Water quality — Determination of the genotoxicity of water and waste water using the umu-test

This International Standard specifies a procedure which can be used to determine the genotoxicity1) of water and waste water using the umu-test. This assay is based on the detection of genotoxicity of a test sample which increases the expression of the SOSrepair system2) associated with the umuC-gene3).

Qualité de l'eau — Détermination de la génotoxicité des eaux et des eaux résiduaires à l'aide de l'essai umu

La présente Norme internationale spécifie une procédure qui peut être utilisée pour déterminer la génotoxicité1) des eaux et des eaux résiduaires à l'aide de l'essai umu. L'essai est basé sur la recherche de la génotoxicité d'un échantillon d'essai qui augmente l'expression du système réparateur de secours2) associé au gène umuC3).

Kakovost vode - Določevanje genotoksičnosti vode in odpadne vode z umu-preskusom

Ta mednarodni standard opredeljuje postopek, ki se lahko uporablja za določevanje genotoksičnosti vode in odpadne vode z umu-preskusom. Ta določitev kemične sestave snovi je osnovana na detekciji genotoksičnosti preskusnega vzorca, ki povečuje iztiskanje SOS okrevalni sistema, povezanega z umuC-gene3.

General Information

Status
Published
Publication Date
29-Mar-2000
Current Stage
9093 - International Standard confirmed
Start Date
15-Aug-2005
Completion Date
21-Dec-2021

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ISO 13829:2000 - Water quality -- Determination of the genotoxicity of water and waste water using the umu-test
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ISO 13829:2010
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ISO 13829:2000 - Qualité de l'eau -- Détermination de la génotoxicité des eaux et des eaux résiduaires a l'aide de l'essai umu
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Standards Content (sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 13829
First edition
2000-03-15
Water quality — Determination of the
genotoxicity of water and waste water
using the umu-test
Qualité de l'eau — Détermination de la génotoxicité des eaux et des eaux
résiduaires àl'aidedel'essaiumu
Reference number
ISO 13829:2000(E)
ISO 2000
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 13829:2000(E)
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that a problem relating to it is found, please inform the Central Secretariat at the address given below.

© ISO 2000

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ISO copyright office
Case postale 56 � CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 734 10 79
E-mail copyright@iso.ch
Web www.iso.ch
Printed in Switzerland
ii © ISO 2000 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 13829:2000(E)
Contents Page

Foreword.....................................................................................................................................................................iv

Introduction.................................................................................................................................................................v

1 Scope ..............................................................................................................................................................1

2 Normative reference ......................................................................................................................................1

3 Terms and definitions ...................................................................................................................................1

4 Principle..........................................................................................................................................................3

5 Test organism and reagents.........................................................................................................................3

6 Apparatus .......................................................................................................................................................5

7 Sample preparation and preservation .........................................................................................................5

8 Interferences ..................................................................................................................................................6

9 Test performance...........................................................................................................................................6

10 Measurements................................................................................................................................................8

11 Calculation and expression of results.........................................................................................................9

12 Precision.......................................................................................................................................................10

13 Validity criteria .............................................................................................................................................10

14 Test report ....................................................................................................................................................10

Annex A (informative) General definitions and terms regarding genotoxicity ...................................................11

Annex B (informative) Salmonella typhimurium TA1535/pSK1002 ......................................................................12

Annex C (informative) Composition of the sample and control wells .................................................................13

Annex D (informative) Lowest value of the dilution series ...................................................................................14

Annex E (informative) Checking the genotype.......................................................................................................15

Annex F (informative) Precision data from an interlaboratory study ..................................................................16

Annex G (informative) Final protocol for the umu-test..........................................................................................17

Bibliography..............................................................................................................................................................18

© ISO 2000 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 13829:2000(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO

member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical

committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has

the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in

liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical

Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.

International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.

Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.

Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this International Standard may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.

International Standard ISO 13829 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality,

Subcommittee SC 5, Biological methods.
Annexes A to G of this International Standard are for information only.
iv © ISO 2000 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 13829:2000(E)
Introduction

The genetically engineered bacterium Salmonella typhimurium TA1535/pSK1002 serves as a test organism.

The bacteria are exposed under controlled conditions to different concentrations of the samples to be tested. The

test is based on the capability of genotoxic agents to induce the umuC-gene in the Salmonella strain in response to

genotoxic lesions in the DNA.

Due to its capability to respond to different types of genotoxic lesions, only one single strain is necessary to detect

different kinds of genotoxic substances.

The induction of the umuC-gene is thus a measure for the genotoxic potential of the sample. Since the umuC-gene

is fused with the lacZ-gene for �-galactosidase, the induction of the umuC-gene can be easily assessed by

determination of the�-galactosidase activity.
© ISO 2000 – All rights reserved v
---------------------- Page: 5 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 13829:2000(E)
Water quality — Determination of the genotoxicity of water and
waste water using the umu-test

WARNING — This test involves the use of genetically modified organisms. National or international

licensing may restrict the use of these organisms.

Test conducted according to this International Standard should be carried out by qualified experts or by a

qualified testing laboratory.

When applying this International Standard it is necessary in each case, depending on the range to be

tested, to determine if and to which extent additional criteria should be established.

1 Scope

This International Standard specifies a procedure which can be used to determine the genotoxicity of water and

waste water using the umu-test.

This assay is based on the detection of genotoxicity of a test sample which increases the expression of the SOS-

2) 3)
repair system associated with the umuC-gene .
2 Normative reference

The following normative document contains provisions which, through reference in this text, constitute provisions of

this International Standard. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, any of these

publications do not apply. However, parties to agreements based on this International Standard are encouraged to

investigate the possibility of applying the most recent edition of the normative document indicated below. For

undated references, the latest edition of the normative document referred to applies. Members of ISO and IEC

maintain registers of currently valid International Standards.

ISO 5667-16, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples.

3 Terms and definitions

For the purposes of this International Standard, the following terms and definitions apply. Other related terms and

definitions have been included in annex A for information.
3.1
stock culture

culture of a bacterial strain to preserve the original test strain and to prepare the inoculation material for the

overnight culture or the pre-culture
1) Toxicity which specifically affects the genome (genetic material).

2) SOS repair occurs when cells are overwhelmed by genotoxins allowing the cell to survive at the cost of mutagenesis.

3) umuC-gene is the acronym for UV mutagenesis gene C. The induction of the umuC-gene is part of the specific response of

the bacterial cell to DNA-damage.
© ISO 2000 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 13829:2000(E)
3.2
overnight culture
culture of test bacteria for the preparation of the pre-culture
3.3
pre-culture

culture for adaptation of the overnight culture to the test conditions and to prepare the inoculum for the assay

3.4
inoculum
inoculation material
aliquot of a bacterial suspension used for inoculation in the assay
3.5
concentration effect relationship

induction of the umuC-gene depending on the concentration of genotoxic agents in the test sample

3.6
culture medium
aqueous solution of nutrients required for bacterial growth
3.7
test sample
the sample to be tested, after finishing all preparations

EXAMPLES Preparations may include centrifugation, filtration, homogenization, pH adjustment and measurement of

conductivity.
3.8
dilution series
mixture of the test sample and dilution water in varying proportions
3.9
test mixture
mixture of culture medium, inoculum and dilution series
3.10
negative control
culture medium
3.10.1
blank
culture medium without bacteria
3.10.2
negative control for test samples
mixture of culture medium, inoculum and distilled water
3.10.3
solvent control
mixture of culture medium, inoculum and dimethyl sulfoxide
3.11
positive control
mixture of culture medium, inoculum and a dissolved genotoxic substance

EXAMPLES Typical genotoxic substances are 4-nitroquinoline-N-oxide or 2-aminoanthracene in the case of metabolic

activation.
2 © ISO 2000 – All rights reserved
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 13829:2000(E)
3.12
S9 fraction

�metabolic activation system� 9 000 g centrifugation supernatant prepared from the livers of male rats pretreated

with enzyme-inducing agents

NOTE Bacteria are exposed to the test sample both with and without an appropriate metabolic activation system.

4Principle

The test organisms are exposed to the test sample with and without metabolic activation system using microplates.

After 4 h of incubation, the genotoxin-dependent induction of the umuC-gene is compared to the spontaneous

activation of the untreated, control culture.
5 Test organism and reagents
5.1 Test organism and stock culture
5.1.1 Test organism

Salmonella typhimurium is a gram-negative, facultative, anaerobic bacterium from the Enterobacteriaceae family.

Salmonella typhimurium TA1535 is the original strain. The test organism carries the plasmid pSK1002 with the

umuC-lacZ gene and a gene for ampicillin resistance. The designation of this Salmonella strain is "TA1535/

pSK1002" (see annex B). This bacterial strain can be easily selected due to its ampicillin resistance.

5.1.2 Stock culture preparation and preservation

Preserve Salmonella typhimurium TA1535/pSK1002 in 150 μl culture medium with 10 % dimethyl sulfoxide (DMSO)

or 20 % glycerol in 2 ml ampoules at a temperature not above � 80 °C. For the preparation of an overnight culture

only one ampoule is used.
5.2 Reagents

Chemicals shall be of analytical grade. Prepare all solutions with purified deionized water or water of equivalent

purity.
5.2.1 Hydrochloric acid, c(HCl) = 1mol/l.
5.2.2 Sodium hydroxide solution, c(NaOH) = 1 mol/l.
5.2.3 Dimethyl sulfoxide (DMSO),C H SO .
2 6 4
WARNING — DMSO forms mutagenic products over a period of time.

5.2.4 TGA-culture medium, consisting of tryptone, glucose and ampicillin, prepared as follows.

Dissolve 10 g of tryptone, 5 g of sodium chloride (NaCl) and 11,9 g of 4-(2-hydroxyethyl)-I-

piperazineethanesulphonic acid (HEPES) in water, adjust the pH-value to 7,0� 0,2, dilute to 980 ml and autoclave

for 20 min at 121 °C. Dissolve 2 g of D(+)-glucose (anhydrous) in 20 ml distilled water and autoclave separately.

After autoclaving, mix the two solutions in equal proportions and add 50 mg of ampicillin to 1 000 ml of cooled TGA

medium under sterile conditions. The solution can be stored in portions at � 20 °C for up to 4 weeks.

5.2.5 Concentrated 10�����TGA-culture medium, consisting of a tenfold concentrated TGA (5.2.4) solution, which

canbestoredfor 14days at4°C.
© ISO 2000 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 13829:2000(E)
5.2.5.1 For incubation without S9, prepared as follows.

Dissolve 10 g of tryptone, 5 g of sodium chloride (NaCl) and 11,9 g of HEPES in 80 ml water. Adjust the pH-value

to 7,0� 0,2. Dissolve 2 g of D(+)-glucose (anhydrous) in 20 ml of water. Autoclave the solutions separately for

20 min at 121 °C, mix the solutions and add 50 mg of ampicillin to 100 ml of the mixed solution under sterile

conditions.
5.2.5.2 For incubation with S9, prepared as follows.

Dissolve 10 g of tryptone, 5 g of sodium chloride (NaCl), 2,46 g of potassium chloride (KCl), 1,63 g of magnesium

chloride hexahydrate (MgCl �6H O), and 11,9 g of HEPES in 80 ml of water. Adjust the pH to 7,0� 0,2. Dissolve

2 2

2gof D(+)-glucose (anhydrous) in 20 ml of distilled water. Autoclave both solutions separately for 20 min at 121 °C,

mix the solutions and add 50 mg of ampicillin to 100 ml mixed solution under sterile conditions.

5.2.6 B-buffer , consisting of a cell-lysis and reaction buffer, prepared as follows.

Dissolve 20,18 g of disodium hydrogenphosphate dihydrate (Na HPO �2H 0), 5,5 g of sodium

2 4 2

dihydrogenphosphate monohydrate (NaH PO � H O), 0,75 g of potassium chloride (KCl), 0,25 g of magnesium

2 4 2

sulfate heptahydrate (MgSO �7H 0) in 900 ml water. Adjust the pH to 7,0� 0,2. Then add 1,0 g of

4 2

sodiumdodecylsulfate (SDS) and dilute to 1 000 ml. Before use, add 0,27 ml of 2-mercaptoethanol to 100 ml of

B-buffer and mix.
5.2.7 Phosphate buffer pH (7,0���� 0,2) .

Dissolve 1,086 g disodium hydrogenphosphate dihydrate (Na HPO �2H 0) and 0,538 g sodium

2 4 2
dihydrogenphosphate monohydrate (NaH PO � H O) in 100 ml water.
2 4 2

If necessary adjust pH value to 7,0� 0,2. Autoclave the solution at 121 °C for 20 min.

5.2.8 Stop reagent .

Dissolve 105,99 g of sodium carbonate (Na CO ) in 900 ml water and dilute to 1 000 ml.

2 3
5.2.9 o-Nitrophenol-����-D-galactopyranoside (ONPG) solution.
Dissolve 45 mg ONPG in 10 ml phosphate buffer (5.2.7).

Due to the poor solubility of ONPG, prepare this solution in advance and stir at room temperature in the dark until

completely dissolved (approximately 2 h). Keep the solution in the dark.
5.2.10 S9 fraction, the required quantity being taken from the freezer.

Immediately after thawing, the S9 fraction is to be cooled on ice until use. Shake briefly before adding to the pre-

culture.
NOTE The S9 fraction is available commercially.

5.2.11 Cofactor solution, consisting of a freshly prepared solution, kept on ice during the test and prepared as

follows.

Dissolve 148 mg NADP (sodium salt) and 76 mg glucose-6-phosphate (disodium salt) in 5 ml 10� TGA (5.2.5).

5.2.12 Positive-control substances in dimethysulfoxide (DMSO), prepared as follows.

Warning — 2-AA can be rapidly photooxidized. Avoid prolonged exposure to light.
4) This solution can be stored at room temperature.
4 © ISO 2000 – All rights reserved
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 13829:2000(E)

Dissolve 5 mg of 4-nitroquinoline-N-oxide (4-NQO) in 5 ml of DMSO. This stock solution can be stored in aliquots at

� 20 °C.

Prior to the test dilute 2 000-fold using a 30 % by volume DMSO solution (DMSO/distilled water: 3/7).

Dissolve 5 mg of aminoanthracene (2-AA) in 5 ml of DMSO. This stock solution can be stored in aliquots at

� 20 °C.

Prior to the test, dilute 500-fold using a 30 % by volume DMSO solution (DMSO/distilled water: 3/7).

6 Apparatus
The apparatus shall consist of the following:
� storage bottles: 250 ml and 500 ml;
� pipettes with rated volume: 1 ml, 10 ml, 25 ml;

� multi-channel pipettes (8 channel) having volumes: 5 μl to 50 μl, 50 μl to 200 μl, 50 μl to 300 μl;

� reservoirs for charging the multi-channel pipettes having volumes: 17 ml and 34 ml;

� measuring cylinders: 500 ml;
� culture vessels, conical flasks: 100 ml;
� sterile preservation ampoules: 2 ml (cryotubes);
� thermometer capable of measuring in the range 25 °C to 30 °C (�1°C);
� temperature- and time-controlled water bath;

� microplate-incubator for (28� 1) °C and (37� 1) °C with shaker (frequency of 125 r/min to 150 r/min);

� autoclave;
� centrifuge;

� 96-well microplates with lids and flat transparent bottoms (well capacity 380 μl);

� pH-meter;
� UV/Vis photometer (1 cm cuvettes);
� photometer for the microplates.
7 Sample preparation and preservation
Test water and waste water samples as soon as possible after sampling.

If immediate testing is not possible, store the sample at 4 °C. In this case, analyse the sample within 48 h after

collection. Otherwise, keep the sample at a temperature below� 18 °C in accordance with ISO 5667-16.

In exceptional cases, additional preparation m
...

SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 13829:2010
01-september-2010
.DNRYRVWYRGH'RORþHYDQMHJHQRWRNVLþQRVWLYRGHLQRGSDGQHYRGH]XPX
SUHVNXVRP

Water quality - Determination of the genotoxicity of water and waste water using the umu

-test

Qualité de l'eau - Détermination de la génotoxicité des eaux et des eaux résiduaires à

l'aide de l'essai umu
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 13829:2000
ICS:
13.060.70 Preiskava bioloških lastnosti Examination of biological
vode properties of water
SIST ISO 13829:2010 en,fr

2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.

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SIST ISO 13829:2010
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SIST ISO 13829:2010
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 13829
First edition
2000-03-15
Water quality — Determination of the
genotoxicity of water and waste water
using the umu-test
Qualité de l'eau — Détermination de la génotoxicité des eaux et des eaux
résiduaires àl'aidedel'essaiumu
Reference number
ISO 13829:2000(E)
ISO 2000
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ISO 13829:2000(E)
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ISO 13829:2000(E)
Contents Page

Foreword.....................................................................................................................................................................iv

Introduction.................................................................................................................................................................v

1 Scope ..............................................................................................................................................................1

2 Normative reference ......................................................................................................................................1

3 Terms and definitions ...................................................................................................................................1

4 Principle..........................................................................................................................................................3

5 Test organism and reagents.........................................................................................................................3

6 Apparatus .......................................................................................................................................................5

7 Sample preparation and preservation .........................................................................................................5

8 Interferences ..................................................................................................................................................6

9 Test performance...........................................................................................................................................6

10 Measurements................................................................................................................................................8

11 Calculation and expression of results.........................................................................................................9

12 Precision.......................................................................................................................................................10

13 Validity criteria .............................................................................................................................................10

14 Test report ....................................................................................................................................................10

Annex A (informative) General definitions and terms regarding genotoxicity ...................................................11

Annex B (informative) Salmonella typhimurium TA1535/pSK1002 ......................................................................12

Annex C (informative) Composition of the sample and control wells .................................................................13

Annex D (informative) Lowest value of the dilution series ...................................................................................14

Annex E (informative) Checking the genotype.......................................................................................................15

Annex F (informative) Precision data from an interlaboratory study ..................................................................16

Annex G (informative) Final protocol for the umu-test..........................................................................................17

Bibliography..............................................................................................................................................................18

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SIST ISO 13829:2010
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Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO

member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical

committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has

the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in

liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical

Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.

International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.

Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.

Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this International Standard may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.

International Standard ISO 13829 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality,

Subcommittee SC 5, Biological methods.
Annexes A to G of this International Standard are for information only.
iv © ISO 2000 – All rights reserved
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SIST ISO 13829:2010
ISO 13829:2000(E)
Introduction

The genetically engineered bacterium Salmonella typhimurium TA1535/pSK1002 serves as a test organism.

The bacteria are exposed under controlled conditions to different concentrations of the samples to be tested. The

test is based on the capability of genotoxic agents to induce the umuC-gene in the Salmonella strain in response to

genotoxic lesions in the DNA.

Due to its capability to respond to different types of genotoxic lesions, only one single strain is necessary to detect

different kinds of genotoxic substances.

The induction of the umuC-gene is thus a measure for the genotoxic potential of the sample. Since the umuC-gene

is fused with the lacZ-gene for �-galactosidase, the induction of the umuC-gene can be easily assessed by

determination of the�-galactosidase activity.
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SIST ISO 13829:2010
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Water quality — Determination of the genotoxicity of water and
waste water using the umu-test

WARNING — This test involves the use of genetically modified organisms. National or international

licensing may restrict the use of these organisms.

Test conducted according to this International Standard should be carried out by qualified experts or by a

qualified testing laboratory.

When applying this International Standard it is necessary in each case, depending on the range to be

tested, to determine if and to which extent additional criteria should be established.

1 Scope

This International Standard specifies a procedure which can be used to determine the genotoxicity of water and

waste water using the umu-test.

This assay is based on the detection of genotoxicity of a test sample which increases the expression of the SOS-

2) 3)
repair system associated with the umuC-gene .
2 Normative reference

The following normative document contains provisions which, through reference in this text, constitute provisions of

this International Standard. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, any of these

publications do not apply. However, parties to agreements based on this International Standard are encouraged to

investigate the possibility of applying the most recent edition of the normative document indicated below. For

undated references, the latest edition of the normative document referred to applies. Members of ISO and IEC

maintain registers of currently valid International Standards.

ISO 5667-16, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples.

3 Terms and definitions

For the purposes of this International Standard, the following terms and definitions apply. Other related terms and

definitions have been included in annex A for information.
3.1
stock culture

culture of a bacterial strain to preserve the original test strain and to prepare the inoculation material for the

overnight culture or the pre-culture
1) Toxicity which specifically affects the genome (genetic material).

2) SOS repair occurs when cells are overwhelmed by genotoxins allowing the cell to survive at the cost of mutagenesis.

3) umuC-gene is the acronym for UV mutagenesis gene C. The induction of the umuC-gene is part of the specific response of

the bacterial cell to DNA-damage.
© ISO 2000 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 9 ----------------------
SIST ISO 13829:2010
ISO 13829:2000(E)
3.2
overnight culture
culture of test bacteria for the preparation of the pre-culture
3.3
pre-culture

culture for adaptation of the overnight culture to the test conditions and to prepare the inoculum for the assay

3.4
inoculum
inoculation material
aliquot of a bacterial suspension used for inoculation in the assay
3.5
concentration effect relationship

induction of the umuC-gene depending on the concentration of genotoxic agents in the test sample

3.6
culture medium
aqueous solution of nutrients required for bacterial growth
3.7
test sample
the sample to be tested, after finishing all preparations

EXAMPLES Preparations may include centrifugation, filtration, homogenization, pH adjustment and measurement of

conductivity.
3.8
dilution series
mixture of the test sample and dilution water in varying proportions
3.9
test mixture
mixture of culture medium, inoculum and dilution series
3.10
negative control
culture medium
3.10.1
blank
culture medium without bacteria
3.10.2
negative control for test samples
mixture of culture medium, inoculum and distilled water
3.10.3
solvent control
mixture of culture medium, inoculum and dimethyl sulfoxide
3.11
positive control
mixture of culture medium, inoculum and a dissolved genotoxic substance

EXAMPLES Typical genotoxic substances are 4-nitroquinoline-N-oxide or 2-aminoanthracene in the case of metabolic

activation.
2 © ISO 2000 – All rights reserved
---------------------- Page: 10 ----------------------
SIST ISO 13829:2010
ISO 13829:2000(E)
3.12
S9 fraction

�metabolic activation system� 9 000 g centrifugation supernatant prepared from the livers of male rats pretreated

with enzyme-inducing agents

NOTE Bacteria are exposed to the test sample both with and without an appropriate metabolic activation system.

4Principle

The test organisms are exposed to the test sample with and without metabolic activation system using microplates.

After 4 h of incubation, the genotoxin-dependent induction of the umuC-gene is compared to the spontaneous

activation of the untreated, control culture.
5 Test organism and reagents
5.1 Test organism and stock culture
5.1.1 Test organism

Salmonella typhimurium is a gram-negative, facultative, anaerobic bacterium from the Enterobacteriaceae family.

Salmonella typhimurium TA1535 is the original strain. The test organism carries the plasmid pSK1002 with the

umuC-lacZ gene and a gene for ampicillin resistance. The designation of this Salmonella strain is "TA1535/

pSK1002" (see annex B). This bacterial strain can be easily selected due to its ampicillin resistance.

5.1.2 Stock culture preparation and preservation

Preserve Salmonella typhimurium TA1535/pSK1002 in 150 μl culture medium with 10 % dimethyl sulfoxide (DMSO)

or 20 % glycerol in 2 ml ampoules at a temperature not above � 80 °C. For the preparation of an overnight culture

only one ampoule is used.
5.2 Reagents

Chemicals shall be of analytical grade. Prepare all solutions with purified deionized water or water of equivalent

purity.
5.2.1 Hydrochloric acid, c(HCl) = 1mol/l.
5.2.2 Sodium hydroxide solution, c(NaOH) = 1 mol/l.
5.2.3 Dimethyl sulfoxide (DMSO),C H SO .
2 6 4
WARNING — DMSO forms mutagenic products over a period of time.

5.2.4 TGA-culture medium, consisting of tryptone, glucose and ampicillin, prepared as follows.

Dissolve 10 g of tryptone, 5 g of sodium chloride (NaCl) and 11,9 g of 4-(2-hydroxyethyl)-I-

piperazineethanesulphonic acid (HEPES) in water, adjust the pH-value to 7,0� 0,2, dilute to 980 ml and autoclave

for 20 min at 121 °C. Dissolve 2 g of D(+)-glucose (anhydrous) in 20 ml distilled water and autoclave separately.

After autoclaving, mix the two solutions in equal proportions and add 50 mg of ampicillin to 1 000 ml of cooled TGA

medium under sterile conditions. The solution can be stored in portions at � 20 °C for up to 4 weeks.

5.2.5 Concentrated 10�����TGA-culture medium, consisting of a tenfold concentrated TGA (5.2.4) solution, which

canbestoredfor 14days at4°C.
© ISO 2000 – All rights reserved 3
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SIST ISO 13829:2010
ISO 13829:2000(E)
5.2.5.1 For incubation without S9, prepared as follows.

Dissolve 10 g of tryptone, 5 g of sodium chloride (NaCl) and 11,9 g of HEPES in 80 ml water. Adjust the pH-value

to 7,0� 0,2. Dissolve 2 g of D(+)-glucose (anhydrous) in 20 ml of water. Autoclave the solutions separately for

20 min at 121 °C, mix the solutions and add 50 mg of ampicillin to 100 ml of the mixed solution under sterile

conditions.
5.2.5.2 For incubation with S9, prepared as follows.

Dissolve 10 g of tryptone, 5 g of sodium chloride (NaCl), 2,46 g of potassium chloride (KCl), 1,63 g of magnesium

chloride hexahydrate (MgCl �6H O), and 11,9 g of HEPES in 80 ml of water. Adjust the pH to 7,0� 0,2. Dissolve

2 2

2gof D(+)-glucose (anhydrous) in 20 ml of distilled water. Autoclave both solutions separately for 20 min at 121 °C,

mix the solutions and add 50 mg of ampicillin to 100 ml mixed solution under sterile conditions.

5.2.6 B-buffer , consisting of a cell-lysis and reaction buffer, prepared as follows.

Dissolve 20,18 g of disodium hydrogenphosphate dihydrate (Na HPO �2H 0), 5,5 g of sodium

2 4 2

dihydrogenphosphate monohydrate (NaH PO � H O), 0,75 g of potassium chloride (KCl), 0,25 g of magnesium

2 4 2

sulfate heptahydrate (MgSO �7H 0) in 900 ml water. Adjust the pH to 7,0� 0,2. Then add 1,0 g of

4 2

sodiumdodecylsulfate (SDS) and dilute to 1 000 ml. Before use, add 0,27 ml of 2-mercaptoethanol to 100 ml of

B-buffer and mix.
5.2.7 Phosphate buffer pH (7,0���� 0,2) .

Dissolve 1,086 g disodium hydrogenphosphate dihydrate (Na HPO �2H 0) and 0,538 g sodium

2 4 2
dihydrogenphosphate monohydrate (NaH PO � H O) in 100 ml water.
2 4 2

If necessary adjust pH value to 7,0� 0,2. Autoclave the solution at 121 °C for 20 min.

5.2.8 Stop reagent .

Dissolve 105,99 g of sodium carbonate (Na CO ) in 900 ml water and dilute to 1 000 ml.

2 3
5.2.9 o-Nitrophenol-����-D-galactopyranoside (ONPG) solution.
Dissolve 45 mg ONPG in 10 ml phosphate buffer (5.2.7).

Due to the poor solubility of ONPG, prepare this solution in advance and stir at room temperature in the dark until

completely dissolved (approximately 2 h). Keep the solution in the dark.
5.2.10 S9 fraction, the required quantity being taken from the freezer.

Immediately after thawing, the S9 fraction is to be cooled on ice until use. Shake briefly before adding to the pre-

culture.
NOTE The S9 fraction is available commercially.

5.2.11 Cofactor solution, consisting of a freshly prepared solution, kept on ice during the test and prepared as

follows.

Dissolve 148 mg NADP (sodium salt) and 76 mg glucose-6-phosphate (disodium salt) in 5 ml 10� TGA (5.2.5).

5.2.12 Positive-control substances in dimethysulfoxide (DMSO), prepared as follows.

Warning — 2-AA can be rapidly photooxidized. Avoid prolonged exposure to light.
4) This solution can be stored at room temperature.
4 © ISO 2000 – All rights reserved
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SIST ISO 13829:2010
ISO 13829:2000(E)

Dissolve 5 mg of 4-nitroquinoline-N-oxide (4-NQO) in 5 ml of DMSO. This stock solution can be stored in aliquots at

� 20 °C.

Prior to the test dilute 2 000-fold using a 30 % by volume DMSO solution (DMSO/distilled water: 3/7).

Dissolve 5 mg of aminoanthracene (2-AA) in 5 ml of DMSO. This stock solution can be stored in aliquots at

� 20 °C.

Prior to the test, dilute 500-fold using a 30 % by volume DMSO solution (DMSO/distilled water: 3/7).

6 Apparatus
The apparatus shall consist of the following:
� storage bottles: 250 ml and 500 ml;
� pipettes with rated volume: 1 ml, 10 ml, 25 ml;

� multi-channel pipettes (8 channel) having volumes: 5 μl to 50 μl, 50 μl to 200 μl, 50 μl to 300 μl;

� reservoirs for charging the multi-channel pipettes having volumes: 17 ml and 34 ml;

� measuring cylinders: 500 ml;
� culture vessels, conical flasks: 100 ml;
� sterile preservation ampoules: 2 ml (cryotubes);
� thermometer capable of measuring in the range 25 °C to 30 °C (�1°C);
� temperature- and time-controlled water bath;

� microplate-incubator for (28� 1) °C and (37� 1) °C with shaker (frequency of 125 r/min to 150 r/min);

� autoclave;
� centrifuge;
� 96-well microplates with lids and flat transparent bottoms (well capacity
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 13829
Première édition
2000-03-15
Qualité de l'eau — Détermination de la
génotoxicité des eaux et des eaux
résiduaires à l'aide de l'essai umu
Water quality — Determination of the genotoxicity of water and waste water
using the umu-test
Numéro de référence
ISO 13829:2000(F)
ISO 2000
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ISO 13829:2000(F)
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ii © ISO 2000 – Tous droits réservés
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ISO 13829:2000(F)
Sommaire Page

Avant-propos..............................................................................................................................................................iv

Introduction.................................................................................................................................................................v

1 Domaine d'application...................................................................................................................................1

2 Référence normative .....................................................................................................................................1

3 Termes et définitions.....................................................................................................................................1

4 Principe...........................................................................................................................................................3

5 Organisme d’essai et réactifs.......................................................................................................................3

6 Appareillage ...................................................................................................................................................5

7 Préparation et conservation d’échantillon..................................................................................................6

8 Interférences ..................................................................................................................................................6

9 Réalisation de l'essai.....................................................................................................................................6

10 Mesurages ......................................................................................................................................................9

11 Calcul et expression des résultats...............................................................................................................9

12 Fidélité ..........................................................................................................................................................10

13 Critères de validité.......................................................................................................................................10

14 Rapport d’essai............................................................................................................................................11

Annexe A (informative) Définitions générales et termes concernant la génotoxicité........................................12

Annexe B (informative) Salmonella typhimurium TA1535/pSK1002....................................................................13

Annexe C (informative) Composition du contenu des puits-échantillons et des puits-témoins ......................14

Annexe D (informative) Plus faible valeur de la série de dilutions ......................................................................15

Annexe E (informative) Vérification du génotype ..................................................................................................16

Annexe F (informative) Données de fidélité résultant d'une étude interlaboratoire ..........................................17

Annexe G (informative) Protocole final de l'essai umu .........................................................................................18

Bibliographie .............................................................................................................................................................19

© ISO 2000 – Tous droits réservés iii
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ISO 13829:2000(F)
Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de

normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux

comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité

technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en

liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission

électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.

Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 3.

Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour

vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités

membres votants.

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments de la présente Norme internationale peuvent faire

l’objet de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de

ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.

La Norme internationale ISO 13829 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau,

sous-comité SC 5, Méthodes biologiques.

Les annexes A à G de la présente Norme internationale sont données uniquement à titre d'information.

iv © ISO 2000 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 13829:2000(F)
Introduction

L’organisme d’essai est la bactérie génétiquement modifiée Salmonella typhimurium TA1535/pSK1002.

Les bactéries sont exposées, dans des conditions controlées, à différentes concentrations des échantillons à

expérimenter. L’essai est basé sur la capacité des agents génotoxiques à induire le gène umuC dans la souche

Salmonella en réponse aux liaisons génotoxiques de l’ADN.

Du fait de sa capacité à réagir à différents types de liaisons génotoxiques, une seule souche suffit à déceler

différents types de substances génotoxiques.

L’induction du gène umuC représente ainsi une mesure du potentiel génotoxique de l’échantillon. Dans la mesure

où le gène umuC s’identifie au gène lacZ de la �-galactosidase, l’induction du gène umuC peut être facilement

évaluée par détermination de l’activité de la�-galactosidase.
© ISO 2000 – Tous droits réservés v
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NORME INTERNATIONALE ISO 13829:2000(F)
Qualité de l'eau — Détermination de la génotoxicité des eaux et
des eaux résiduaires à l'aide de l'essai umu

AVERTISSEMENT — Le présent essai implique l’utilisation d’organismes génétiquement modifiés.

L’utilisation de tels organismes peut être soumise à des autorisations nationales ou internationales.

Il convient que les essais réalisés conformément à la présente Norme internationale soient effectués par

des experts qualifiés ou par un laboratoire d’essai qualifié.

L’application de la présente Norme internationale implique, dans tous les cas, de déterminer, en fonction

du domaine de travail étudié, la nécessité de prendre en compte d’éventuels critères supplémentaires.

1 Domaine d'application

La présente Norme internationale spécifie une procédure qui peut être utilisée pour déterminer la génotoxicité

des eaux et des eaux résiduaires à l'aide de l'essai umu.

L'essai est basé sur la recherche de la génotoxicité d'un échantillon d'essai qui augmente l'expression du système

2) 3)
réparateur de secours associé au gène umuC .
2 Référence normative

Le document normatif suivant contient des dispositions qui, par suite de la référence qui y est faite, constituent des

dispositions valables pour la présente Norme internationale. Pour les références datées, les amendements

ultérieurs ou les révisions de ces publications ne s’appliquent pas. Toutefois, les parties prenantes aux accords

fondés sur la présente Norme internationale sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer l’édition la plus

récente du document normatif indiqué ci-après. Pour les références non datées, la dernière édition du document

normatif en référence s’applique. Les membres de l'ISO et de la CEI possèdent le registre des Normes

internationales en vigueur.

ISO 5667-16, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Part 16: Lignes directrices pour les essais biologiques des

échantillons.
3 Termes et définitions

Pour les besoins de la présente Norme internationale, les termes et définitions suivants s'appliquent. D’autres

termes et définitions connexes ont été inclus dans l’annexe A pour information.
1) Toxicité qui affecte de manière spécifique le génome (matière génétique).

2) Le réparateur de secours se déclenche quand les cellules sont ensevelies dans les génotoxines qui permettent à la cellule

de survivre au prix d'une mutagénèse.

3) umuC est acronyme de UV mutagenesis gene C (gène C mutagène UV). L'induction du gène umuC fait partie de la

réponse spécifique des cellules bactériennes à la lésion de l'ADN.
© ISO 2000 – Tous droits réservés 1
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ISO 13829:2000(F)
3.1
culture mère

culture d'une souche bactérienne pour conserver la souche d'essai initiale et préparer l'inoculum pour la

culture/préculture de toute une nuit
3.2
culture de toute une nuit

culture des bactéries d'essai destinées à être utilisées pour la préparation de la préculture

3.3
préculture

culture utilisée pour adapter la culture de toute une nuit aux conditions d’essai et préparer l'inoculum pour l'essai

3.4
inoculum
substance d'inoculation

partie aliquote d’une suspension de bactéries utilisée pour l'inoculation lors de l’essai

3.5
relation concentration-effet

induction du gène umuC en fonction de la concentration en agents génotoxiques de l'échantillon d'essai

3.6
milieu de culture
solution aqueuse de nutriments nécessaire à la croissance bactérienne
3.7
échantillon d'essai
échantillon à expérimenter à l'issue de toutes les étapes de préparation

EXEMPLES La préparation peut inclure centrifugation, filtration, homogénéisation, ajustement de la valeur du pH, et

mesure de la conductivité.
3.8
série de dilutions

mélange de l’échantillon d’essai et de l'eau de dilution en différentes proportions

3.9
mélange d'essai
mélange du milieu de culture, de l'inoculum et des séries de dilution
3.10
témoins négatifs
milieu de culture
3.10.1
blanc
milieu de culture sans bactéries
3.10.2
témoin négatif pour les échantillons d’essai
mélange de milieu de culture, d’inoculum et d’eau distillée
3.10.3
témoin solvant
mélange de milieu de culture, d’inoculum et de diméthylsulfoxyde
3.11
témoin positif
mélange de milieu de culture, d’inoculum et de substance génotoxique dissoute
2 © ISO 2000 – Tous droits réservés
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ISO 13829:2000(F)

EXEMPLES Substances génotoxiques types: 4-nitro-quinoline-N-oxyde ou amino-2 anthracène en cas d’activation

métabolique.
3.12
fraction S9

�système d’activation métabolique� surnageant résultant de la centrifugation à 9 000 g de foies de rats mâles

préalablement traités aux agents producteurs d’enzymes

NOTE Les bactéries sont exposées à l’échantillon d’essai à la fois avec et sans système d’activation métabolique

approprié.
4Principe

Les organismes d’essai sont exposés, à l'aide de microplaques, à l’échantillon d’essai avec et sans système

d’activation métabolique. Après 4 h d’incubation, une comparaison est effectuée entre l’induction du gène umuC,

produite par les agents génotoxiques, et l’activation spontanée de la culture témoin, non traitée.

5 Organisme d’essai et réactifs
5.1 Organisme d’essai et culture mère
5.1.1 Organisme d’essai

Salmonella typhimurium est une bactérie anaérobie facultative, Gram négatif, de la famille des entérobactériacées.

La souche d'origine est Salmonella typhimurium TA1535. L'organisme d'essai véhicule le plasmide pSK1002 avec

le gène umuC-lacZ et un gène résistant à l'ampicilline. Cette souche de Salmonella est désignée

«TA1535/pSK1002» (voir annexe B). Du fait de sa résistance à l'ampicilline, cette souche bactérienne peut être

aisément choisie.
5.1.2 Préparation et conservation de la culture mère

Conserver Salmonella typhimurium TA1535/pSK1002 dans des ampoules de 2 ml, contenant 150 μl de milieu de

culture, avec du diméthylsulfoxyde (DMSO) à 10 % ou du glycérol à 20 %, maintenues à une température

maximale de � 80 °C. Utiliser une seule ampoule pour la préparation d'une culture de bactéries de toute une nuit.

5.2 Réactifs

Les produits chimiques doivent être de qualité analytique. Préparer toutes les solutions dans de l'eau déionisée

purifiée, ou dans de l’eau d'un degré de pureté équivalent.
5.2.1 Acide chlorhydrique, c(HCl) = 1 mol/l.
5.2.2 Solution d'hydroxyde de sodium, c(NaOH) = 1 mol/l.
5.2.3 Diméthylsulfoxyde (DMSO),C H SO .
2 6 4

AVERTISSEMENT — Le DMSO engendre des produits mutagènes au bout d'un certain temps.

5.2.4 Milieu de culture TGA, composé de tryptone, glucose et ampicilline, préparé comme indiqué ci- après.

Dissoudre 10 g de tryptone, 5 g de chlorure de sodium (NaCl) et 11,9 g de 4-(hydroxy-2 éthyle)-l-acide

pipérazineéthanesulfonique (HEPES) dans de l'eau, ajuster le pH à 7,0� 0,2, diluer à 980 ml et autoclaver à

121 °C pendant 20 min. Dissoudre 2 g de D(+)-glucose (anhydre) dans 20 ml d'eau distillée et autoclaver

séparément. Après l'autoclavage, mélanger les deux solutions en proportions égales puis ajouter 50 mg

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ISO 13829:2000(F)

d'ampicilline aux 1 000 ml de milieu TGA refroidi dans des conditions stériles. La solution peut être divisée en

portions et conservée à�20 °C pendant au maximum 4 semaines.

5.2.5 Milieu de culture TGA concentré 10����, composé de TGA concentré 10 fois, qui peut être conservé 14

jours à 4 °C.
5.2.5.1 Pour incubation sans S9, préparé comme suit.

Dissoudre 10 g de tryptone, 5 g de chlorure de sodium (NaCl) et 11,9 g de HEPES dans 80 ml d'eau. Ajuster le pH

à7,0� 0,2. Dissoudre 2 g de D(+)-glucose (anhydre) dans 20 ml d'eau. Autoclaver les solutions séparément à

121 °C pendant 20 min, mélanger ensuite les solutions puis ajouter 50 mg d'ampicilline à 100 ml du mélange dans

des conditions stériles.
5.2.5.2 Pour incubation avec S9, préparé comme suit.

Dissoudre 10 g de tryptone, 5 g de chlorure de sodium (NaCl), 2,46 g de chlorure de potassium (KCl), 1,63 g de

chlorure de magnésium hexahydraté (MgCl ,6H O) et 11,9 g de HEPES dans 80 ml d'eau. Ajuster le pH à

2 2

7,0� 0,2. Dissoudre 2 g de D(+)-glucose (anhydre) dans 20 ml d'eau distillée. Autoclaver les solutions séparément

à 121 °C pendant 20 min, mélanger ensuite les solutions puis ajouter 50 mg d'ampicilline aux 100 ml de solution

dans des conditions stériles.

5.2.6 Tampon B , composé de lyse cellulaire et tampon de réaction et préparé comme suit.

Dissoudre 20,18 g d'hydrogénophosphate disodique dihydraté (Na HPO ,2H O), 5,5 g de dihydrogénophosphate

2 4 2

de sodium monohydraté (NaH PO ,H O), 0,75 g de chlorure de potassium (KCl), 0,25 g de sulfate de magnésium

2 4 2

heptahydraté (MgSO ,7H O) dans 900 ml d’eau. Ajuster le pH à 7,0� 0,2. Ajouter ensuite 1,0 g de sodium

4 2

dodécyle sulfate (SDS) et diluer à 1 000 ml. Avant utilisation, ajouter 0,27 ml de mercapto-2 éthanol aux 100 ml de

tampon B et mélanger.
5.2.7 Tampon phosphaté pH (7,0���� 0,2) .

Dissoudre 1,086 g d'hydrogénophosphate disodique dihydraté (Na HPO ,2H O) et 0,538 g de dihydrogéno-

2 4 2
phosphate de sodium monohydraté (NaH PO ,H O) dans 100 ml d'eau.
2 4 2

Si nécessaire, ajuster le pH à 7,0� 0,2. Autoclaver la solution à 121 °C pendant 20 min.

5.2.8 Réactif d'arrêt .

Dissoudre 105,99 g de carbonate de sodium (Na CO ) dans 900 ml d’eau et diluer à 1 000 ml.

2 3
5.2.9 Solution de o-nitrophénol-����-D-galactopyranoside (ONPG).
Dissoudre 45 mg de ONPG dans 10 ml de tampon phosphaté (5.2.7).

En raison de la faible solubilité de l'ONPG, cette solution doit être préparée à l'avance, entièrement dissoute par

agitation à l'obscurité, et à température ambiante (environ 2 h). Cette solution doit être conservée à l’obscurité.

5.2.10 Fraction S9, la quantité nécessaire étant sortie du congélateur.

Une fois décongelée, la fraction S9 doit être conservée dans de la glace jusqu’à son utilisation. Agiter le flacon,

avant de l'ajouter à la préculture.
NOTE Des fractions S9 sont disponibles dans le commerce.
4) Cette solution peut être conservée à température ambiante.
4 © ISO 2000 – Tous droits réservés
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ISO 13829:2000(F)

5.2.11 Solution cofactorielle, fraîchement préparée, conservée dans de la glace pendant la durée de l’essai et

réalisée comme suit.

Dissoudre 148 mg de NADP (sel de sodium) et 76 mg de glucose-6-phosphate (sel disodique) dans 5 ml de milieu

de culture TGA concentré 10� (5.2.5).
5.2.12 Témoins positifs dans le diméthylsulfoxyde (DMSO), préparés comme suit.

AVERTISSEMENT — Le 2-AA peut se photo-oxyder rapidement. Éviter toute exposition prolongée à la

lumière.

Dissoudre 5 mg de N-oxyde de 4-nitroquinoléine (4-NQO) dans 5 ml de DMSO. Cette solution mère peut être

divisée en parties aliquotes et conservée à�20 °C.

Avant l’essai, diluer 2 000 fois en utilisant une solution DMSO à 30 % en fraction volumique (DMSO/eau

déminéralisée: 3/7).

Dissoudre 5 mg d'aminoanthracène (2-AA) dans 5 ml de DMSO. Cette solution mère peut être divisée en parties

aliquotes et conservée à�20 °C.

Avant l’essai, diluer 500 fois en utilisant une solution DMSO à 30 % en fraction volumique (DMSO/eau

déminéralisée: 3/7).
6 Appareillage
L'appareillage doit comprendre les éléments suivants:
� flacons de conservation de 250 ml et 500 ml;
� pipettes de capacité de 1 ml, 10 ml et 25 ml;

� pipettes multicanaux (8 canaux) de volume de 5 μl à 50 μl, 50 μl à 200 μl, 50 μl à 300 μl;

� réservoirs de charge de pipettes multicanaux, ayant des volumes de 17 ml et 34 ml;

� éprouvettes graduées de 500 ml;
� récipients de culture, fioles coniques, de 100 ml;
� ampoules de conservation stériles de 2 ml (cryotubes);
� thermomètre gradué entre 25 °C et 30 °C (�1°C);
� bain-marie à température et durée régulables;

� microplaques-incubateur pour (28� 1) °C et (37� 1) °C avec agitateur (vitesse de 125 tr/min à 150 tr/min);

� autoclave;
� centrifugeuse;

� microplaques 96 puits à couvercles, et fonds plats transparents (capacité du puits de 380 μl);

� pH-mètre;
� photomètre UV/visible (cuves de 1 cm);
� photomètre pour les microplaques.
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ISO 13829:2000(F)
7 Préparation et conservation d’échantillon

Il convient que les échantillons d'eaux et d'eaux résiduaires soient soumis à l'essai le plus rapidement possible

après le prélèvement.

Si l'essai ne peut être réalisé immédiatement, l'échantillon doit être conservé à 4 °C. Dans ce cas, l'échantillon doit

être analysé dans les 48 h qui suivent le prélèvement. Si ce n’est pas le cas, l’échantillon doit être conservé à une

température de�18 °C conformément à l’ISO 5667-16.

Dans certains cas exceptionnels, il est possible de procéder à d'autres mesures préparatoires comme, par

exemple, la centrifugation et la filtration. Ceci peut conduire à l'élimination de la substance génotoxique

(ISO 5667-16). En conséquence, les opérations d'extraction par solvant et de
...

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