ISO 11866-3:1997
(Main)Milk and milk products — Enumeration of presumptive Escherichia coli — Part 3: Colony-count technique at 44 degrees C using membranes
Milk and milk products — Enumeration of presumptive Escherichia coli — Part 3: Colony-count technique at 44 degrees C using membranes
Describes a method for the enumeration of presumptive Escherichia coli by means of a colony-count technique at 44 °C using membranes. Applicable to milk, liquid milk products, dried milk, butter, frozen milk products, cheese, cream, etc.
Lait et produits laitiers — Dénombrement d'Escherichia coli présumés — Partie 3: Technique par comptage des colonies obtenues sur membranes à 44 degrés C
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL IS0
STANDARD 11866-3
First edition
1997-02- 15
Milk and milk products - Enumeration of
presumptive Escherichia co/i -
Part 3:
Colony-count technique at 44 “C using
membranes
Lait et produits laitiers - Dknombrement d ’Escherichia coli p&urn& -
Pattie 3: Technique par comptage des colonies obtenues sur membranes &
44 “C
Reference number
IS0 11866-3: 1997(E)
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0 IS0
IS0 118664: 1997(E)
Foreword
IS0 (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (IS0
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through IS0 technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. IS0 collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
This part of IS0 11866 was prepared by Technical Committee ISOTTC 34, Agricultural food products, Subcommittee
SC 5, Milk and milk products, in collaboration with the International Dairy Federation (IDF) and AOAC
INTERNATIONAL. It will also be published by these organizations.
IS0 11866 consists of the following parts, under the general title Milk and milk products - Enumeration of
presumptive Escherichia coli:
- Part I: Most probable number technique
- Part 2: Most probable number technique using 4-methylumbelliferyl-P-D-glucuronide (MUG)
- Par? 3: Colony-count technique at 44 “C using membranes
The method specified in IS0 11866-3 is preferred for samples in which comparatively large numbers of presumptive
fscherichia CO/Iare ’ suspected.
Annex A of this part of IS0 11866 is for information only.
0 IS0 1997
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and
microfilm, without permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
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Internet central @? iso.ch
x.400 c=ch; a=400net; p=iso; o=isocs; s=central
Printed in Switzerland
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INTERNATIONAL STANDARD o IS0 IS0 I 1866-3: 1997(E)
Milk and milk products - Enumeration of presumptive Escherichia
co/i -
Part 3:
Colony-count technique at 44 “C using membranes
1 Scope
This part of IS0 11866 specifies a method for the enumeration of presumptive Escherichia CO/I’ by means of a
colony-count technique at 44 “C.
The method is applicable to
- milk, liquid milk products;
- dried milk, dried sweet whey, dried buttermilk, lactose;
- acid casein, lactic casein and rennet casein;
- caseinate and dried acid whey;
- cheese and processed cheese;
- butter;
- frozen milk products (including edible ices);
- custard, desserts and cream.
The method specified in this part of IS0 11866 is the preferred method for samples in which comparatively large
numbers of presumptive fscherichia co/i (more than 100 per gram or 10 per millilitre) are suspected.
CAUTION - Some Escherichia co/; pathogenic species do not grow at 44 “C.
2 Normative references
The following standards contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of this part of
IS0 11866. At the time of publication, the editions indicated were valid. All standards are subject to revision and
parties to agreements based on this part of IS0 11866 are encouraged to investigate the possibility of applying the
most recent editions of the standards indicated below. Members of IEC and IS0 maintain registers of currently valid
International Standards.
Enumeration of colony-forming units of micro-organisms - Colony-count
IS0 6610:1992, Milk and milk products -
technique at 30 “C.
General rules for microbiological examinations.
IS0 7218:1996, Microbiology of food and animal feeding stuffs -
IS0 8261: 1989, Milk and milk products - Preparation of test samples and dilutions for microbiological examination.
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IS0 11866-3: 1997(E) 0 IS0
3 Definition
For the purposes of this part of IS0 11866, the following definition applies.
31 presumptive Escherichia co/i; Bacteria which at 44 “C form indole-positive (pink) colonies on cellulose
acetate membranes overlaid on tryptone-bile agar, under the conditions specified in this part of IS0 11866.
4 Principle
Enumeration of presumptive Escherichia CO/Irequires ’ four successive stages.
4.1 Resuscitation
Inoculation of a specified quantity of the test sample or initial suspension onto cellulose acetate membranes overlaid
on mineral-modified glutamate agar, then incubation at 37 “C for 4 h.
NOTE- This procedure enables the presumptive Escherichia co/i damaged by storage under frozen, dried or chill conditions,
or damaged by heat or chemical processes, to be resuscitated. It also permits the diffusion of high concentrations of any
fermentable carbohydrate present in the test sample which would otherwise interfere with indole production during the
subsequent isolation stage.
4.2 Isolation
Transfer of membranes from the resuscitation stage on the mineral-modified glutamate agar to tryptone-bile agar.
Incubation at 44 “C for 18 h to 24 h.
4.3 Detection
Demonstration of the presence of presumptive Escherichia co/; on the membrane by the production of indole by
each colony.
4.4 Calculation
Calculation of the number of colony-forming units (CFU) of presumptive Escherichia co/; per gram or per millilitre of
sample from the number of indole-positive colonies obtained on membranes at dilution levels chosen so as to give a
significant result.
5 Dilution fluid, culture media and reagent
5.1 General
For current laboratory practice, see IS0 7218 and IS0 8261 l
If the prepared culture media and reagents are not used immediately, they shall, unless otherwise stated, be stored
in the dark at a temperature between 0°C and +5 “C for no longer than 1 month, under conditions which do not
produce any change in their composition.
5.2 Dilution fluid
See IS0 8261.
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IS0 11866-3: 1997(E)
0 IS0
5.3 Culture media and reagent
53.1 Resuscitation medium: Mineral-modified glutamate agar
5.3.1 .l Composition
Sodium glutamate
635 g
Lactose IO,0 g
Sodium formate 025 g
0902 g
L(-)Cystine
0902 g
L(-)Aspartic acid
0,024 g
L(+)Arginine
0,001 g
Thiamine
0,001 g
Nicotinic acid
0,001 g
Pantothenic acid
0,100 g
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSOJo7H,0)
0,010 g
Ammonium iron(U) citrate”
0,010 g
Calcium chloride dihydrate (CaCI,.-2H,O)
Dipotassium hydrogen phosphate (K,HPO,) wo g
Ammonium chloride 215 g
12 g to 18 g*)
Agar
1 000 ml
Water
1) Iron content of at least 15 % (m/m).
2) Depending on the gel strength of the agar.
5.3.1.2 Preparation
Dissolve the ammonium chloride in the water. Add the other components and heat to boiling.
Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization it is 6,7 at 25 “C.
Transfer 100 ml volumes of the medium to suitable containers.
Sterilize in the autoclave (6.1) set at 115 “C for 10 min.
5.3.1.3 Preparation of agar plates
Pour into sterile Petri dishes (6.12), 12 ml to 15 ml of the medium cooled to approximately 45 “C, and allow to
solidify. The plates may be stored at 0 “C to +5 “C for up to 4 days.
Immediately before use, dry the plates, preferably with the lids removed and the agar surfaces facing downwards, in
the drying cabinet or the oven (6.3) set at 50 “C for 30 min or until the droplets have disappeared from the surface
of the medium.
NOTE - The agar should be dry enough not to allow excess moisture to appear within 15 min of spreading the inoculum
(1 ml).
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0 IS0
IS0 11866-3: 1997(E)
5.3.2 Selective medium: Tryptone-bile agar
5.3.2.1 Composition
2090 g
Tryptone
Bile salts (refined)
195 g
12 g to 18 g”
Agar
1 000 ml
Water
1) Depending on the gel strength of the agar.
5.3.2.2 Preparation
Dissolve the components in the water and heat to boiling. Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization it is
7,2 at 25 “C.
Transfer aliquots of up to 500 ml of the medium to suitable containers. Sterilize the medium in the autoclave (6.1)
set at 121 “C for 15 min.
5.3.2.3 Preparation of agar plates
Pour into sterile Petri dishes (6.12), 12 ml to 15 ml of the medium cooled to approximately 45 “C, and allow to
solidify. The plates may be stored at 0 “C to +5 “C for up to 4 days.
Immediately before use, dry the plates, preferably with the lids removed and the agar surfaces facing downwards, in
the oven (6.3) set at 50 “C for 30 min or until the droplets have disappeared from the surface of the medium.
5.3.3 lndole detection reagent (Vracko and Sherris reagent)
5.3.3.1 Composition
4-Dimethylaminobenzaldehyde
50 g
Hydrochloric acid, c(HCI) = 1 mol/l 100 ml
5.3.3.2 Preparation
Dissolve the 4-dimethylaminobenzaldehyde in the hydrochloric acid by heating, if necessary. The reagent may be
stored in the dark at 0 “C to +5 “C for a maximum period of 3 months.
6 Apparatus and glassware
For general requirements, see IS0
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 11866-3
Première édition
199702- 15
Lait et produits laitiers - Dénombrement
d’Escherichia Co/i présumés -
Partie 3:
Technique par comptage des colonies
obtenues sur membranes à 44 OC
Milk and milk products -
Enumeration of presumptive Escherichia coli -
Part 3: Colony-Count technique at 44 OC using membranes
Numéro de référence
ISO 11866-3: 1997(F)
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ISO 11866-3: 1997(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
L’ISO collabore étroitement avec la Commission
liaison avec I’ISO participent également aux travaux.
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
La Norme internationale ISO 11866-3 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits agricoles
alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers, en collaboration avec la Fédération internationale de laiterie
(FIL) et I’AOAC INTERNATIONAL et sera également publiée par ces organisations.
présentées sous le titre général Lait et produits laitiers -
L’ISO 11866 comprend les parties suivantes,
Dénombrement d’Escherichia coli présumés:
- Partie 1: Technique du nombre le plus probable
- Par?ie 2: Technique du nombre le plus probable avec utilisation de 4-méthylumbelliféryl-P-D-glucuronide
WJG)
- Partie 3: Technique par comptage des colonies obtenues sur membranes à 44 *C
La méthode prescrite dans I’ISO 11866-3 est particulièrement applicable aux échantillons supposés contenir un
nombre relativement faible d’Escherichia coli présumés.
L’annexe A de la présente partie de I’ISO 11866 est donnée uniquement à titre d’information.
0 ISO 1997
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 l CH-121 1 Genève 20 l Suisse
Internet central @ isoch
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Imprimé en Suisse
ii
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NORME INTERNATIONALE @ ISO ISO 11866-3: 1997(F)
Lait et produits laitiers - Dénombrement d’Escherichia coli
présumés
Partie 3:
Technique par comptage des colonies obtenues sur membranes à
44 OC
1 Domaine d’application
La présente partie de I’ISO 11866 prescrit une méthode pour le dénombrement d’Escherichia Co/i présumés, au
moyen de la technique de comptage des colonies à 44 OC.
Cette méthode est applicable aux :
- lait et produits laitiers liquides;
lait sec, lactosérum sucré sec, babeurre sec et lactose;
-
- caséine acide, caséine lactique et caséine présure;
- caséinates et lactosérum acide sec;
- fromage et fromages fondus;
- beurre;
- produits laitiers congelés (y compris les glaces de consommation);
- crème anglaise, desserts et crème.
La méthode prescrite dans la présente partie de I’ISO 11866 est la méthode recommandée pour les échantillons
supposés contenir un nombre relativement important d’Escherichia Co/i présumés (plus de 100 par gramme ou 10
par millilitre).
ATTENTION - Certaines espèces pathogènes d’Escherichia Co/i ne se développent pas à 44 OC.
2 Références normatives
Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente partie de I’ISO 11866. Au moment de la publication, les éditions indiquées
étaient en vigueur. Toute norme est sujette à révision et les parties prenantes des accords fondés sur la présente
partie de I’ISO 11866 sont invitées à rechercher la possibilité d’appliquer les éditions les plus récentes des normes
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de I’ISO possèdent le registre des Normes internationales en vigueur
à un moment donné.
Lait et produits laitiers - Dénombrement des unités formant colonie de micro-organismes -
ISO 6610:1992,
Comptage des colonies à 30 OC.
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0 ISO
ISO 11866-3: 1997(F)
ISO 7218:1996, Microbiologie des aliments - Règles générales pour les examens microbiologiques.
ISO 82613 989, Lait et produits laitiers - Préparation des échantillons pour essai et des dilutions en vue de
l’examen microbiologique.
3 Définition
Pour les besoins de la présente partie de I’ISO 11866, la définition suivante s’applique.
31 Escherichia coli présumés:
Bactéries qui, à 44 OC, forment des colonies indole-positives (roses) caractéristiques sur membranes en acétate de
cellulose appliquées sur gélose tryptonée biliée, dans les conditions prescrites dans la présente partie de
NS0 11866.
4 Principe
Le dénombrement d’kcherichia coli présumés nécessite quatre étapes successives.
4.1 Revivification
embranes en acétate de tel lulose appliquées sur gélose au glutamate modifiée avec une
Enseme ncement de 1s m
‘échantillon pour essai la suspension mè re puis incu bation à 37 “C pendant 4 h.
quantité déterminée de I ou de
NOTE - Ce mode opératoire permet la revivification d’Escherichia coii présumés ayant été endommagés au cours d’un
stockage dans des conditions de gel, de sécheresse ou de froid, ou endommagés par l’action de la chaleur ou par un
traitement chimique. II permet également la diffusion de concentrations élevées d’hydrates de carbone fermentescibles
présents dans l’échantillon pour essai, ce qui évite leur interférence avec la formation d’indole au moment de l’isolement.
4.2 Isolement
Après la revivification, transfert des membranes de la gélose au glutamate modifiée sur la gélose tryptonée biliée.
Incubation à 44 “C pendant 18 h à 24 h.
4.3 Recherche
Mise en évidence de la présence sur la membrane d’Escherichia Co/i présumés par la formation d’indole à partir de
chaque colonie.
4.4 Calcul
Calcul du nombre d’unités formant colonies (UFC) d’kcherichia Co/i présumés par gramme ou par millilitre
d’échantillon à partir du nombre de colonies indole-positives obtenues sur les membranes à des niveaux de
dilutions choisis afin de donner un résultat significatif.
5 Diluant, milieux de culture et réactif
5.1 Généralités
Pour les pratiques courantes de laboratoires, voir NS0 7218 et I’ISO 8261.
Si les milieux de culture et les réactifs préparés ne sont pas utilisés extemporanément, ils doivent, sauf indications
contraires, être conservés à l’obscurité à une température située entre 0 OC et + 5 “C pendant 1 mois au maximum,
dans des conditions évitant toute modification de leur composition.
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ISO 11866-3: 1997(F)
0 ISO
5.2 Diluant
Voir I’ISO 8261.
5.3 Milieux de culture et réactif
5.3.1 Milieu de revivification: gélose au glutamate modifiée
5.3.1 .l Composition
Glutamate de sodium 6935 g
Lactose 1w g
Formiate de sodium 025 g
0902 g
L(-)Cystine
om g
L(-)Acide aspartique
0,024 g
L(+)Arginine
0,001 g
Thiamine
0,001 g
Acide nicotinique
0,001 g
Acide pantothénique
0,100 g
Sulfate de magnésium heptahydraté (MgS0,,7H,O)
0,010 g
Citrate ammoniacal de fer(lll)l)
0,010 g
Chlorure de calcium dihydraté (CaC1,,2H,O)
Hydrogénophosphate dipotassique (K,HPO,)
wo g
Chlorure d’ammonium 2s g
12 g à 18 g*)
Agar-agar
1 000 ml
Eau
1) Teneur en fer au moins égale à 15 % (m/m).
2) Selon le pouvoir gélifiant de I’agar-agar.
5.3.1.2 Préparation
Dissoudre le chlorure d’ammonium dans l’eau. Ajouter les autres composants et porter à ébullition.
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de 6,7 à 25 “C.
Répartir le milieu, par quantités de 100 ml, dans des récipients appropriés.
Stériliser à l’autoclave (6.1) réglé à 115 “C pendant 10 min.
5.3.1.3 Préparation des boîtes de gélose
Couler 12 ml à 15 ml de milieu refroidi à environ 45 “C dans les boîtes de Petri stériles (6.12) et laisser se solidifier.
Les boîtes peuvent être conservées entre 0 “C et + 5 “C pendant 4 jours.
Juste avant l’emploi, sécher soigneusement les boîtes, de préférence avec le couvercle enlevé et avec la surface
de la gélose tournée vers le bas, dans une étuve (6.3) réglée à 50 “C pendant 30 min ou jusqu’à disparition des
gouttelettes à la surface du milieu.
3
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0 ISO
ISO 11866-3: 1997(F)
NOTE - II convient que la gélose soit suffisamment sèche pour éviter un excès d’humidité au cours des 15 min qui suivent
l’étalement de I’inoculum (1 ml).
5.3.2 Milieu sélectif: gélose tryptonée biliée
5.3.2.1 Composition
Tryptone 2090 g
Sels biliaires (purifiés)
13 g
Agar-agar 12 g à 18 g’)
Eau 1 000 ml
1) Selon le pouvoir gélifiant de I’agar-agar.
5.3.2.2 Préparation
Dissoudre les composants dans l’eau et porter à l’ébullition.
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de 7,2 à 25 OC.
Répartir le milieu, par quantités pouvant aller jusqu’à 500 ml, dans les récipients appropriés.
Stériliser à l’autoclave (6.1) réglé à 121 “C pendant 15 min.
5.3.2.3 Préparation des boîtes de gélose
Couler 12 ml à 15 ml de milieu refroidi à environ 45 “C dans les boîtes de Petri stériles (6.12) et laisser se solidifier.
Les boîtes peuvent être conservées entre 0 “C et + 5 “C pendant 4 jours.
Juste avant l’emploi, sécher soigneusement les boîtes, de préférence avec le couvercle enlevé et avec la surface
de la gélose tournée vers le bas, dans une étuve (6.3) réglée à 50 “C pendant 30 min ou jusqu’à disparition des
gouttelettes à la surface du milieu.
5.3.3 Réactif pour la recherche de I’indole (réactif de Vracko et Sherris)
5.3.3.1 Composition
Diméthylamino-4 benzaldéhyde
50 g
Acide chlorhydrique, c(HCI) = 1 mol/1 100 ml
5.3.3.2 Préparation
Dissoudre le diméthylamino-4 benzaldéhyde dans l’acide chlorhydrique en chauffant si nécessaire. Le réactif peut
être conservé à l’obscurité entre 0 “C et + 5 “C pendant 3 mois au maximum.
6 Appareillage et verrerie
Voir I’ISO 7218 et I’ISO 8261 pour les spécifications
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 11866-3
Première édition
199702- 15
Lait et produits laitiers - Dénombrement
d’Escherichia Co/i présumés -
Partie 3:
Technique par comptage des colonies
obtenues sur membranes à 44 OC
Milk and milk products -
Enumeration of presumptive Escherichia coli -
Part 3: Colony-Count technique at 44 OC using membranes
Numéro de référence
ISO 11866-3: 1997(F)
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ISO 11866-3: 1997(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
L’ISO collabore étroitement avec la Commission
liaison avec I’ISO participent également aux travaux.
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
La Norme internationale ISO 11866-3 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits agricoles
alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers, en collaboration avec la Fédération internationale de laiterie
(FIL) et I’AOAC INTERNATIONAL et sera également publiée par ces organisations.
présentées sous le titre général Lait et produits laitiers -
L’ISO 11866 comprend les parties suivantes,
Dénombrement d’Escherichia coli présumés:
- Partie 1: Technique du nombre le plus probable
- Par?ie 2: Technique du nombre le plus probable avec utilisation de 4-méthylumbelliféryl-P-D-glucuronide
WJG)
- Partie 3: Technique par comptage des colonies obtenues sur membranes à 44 *C
La méthode prescrite dans I’ISO 11866-3 est particulièrement applicable aux échantillons supposés contenir un
nombre relativement faible d’Escherichia coli présumés.
L’annexe A de la présente partie de I’ISO 11866 est donnée uniquement à titre d’information.
0 ISO 1997
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 l CH-121 1 Genève 20 l Suisse
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Lait et produits laitiers - Dénombrement d’Escherichia coli
présumés
Partie 3:
Technique par comptage des colonies obtenues sur membranes à
44 OC
1 Domaine d’application
La présente partie de I’ISO 11866 prescrit une méthode pour le dénombrement d’Escherichia Co/i présumés, au
moyen de la technique de comptage des colonies à 44 OC.
Cette méthode est applicable aux :
- lait et produits laitiers liquides;
lait sec, lactosérum sucré sec, babeurre sec et lactose;
-
- caséine acide, caséine lactique et caséine présure;
- caséinates et lactosérum acide sec;
- fromage et fromages fondus;
- beurre;
- produits laitiers congelés (y compris les glaces de consommation);
- crème anglaise, desserts et crème.
La méthode prescrite dans la présente partie de I’ISO 11866 est la méthode recommandée pour les échantillons
supposés contenir un nombre relativement important d’Escherichia Co/i présumés (plus de 100 par gramme ou 10
par millilitre).
ATTENTION - Certaines espèces pathogènes d’Escherichia Co/i ne se développent pas à 44 OC.
2 Références normatives
Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente partie de I’ISO 11866. Au moment de la publication, les éditions indiquées
étaient en vigueur. Toute norme est sujette à révision et les parties prenantes des accords fondés sur la présente
partie de I’ISO 11866 sont invitées à rechercher la possibilité d’appliquer les éditions les plus récentes des normes
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de I’ISO possèdent le registre des Normes internationales en vigueur
à un moment donné.
Lait et produits laitiers - Dénombrement des unités formant colonie de micro-organismes -
ISO 6610:1992,
Comptage des colonies à 30 OC.
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ISO 11866-3: 1997(F)
ISO 7218:1996, Microbiologie des aliments - Règles générales pour les examens microbiologiques.
ISO 82613 989, Lait et produits laitiers - Préparation des échantillons pour essai et des dilutions en vue de
l’examen microbiologique.
3 Définition
Pour les besoins de la présente partie de I’ISO 11866, la définition suivante s’applique.
31 Escherichia coli présumés:
Bactéries qui, à 44 OC, forment des colonies indole-positives (roses) caractéristiques sur membranes en acétate de
cellulose appliquées sur gélose tryptonée biliée, dans les conditions prescrites dans la présente partie de
NS0 11866.
4 Principe
Le dénombrement d’kcherichia coli présumés nécessite quatre étapes successives.
4.1 Revivification
embranes en acétate de tel lulose appliquées sur gélose au glutamate modifiée avec une
Enseme ncement de 1s m
‘échantillon pour essai la suspension mè re puis incu bation à 37 “C pendant 4 h.
quantité déterminée de I ou de
NOTE - Ce mode opératoire permet la revivification d’Escherichia coii présumés ayant été endommagés au cours d’un
stockage dans des conditions de gel, de sécheresse ou de froid, ou endommagés par l’action de la chaleur ou par un
traitement chimique. II permet également la diffusion de concentrations élevées d’hydrates de carbone fermentescibles
présents dans l’échantillon pour essai, ce qui évite leur interférence avec la formation d’indole au moment de l’isolement.
4.2 Isolement
Après la revivification, transfert des membranes de la gélose au glutamate modifiée sur la gélose tryptonée biliée.
Incubation à 44 “C pendant 18 h à 24 h.
4.3 Recherche
Mise en évidence de la présence sur la membrane d’Escherichia Co/i présumés par la formation d’indole à partir de
chaque colonie.
4.4 Calcul
Calcul du nombre d’unités formant colonies (UFC) d’kcherichia Co/i présumés par gramme ou par millilitre
d’échantillon à partir du nombre de colonies indole-positives obtenues sur les membranes à des niveaux de
dilutions choisis afin de donner un résultat significatif.
5 Diluant, milieux de culture et réactif
5.1 Généralités
Pour les pratiques courantes de laboratoires, voir NS0 7218 et I’ISO 8261.
Si les milieux de culture et les réactifs préparés ne sont pas utilisés extemporanément, ils doivent, sauf indications
contraires, être conservés à l’obscurité à une température située entre 0 OC et + 5 “C pendant 1 mois au maximum,
dans des conditions évitant toute modification de leur composition.
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ISO 11866-3: 1997(F)
0 ISO
5.2 Diluant
Voir I’ISO 8261.
5.3 Milieux de culture et réactif
5.3.1 Milieu de revivification: gélose au glutamate modifiée
5.3.1 .l Composition
Glutamate de sodium 6935 g
Lactose 1w g
Formiate de sodium 025 g
0902 g
L(-)Cystine
om g
L(-)Acide aspartique
0,024 g
L(+)Arginine
0,001 g
Thiamine
0,001 g
Acide nicotinique
0,001 g
Acide pantothénique
0,100 g
Sulfate de magnésium heptahydraté (MgS0,,7H,O)
0,010 g
Citrate ammoniacal de fer(lll)l)
0,010 g
Chlorure de calcium dihydraté (CaC1,,2H,O)
Hydrogénophosphate dipotassique (K,HPO,)
wo g
Chlorure d’ammonium 2s g
12 g à 18 g*)
Agar-agar
1 000 ml
Eau
1) Teneur en fer au moins égale à 15 % (m/m).
2) Selon le pouvoir gélifiant de I’agar-agar.
5.3.1.2 Préparation
Dissoudre le chlorure d’ammonium dans l’eau. Ajouter les autres composants et porter à ébullition.
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de 6,7 à 25 “C.
Répartir le milieu, par quantités de 100 ml, dans des récipients appropriés.
Stériliser à l’autoclave (6.1) réglé à 115 “C pendant 10 min.
5.3.1.3 Préparation des boîtes de gélose
Couler 12 ml à 15 ml de milieu refroidi à environ 45 “C dans les boîtes de Petri stériles (6.12) et laisser se solidifier.
Les boîtes peuvent être conservées entre 0 “C et + 5 “C pendant 4 jours.
Juste avant l’emploi, sécher soigneusement les boîtes, de préférence avec le couvercle enlevé et avec la surface
de la gélose tournée vers le bas, dans une étuve (6.3) réglée à 50 “C pendant 30 min ou jusqu’à disparition des
gouttelettes à la surface du milieu.
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ISO 11866-3: 1997(F)
NOTE - II convient que la gélose soit suffisamment sèche pour éviter un excès d’humidité au cours des 15 min qui suivent
l’étalement de I’inoculum (1 ml).
5.3.2 Milieu sélectif: gélose tryptonée biliée
5.3.2.1 Composition
Tryptone 2090 g
Sels biliaires (purifiés)
13 g
Agar-agar 12 g à 18 g’)
Eau 1 000 ml
1) Selon le pouvoir gélifiant de I’agar-agar.
5.3.2.2 Préparation
Dissoudre les composants dans l’eau et porter à l’ébullition.
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de 7,2 à 25 OC.
Répartir le milieu, par quantités pouvant aller jusqu’à 500 ml, dans les récipients appropriés.
Stériliser à l’autoclave (6.1) réglé à 121 “C pendant 15 min.
5.3.2.3 Préparation des boîtes de gélose
Couler 12 ml à 15 ml de milieu refroidi à environ 45 “C dans les boîtes de Petri stériles (6.12) et laisser se solidifier.
Les boîtes peuvent être conservées entre 0 “C et + 5 “C pendant 4 jours.
Juste avant l’emploi, sécher soigneusement les boîtes, de préférence avec le couvercle enlevé et avec la surface
de la gélose tournée vers le bas, dans une étuve (6.3) réglée à 50 “C pendant 30 min ou jusqu’à disparition des
gouttelettes à la surface du milieu.
5.3.3 Réactif pour la recherche de I’indole (réactif de Vracko et Sherris)
5.3.3.1 Composition
Diméthylamino-4 benzaldéhyde
50 g
Acide chlorhydrique, c(HCI) = 1 mol/1 100 ml
5.3.3.2 Préparation
Dissoudre le diméthylamino-4 benzaldéhyde dans l’acide chlorhydrique en chauffant si nécessaire. Le réactif peut
être conservé à l’obscurité entre 0 “C et + 5 “C pendant 3 mois au maximum.
6 Appareillage et verrerie
Voir I’ISO 7218 et I’ISO 8261 pour les spécifications
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