the orientation of the DNA
insert;
b) testing of the resulting plasmid by qualitative PCR for the presence of the insert;
c) assessment of the DNA sequence identity by DNA sequence analysis of either the whole DNA sequence
or the DNA fragment of interest.
2.3.1.5 In the case of different DNA fragments inserted into a plasmid in a desired ratio, methods should
be employed to verify this ratio.
a) Digital PCR experiments can confirm the expected ratio between two target sequences.
b) Real-time PCR method targeting one of the fragments and using the second fragment as normalizer
can be applied provided that amplification efficiencies are equivalent.
2 © ISO 2015 – All rights reserved

2.3.1.6 The DNA sequence identity needs to be confirmed. This confirmation can either concern the
whole DNA sequence (e.g. in case of a plasmid) or one or more parts of the DNA (e.g. the PCR target
region in genomic DNA from microorganisms used for identification of strains or different DNA fragments
inserted into a plasmid in a desired ratio).
Part of the identity confirmation is carried out during the processing (2.3.1 Processing of the materials).
Depending on the processing steps, repeated application of confirmation method should be considered
(e.g. DNA sequencing at various crucial processing steps and if possible in the final preparation).
To ensure that DNA sequencing data have a low probability of incorrect reads, forward and backwards
sequencing (Sanger-based sequencing) should be applied. The probability for incorrect reads can be
estimated according to Reference [6].
2.3.1.7 In any case, the following should be taken into account with respect to homology searches of the
found DNA sequence:
a) if published sequence data were judged to be trustworthy, a homology search of the found DNA
sequence (either whole DNA sequence or DNA fragment of relevance) should be applied;
b) a comparison of the found DNA sequence with e.g. data provided by a culture collection centre
should be made.
2.3.2 Purity assessment
2.3.2.1 First step
As a first step in the DNA purity investigation, a list of potential DNA contaminants is made. Their impact
on the later use of the CRM is evaluated and ways to check for impacting DNA contaminants are elaborated.
2.3.2.2 Plasmid-based CRMs
2.3.2.2.1 Remaining traces of genomic DNA from host bacterial cell or traces of RNA molecules:
It should be checked if such traces would affect the identity of the plasmid and its suitability for real-
time PCR measurements, for instance if a high homology is given. If the sequence identity of the genomic
DNA of the bacteria and the DNA fragments of interest is low, it is reasonable to conclude that they would
not have an impact. However, as remaining traces may induce a bias in the UV absorbance-based DNA
quantification of the plasmid solution, the user should be made aware that this could lead to erroneous
estimation of the absolute number of plasmid copies.
2.3.2.2.2 Presence of other plasmids than the one containing the DNA fragment(s) of interest:
a) In order to prevent that other plasmids than the one containing the DNA fragment(s) of interest
are present, the synthetic vectors used for cloning should be high copy vectors from the same
incompatibility group. As a result, the transformed bacterial clones can only bear one single plasmid.
It can therefore be concluded that each single bacterium extracted from one colony contains only
one type of plasmid.
b) Presence of other plasmids in higher abundance can be tested by enzymatic restriction, with
conditions allowing a full digestion. However, one has to bear in mind that it is very difficult to prove
that all plasmids were indeed fully digested, as traces of undigested plasmids will not be visible
after gel electrophoresis and ethidium bromide staining.
c) As additional proof of purity, the plasmid DNA can be sequenced completely to verify that the desired
sequence was correctly cloned. To confirm the purity, the results should not reveal the presence of a
mixed population of plasmids. The sequencing technique should be carefully selected in view of the
question to be answered; nowadays, a Next Generation Sequencing (NGS) analysis could be applied,
provided that settings are chosen in such way that disturbing impurities are detected.
d) End-point PCR followed by agarose gel electrophoresis can be used to further investigate the purity.
The qualitative PCR should be targeted at the DNA sequence(s) which is (are) considered to be either
a problem for the later use of the CRM and/or at the DNA sequence which could be expected as
contaminant. However, the ability of this method to investigate the purity of the material is limited
and often only a purity of 90 % can be proven. Likewise, digital end-point PCR can be used to check
for contamination.
2.3.3 Genomic DNA CRMs
Purity of the gDNA from one cell culture:
a) In order to ensure that the gDNA has the desired identity, the origin of the material should be controlled
and documented as well as possible. Genomic DNA from the desired microorganism strain should
be obtained from culture collection centres together with a certificate of analysis confirming the
identity of the material. The issuing of the certificate for genomic DNA of a particular microorganism
strain is typically based on biochemical-, morphological- and microbiological information.
b) As an additional proof of purity, the gDNA could be sequenced. This could be done on the whole
genome (if feasible) or limited to part of the sequence of interest (i.e. the target region of a PCR).
2.3.4 Characterization (leading to certified values)
Characterization and value assignment for qualitative DNA CRMs rely to a large extent on proper control
of processing and the outcome of the purity assessment. In several cases, the characterization could be
classified as confirmation, which confirm that the intended material was processed.
Two possible confirmation techniques are as follows.
a) Control of the restriction pattern of the plasmid DNA samples can be done by gel electrophoresis.
Gel electrophoresis can be carried out on the gDNA or on the PCR amplicons generated after
performance of a specific PCR.
b) The whole DNA should preferably be sequenced by two independent laboratories/instruments or
protocols, using preferably forward and backward sequencing (Sanger-based sequencing). Double
stranded DNA should be sequenced on both strands in order to ensure an accurate determination
by a twofold-coverage of the generated sequences, as well as a complete characterization of the
molecular composition of the double stranded DNA.
In the case that a whole sequencing is not possible or considered not to be of interest, sequencing can
e.g. be limited to amplicons generated after performance of a specific PCR. The amplicons need to be
purified and cloned into a plasmid, which after purification can be sequenced.
The uncertainty related to the sequence determination by Sanger-based sequencing techniques can
often be considered as negligible, as the probability to report a wrong base (error probability) is very
low. For further guidance, see Reference [6].
2.3.5 Additional characterization (leading to non-certified values)
In various cases, the DNA amount is useful additional material information. Quantification can be done
by fluorometry. However, in the absence of reference materials certified for their DNA amount, the
resulting value is an estimation of the DNA quantity.
2.3.6 Suitability study
A suitability study is carried out to ensure that the material is fit for purpose and can be used for
its intended use. Intrinsically, the suitability study should be designed in such a way that existing
commutability problems would be discovered.
As the examples used in this document concern CRMs certified for their sequence and intended to be
used for PCR measurements, the intended use for PCR is elaborated here.
4 © ISO 2015 – All rights reserved

The correct behaviour of a qualitative CRM for its intended purpose (i.e. as PCR calibrant or positive
control in PCR) needs to be verified. Ideally, the performance can be tested by laboratories which are
potential (later) users of the CRM.
If the type of DNA from analysed samples and calibrants differ (i.e. gDNA and plasmids), commutability
problems should be investigated. The calibrant should behave in the analytical process in the same way
as the material under investigation.
Suitability of the CRM might not only depend on certified parameters (DNA sequence) but also on non-
certified parameters (i.e. the DNA amount). This should be taken into account in the suitability study as
well as in the homogeneity study.
Positive outcome of a suitability study proves that the material is fit for its intended purpose.
2.3.7 Homogeneity study
A CRM certified for its DNA sequence is certified for identity. The sequence identify defines the structure.
The homogeneity of the material is therefore determined by the purity of the material.
However, additional homogeneity studies should verify the homogeneity in view of the intended use of
the CRM.
a) This could e.g. concern the DNA amount, justifying to measure the mass of double stranded DNA
in a representative number of vials by fluorescence. The obtained data can be evaluated like a
[1]
homogeneity study (e.g. as outlined in ISO Guide 35 ), proving that the mass of DNA in each vial is
not significant different from each other (95 % confidence level).
b) For gDNA, the intactness of the DNA might be of relevance and a number of vials could be analysed by
gel electrophoresis. A single band of DNA confirms a reasonable intactness of the gDNA in each vial.
c) PCR amplification in different vials should be checked, when the CRM is intended for PCR. For real-
time PCR, this could include the monitoring of the crossing point threshold (Cp) and/or the melting
temperature. This would contribute to the confirmation of the sequence identity (within the DNA
sequence defined by the primers).
Uncertainties related to homogeneity studies should not be above a level at which the random selection
of a vial would have an impact on the performance. A CRM certified for its DNA sequence and intended
to be used as positive control in PCR applications needs, e.g. to contain in each unit enough of the DNA
so that the PCR result is not negative. Impurities may influence the suitability of the material if they
interfere with the PCR but are not relevant if they e.g. concern not targeted DNA and/or background
DNA added to enhance the stability of the targeted DNA in the CRM.
2.3.8 Minimum sample intake
A CRM certified for its DNA sequence is often a pure material. Therefore, classical studies designed to
[12]
investigate the minimum sample intake are not applicable.
Instead the suitability and homogeneity studies, in which the CRM was used for its intended purpose,
can be used to demonstrate that a certain amount of the CRM is sufficient to obtain the expected results.
A minimum sample intake for a given purpose can be recommended. The establishment of a minimum
sample intake in this case often resembles the typical sample intake area, rather than the minimum
(possible) sample intake.
2.3.9 Short-term and long-term stability
A CRM can be certified for its DNA sequence. The sequence identify is unlikely to change, even DNA
degradation would strictly speaking not impact the identity.
However, during short-term stability studies the transport stability and during long-term stability studies
the to-be expected storage stability in view of the intended use of the CRM should be investigated. Based
on the outcome, transport conditions and shelf-lives for specified storage conditions, not influencing the
intended use should be selected.
Uncertainties related to stability studies should ensure that the material can still be used without impact
on the performance after a certain time and/or exposure to specified temperatures.
2.3.10 Identification probability
No uncertainty concept exits for identity. The probability to misidentify for instance the DNA sequence
of a material is often very low. To demonstrate this, the probability should be calculated that two
sequencing procedures, independently performed in different laboratories, generated identical results
by forward and backward sequencing.
However, one has to be aware that the DNA sequence information is used to ‘identify’ the material.
This identification can be based on established classification schemes, which in itself can be subject to
changes. It therefore should be mentioned which classification scheme has been applied at which time.
The probability for wrong identification in some specific areas can be rather high. e.g. if the DNA
sequences are very similar, if crossings occur and if the availability of DNA sequence information is very
limited. However, it should be carefully discriminated between the probability of a wrong outcome of
DNA sequencing and the probability of a wrong identification because of a classification scheme which
was set up on limited DNA information.
2.3.11 Documentary and metrological traceability
The certified identity is often based on a documentary traceability to a document linking the DNA
sequence to a certain identity. Additionally, a metrological traceability exists for the confirmation step
(such as dye terminator cycle sequencing or PCR measurements) carried out on the DNA sequence.
Beside the metrological traceability, the traceability (trackability) to a classification scheme is of interest.
3 Organic reference materials for qualitative analysis
3.1 General
Chemical measurement, whether it is quantitative or qualitative, requires reference materials for
which the analyte of interest has been correctly identified. Laboratories are encouraged to purchase
appropriately certified reference materials from an accredited reference material producer (RMP),
providing confidence that the identity of their product has been correctly assigned. Due to the lack
of reference materials certified for identity, laboratories are often forced to purchase chemicals from
reputable chemical suppliers or simply use a sample “found on the shelf” and put their faith in the
manufacturer’s labelling and/or associated paperwork. Regardless of the source of the material, it would
be considered prudent to perform in-house cross checks before embarking upon a testing program
with a potentially incorrectly labelled reference material. Most modern day analytical laboratories
will have access to mass selective detectors, linked to either liquid chromatography (LC-MS) or gas
chromatography (GC-MS) equipment, which provide a fingerprint of the compound in hand. Specialized
laboratories may also have access to infrared (IR) spectrometers, which can provide further structural
information. Demonstrated equivalence with literature spectra is generally considered sufficient for
structural confirmation. In cases where literature data are limited or non-existent, the analyst would
need to exercise a lot more care when interpreting the structural information. The analyst also needs
to appreciate the limitations of these techniques, particularly when considerations such as regio-
and stereochemistry are important. In such cases, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy
is recommended, as this technique provides a definitive structural analysis. On the downside, this
introduces the need to access an NMR spectrometer and suitably qualified staff to interpret the spectra,
which may be difficult for many laboratories. Fortunately, many university chemistry departments now
offer this service.
6 © ISO 2015 – All rights reserved

3.2 Verification of the identification of a marker for steroid abuse
The following example serves to warn laboratories of the dangers of purchasing chemicals from
commercial suppliers for use as a reference material (RM) for qualitative analysis, without performing
adequate cross checks to confirm the identity.
7 β-Hydroxydihydroepiandrosterone (7β -hydroxyDHEA) 1, a marker for steroid abuse, is required by
the sports doping control community. Being a human metabolite of DHEA, sufficient quantities of the
7 β-hydroxy metabolite can only be realized through synthesis. Having exhausted the original batch,
National Measurement Institute Australia purchased 7 β-hydroxyDHEA from a commercial company
specializing in the provision of steroids. Unfortunately, the compound received was not the desired 7
β-hydroxyDHEA, but a compound of similar structure. Suspicions were first raised when the solubility
characteristics of the supplied material did not match that exhibited by the originally certified material.
–1
IR analysis, while confirming the presence of a ketone group (strong peak at 1 734 cm ) and at least
–1
one hydroxyl group (broad peak at 3 283 cm ), did not match the IR spectrum of the certified sample
–1
which displayed a strong carbonyl peak at 1 726 cm and a relatively narrow hydroxyl band at 3 447 to
–1
3 474 cm . A GC-MS based co-elution study (Figure 1) confirmed beyond all doubt that the purchased
sample had been incorrectly assigned, although it is worth noting that separation of the two compounds
required significant optimization of the chromatography conditions.
Figure 1 — GC-MS based co-elution study of a commercial unknown (r.t. = 10,1 min) and 7
β-hydroxyDHEA (r.t. = 10,4 min)
The respective mass spectra (Figure 2) of the two compounds are clearly different, although key peaks
are common to each. Both compounds afford a weak molecular ion (304 m/z), and a base peak at 286 m/z
representing the loss of water, while peaks at 271 m/z and 268 m/z represent the loss of a methyl group
and a second water molecule respectively, in line with the proposed structure. A similar scenario was
observed for the tris-TMS derivative of each compound. The observation of a vanishingly small molecular
ion at 520 m/z in each case, and key fragments common to both compounds, provided further evidence
that the requisite functionality was present on both steroids. The possibility that 7α-hydroxyDHEA
had been provided was ruled out, again by direct comparison with a certified reference material which
displayed almost identical IR and MS spectra to the desired 7 β diastereomer.
Figure 2 — Electron ionization mass spectra of the unknown (r.t. = 10,1 min) and
7 β-hydroxyDHEA (r.t. = 10,4 min)
H NMR analysis (Figure 3) confirmed beyond al
...

ТЕХНИЧЕСКИЙ
ISO/TR
ОТЧЁТ
Первое издание
2015-04-15
Стандартные образцы. Примеры
стандартных образцов качественных
свойств
Reference materials — Examples of reference materials for qualitative
properties
Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава ISO

Ссылочный номер
©
ISO 2015
ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ

Все права сохраняются. Если не указано иное, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия ISO по соответствующему адресу, указанному ниже, или комитета-члена ISO в стране
заявителя.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail [e-mail]
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO 2015 – Все права сохраняются

Содержание Страница
Предисловие . v
Введение . vi
1 Область применения . 1
2 Стандартные образцы, сертифицированные на последовательность ДНК . 1
2.1 Общие сведения . 1
2.2 Некоторые примеры сертифицированных стандартных образцов . 1
2.3 Подходы, применяемые к сертификации . 2
2.3.1 Обработка материалов . 2
2.3.2 Оценка чистоты . 3
2.3.3 ССО геномной ДНК . 4
2.3.4 Характеризация (ведущая к сертифицированному значению) . 4
2.3.5 Дополнительная характеризация (ведущая к несертифицированному
значению) . 5
2.3.6 Исследование пригодности . 5
2.3.7 Исследование однородности . 5
2.3.8 Минимальный размер пробы . 6
2.3.9 Кратковременная и долговременная стабильность . 6
2.3.10 Вероятность идентификации . 6
2.3.11 Документальная и метрологическая прослеживаемость . 7
3 Органические стандартные образы для качественного анализа . 7
3.1 Общие сведения . 7
3.2 Проверка идентификации маркера стероидного злоупотребления . 8
3.3 Дополнительное значение знания процедуры синтеза . 10
4 Биообразцы человеческого происхождения, сертифицированные на качественные
свойства . 11
4.1 Общие сведения . 11
4.2 Отобранные человеческие биообразцы – примеры стандартных образцов . 11
4.3 Подходы, применяемые к сертификации . 12
4.3.1 Общие сведения. 12
4.3.2 Обработка материалов . 12
4.3.3 Оценка чистоты . 13
4.3.4 Характеризация . 13
4.3.5 Исследования пригодности . 17
4.3.6 Исследование однородности . 17
4.3.7 Исследование стабильности . 18
4.4 Выводы по биообразцам как стандартным образцам, сертифицированным на
качественные свойства . 18
4.4.1 Общие сведения. 18
4.4.2 Документальная и метрологическая прослеживаемость . 19
5 Стандартный образец для идентификации семени плевела . 19
5.1 Общие сведения . 19
5.2 Приготовление стандартных образцов . 19
5.3 Назначение . 20
5.4 Характеризация . 20
5.4.1 Характеризуемые качественные свойства . 20
5.4.2 Основной принцип характеризации . 20
5.4.3 Характеризация стандартного образца для идентификации семян плевела . 26
5.5 Исследования однородности и стабильности . 30
5.6 Неопределенность . 30
5.7 Выражение качественного свойства стандартного образца . 30
5.8 Прослеживаемость . 30
6 Цвет пресноводного выращенного жемчуга . 31
6.1 Общие сведения . 31
6.2 Исследование однородности . 31
7 Стандартные образцы Европейской фармакопеи для качественного анализа . 34
7.1 Общие сведения . 34
7.2 Примеры . 34
7.2.1 Стандартные образцы Европейской фармакопеи для подтверждения
идентичности вещества для фармакологического применения методом
инфракрасной спектрофотометрии . 34
7.2.2 Стандартные образцы Европейской фармакопеи для идентификации методом
спектрометрии ядерного магнитного резонанса . 35
7.2.3 Стандартные образцы Европейской фармакопеи для идентификации примесей
методом жидкостной хроматографии . 36
7.2.4 Разработка и производство стандартных образцов Европейской фармакопеи
для качественного использования . 37
Библиография . 38

iv © ISO 2015 – Все права сохраняются

Предисловие
ISO (Международная организация по стандартизации) является всемирной федерацией национальных
учреждений по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка Международных стандартов
обычно проводится техническими комитетами ISO. Каждый член ISO, имеющий интерес к
тематической области, для которой установлен технический комитет, имеет право быть
представленным в этом комитете. Сотрудничающие с ISO международные организации, как
правительственные, так и неправительственные, также принимают участие в работе ISO. ISO тесно
сотрудничает с Международной электротехнической комиссией (IEC) по всем вопросам
стандартизации в области электротехники.
Процедуры, используемые для разработки и дальнейшего поддержания настоящего документа,
установлены в Директивах ISO/IEC, Часть 1. В частности, следует отметить различные критерии
утверждения различных типов документов ISO. Этот документ был разработан в соответствии с
редакционными правилами Директив ISO/IEC, Часть 2. (см. www.iso.org/directives).
Следует обратить внимание на то, что некоторые элементы настоящего документа могут быть
предметом патентных прав. ISO не несёт ответственности за обнаружение каких-либо или всех таких
патентных прав. Сведения о каких-либо патентных правах, обнаруженных во время разработки
документа, будут указаны во Введении и/или в Перечне ISO полученных патентных деклараций
(см. www.iso.org/patents).
Любое торговое название, использованное в этом документе, является информацией, представленной
для удобства потребителей, и не означает одобрение.
Для разъяснения значения специальных терминов и выражений ISO, относящихся к оценке
соответствия, а также для информации о соблюдении ISO принципов ВТО в отношении к Техническим
барьерам в торговле (ТБТ) см. следующий URL: Foreword – Supplementary information.
Комитетом, ответственным за этот документ, является ISO/REMCO, Комитет по стандартным
образцам.
Введение
В 2007 г. ISO/REMCO создал Специальную группу (AHG) для исследования необходимости
руководства по созданию Стандартного образца (RM = СО), сертифицированного на качественное
свойство. AGH 01 провела анализ неиспользованных резервов, обратившись к 12 организациям и
предприятиям, использующим качественные стандартные образцы и рассмотрела 13 документов,
относящихся к качественным СО. По результатам этого анализа ISO/REMCO решил в 2008 г. создать
рабочую группу (WG = РГ) и поручить ей разработку документа ISO.
В связи с ограниченным объёмом информации, представленной РГ 13 в последующие годы,
разработка руководства, гармонизированного на международном уровне, оказалась невозможной.
Вместо этого, было принято решение начать разработку Технического отчёта ISO (TR = ТО),
обобщающего состояние работ по производству качественных СО. В настоящем ТО приведены
примеры СО, которые либо сертифицированы на качественное свойство, либо могут рассматриваться
как СО предприятий, охарактеризованные на качественное свойство. Поэтому многие из
[1]
перечисленных здесь примеров СО основаны на принципах, установленных в Руководстве ISO 35 и в
[2]
Руководстве ISO 80 . Эти примеры представляют опыт, накопленный различными организациями и
предприятиями и их интерпретацию качественных свойств, но не отражают процесс достижения
общего мнения в этой области.
В настоящем отчёте представлены шесть следующих образцов:
a) сертификация СО на их последовательности ДНК изготовителем стандартных образцов (RMP),
[3]
аккредитованным на соответствие Руководству ISO 34 (Раздел 2);
b) характеризация лабораторией органических химикатов в качестве СО для целей идентификации
в рамках предприятия (Раздел 3);
[4]
c) идентификация СО биопробы банком тканей, аккредитованным на соответствие ISO/IEC 17020
(Раздел 4);
d) разработка стандартного образца для идентификации семян плевела (Раздел 5);
e) классификация и исследование однородности между пробами пресноводного искусственно
выращенного жемчуга (Раздел 6);
f) Стандартные образцы Европейской фармакопеи для качественного анализа (Раздел 7).
Недостаточность международной стандартизации в области качественных свойств была признана
несколькими группами. В их число входит РГ 2 Объединённого комитета по руководствам в метрологии
[5]
(JCGM), официально ответственная за Международный словарь по метрологии (VIM) , занимающаяся
актуализацией и расширением VIM для включения в него также качественных свойств. Поскольку, эти
обсуждения продолжаются, терминология, используемая в различных примерах, представленных в
этом ТО, может быть разной, например, некоторые группы называют качественные свойства
номинальными свойствами. Аналогично, на международном уровне ещё не достигнуто соглашение в
тех случаях, когда термин «измерение» ограничен количественными свойствами, но может также
использоваться для качественных свойств. Для удобства чтения этого ТО, термину качественное
свойство отдаётся предпочтение, и термин измерение ограничен использованием вместе с
количественными свойствами в соответствии с рекомендациями, высказанными большинством
делегатов во время ежегодного 37-го заседания ISO/REMCO в 2014 г.
В связи с отсутствием общего руководства в области производства СО качественных свойств, подходы
и понимание терминов, определения которым даны для количественных свойств (например,
однородность и прослеживаемость) по-разному интерпретируются и применяются для качественных
свойств различными организациями и предприятиями, представившими свои примеры в эту подборку
примеров. Также по-разному интерпретируется граница между количественными и качественными
свойствами. Порядковые свойства воспринимаются некоторыми группами как ограниченные
количественными свойствами, в то время как другие группы предлагают разграничить количественный
и качественный порядок.
vi © ISO 2015 – Все права сохраняются

Поскольку ключевой целью настоящего ТО является развитие проходящего по этому вопросу
обсуждения, эти расхождения были намеренно сохранены.
В ходе подготовки ISO/TR 79, РГ 13 ISO/REMCO определила ряд вопросов для обсуждения, на
которые пока невозможно дать согласованные ответы, но которые считаются решающими, если будут
проводиться дальнейшие работы по переводу этого ТО в Руководство.
— Обсуждалось выражение доверия к идентификации, и в большинстве случаев не проводилась
оценка неопределённости, хотя эксперты соглашаются, что вероятность неправильной
идентификации также формирует часть результата. Идентификация объекта не имеет
неопределённости; однако оценка идентификации объекта связана с возможностью
неправильной классификации. Способы оценки неопределённости результатов качественного
[6]
анализа предлагались преимущественно в области последовательности ДНК . В то же время в
некоторых областях требуется оценка неопределённости, равной нулю, например, при
[7]
классификации группы крови.
— Прямая/обратная последовательность ДНК рассматривается многими экспертами как
ортогональный метод, свободный от параметров, влияющих на результат. В то же время
задаётся вопрос, о том, что делает последовательность ДНК специфичной.
— Неоднородность материалов, используемых в качестве СО для идентификации качественного
свойства, необязательно неблагоприятно влияет на его назначение. Необходимы методы
определения степени, до которой, например, может быть принята неоднородность.
— Рабочая группа в AOAC International разработала гармонизированное на международном уровне
[7]
руководство по валидации качественных двоичных химических методов В Руководстве по
валидации качественных двоичных химических методов рассмотрен вопрос с позиции метода.
Вопрос о необходимости сертификации СО, используемого при проведении испытания/без
испытания, на количественное или качественное свойство в этой рабочей группе до настоящего
времени не обсуждался.
ТЕХНИЧЕСКИЙ ОТЧЁТ ISO/TR 79:2015(R)

Стандартные образцы. Примеры стандартных образцов
качественных свойств
1 Область применения
Настоящий Технический отчет обобщает современное состояние производства и сертификации или
характеризации стандартных образцов (СО) качественных свойств.
Потребность в руководстве по производству СО, сертифицированных на качественные свойства, была
признана многими экспертами. В то же время, имеющаяся информация была признана недостаточной
для создания руководства, принятого на международном уровне. Кроме того, отсутствие
международного словаря в части терминов и определений для качественных свойств затрудняло
взаимодействие специалистов из различных областей испытания друг с другом.
ISO/TR 79 обобщает накопленный опыт. Его цель состоит в том, чтобы способствовать проходящему в
настоящее время обсуждению номинальных свойств и производству подобных СО. Исследование
номинальных свойств варьируются в различных специализированных областях (исследование,
классификация, идентификация, испытание, наблюдение, и т.д.). ISO/TR 79 — это попытка
способствовать будущей разработке международного согласованного руководства.
2 Стандартные образцы, сертифицированные на последовательность ДНК
2.1 Общие сведения
Нижеследующее — это компиляция подходов к сертификации, применительно к трем стандартным
образцам, которые были сертифицированы на последовательность ДНК, Объединенным
исследовательским центром Европейской комиссии, Институтом стандартных образцов (IRMM, Гиль,
Бельгия).
2.2 Некоторые примеры сертифицированных стандартных образцов
[9]
СRM ERM-AD427 состоит из плазмидной ДНК, сертифицированной на содержание некоторых
фрагментов ДНК. Он применяется для определения количества Генетически модифицированных
организмов (ГМО) и калибровки в целях реализации определенного количественного метода
Полимеразной цепной реакции (ПЦР). Сертифицированный стандартный образец (ССО) содержит
плазмиду, несущую два определенных фрагмента 2’- дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК).
Калибрант плазмиды сертифицирован путем определения последовательности ДНК на содержание
двух специфичных ДНК-мишеней на плазмиду. Числовое соотношение между двумя мишенями равно
1, что позволяет использование СО в качестве калибранта для относительных измерений ПЦР в
режиме реального времени. Идентичность последовательности ДНК подтверждается цикличным
секвенированием красящего терминатора с вероятностью ничтожно малой погрешности для
идентификации последовательности.
[10]
состоит из геномной ДНК, полученной от микроорганизма и сертифицированной на
CRM IRMM-448
идентичность его ДНК (с исследуемой областью ПЦР путем определения последовательности ДНК).
IRMM-448 используется в качестве позитивного контроля в определенном качественном методе ПЦР
для тестирования продуктов питания. ССО (CRM) состоит из очищенной сублимированной геномной
ДНК (гДНК) Кампилобактера еюни (NCTC11351). Идентичность gДНК была подтверждена анализом
последовательности ДНК гена ceuE, в поддержку гармонизации и валидации методов ПЦР путем их
использования в качестве таксономического контроля в реакциях ПЦР. Приведено ориентировочное
значение массы сублимированной геномной gДНК.
[11]
CRM IRMM/IFCC-490 состоит из плазмиды ДНК, сертифицированной на последовательность его
ДНК (целая последовательность). IRMM/IFCC-490 предназначен для использования в качестве
позитивного контроля в количественном методе ПЦР в области генетического тестирования. ССО
состоит из очищенной плазмиды ДНК (пДНК) pUC18, содержащей специфический фрагмент
последовательности человеческого гена Фактора II (протромбин). ССО применяется для поддержки
валидации и гармонизации методов, основанных на ПЦР, для выявления мутации в человеческом гене
протромбин. В любом случае ПЦР-амплификация следует либо за рестриктивным ферментом
пищеварения, либо за протоколами гибридизации, анализом одноцепочечного конформационного
полиморфизма, анализом кривой плавления, анализом или определением последовательности
денатурирующего градиентного геля.
2.3 Подходы, применяемые к сертификации
2.3.1 Обработка материалов
[3]
2.3.1.1 Обработка может осуществляться в соответствии с требованиями Руководства ISO 34 .
Доскональное знание и понимание отдельных этапов обработки имеют исключительно важное
значение для создания качественных СО, так как знания об использованном исходном материале —
это единственный способ обеспечить идентичность. Также важны средства контроля процесса
обработки.
Примером может служить использование полученной геномной ДНК для приготовления СО. Геномную
ДНК от необходимого штамма микроорганизма можно получить от центров собрания культур вместе с
сертификатом анализа, подтверждающим идентичность материала. Выдача сертификата на геномную
ДНК отдельного штамма микроорганизма обычно основывается на биохимической, морфологической и
микробиологической информации. Аналогичным образом данный подход контролируемого
происхождения может применяться для фрагментов ДНК, выбранных для клонирования.
2.3.1.2 Проверка желаемой последовательности фрагментов ДНК включает следующие техники:
a) очищение фрагмента ДНК перед лигированием продукта амплификации, например, с набором
очищения фрагмента ПЦР.
b) контроль правильной длины ампликонов ДНК методом электрофореза в агарозном геле путем
сравнения с лэддером молекулярной массы ДНК.
c) исследование температуры плавления продуктов кПЦР, полученных с помощью праймеров и
зондов для дальнейшего подтверждения идентичности последовательности ДНК.
d) оценка идентичности последовательности ДНК путем анализа последовательности ДНК
фрагмента, вставленного в вектор.
2.3.1.3 Условия клонирования должны быть выбраны таким образом, чтобы клонирование других
фрагментов, отличных от желаемого, было запрещено. Необходимо учитывать следующее:
a) синтетические векторы, используемые для клонирования, должны быть многокопийными
векторами от той же самой группы несовместимости. Таким образом, трансформируемые
бактериальные клоны могут только переносить одну отдельную плазмиду, а не смесь различных
плазмид.
b) при повторном выращивании необходимо удостовериться, что культивируется только одна
колония.
2.3.1.4 Результат клонирования можно проверить следующими методами:
a) рестрикционный анализ эндонуклеаза для контроля правильного клонирования и проверки
ориентации вставки ДНК.
b) испытание полученной плазмиды с использованием качественной ПЦР на присутствие вставки.
2 © ISO 2015 – Все права сохраняются

c) оценка идентичности последовательности ДНК путем анализа последовательности ДНК других
целых последовательностей ДНК или интересующего фрагмента ДНК.
2.3.1.5 В случае, если в плазмиду вставляются различные фрагменты ДНК в желаемом
соотношении, необходимо использовать следующие методы для проверки соотношения:
а) цифровые эксперименты ПЦР могут подтверждать ожидаемое соотношение между двумя
последовательностями мишеней.
b) можно применять метод ПЦР в режиме реального времени, помечающий один фрагмент и
использующий второй фрагмент в качестве нормализатора при условии, что эффективности
амплификации эквивалентны.
2.3.1.6 Идентичность последовательности ДНК нуждается в подтверждении. Данное подтверждение
может касаться как целой последовательности ДНК (например, как в случае с плазмидой), так и одной
или нескольких частей ДНК (например, область ПЦР-мишени в геномной ДНК от микроорганизмов,
используемых для идентификации штамма или различных фрагментов ДНК, вставленных в плазмиду в
нужном соотношении).
Часть подтверждения идентичности проводится в процессе обработки (2.3.1 Обработка материалов).
В зависимости от этапов обработки, необходимо рассматривать возможность повторного применения
метода подтверждения (например, определение последовательности ДНК на различных критических
этапах обработки и, по возможности, в заключительной подготовке).
Чтобы убедится, что данные последовательности ДНК имеют низкую вероятность неправильного
прочтения, необходимо применять прямое и обратное определение последовательности (определение
последовательности по Сангеру). Вероятность неправильного прочтения может быть оценена в
соответствии с Ссылочным документом [6].
2.3.1.7 В любом случае, в отношении поиска гомологии найденной последовательности ДНК
необходимо принимать во внимание следующее:
а) если опубликованные данные последовательности ДНК оцениваются как достоверные,
необходимо применять метод поиска гомологии найденной последовательности ДНК (как для
целой последовательности ДНК, так и соответствующего фрагмента ДНК).
b) сравнение найденной последовательности ДНК, например, с данными, представленными
центром коллекции культур.
2.3.2 Оценка чистоты
2.3.2.1 Первый этап
На первом этапе исследования чистоты ДНК составляется список загрязнений ДНК. Оценивается их
влияние на дальнейшее использование ССО и разрабатываются методы проверки влияния
загрязнений ДНК:
2.3.2.2 ССО, основанные на плазмиде
2.3.2.2.1 Оставшиеся следы геномной ДНК от бактериальной клетки хозяина или следы молекул РНК:
необходимо проверить, будут ли подобные следы влиять на идентичность плазмиды или ее
пригодность для измерений ПЦР в режиме реального времени, например, если задается высокая
гомология. Если идентичность последовательности геномной ДНК бактерий и интересующих
фрагментов ДНК низкая, разумно предположить, что они не будут оказывать влияния. Однако, в связи
с тем, что оставшиеся следы могут вызывать смещение в количественном анализе ДНК, основанном
на УФ-поглощении раствора плазмиды, пользователь должен знать, что это может привести к
ошибочной оценке абсолютного числа копий плазмиды.
2.3.2.2.2 Наличие других плазмид, отличных от плазмид, содержащих исследуемый (ые)
фрагмент(ы) ДНК:
а) для предотвращения присутствия других плазмид, вместо той, которая содержит
исследуемый(ые) фрагмент(ы) ДНК, синтетические векторы, применяемые для клонирования
должны быть многокопийными векторами от одной и той же группы несовместимости. В
результате, трансформируемые бактериальные клоны смогут нести только одну отдельную
плазмиду. Из этого можно сделать вывод, что каждая отдельная бактерия, выделенная из одной
колонии, содержит только один тип плазмиды.
b) присутствие других плазмид в избыточном количестве можно выявить при помощи энзимного
ограничения при условии полного расщепления. Однако, следует иметь в виду, что очень трудно
доказать, что все плазмиды были на самом деле полностью расщеплены, так как следы
нерасщепленных плазмид будут не видны после электрофореза в геле и окрашивания
бромистым этидием.
с) в качестве дополнительного доказательства чистоты, последовательность плазмидной ДНК
может быть определена полностью для того, что бы убедиться, что желаемая
последовательность правильно клонирована. Для подтверждения чистоты, результаты не
должны обнаруживать присутствие смешанных популяций плазмид. Необходимо с особой
тщательностью выбирать технику определения последовательности в зависимости от
поставленных вопросов. Сегодня можно применять анализ определения Последовательности
нового поколения (NGS), при условии, что настройки заданы таким образом, что мешающие
примеси выявляются.
d) Для дальнейшего исследования чистоты можно использовать метод ПЦР по конечной точке
перед электрофорезом в агарозном геле. Качественная ПЦР должна быть отмечена в
последовательность(и) ДНК, которая(ые) рассматриваются как проблема для дальнейшего
использования ССО и/или в последовательности ДНК, которая предполагается как загрязнитель.
Однако, возможности данного метода по определению чистоты материала ограничены и часто
только чистота в 90% может быть доказана. Аналогично можно использовать цифровой метод
ПЦР в конечной точке для проверки загрязнения.
2.3.3 ССО геномной ДНК
Чистота gДНК одноклеточных культур:
а) для того, чтобы убедиться в требуемой чистоте gДНК, необходимо, насколько это возможно,
проверить и документировать происхождение материала. Геномная ДНК от желаемого штамма
микроорганизма должна быть получена от центров коллекции культур с сертификатом анализа,
подтверждающим идентичность материала. Выдача сертификата на геномную ДНК конкретных
штаммов микроорганизмов обычно основывается на биохимической, морфологической и
микробиологической информации.
b) в качестве дополнительного доказательства чистоты, может быть определена
последовательность gДНК. Это можно сделать на целом геноме (если возможно) или для
ограниченной части исследуемой последовательности (например, заданный диапазон ПЦР).
2.3.4 Характеризация (ведущая к сертифицированному значению)
Характеризация и приписывание значений качественным ССО ДНК опирается во многом на
надлежащий контроль обработки материала и результат оценки чистоты. В некоторых случаях
характеризация может быть классифицирована как подтверждение обработки исследуемого
материала.
Ниже рассмотрены два возможных метода подтверждения:
4 © ISO 2015 – Все права сохраняются

а) контроль рестрикционной структуры проб плазмидной ДНК путем электрофореза в геле.
Электрофорез в геле можно использовать на gДНК или ампликонах ПЦР, полученных после
проведения конкретной ПЦР.
b) предпочтительнее определение последовательности целой ДНК двумя независимыми
лабораториями/инструментами или протоколами с использованием прямого и обратного
определения последовательности (определение последовательности по Сангеру). Определять
последовательность двухцепочной ДНК необходимо на обеих цепочках для того чтобы
обеспечить точное определение двойного покрытия полученных последовательностей, а также
полную характеризацию молекулярного состава двухцепочной ДНК.
В случае, если определение целой последовательности невозможно или не представляет интереса,
определение последовательности, например, может быть ограничено ампликонами, полученными
после проведения конкретной ПЦР. Амликоны необходимо очищать и клонировать в плазмиде, у
которой после очищения можно определить последовательность.
Неопределенность, связанная с определением последовательности по методу. Сангера, часто может
рассматриваться как ничтожная, так что вероятность представления ошибочного основания
[6]
(вероятность погрешностей) очень мала. Для дальнейшего руководства см. Ссылочный документ .
2.3.5 Дополнительная характеризация (ведущая к несертифицированному значению)
В различных случаях количество ДНК является полезной дополнительной информацией о материале.
Количественное определение можно выполнить флуориметрическим методом. Однако при отсутствии
стандартных образцов, сертифицированных на количество ДНК, результирующим значением является
оценка величины ДНК.
2.3.6 Исследование пригодности
Исследование пригодности проводят для того чтобы убедиться, что материал соответствует заданным
целям и может использоваться по назначению. По существу, исследование пригодности должно
проводиться для возможности обнаружения проблем коммутативности.
В связи с тем, что примеры, использованные в настоящем документе, относятся к ССО
сертифицированным на их последовательность и предназначенным для применения в области
измерений ПЦР, планируемого назначение ПЦР разработано здесь.
Необходимо проверять правильное поведение качественного ССО относительно его назначения (т.е.
как калибрующее вещество ПЦР или позитивный контроль в ПЦР). Идеально, действие ССО может
быть проверено лабораториями — потенциальными (позднее) пользователями этого ССО.
Если тип ДНК отличается от проанализированных образцов и калибрующих веществ (т.е. gДНК и
плазмиды), необходимо проанализировать проблемы коммутативности. Калибрующее вещество
должно вести себя точно так же, как и исследуемый материал.
Пригодность ССО может зависеть не только от сертифицированных параметров (последовательность
ДНК), но также от несертифицированных параметров (т.е. количества ДНК). Необходимо принимать во
внимание данный факт при исследовании пригодности и однородности.
Положительный результат исследования пригодности свидетельствует о том, что материал
соответствует своему назначению.
2.3.7 Исследование однородности
ССО, сертифицированный на его последовательность ДНК, сертифицирован на идентичность.
Идентичность последовательности определяет структуру. Однородность материала, следовательно,
определяется чистотой материала.
Однако дополнительные исследования однородности должны проверить однородность, принимая во
внимание назначение ССО:
а) это может, например, касаться количества ДНК, для обоснования измерения массы двойной
цепочки ДНК в представительном числе ампул методом флуоресценции. Полученные данные
могут быть оценены как результаты исследования однородности (например, как описано в
[1]
Руководстве ISO 35 ), доказывающие, что масса ДНК в каждой ампуле отличается
незначительно (уровень доверия 95%).
b) для gДНК целостность ДНК может быть важным фактором и число ампул можно
проанализировать, используя электрофорез в геле. Одна полоса ДНК подтверждает
достаточную целостность gДНК в каждой ампуле.
c) необходимо проверять ПЦР-амплификацию в различных ампулах в случаях, когда ССО
предназначается для ПЦР. Для ПЦР в режиме реального времени эта проверка может включать
мониторинг порога точки пересечения (Ср) и/или температуры плавления. Это может
способствовать подтверждению идентичности последовательности (в рамках
последовательности ДНК, определенной праймерами).
Неопределенности, относящиеся к исследованиям однородности не должны превышать уровень, при
котором произвольный отбор ампул будет оказывать влияние на действие ССО. ССО,
сертифицированный на последовательность ДНК и предназначенный для использования при
позитивном контроле в ПЦР-применениях, должен, например, содержать в каждом своём экземпляре
достаточно ДНК, чтобы результат ПЦР не оказался отрицательным. Примеси могут оказывать влияние
на пригодность материала, если они вмешиваются в ПЦР, но не значимы, например, если они
касаются нецелевой ДНК и/или фоновой ДНК, добавленной для повышения стабильности целевой
ДНК в ССО.
2.3.8 Минимальный размер пробы
ССО, сертифицированный на последовательность ДНК, часто является чистым материалом. Поэтому,
[12]
классические исследования, предназначенные для исследования минимального размера пробы ,
неприменимы.
Альтернативно исследования пригодности и однородности, в которых СО использовался по своему
назначению, могут использоваться для демонстрации того, что определённое количество СО
достаточно для получения ожидаемых результатов. Для данной цели можно порекомендовать
минимальный размер пробы. Установление минимального размера пробы в этом случае скорее
напоминает типичную площадь отбора пробы, чем минимальный (возможный) размер пробы.
2.3.9 Кратковременная и долговременная стабильность
ССО может быть сертифицирован на его последовательность ДНК. Идентичность последовательности
едва ли можно изменить, даже если ухудшение ДНК, строго говоря, не влияет на идентичность.
Однако, при исследованиях кратковременной стабильности необходимо исследовать стабильность
при транспортировке, а при исследованиях долговременной стабильности — стабильность при
хранении, принимая во внимание назначение ССО. Основываясь на результате, следует выбирать
такие транспортные условия и сроки хранения ССО, которые не оказывают влияние на его назначение.
Неопределенности, связанные с исследованиями стабильности, должны обеспечивать возможность
использования материала без влияния на его действие, после определённого времени и/или
воздействия заданных температур.
2.3.10 Вероятность идентификации
Для идентификации не существует никакой концепции неопределенности. Вероятность неправильной
идентификации, например, последовательности ДНК материала, зачастую очень низкая. Для того,
чтобы это продемонстрировать, вероятность должна быть подтверждена тем фактом, что две
6 © ISO 2015 – Все права сохраняются

процедуры определения последовательности, независимо выполненные в разных лабораториях, дают
идентичные результаты с использованием прямого и обратного определения последовательности.
Однако, следует знать, что информация о последовательности ДНК используется для
«идентификации» материала. Эта идентификация может основываться на установленных схемах
классификации, которые сами по себе могут подвергаться изменениям. Поэтому необходимо
указывать, какая схема классификации использоваться в данное время.
Вероятность для неправильной идентификации в некоторых конкретных областях может быть
довольно высокой, например, если последовательности ДНК очень похожи, если происходит
наложение и доступность информации о пследовательности ДНК очень ограничена. Однако,
необходимо тщательно разграничивать вероятность неправильного результата последовательности
ДНК и вероятность неправильной идентификации, вызванной схемой классификации вследствие
ограниченной информации о ДНК.
2.3.11 Документальная и метрологическая прослеживаемость
Сертифицированная идентичность часто основывается на документальной прослеживаемости к
документу, связывающему последовательность ДНК к определённой идентичности. Дополнительно
существует метрологическая прослеживаемость для этапа подтверждения (например, красящий агент
для цикла последовательного определения или измерения ПЦР), проведенного для
последовательности ДНК.
Помимо метрологической прослеживаемости, представляет интерес прослеживаемость к схеме
классификации (возможность слежения).
3 Органические стандартные образы для качественного анализа
3.1 Общие сведения
Химическое измерение, независимо от того, количественное оно или качественное, требует
применения стандартных образцов, для которых правильно определен аналит. Соответственно
лабораториям рекомендуется приобретать сертифицированные стандартные образцы у
аккредитованных производителей стандартных образцов (RMP), дающих гарантию в том, что
идентичность их продукта правильно определена. Из-за недостатка в стандартных образцах,
сертифицированных на идентичность, лаборатории часто вынуждены покупать химикаты у известных
поставщиков химических веществ или просто используют образец «найденный на полке» и верить
этикетке производителя и/или соответствующей документации. Независимо от источника материала,
считается целесообразным подвергать его внутренней перекрестной проверке прежде, чем приступать
к программе испытаний с возможно некорректно промаркированным стандартным образцам.
Большинство современных лабораторий имеют доступ к селективным детекторам, связанным с
оборудованием жидкостной хроматографии (ЖХ-MС) или газовой хроматографии (ГХ-MС),
позволяющим получить хроматографическую характеристику имеющегося соединения.
Специализированные лаборатории могут также иметь доступ к инфракрасным спектрометрам (ИК),
которые могут дать дополнительное подтверждение структуры материала. Демонстрируемая
эквивалентность спектрам, представленным в литературе, в основном считается достаточной для
подтверждения структуры материала. Если литературные данные ограничены или отсутствуют,
аналитику придется выполнить намного больше работы для интерпретации информации о структуре
материала. Аналитик также должен оценивать недостатки этих методов, особенно, когда важны
принципы регио- и стереохимии. В таких случаях, рекомендуется использовать метод ядерной
магнитно-резонансной спектроскопии (ЯМР), так как данный метод обеспечивает точный структурный
анализ. Недостаток в данном случае состоит в необходимости иметь доступ к ЯМР-спектрометру и
квалифицированный персонал для интерпретации спектров, что может вызвать затруднения для
многих лабораторий. К счастью, многие химические факультеты университета теперь предлагают
такую услугу.
3.2 Проверка идентификации маркера стероидного злоупотребления
Следующий пример служит предупреждением для лабораторий об опасности приобретения химикатов
у коммерческих поставщиков, с целью использования их в качестве стандартного образца (СО) для
качественного анализа, без выполнения адекватной перекрестной проверки для подтверждения
идентичности.
7 β-Гидроксидегидроэпиандростерон (7 β-гидроксиДГЕА) 1, маркер стероидного злоупотребления
требуется для спортивного сообщества по допинг-контролю. Будучи человеческим продуктом обмена
веществ ДГЕА, достаточное количество 7 β гидроксиметаболита может быть выработано только путем
синтеза. Израсходовав первоначальную партию, Национальный институт измерений Австралии
приобрел 7 β-гидроксиДГЕА у коммерческой компании, специализирующейся на поставке стероидов. К
сожалению, полученное соединение не было требующимся 7 β- гидроксиДГЕА, а соединением с
аналогичной структурой. Подозрения впервые возникли, когда выяснилось, что характеристики
растворимости купленного материала не соответствуют характеристикам первоначально
сертифицированного материала. Инфракрасный спектральный анализ, хотя и подтвердил присутствие
-1
) и, по крайней мере одной гидроксильной группы
кетонной группы (наибольший пик в 1732 см
-1
(широкий пик в 3283 cm ) не соответствовал ИК спектру сертифицированного образца, который
-1
показал сильный карбониловый пик в 1726 cm и относительно узкую гидроксильную полосу в 3447-
-1
3474 cm . Метод ГХ-МС, основанный на коэлюционном исследовании (Рисунок 1) достоверно
подтвердил, что приобретенный образец имел неправильно приписанные значения, хотя следует
отметить заметить, что разделение двух соединений требовало существенной оптимизации условий
хроматографии.
Рисунок 1 — Метод ГХ-МС, основанный на коэлюционном исследовании коммерческого
неизвестного материала (r.t. = 10,1 мин) и 7 β- гидроксиДГЕА (r.t. = 10,4 мин)
Соответствующие массовые спектры (Рисунок 2) двух соединений чётко различаются, хотя ключевые
пики одинаковы для каждого. Оба соединения позволяют использовать слабый молекулярный ион (304
m/z), и основной пик в 286 m/z, представляющий потерю воды, в то время как пики в 271 и 268 m/z
представляют потерю метиловой группы и второй молекулы воды соответственно, в соответствии с
предложенной структурой. Подобный сценарий наблюдался для tris-TMS производного каждого
соединения. Наблюдение исчезающе малого молекулярного иона в 520 m/z в каждом случае и
ключевых фрагментов, общих для обоих соединений, дало дополнительные доказательства, что
необходимая функциональность присутствовала на обоих стероидах. Возможность, которую
предусматривал 7 β- гидроксиДГЕА, была снова исключена, на основе непосредственного сравнения с
сертифицированным стандартным образцом, который показал почти идентичные ИК и МС спектры для
требующегося 7 β-диастереомера.
8 © ISO 2015 – Все права сохраняются

Рисунок 2 — Электронные ионизирующие масс-спектры неизвестного материала (r.t. = 10,1 мин)
и 7 β- гидроксиДГЕА (r.t. = 10,4 мин)
Н ЯМР-анализ
...